Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Podsumowanie

Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.

Streszczenie

Poprzez połączenie mocy Affinity Labeling i Immunoprecipitation (AFLIP), zaimplementowano technikę wykrywania receptorów o niskiej liczebności w zarodkach danio pręgowanego. Technika ta wykorzystuje selektywność i czułość wynikającą z znakowania powinowactwa danego receptora przez jego ligand ze swoistością immunoprecypitacji. Użyliśmy AFLIP do wykrycia receptora TGF-β typu III (TGFBR3), znanego również jako betaglikan, podczas wczesnego rozwoju danio pręgowanego. Projekt AFLIP odegrał zasadniczą rolę w walidacji skuteczności fenotypu morfanta TGFBR3 danio pręgowanego. W pierwszym etapie przygotowywane są ekstrakty białkowe z zarodków, które są wykorzystywane do wytworzenia ¹²⁵kompleksów I-TGF-β2-TGFBR3, które są oczyszczane przez immunoprecypitację. Później kompleksy te są kuriocyjnie sieciowane i ujawniane za pomocą separacji SDS-PAGE i detekcji autoradiograficznej. Technika ta wymaga dostępności znakowanego liganda dla wykrywanego receptora i specyficznego przeciwciała przeciwko mu, a także musi być łatwo przystosowana do identyfikacji dowolnego czynnika wzrostu lub receptora cytokinowego, który spełnia te wymagania.

Wprowadzenie

Specyficzne wykrywanie białek ulegających ekspresji podczas rozwoju embrionalnego jest wymagane do walidacji profili ekspresji uzyskanych przez pomiar ich pokrewnych mRNA za pomocą RT-PCR lub hybrydyzacji in situ (ISH). Zwykle osiąga się to za pomocą western blot ekstraktów z zarodków, a następnie wykrywania za pomocą specyficznych przeciwciał. Jednak takie podejście jest trudne do zastosowania w przypadku białek, które występują w bardzo niskiej obfitości lub które mają właściwości utrudniające ich ilościowy transfer podczas blottingu. Przykładem tych trudności jest betaglikan, znany również jako receptor transformującego czynnika wzrostu typu β III (TGF-β) (TGFBR3). TGFBR3 jest proteoglikanem błonowym w niepełnym wymiarze godzin, który wiąże TGF-β poprzez swoje białko^{rdzeniowe 1}, ze znacznie wyższym powinowactwem do izoformy TGF-β2, co odróżnia go od każdego innego białka wiążącego TGF-β². TGFBR3 w danio pręgowanym ulega ekspresji od 8 hpf wzwyż, osiągając maksimum o 72 hpf, co wykryto za pomocą RT-PCR jego mRNA³.

Jednakże, pomimo dostępności bardzo specyficznego przeciwciała³, każda próba wykrycia jego translowanego produktu przez western blot okazała się nieskuteczna. Sądząc, że proteoglikańska natura TGFBR3, a także przypuszczalnie niska obfitość mogą być odpowiedzialne za tę awarię, opracowano metodę wykrywania AFLIP, która wykorzystuje wysokie powinowactwo TGFBR3 do TGF-β2. W tej metodzie pozwala się na swoiste związanie ekstraktu białkowego z połączonych zarodków ¹²⁵TGF-β2 znakowanego I, a kompleksy receptor-ligand są oczyszczane przez immunoprecypitację i sieciowane przed rozdzieleniem przez SDS-PAGE. Wzorce migracji zaobserwowane przez autoradiografię żeli ujawniły obecność i charakter znakowanych gatunków receptorów. Podejście to łączy specyficzność liganda znakowania powinowactwem z immunoprecypitacją przez specyficzne przeciwciała, zwiększając zakres wykrywania, unikając nieefektywnego blottingu transferowego TGFBR3. Ze względu na swoje nieodłączne właściwości, test AFLIP nie jest testem ilościowym, ale może być stosowany do pewnej oceny względnych różnic eksperymentalnych w analizowanym receptorze.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi i Użytkowania Autonomicznego Narodowego Uniwersytetu Meksyku (UNAM), pod numerem protokołu CICUAL: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologìa Celular, Universidad Nacional Autònoma de México").

