Testy behawioralne dostarczają potężnych narzędzi do zrozumienia funkcji neuronów. W tym miejscu przedstawiamy kilka protokołów ilościowego określania zachowań żywieniowych drapieżników występujących u modelowego nicienia Pristionchus pacificus i jego krewnych. Dodatkowo udostępniamy metody analizy adaptacji żywieniowych drapieżników, w tym budowy jamy ustnej i zębów.
Artykuł metodologiczny
Badanie drapieżnych zachowań żywieniowych u Pristionchus i innych nicieni
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół dostarcza wielu metod analizy i kwantyfikacji zachowań żywieniowych drapieżników u nicieni. Wiele gatunków nicieni, w tym Pristionchus pacificus, wykazuje złożone zachowania, z których najbardziej uderzającym jest drapieżnictwo innych larw nicieni. Ponieważ jednak zachowania te są nieobecne w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans, do tej pory zostały one szczegółowo opisane dopiero niedawno wraz z opracowaniem wiarygodnych testów behawioralnych 1. Te drapieżne zachowania są zależne od fenotypowo plastycznych, ale stałych kształtów ust, co sprawia, że prawidłowa identyfikacja i kategoryzacja tych zwierząt jest niezbędna. U P. pacificus występują dwa typy pysków, zwężony i eurystomatyczny morf 2, przy czym tylko eurystomatous z szerokimi ustami zawiera dodatkowy ząb i jest zdolny do zabijania innych larw nicieni. Poprzez izolację dużej liczby larw ofiar o dopasowanej wielkości, a następnie narażenie na drapieżne nicienie, możliwe są testy, w tym zarówno "testy zwłok", jak i "testy ugryzień" na prawidłowo zidentyfikowanych nicieniach o morfie ust. Testy te umożliwiają szybkie ilościowe określenie wskaźników sukcesu drapieżnictwa i zapewniają szczegółową analizę behawioralną poszczególnych nicieni zaangażowanych w drapieżne działania żywieniowe. Dodatkowo, dzięki zastosowaniu szybkiej kamery, możliwa jest również wizualizacja zmian w aktywności gardła, w tym dynamiki zębów i pompowania.
Wprowadzenie
Nicienie ze swoimi małymi, ale złożonymi układami nerwowymi okazały się potężnymi narzędziami do zrozumienia wielu aspektów neurobiologii, w tym zachowania. Wiele z tych badań koncentrowało się na organizmie modelowym Caenorhabditis elegans, w którym z powodzeniem przeanalizowano i przeanalizowano bogactwo różnych zachowań. Należą do nich: mechanosensoryka 3, chemotaktyczna 4, termotaktyczna 5,6 i magnetotaktyczna 7 wpływająca na krycie 8,9, uczenie się 10 i zachowania żywieniowe 11. Jednak inne, bardziej daleko spokrewnione gatunki nicieni wykazują zachowania, których nie obserwuje się u rabditidae C. elegans lub alternatywnie wykazują dodatkowe poziomy złożoności, co rodzi istotne pytania dotyczące ich ewolucji i regulacji. Jeden z takich przykładów można zaobserwować u daleko spokrewnionego nicienia diplogastrid Pristionchus pacificus, który wykazuje znacznie bardziej złożone zachowania i rytmy żywieniowe niż obserwowane u C. elegans 1. Dzieje się tak pomimo tego, że oba gatunki mają wspólne homologiczne neurony gardłowe 12. Zbiegając się z tymi dodatkowymi zachowaniami żywieniowymi, P. pacificus wykazuje również rozszerzony zakres diety, ponieważ jest zapalonym drapieżnikiem, zdolnym do uzupełniania diety bakteryjnej, żywiąc się również larwami innych nicieni. Na szczęście P. pacificus został opracowany jako model dla porównawczej i integracyjnej biologii ewolucyjnej, dlatego obecnie dostępnych jest wiele narzędzi molekularnych i genetycznych. Obejmują one w pełni zsekwencjonowany i opisany genom 13, narzędzia molekularne i genetyczne, w tym transgeny 14 i CRISPR/Cas9 15,16, a także szczegółową i dobrze opisaną filogenezę 17 z ponad 25 blisko spokrewnionymi gatunkami, w tym nowo odkrytymi gatunkami siostrzanymi. Ponadto ekologia wielu gatunków Pristionchus, w tym P. pacificus, jest dobrze zdefiniowana, a wiele gatunków zostało obecnie opisanych mających nekromeczny związek z chrząszczami skarabeuszami, żywicielem, którego często dzielą z innymi gatunkami nicieni 18. P. pacificus stanowi zatem doskonały system modelowy, za pomocą którego można analizować ewolucję nowych zachowań i ich znaczenie ekologiczne.
