Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test preferencji smakowych dla dorosłych Drosophila

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54403

⸱

8 września 2016

 , 
1Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine-South Bend

W tym artykule

Podsumowanie

Smak jest ważnym procesem sensorycznym, który ułatwia przyciąganie do dobroczynnych substancji i unikanie substancji toksycznych. Protokół ten opisuje prosty test spożycia w celu określenia preferencji smakowej Drosophila dla danego związku chemicznego.

Streszczenie

Węchowa i smakowa percepcja otoczenia jest niezbędna dla przetrwania zwierząt. Najbardziej oczywistym zastosowaniem tych chemozmysłów jest umiejętność odróżnienia dobrych źródeł pożywienia od potencjalnie niebezpiecznych źródeł żywności. Gustacja wymaga fizycznego kontaktu ze związkiem chemicznym, który jest w stanie sygnalizować poprzez receptory smaku, które wyrażają się na powierzchni neuronów. U owadów te neurony smakowe mogą być zlokalizowane w całym ciele zwierzęcia, dzięki czemu smak odgrywa ważną rolę w wielu różnych zachowaniach. Owady zazwyczaj preferują związki zawierające cukry, podczas gdy unika się związków, które są uważane za gorzkie w smaku. Biorąc pod uwagę podstawowe biologiczne znaczenie smaku, istnieje duże zainteresowanie zrozumieniem mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tej modalności sensorycznej. Opisujemy test smakowy dorosłego osobnika Drosophila, który odzwierciedla preferencje zwierząt dotyczące danego związku smakowego. Test ten może być stosowany do zwierząt o dowolnym pochodzeniu genetycznym w celu zbadania preferencji smakowych dla pożądanego rozpuszczalnego związku.

Wprowadzenie

Zwierzęta używają chemosensacji do odróżniania korzystnych warunków od niekorzystnych. To postrzeganie może mieć kluczowe znaczenie dla takich rzeczy, jak określenie najlepszego źródła pożywienia, unikanie substancji toksycznych lub określenie najlepszego partnera do krycia1. Chemosensacja często dzieli się na dwa komponenty sensoryczne: zmysły węchu i zmysły smakowe. Główną cechą wyróżniającą te zmysły jest to, że węch (zapach) służy do pobierania próbek otaczającego gazowego środowiska chemicznego, podczas gdy smak (smak) wymaga fizycznego kontaktu z nielotnym substratem. Obie modalności sensoryczne stymulują reakcje neurologiczne, które są przetwarzane i dekodowane w mózgu w celu wytworzenia odpowiedniego atrakcyjnego lub odpychającego zachowania2. Zmysły te mają zatem kluczowe znaczenie dla przetrwania zwierząt.

Muszka owocowa Drosophila melanogaster to organizm modelowy, który wciąż zyskuje na popularności do wykorzystania w zrozumieniu, jak owady odbierają zapach i smak. Muszki owocowe oferują ogromne korzyści w porównaniu z innymi systemami modelowymi ze względu na bogactwo narzędzi genetycznych dostępnych do analizy ścieżek molekularnych, komórkowych i behawioralnych. Prace prowadzone w ciągu ostatnich 15 lat były szczególnie pomocne w charakteryzowaniu specyficznych tożsamości komórkowych, receptorów neuronalnych i mechanizmów sygnalizacyjnych związanych zarówno z zapachem, jak i smakiem. Teraz moc genetyki Drosophila jest wykorzystywana do dalszego wyjaśnienia, w jaki sposób procesy te są kodowane na poziomie3-6 pojedynczego neuronu i pojedynczego obwodu. Dlatego testy, które zapewniają łatwe do oceny odczyty zmian w szlakach sensorycznych, mają kluczowe znaczenie dla dalszego rozwoju tych dziedzin.

Podczas gdy wiele wiadomo o tym, jak sygnały węchowe są kodowane i przetwarzane w mózgu, znacznie mniej wiadomo o podobnych mechanizmach w szlaku smakowym. Opisujemy tutaj protokół, który można wykorzystać do ustalenia preferencji smakowych u Drosophila. Drosophila, podobnie jak ssaki, na ogół preferuje związki o słodkim smaku w przeciwieństwie do związków o gorzkim smaku. Każda kombinacja tych źródeł żywności może być wykorzystana w tym eksperymentalnym projekcie w celu określenia, w jaki sposób znane zmiany genetyczne wpływają na wybór smaku. Ponadto strategie interwencji farmakologicznej mogą być podobnie oceniane pod kątem ich wpływu na preferencje smakowe zwierząt. Łatwość i elastyczność tego testu sprawia, że jest to użyteczny paradygmat do zrozumienia natury percepcji smakowej u Drosophila.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Głód