1. Przygotowanie ekstraktu z białka zarodka

1. Zbierz od 100 do 200 zarodków dla każdego schorzenia, aby porównać je (morfanty i typ dziki) na pożądanym etapie, na przykład 72 godziny po zapłodnieniu (hpf).
2. Umieść zarodki na szalkach Petriego zawierających wodę dla ryb (patrz Tabela 1) i ręcznie odstrunij zarodki za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Na tym etapie należy unikać stosowania pronazy (lub jakiejkolwiek innej proteazy w całym protokole), ponieważ może ona trawić docelowy receptor.
3. Umieścić zarodki w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i dwukrotnie przemyć zarodki 1x roztworem buforu fosforanowego (PBS) (patrz Tabela 1).
4. Dodać 500 μl buforu deyolk (patrz tabela 1).
5. Uwolnij większość żółtka, delikatnie pipetując w górę i w dół (około 30 - 40 razy) zarodki w roztworze. W przypadku zarodków o mocy 72 hpf i 48 hpf należy użyć odpowiednio niebieskich i żółtych końcówek pipet. Żółte końcówki mogą wymagać lekkiego przycięcia, aby uniknąć zniszczenia zarodków. Pomyślne uwalnianie żółtka można sprawdzić, obserwując zarodki pod mikroskopem.
6. Zebrać zarodki przez odwirowanie przy 600 x g przez 15 sekund.
7. Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić za pomocą pipety.
8. Przepłukać zarodki dwukrotnie buforem do przemywania o pojemności 500 μl (patrz Tabela 1), delikatnie wirując z najniższą prędkością.
9. Zebrać zarodki przez odwirowanie przy 600 x g przez 15 sekund.
10. Zaczynając od tego miejsca, kontynuuj procedurę w temperaturze 4 °C.
11. Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić za pomocą pipety.
12. Zawiesić zarodki w 350 μl buforu do lizy (patrz Tabela 1) i homogenizować za pomocą plastikowego tłuczka.
13. Inkubować zlizowane zarodki przez 30 minut z mieszaniem na bujaczku probówki w temperaturze 4 °C.
14. Odwirować lizowane zarodki w temperaturze 11 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.
15. Przenieść oczyszczony supernatant za pomocą pipety do świeżej probówki.
16. Oznaczyć białko całkowite za pomocą testu białkowego Bradforda⁴ lub innej odpowiedniej procedury. Jeżeli stosuje się test Bradforda, należy wykonać krzywą kalibracyjną w obecności równoważnych stężeń detergentów obecnych w buforze do lizy, ponieważ powodują one niedoszacowanie wzorca białka⁴.