Aby przeanalizować zachowania żywieniowe drapieżników u gatunków nicieni, takich jak P. pacificus, opracowaliśmy kilka nowatorskich testów behawioralnych ułatwiających obserwację i kwantyfikację działań drapieżników. Ponieważ P. pacificus wykazuje dymorficzną budowę ust, która silnie wpływa na zachowania drapieżników, niezbędna jest identyfikacja prawidłowego morfotypu 1,2. Wąskoustny morf zstenostomatyczny zawiera pojedynczy ząb grzbietowy i nie angażuje się w żadne drapieżne żerowanie. Alternatywnie, morfa eurystomatyczna z szerokimi ustami obejmuje znacznie większy ząb grzbietowy w kształcie pazura i dodatkowy przeciwstawny ząb podbrzuszny, które razem działają, aby skutecznie otworzyć naskórek ofiary. Stosunek drapieżnej formy eurystomatycznej do niedrapieżnej formy stenostomatycznej różni się w zależności od gatunku Pristionchus, a także w obrębie P. pacificus, jednak odsetek eurystomatous mouth morph w dzikim szczepie P. pacificus (PS312) wynosi zwykle 70 - 90% 2. Ponadto proporcje kształtu jamy ustnej mogą się wahać w zależności od różnych wpływów środowiska (zarówno znanych, w tym głodu i sygnalizacji małych cząsteczek, jak i nieznanych czynników), dlatego prawidłowa identyfikacja i izolacja drapieżnej formy jamy ustnej jest niezbędna do udanych testów drapieżnych.
Wraz z opisem formy pyska drapieżnika opracowaliśmy "test ugryzienia" do bezpośredniej obserwacji i kwantyfikacji zachowań drapieżników, w tym gryzienia, zabijania i żerowania. Tutaj nicienie drapieżne są izolowane poprzez filtrowanie nowo wygłodzonych kultur i wystawiane na drapieżne dorosłe P. pacificus, które są obserwowane razem przez krótki okres czasu. Ponadto opracowaliśmy również wysokoprzepustowy "test zwłok", aby ułatwić szybkie badanie przesiewowe zachowań drapieżnych poprzez pośrednią obserwację zdarzeń drapieżnych. Wykorzystuje to obecność zwłok larw jako narzędzie do wykrywania drapieżników. Oba testy zapewniają łatwe i wysoce powtarzalne metody obserwacji i pomiaru zachowań drapieżników u gatunków nicieni, takich jak P. pacificus.
Protokół
1. Forma ust Fenotypowanie
- Identyfikacja formy gębowej na opuszkach agarozowych
Uwaga: Aby uwidocznić morfy ust nicienia, unieruchom robaki za pomocą łagodnego środka znieczulającego na płatkach agarozowych i postępuj zgodnie z poniższymi zasadami.- Hoduj i utrzymuj kultury nicieni, takie jak P. pacificus, na 6 cm standardowych pożywkach do hodowli nicieni (NGM) i żywij się trawnikiem bakteryjnym E. coli OP50 19.
- Przygotuj płatki agarozowe, najpierw dodając 0,06 g agarozy do 3 ml H2O w probówce o pojemności 15 ml, aby uzyskać 3 ml 2% roztworu agarozy. Można go przechowywać do roku w temperaturze 4 °C.
- Dokładnie wymieszaj i rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej lub alternatywnie użyj bloku grzewczego ustawionego na > 88°C.
- Po całkowitym stopieniu dodać do agarozy 10 μl 10 % roztworu azydku sodu i dokładnie wymieszać. UWAGA: Suchy azydek sodu jest reaktywny i wszystkie formy są toksyczne.
- Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml umieścić kroplę nie mniejszą niż 300 μl płynnej mieszaniny azydku agarozy na środku standardowego szklanego szkiełka mikroskopowego.
- Zanim agar ostygnie, szybko umieść drugie szkiełko mikroskopowe na wierzchu kropli, aby spłaszczyć agarozę, która po schłodzeniu tworzy podkładkę. Powtórz dla tylu pól lutowniczych, ile jest wymagane.
- Tuż przed użyciem należy rozerwać szklane szkiełka mikroskopowe, zsuwając je z siebie. Uwaga: Jeśli płatki agarozowe zostaną przygotowane zbyt wcześnie, mogą być nadmiernie suche i mogą uszkodzić nicienie.
- Aby przenieść robaki do znieczulających elektrod agarozowych, umieść kroplę buforu M9 (2 - 3 μl) na środku podkładki. Wybierz 2-3 młode dorosłe osobniki P. pacificus do kropli M9 przed ostrożnym umieszczeniem szkiełka nakrywkowego na podkładce. Nicienie P. pacificus zostaną unieruchomione w agarozie i gotowe do wizualizacji.
- Przenieś szkiełko mikroskopowe zawierające znieczulonego robaka do odpowiedniego mikroskopu i obserwuj pod optyką 63X Nomarski. Kategoryzuj tożsamości morfów na podstawie następujących cech: obecność dodatkowego zęba podbrzusznego, powiększonego zęba grzbietowego i szerokiego otworu gębowego wskazuje na zwierzę o morfie jamy ustnej eurystomatycznej, podczas gdy obecność pojedynczego zęba grzbietowego i węższego otworu gębowego wskazuje na zwierzę zstenostomatyczne (ryc. 1).
Uwaga: W celu utrzymania zdrowia zwierzęcia robaki powinny być trzymane na podkładce agarowej nie dłużej niż 5 minut. - Po zidentyfikowaniu morfa jamy ustnej odzyskaj nicienie eurystomatyczne lub stenostomatyczne, zgodnie z wymaganiami, usuwając szkiełko nakrywkowe, delikatnie zsuwając je z podkładki agarozowej. Ostrożnie wybierz wybrane zwierzęta z podkładki agarozowej (E. coli OP50 może być użyta na kilofie, aby była bardziej lepka) na świeże płytki NGM. Odczekać, aż dojdzie do siebie po podaniu środka znieczulającego do czasu wznowienia normalnego zachowania ruchliwego, po którym zwierzęta są gotowe do dalszych testów drapieżników.
- Szybkie fenotypowanie jamy ustnej
Uwaga: Alternatywnie, przy większym doświadczeniu, typ kształtu ust można oznaczyć bez konieczności leczenia znieczulającego za pomocą stereomikroskopu o dużym powiększeniu (150X).- Umieść nicienie na standardowych płytkach NGM z trawnikiem bakteryjnym E. coli OP50 w obszarze widzenia mikroskopu.
- Wykrywaj różnice w wielkości i szerokości ust. Uwaga: Przy tym powiększeniu nie można zaobserwować żadnych struktur przypominających zęby, dlatego identyfikacja kształtu jamy ustnej opiera się wyłącznie na szerokich ustach w porównaniu z wąskimi ustami.
2. Test zgryzu
Uwaga: Testy gryzienia pozwalają na szczegółową analizę zachowań drapieżników.
- Hoduj i utrzymuj kultury nicieni na standardowych płytkach NGM (6 cm) i żywij się trawnikiem bakteryjnym E. coli OP50 19.
- Wykonać płytki testowe, hodując dużą ilość wybranych larw nicieni drapieżnych, takich jak C. elegans lub alternatywnie odpowiednią zdobycz istotną z ekologicznego punktu widzenia. Uwaga: Dorosłe osobniki C. elegans są zbyt duże, aby mogły być odpowiednią zdobyczą, dlatego ważne jest, aby wykorzystać stadium larwalne.
- Utrzymuj C. elegans lub inne potencjalne gatunki ofiar na standardowych płytkach NGM i żywij się trawnikiem bakteryjnym E. coli OP50, dopóki populacja nie zostanie świeżo zagłodzona, co spowoduje obfitość młodych larw L1.
Uwaga: Czas głodu zależy od wielu czynników środowiskowych i eksperymentalnych, w tym liczby nicieni użytych do rozpoczęcia hodowli, ilości dodanego E. coliOP50 i temperatury otoczenia.
- Utrzymuj C. elegans lub inne potencjalne gatunki ofiar na standardowych płytkach NGM i żywij się trawnikiem bakteryjnym E. coli OP50, dopóki populacja nie zostanie świeżo zagłodzona, co spowoduje obfitość młodych larw L1.
- Umyj cztery lub więcej świeżo zagłodzonych płytek zdobyczy M9 i przepuść roztwór robaka przez dwa filtry 20 μm, aby usunąć wszystkie duże zwierzęta i wszelkie pozostałe jaja przed zebraniem do probówki o pojemności 15 ml. W roztworze powinny pozostać tylko małe larwy.
- Aby utworzyć osad larwalny, odwirować przefiltrowaną zdobycz o sile 377 x g przez 1 min.
- Odpipetować 3 μl czystego osadu robaka na 6 cm płytkę NGM bez obecności E. coliOP50 i odczekać co najmniej 30 minut, aż larwy rozprzestrzenią się na tyle, aby wytworzyć płytkę testową.
Uwaga: 3 μl czystego osadu robaka na standardowych płytkach testowych zawiera > 3 000 larw ofiar. To wystarczy, aby wygenerować częsty kontakt między drapieżnikami a ofiarą. - Przebadaj nicienie drapieżne pod kątem wymaganej morfozy jamy ustnej (protokół 1).
- Korzystając ze standardowych technik zbierania robaków i lekkiego mikroskopu stereoskopowego 19, przenieś prawidłowo sklasyfikowane drapieżniki na płytkę testową. Należy uważać, aby przenieść jak najmniej bakterii OP50 na płytkę testową podczas przenoszenia drapieżników, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne. Odczekaj 15 minut, aby robak mógł się zregenerować po stresie związanym z przeniesieniem i sprawdź, czy robaki nie zachowują się ruchomo typu dzikiego, aby upewnić się, że robaki nie zostały uszkodzone w wyniku transferu.
Uwaga: Nie ma potrzeby głodzenia P. pacificus, ponieważ są one bardzo skutecznymi drapieżnikami innych larw nicieni, nawet gdy są dobrze odżywione bakteriami. - Po odzyskaniu zdrowia obserwuj drapieżnika za pomocą lekkiego mikroskopu stereoskopowego przez 10 minut. Za pomocą tego sprzętu obserwuj i charakteryzuj różne zdarzenia żywieniowe, takie jak gryzienie, charakteryzujące się tym, że drapieżnik ogranicza ruch ofiary; zabijanie, w którym wykrywa się przez otwarcie naskórka ofiary; i karmienie, skategoryzowane przez obserwowalne spożycie wnętrzności ofiary (Rysunek 2A, B i Film 1).
- Powtórzyć test, przeprowadzając badania przesiewowe i obserwując co najmniej 10 pojedynczych drapieżnych nicieni w celu zapewnienia dokładności.
3. Badanie zwłok
Uwaga: Testy zwłok umożliwiają szybszą kwantyfikację zachowań drapieżników.
- Hoduj i utrzymuj kultury nicieni na standardowych płytkach NGM i żywij się trawnikiem bakteryjnym E. coli OP50 19. Wygeneruj trzy egzemplarze wspomnianych wcześniej płytek testowych (protokół 2.1 - 2.5).
- Przebadać nicienie drapieżne pod kątem wymaganej morfozy jamy ustnej, jak opisano w protokole 1. Korzystając ze standardowych technik zbierania robaków i lekkiego mikroskopu stereoskopowego, przenieś 5 drapieżnych nicieni z wymaganą przemianą ust na każdą płytkę testową. Pozostaw drapieżniki razem z ofiarą na 2 godziny.
- Po upływie 2 godzin należy przesiać płytkę testową na obecność opróżnionych zwłok (rys. 2B i C). Identyfikuj zwłoki na podstawie braku ruchliwości wraz z oczywistymi wadami morfologicznymi, w tym przeciekającymi wnętrznościami lub brakującymi fragmentami robaków.
4. Analiza ruchu gardła i zębów
- Hoduj i utrzymuj kultury nicieni na standardowych płytkach NGM i żywij się trawnikiem bakteryjnym E. coli OP50 19. Wygeneruj płytki testowe, jak wspomniano wcześniej (protokół 2.1 - 2.5). Jeśli standardowe płytki NGM o średnicy 6 cm nie mieszczą się między obiektywem a stolikiem mikroskopu, należy użyć pokrywki małych szalek Petriego o średnicy 35 mm zawierających 2 ml NGM jako odpowiedniej alternatywy.
- Przebadać nicienie drapieżne pod kątem wymaganej morfozy jamy ustnej, jak opisano w protokole 1. Korzystając ze standardowych technik zbierania robaków i lekkiego mikroskopu stereoskopowego, przenieś pojedynczego prawidłowo sklasyfikowanego drapieżnika na płytkę testową. Odczekaj 15 minut, aby robak mógł się zregenerować po stresie związanym z przeniesieniem.
- Obserwuj zwierzęta drapieżne pod mikroskopem przy 40 - 63x Normaski, za pomocą szybkiej kamery (filmy 2 i 3). Rejestruj pompowanie gardła i ruchy zębów przez 15 sekund, przy częstotliwości 50 Hz u co najmniej 20 zwierząt, aby zapewnić dokładną ocenę ilościową. Odtwarzaj ponownie nagrane filmy z żądaną prędkością, aby zliczyć poszczególne pompy i zdarzenia zębów.
Uwaga: Pompowanie obserwuje się w ciele, znajdującym się w środku gardła, podczas gdy ruch zębów jest wykrywalny w otworze ustnym i obserwuje się go tylko z zęba grzbietowego.
Wyniki
Po pomyślnej identyfikacji odpowiedniego morfotypu otworu gębowego u P. pacificus, można wykryć wyraźne różnice między osobnikami eurystomatous i stenostomatous (Rysunek 3), przy czym jedynie osobniki eurystomatous wykazują zachowania drapieżne. U osobników stenostomatous zachowanie to wydaje się być całkowicie stłumione. Ponadto widoczne są różnice w aktywności zębów i pompowaniu gardłowym osobników eurystomatous podczas żerowania na bakteriach oraz na ofiarach (Rysunek 4 oraz Filmy 2 i 3). Podczas żerowania drapieżnego tempo pompowania jest niższe niż obserwowane podczas żerowania na bakteriach, a ruch zębów występuje w stosunku jeden do jednego z pompowaniem gardłowym. Może to wskazywać na kluczowe mechanizmy regulacyjne modulujące odpowiedź behawioralną na różną dietę.
Rysunek 1. P. pacificus wykazuje dymorfizm jam ustnych, który wpływa na zachowanie podczas żerowania. (A) Forma otworu gębowego typu eurystomatous umożliwia drapieżnictwo i charakteryzuje się szerokim otworem gębowym z dużym, zakrzywionym zębem grzbietowym w kształcie pazura (zaznaczonym kolorem czerwonym) oraz (B) duży, przeciwstawny, hakowaty ząb podbrzuszny (zaznaczony kolorem niebieskim). (C) Forma ust stenostomatyczna pozwala na odżywianie się wyłącznie bakteriami i charakteryzuje się węższym otworem gębowym z krzemienistym zębem grzbietowym (zaznaczonym czerwonym kolorem sztucznym) oraz (D) brak zęba podbrzusznego (*). Obrazy Normaski mają powiększenie 63X, a pasek skali reprezentuje 10 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2. Testy drapieżnictwa. (A) *P. pacificus* gryzie i zabija larwy innych nicieni, takich jak C. elegans. (B) W testach żerowania można za pomocą stereomikroskopu świetlnego obserwować liczbę ugryzień wykonanych przez drapieżniki (*) oraz rejestrować udane zdarzenia związane z zabiciem i zjedzeniem ofiar. Wyraźnie widoczne są również truchła (okręgi). (C) W testach przeżywalności (corpse assays) martwe larwy (strzałki) można łatwo odróżnić od żywych larw. Pasek skali w panelach B i 150 µm w C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3. Wyniki testów kąsania i testów trupich na C. elegans Ofiara. (A) Zachowanie gryzienia występuje wyłącznie u osobników o formie gęby eurystomotycznej i nie jest obserwowane u zwierząt o formie stenostomotycznej. Słupek błędu reprezentuje odchylenie standardowe z 10 powtórzeń. (B) W zgodzie z brakiem widocznego zachowania gryzienia u zwierząt stenostomatycznych, testy z użyciem zwłok wykazują obecność trucheł wyłącznie na płytkach testowych zwierząt eurystomatycznych. Słupek błędu reprezentuje odchylenie standardowe z 5 powtórzeń. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4. Szybkość pompowania u ryb z szerokimi ustami oraz ruch zębów podczas drapieżnego żerowania. Ruch zębów obserwuje się wyłącznie w czasie, gdy zwierzęta o szerokich ustach (eurystomatous) oddają się drapieżnemu żerowaniu. Zjawisko to zbiega się również z redukcją pompowania gardłowego. Słupek błędu reprezentuje odchylenie standardowe z 10 powtórzeń. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Dyskusja
Nicienie zapewniają potężny system do zrozumienia neurobiologii i zachowania , a C. elegans jest jak dotąd podstawowym narzędziem. Jednak wiele gatunków nicieni, w tym P. pacificus , wykazuje zachowania, które są nieobecne lub różnią się złożonością od organizmu modelowego C. elegans , a zatem rodzą fascynujące pytania dotyczące ewolucji i regulacji tych zachowań. Jednym z takich dodatkowych zachowań występujących u wielu innych gatunków nicieni, w tym P. pacificus, jest zdolność do uzupełniania diety bakteryjnej poprzez angażowanie się w drapieżne żerowanie 1, 20. Dlatego opracowaliśmy i opisaliśmy szczegółowy protokół łatwej i szybkiej charakterystyki tych wcześniej nieanalizowanych zachowań drapieżnych u nicieni.
Po pierwsze, przedstawiliśmy metody badań przesiewowych pod kątem zmian w aparacie żywieniowym w jamie ustnej nicieni. Identyfikacja właściwego typu jamy ustnej jest niezbędnym pierwszym krokiem do udanych testów drapieżnictwa, ponieważ, przynajmniej w obrębie rodzaju Pristionchus , tylko zwierzęta eurystomatyczne są zdolne do żerowania drapieżników. Najlepiej jest identyfikować morfy jamy ustnej za pomocą protokołu "szybkiego fenotypowania jamy ustnej" opisanego w protokole 1.2, ponieważ metoda ta jest znacznie mniej inwazyjna, a zatem jest mniej prawdopodobne, że zachowania drapieżne mogą być zaburzone. Zaleca się jednak, aby najpierw zapoznać się z różnymi budynkami jamy ustnej poprzez identyfikację ze znieczulonymi zwierzętami na podkładkach agarowych (protokół 1.1).
Po zidentyfikowaniu pożądanego kształtu jamy ustnej opisaliśmy dwa testy do ilościowego określania żerowania drapieżników. Są to szybki, wysokoprzepustowy "test zwłok" (protokół 3) i bardziej czasochłonna, ale bardziej dogłębna analiza behawioralna za pomocą "testu ugryzienia" (protokół 2). Oba te protokoły są bardzo elastyczne, co pozwala na kilka modyfikacji w celu optymalizacji testów w zależności od wymagań eksperymentalnych. W przypadku testów ugryzień z użyciem drapieżników P. pacificus na zdobyczy C. elegans , obserwacje interakcji behawioralnych drapieżników w oknie czasowym 10 minut były wystarczające do ilościowego określenia znacznej liczby ugryzień wraz z innymi zdarzeniami żywieniowymi. W przypadku "testów zwłok", ponownie wykorzystujących drapieżniki P. pacificus na zdobyczy C. elegans , 5 drapieżników przez 2 godziny uzyskało łatwą do oszacowania i spójną liczbę zwłok, co pozwoliło na szybką analizę behawioralną. Należy jednak zauważyć, że różne gatunki drapieżnych nicieni poruszają się z różnymi prędkościami, jedzą w różnym tempie i ogólnie wykazują dużą różnorodność w innych zachowaniach 1. Ponadto różne gatunki ofiar mogą być również spożywane w różnym tempie z podobnych powodów. Dlatego zaleca się optymalizację testów w oparciu o gatunki nicieni badanych zarówno jako drapieżniki, jak i ofiary, a także pod kątem wszelkich różnic w warunkach środowiskowych. Zarówno podczas testów "ugryzienia", jak i "zwłok" bardzo ważne jest, aby zarówno ofiara, jak i drapieżniki były zdrowe, ponieważ zestresowane lub zranione drapieżniki nie będą skutecznie zabijać. Ponadto świeże płytki testowe są niezbędne, ponieważ starsze płytki mogą wyschnąć, co niekorzystnie wpływa na zdrowie nicieni, prowadząc do błędnych testów. Oczekuje się również, że przyszłe iteracje tych drapieżnych testów będą w stanie wykorzystać najnowsze postępy technologiczne w celu zautomatyzowania dużej części analizy, tak jak to zostało osiągnięte w celu zbadania wielu zachowań zaobserwowanych u C. elegans21, 22. Obecnie problemy mogą pojawić się u nicieni takich jak P. pacificus , ponieważ wydają się one znacznie bardziej wrażliwe na kontakt, co sprawia, że izolacja i unieruchomienie w komorach mikroprzepływowych prawdopodobnie zniesie żerowanie drapieżników. Przezwyciężenie tego może okazać się trudne, ale ułatwiłoby badanie przesiewowe poszczególnych nicieni pod kątem subtelniejszych zachowań drapieżnych.
Na koniec przedstawiliśmy również metody badania samego aparatu do karmienia nicieni, ułatwiając porównania między sposobami żywienia drapieżników i bakterii poprzez ilościowe określenie kinetyki pompowania zębów i gardła za pomocą szybkiej kamery (protokół 4). Kwantyfikacja szybkości pompowania gardła u C. elegans była wykorzystywana do monitorowania karmienia przez wiele lat 23, jednak C. elegans nie ma żadnej formy ząbka gębowego, a także nie ma zachowań drapieżnych. Łącząc kwantyfikację pompowania gardła z aktywnością zębów, można również zaobserwować każde unerwienie zębów specyficzne dla drapieżnictwa. Ze względu na powiększenie wymagane do obserwacji ruchu zębów, zwierzęta często wychodzą poza płaszczyznę ogniskową, dlatego zwykle możliwa jest obserwacja zęba tylko przez krótki czas. Dodatkowo, w przeciwieństwie do C. elegans, gardło P. pacificus nie pompuje w sposób ciągły, a raczej angażuje się w okresy pompowania i żerowania. Dlatego, aby określić dokładne tempo pompowania gardła podczas karmienia, ważne jest, aby rejestrować 15 sekund ciągłego karmienia.
Przedstawione tutaj metody stanowią zatem pierwsze ramy do badania zachowań drapieżnych w systemach nicieni. Co więcej, mogą być również przystosowane do wykorzystania w badaniu innych interakcji w ekosystemie nicieni, w tym wpływu organizmów o dodatkowym znaczeniu ekologicznym na drapieżnictwo, w tym mikroorganizmów, grzybów i roztoczy. W ten sposób dostarczają środków do analizy, w jaki sposób te drapieżne zachowania są regulowane, jak mogły ewoluować, a także ich znaczenie ekologiczne.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak interesów finansowych lub konkurencyjnych.
Podziękowania
Dziękujemy Dr. Danielowi Bumbargerowi za zdjęcie zachowania drapieżnictwa. Praca ta została sfinansowana przez Towarzystwo Maxa-Plancka.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Filtry siatkowe nylonowe (20 µ m) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Służy do filtrowania robaków, które po prostu pozostawiają larwy do wykorzystania jako zdobycz. |
| PP Lejek do filtra (54 mm) | Duran | 292215003 | Służy do filtrowania robaków, które po prostu pozostawiają larwy do wykorzystania jako zdobycz. |
| Mała szalka Petriego (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | Do obrazowania na kamerze szybkoobrotowej |
| Zeiss SteREO Discovery V12 | Do identyfikacji formy ust | ||
| Axio-Imager A1 | Do identyfikacji formy ust | ||
| Szkiełka | szklane Roth | H869 | |
| Szkiełka nakrywkowe | Roth | 657 | |
| Motion Scope M3 Kamera szybkoobrotowa | IDT | Szybka kamera | |
| Zoom wideo 44 ENG 1/2" 0,5X do 2,4X | Zeis | 452984-0000-000 | Szybki zoom kamery |
| Pożywka do wzrostu nicieni (NGM) składniki: | |||
| Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
| Chlorek sodu (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
| Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
| Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
| Cholesterol z lanoliny | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
| Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
| Diwodorofosforan potasu (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
| cm szalka Petriego | Greiner Bio-One | 628102 | |
| 3,5 cm szalka Petriego | Greiner Bio-One | 627102 | |
| M9 składniki: | |||
| Diwodorofosforan potasu (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
| Wodorofosforan sodu siedmiowodny (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
| Chlorek sodu (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bibliografia
- Wilecki, M., Lightfoot, J. W., Susoy, V., Sommer, R. J. Predatory feeding behaviour in Pristionchus nematodes is dependent on phenotypic plasticity and induced by serotonin. J Exp Biol. 218 (Pt 9), 1306-1313 (2015).
- Ragsdale, E. J., Muller, M. R., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. A Developmental Switch Coupled to the Evolution of Plasticity Acts through a Sulfatase. Cell. 155 (4), 922-933 (2013).
- Goodman, M. B. Mechanosensation. WormBook. , 1-14 (2006).
- Rankin, C. H. Nematode behavior: the taste of success, the smell of danger! Curr Biol. 16 (3), R89-R91 (2006).
- Beverly, M., Anbil, S., Sengupta, P. Degeneracy and neuromodulation among thermosensory neurons contribute to robust thermosensory behaviors in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 31 (32), 11718-11727 (2011).
- Kimata, T., Sasakura, H., Ohnishi, N., Nishio, N., Mori, I. Thermotaxis of C. elegans as a model for temperature perception, neural information processing and neural plasticity. Worm. 1 (1), 31-41 (2012).
- Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. Elife. 4, (2015).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Sherlekar, A. L., Lints, R. Nematode Tango Milonguero - the C. elegans male's search for the hermaphrodite vulva. Semin Cell Dev Biol. 33, 34-41 (2014).
- Sasakura, H., Mori, I. Behavioral plasticity, learning, and memory in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 23 (1), 92-99 (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
- Bumbarger, D. J., Riebesell, M., Rodelsperger, C., Sommer, R. J. System-wide Rewiring Underlies Behavioral Differences in Predatory and Bacterial-Feeding Nematodes. Cell. 152 (1-2), 109-119 (2013).
- Dieterich, C., et al. The Pristionchus pacificus genome provides a unique perspective on nematode lifestyle and parasitism. Nature Genetics. 40 (10), 1193-1198 (2008).
- Schlager, B., Wang, X. Y., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular Cloning of a Dominant Roller Mutant and Establishment of DNA-Mediated Transformation in the Nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47 (5), 300-304 (2009).
- Witte, H., et al. Gene inactivation using the CRISPR/Cas9 system in the nematode Pristionchus pacificus. Dev Genes Evol. 225 (1), 55-62 (2015).
- Lo, T. W., et al. Precise and Heritable Genome Editing in Evolutionarily Diverse Nematodes Using TALENs and CRISPR/Cas9 to Engineer Insertions and Deletions. Genetics. 195 (2), 331-348 (2013).
- Sommer, R. J., McGaughran, A. The nematode Pristionchus pacificus as a model system for integrative studies in evolutionary biology. Molecular Ecology. 22 (9), 2380-2393 (2013).
- Herrmann, M., et al. The nematode Pristionchus pacificus (Nematoda : Diplogastridae) is associated with the oriental beetle Exomala orientalis (Coleoptera:Scarabaeidae) in Japan. Zoological Science. 24 (9), 883-889 (2007).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
- Serobyan, V., Ragsdale, E. J., Sommer, R. J. Adaptive value of a predatory mouth-form in a dimorphic nematode. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 281, 20141334(2014).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Yeminin, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nat Methods. 9 (10), 877-879 (2013).
- Raizen, D. M., Lee, R. Y. N., Avery, L. Interacting Genes Required for Pharyngeal Excitation by Motor Neuron MC in Caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (4), 1365-1382 (1995).
Przedruki i uprawnienia