  1. Przygotuj fiolki na muchy, nasycając wacik wodą o sile 18,2 MΩ na dnie standardowej fiolki na muchy. Alternatywnie, w podobny sposób nasącz mały pasek bibuły filtracyjnej wodą o mocy 18,2 MΩ i umieść pod kątem w fiolce.
  2. Zbierz muchy w zestawy po ~100 zwierząt na podkładce CO2, a następnie dodaj muchy do przygotowanej fiolki.
    Uwaga: Najlepsze wyniki uzyskuje się ze zwierząt, które mają mniej niż 5 dni. Jednak dokładny wiek zwierząt może być kontrolowany jako zmienna doświadczalna w celu określenia zmian w preferencjach smakowych w czasie.
  3. Użyj wacika lub korka piankowego, aby zabezpieczyć fiolki zamknięte. Umieścić fiolki na boku w inkubatorze z kontrolowanym środowiskiem. Utrzymuj temperaturę na poziomie 25 °C, a wilgotność powyżej 70%. Pozostawić fiolki nietknięte przez 24 godziny.

2. Test preferencji smakowych

  1. Przygotuj wszystkie degustacje do testu tego samego dnia, w którym przeprowadzane jest badanie.
    Uwaga: Dokładne degustacje, które należy użyć, będą się różnić w zależności od zadanego pytania eksperymentalnego. Poniżej znajdują się przykładowe degustacje używane w tym protokole. Zobacz sekcję 4, aby zapoznać się z optymalizacjami.
    1. Przygotować degustator kontrolny (1 mM sacharozy), łącząc 10 μl 100 mM roztworu sacharozy, 13 μl czerwonego barwnika spożywczego i 977 μl 18,2 MΩ wody.
    2. Przygotuj eksperymentalny degustator (5 mM sacharozy), łącząc 50 μl 100 mM roztworu sacharozy, 10 μl niebieskiego barwnika spożywczego i 940 μl wody o stężeniu 18,2 MΩ.
  2. Przygotować komory testowe przy użyciu standardowej plastikowej szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm, przygotowanej w następujący sposób:
    1. Umieść trzy 10 μl kropli degustacji kontrolnej najbliżej krawędzi płytki na godzinie 12 i kolejne 3 krople na godzinie 6. Upewnij się, że odstępy między kroplami są podobne.
    2. Umieść trzy krople degustacji eksperymentalnej o objętości 10 μl najbliżej krawędzi płytki na godzinie 3 i kolejne 3 krople na godzinie 9. Upewnij się, że odstępy między kroplami są podobne.
    3. Powtórz kroki 2.2.1 i 2.2.2 dla dowolnej liczby powtórzeń.
  3. Opróżnij 1 fiolkę z ~ 100 wygłodzonymi muchami na podkładkę CO2 wystarczająco długo, aby znieczulić wszystkie zwierzęta (około 10 sekund). Wyszczotkuj zwierzęta na środku przygotowanej komory testowej i przykryj pokrywką naczynia.
    Uwaga: Należy unikać dłuższych okresów narażenia na CO2 , aby skrócić czas rekonwalescencji i ograniczyć zakłócenia w zachowaniu żywieniowym. Ekspozycja na lód (~5 min) może być wykorzystana do znieczulenia, aby uniknąć skutków behawioralnych CO2 , które mogą wynikać nawet z ograniczonej ekspozycji.
  4. Umieść komorę testową w nieprzezroczystym pudełku kartonowym. Pamiętaj, aby oznaczyć zewnętrzną stronę pudełka stanem i genotypem, który jest testowany.
  5. Umieścić cały zestaw (komorę testową znajdującą się w kartonowym pudełku z kroku 2.4) w inkubatorze o temperaturze 25 °C o wilgotności co najmniej 70% na 2 godziny.
  6. Powtórz kroki od 2.3 do 2.5 dla wszystkich powtórzeń.
  7. Po 2 godzinach umieścić komory testowe, nadal znajdujące się w kartonach, bezpośrednio w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do oznaczania ilościowego.

3. Kwantyfikacja testu preferencji smakowych

  1. Pozwól, aby jedna komora testowa rozgrzała się do temperatury pokojowej (około 5 minut).
  2. Pod mikroskopem preparacyjnym, za pomocą pędzla lub kleszczy, grupuj zwierzęta na podstawie koloru ich brzucha: czerwonego, niebieskiego, fioletowego lub przezroczystego (ryc. 1).
  3. Zanotować liczbę zwierząt w każdej grupie. Należy uznać, że zwierzęta nie brały udziału w teście i dlatego nie uwzględnia się ich w żadnych obliczeniach.
  4. Oblicz indeks preferencji zgodnie z jednym z następujących równań:
    1. Jeśli do czerwonego barwnika dodaje się eksperymentalny degustat, użyj (Nczerwony + 0,5 Nfioletowy)/(Nczerwony + Nniebieski + Nfioletowy).
    2. Jeśli eksperymentalny degustant zostanie dodany do niebieskiego barwnika, dostosuj równanie do (Nniebieski + 0,5 Nfioletowy)/(Nniebieski + Nczerwony + Nfioletowy).
  5. Powtórzyć obliczenia dla wszystkich warunków doświadczalnych i powtórzeń.

4. Optymalizacja testu preferencji smakowych

  1. Empirycznie określ stężenie wskaźników barwników spożywczych, które mają być stosowane, aby barwienie żywności nie wpływało na wynik testu smaku, w następujący sposób:
    1. Przygotuj 4 degustatory, używając tego samego związku bazowego (np. 5 mM sacharozy), jak wskazano w kroku 2.1, ale pomiń barwnik spożywczy.
    2. Dodaj 1,3% czerwonego barwnika spożywczego do jednego z degustatorów. Pozostałe 3 degustacje przygotuj z niebieskim barwnikiem spożywczym o różnych stężeniach w każdej tubce (np. 0,6%, 1% i 1,3%).
    3. Wykonaj kroki protokołu od 2.2 do 3.4 dla każdej pary degustatorów: 1,3% czerwony vs. 0,6% niebieski; 1,3% czerwony vs. 1% niebieski i 1,3% czerwony vs. 1,3% niebieski.
    4. Powtórz kroki 4.1.1-4.1.3 z różnymi procentami niebieskiego barwnika spożywczego, aż wskaźnik preferencji osiągnie średnią wartość 0 (Rysunek 2).
      Uwaga: Na początek 1,3% czerwonego barwnika spożywczego w połączeniu z 1% niebieskiego barwnika spożywczego zazwyczaj daje dobre wyniki. Jeśli nie można dopasować zadowalającego stężenia niebieskiego barwnika spożywczego do 1,3% barwnika, wówczas kroki od 4.1.1 do 4.1.3 można powtórzyć z różnymi stężeniami czerwonego barwnika i stałym stężeniem niebieskiego barwnika spożywczego.
    5. Przeanalizuj wszystkie warunki, które mają być testowane, z tymi samymi zoptymalizowanymi stężeniami barwników spożywczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poniżej przedstawiono niektóre typowe wyniki testów preferencji smakowych. W większości eksperymentów zauważalna będzie pewna zmienność intensywności zabarwienia odwłoka (Rysunek 1). Każde zabarwienie odwłoka, niezależnie od tego, czy jest intensywne, czy słabe, uznaje się za pozytywną ingestję. Zaleca się zatem, aby badacze oceniali zwierzęta w sposób ślepy względem warunków eksperymentalnych, aby ograniczyć potencjalne błędy poznawcze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisaliśmy prosty, ale skuteczny protokół określania preferencji smakowych u Drosophila. Wersje tego testu są rutynowo stosowane w eksperymentach w celu określenia wkładu receptorów smakowych (GR) w postrzeganie różnych jakości (gorzkiej, słodkiej, kwaśnej, słonej i umami) związków smakowych. Genom Drosophila zawiera około 60 genów, które kodują 68 zidentyfikowanych receptorów smakowych za pomocą alternatywnego splicingu8,9. Jednak wykazano, że inne białka, takie jak jonotropowe receptory glu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Tessiera za krytyczne przeczytanie tego manuskryptu i pomocne sugestie podczas przygotowywania tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niebieski barwnik spożywczy (woda, glikol propylenowy, FD& C Niebieski 1 i Czerwony 40, propyloparaben)McCormickN/A
Krio/Zamrażarki bez przegródFisher03-395-455
Dumont #5 KleszczeFine Science Tools11251-20
Lodowaty kwas octowyFisherBP2401-500
Leica S6 E Mikroskop stereozoom 0,63x-4,0XW. Nuhsbaum, Inc.
szalka Petriego (100 mm x 15 mm)BD Falcon351029Wielokrotnego użytku, jeśli dokładnie umyte i wysuszone
Mikroprobówki Quick-SnapAlkali Scientific Inc.C3017
Czerwony barwnik spożywczy (woda, glikol propylenowy, FD& C Reds 40 i 3, propyloparaben)McCormickN/A
SacharozaIBI ScientificIB37160
10446294

Bibliografia

  1. Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
  3. Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
  4. Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
  5. Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
  6. Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
  7. Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042(2013).
  8. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  9. Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
  10. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  11. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  12. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  13. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
  16. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  17. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  18. French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
  19. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test smakowy Drosophilatest preferencji smakowychanaliza stężenia sacharozyilościowe oznaczanie barwników spożywczychmetoda znieczulania CO2przygotowanie szalek Petriegokontrola środowiskowa w inkubatorzetechnika przechowywania w zamrażarceobserwacja pod mikroskopem sekcyjnymgrupowanie według koloru odwłoka
Test preferencji smakowych dla dorosłych Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.