2. Wykrywanie endogennego białka receptorowego

1. Znakowanie powinowactwa i immunoprecypitacja (wszystkie te kroki w temperaturze 4 ^oC)
   1. Umieścić 400 - 500 μg całkowitego białka zarodka w probówce do mikrofug o pojemności 1,5 ml i rozcieńczyć do 1 μg/μl buforem 1 (patrz Tabela 1).
      Uwaga: Aby uzyskać 500 μg całkowitego białka zarodka, należy wstępnie przetworzyć około 100 - 200 zarodków. 72 zarodki HPF rutynowo dają ~ 5 μg całkowitego białka zarodkowego, co jest wystarczające do wykrycia betaglikanu.
   2. Dodać wystarczającą objętość znakowanego materiału TGF-β2, aby osiągnąć końcowe stężenie 150 pM i inkubować z mieszaniem na bujaku probówki przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. TGF-β2 musi być znakowany przed rozpoczęciem AFLIP za pomocą ¹²⁵I metodą chloraminy T, opisaną przez Cheifetza i wsp.⁵.
      UWAGA: Użyj ekranowania, aby zminimalizować narażenie podczas obchodzenia się z ligandem ^{oznaczonym jako 125}I.
   3. Dodać wystarczającą objętość nierozcieńczonego przeciwciała przeciwko receptorowi będącemu przedmiotem zainteresowania, aby osiągnąć rozcieńczenie 1:100 i kontynuować inkubację przez kolejne 2 godziny w temperaturze 4 °C (inkubacja może wynosić O/N). Jest to optymalne rozcieńczenie surowicy antysurowicy # 31, użyte w tym badaniu i opisane w innym miejscu³, ale w zależności od jakości przeciwciała, optymalne może być większe lub mniejsze rozcieńczenie.
   4. Dodać 50 μl odpowiednich kulek wiążących immunoglobuliny (np. białka G-Sepharose, które zostało wcześniej zrównoważone w TNTE i ponownie zawieszone w stosunku 1:5 swojej pierwotnej objętości w TNTE) i inkubować przez 50 minut z mieszaniem na bujaku probówki w temperaturze 4 °C.
   5. Odzyskaj kulki przez mikrowirowanie przy 11 000 x g przez 20 sekund.
   6. Wyrzucić supernatant do odpowiedniego radioaktywnego pojemnika na śmieci.
   7. Przemyć kulki IP trzykrotnie 1 ml buforu do płukania IP (patrz Tabela 1), poprzez wirowanie i mikrowirowanie przy 11 000 x g przez 20 sekund za każdym razem.
   8. Zawiesić kulki IP w 250 μl bufora do płukania IP.
   9. Dodać 1,5 μl suberanu disuccinimidylu (DSS, rozpuszczonego w DMSO w stężeniu 10 mg/ml). Na tym etapie należy przygotować roztwór DSS tuż przed jego użyciem.
   10. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C z mieszaniem.
   11. W celu wygaszenia reakcji sieciowania należy dodać 500 μl buforu do płukania IP, uzupełnionego wystarczającą ilością Tris-Cl pH 7,4, aby osiągnąć 25 mM Tris-Cl. Wolne grupy aminowe w Tris wychwytują nieprzereagowany DSS.
   12. Wirować przy 11 000 x g przez 20 sekund w celu zebrania kulek IP i odrzucenia supernatantu.
   13. Zawiesić kulki IP w 30 μl redukującego buforu Laemmli.
   14. Próbki gotować przez 5 minut w temperaturze 94 °C.
   15. Opcjonalnie można przeanalizować próbki w liczniku gamma przy użyciu protokołu producenta.
2. Analiza próbki
   1. Poddaj próbki denaturacji SDS-PAGE. Użyć poliakrylamidu w ilości procentowej odpowiedniej do masy receptora i uruchomić żel zgodnie ze standardową procedurą.
   2. Zanurzyć żel w roztworze utrwalającym (patrz Tabela 1) na 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Myć żel wodą destylowaną przez 15 min.
   4. Umieść żel we wcześniej uwodnionej bibule filtracyjnej i przykryj folią saran.
   5. Suszyć żel w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.
   6. Naświetlić żel na białym ekranie luminowizora w RT O/N.
   7. Zeskanuj odsłonięty ekran za pomocą luminowizora, korzystając z protokołu producenta.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny wynik uzyskany za pomocą AFLIP. Sygnały na torze 1 pochodzą z ¹²⁵I-ligandów kowalencyjnie połączonych z białkiem rdzeniowym betaglikanu danio pręgowanego (rdzeń BG, poniżej markera 150 kDa) lub rdzeniem BG, który został przetworzony do postaci proteoglikanu przez przyłączenie glikozaminoglikanów (GAG, rozmaz w zakresie od 170 kDa do górnej części żelu). Ten wzorzec migracji, ostre białko rdzeniowe plus rozmazany proteoglika...

Dyskusja

Zastosowanie Western blot ze specyficznym przeciwciałem przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania jest cennym narzędziem do badania jego ekspresji⁷ podczas embriogenezy. Jednak immunoblotting białek o wysokim stopniu glikozylacji nie był zbyt skuteczny ze względu na ich nieefektywne przenoszenie i słabe wiązanie z błonami nitrocelulozowymi lub PVDF^8,9.

Proteoglikany są dobrym przykładem tej wady, ze względu na ich kowalencyjnie przyłączone łańcuchy glikozamino...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Suberat disuccinimidylu (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Białko G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Suszarka żelowa Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	63-0055-78
Cobra II Auto gamma	Packard
	Dynamika molekularna	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Krystaliczne morze morskie mix	Przedsiębiorstwa morskie Międzynarodowe	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix