Wdrożenie systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej w celu zbadania wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza ssaków

Summary

Tutaj opisana jest metoda wykorzystująca system infekcji oparty na wkładce membranowej do badania wpływu Streptolizyny S, wydzielanej toksyny wytwarzanej przez Streptococcus grupy A, na keratynocyty. System ten może być z łatwością zastosowany do badania innych wydzielanych białek bakteryjnych na różnych typach komórek gospodarza podczas infekcji.

Abstract

Wiele patogenów bakteryjnych wydziela silne toksyny, które pomagają w niszczeniu tkanki gospodarza, inicjowaniu zmian sygnalizacyjnych w komórkach gospodarza lub manipulowaniu reakcjami układu odpornościowego w trakcie infekcji. Chociaż opracowano metody skutecznego oczyszczania i wytwarzania wielu z tych ważnych czynników wirulencji, nadal istnieje wiele toksyn bakteryjnych, których unikalna struktura lub rozległe modyfikacje potranslacyjne utrudniają ich oczyszczanie i badanie w systemach in vitro. Co więcej, nawet jeśli można uzyskać czystą toksynę, istnieje wiele wyzwań związanych z badaniem konkretnych skutków toksyny w odpowiednich warunkach fizjologicznych. Większość modeli hodowli komórkowych in vitro zaprojektowanych do oceny wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza obejmuje inkubację komórek gospodarza z jednorazową dawką toksyny. Takie metody słabo przybliżają to, czego komórki gospodarza faktycznie doświadczają podczas infekcji, gdzie toksyna jest stale wytwarzana przez komórki bakteryjne i pozwala się jej stopniowo gromadzić w trakcie infekcji. Protokół ten opisuje projekt przepuszczalnego systemu infekcji bakteryjnych opartego na wkładce membranowej w celu zbadania wpływu Streptolizyny S, silnej toksyny wytwarzanej przez paciorkowce grupy A, na ludzkie keratynocyty nabłonkowe. System ten bardziej naśladuje naturalne środowisko fizjologiczne podczas infekcji niż metody, w których czysta toksyna lub supernatanty bakteryjne są bezpośrednio stosowane do komórek gospodarza. Co ważne, metoda ta eliminuje również stronniczość reakcji gospodarza, która wynika z bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. System ten został wykorzystany do skutecznej oceny wpływu streptolizyny S (SLS) na integralność błony gospodarza, żywotność komórkową i odpowiedzi sygnalizacji komórkowej. Technika ta może być łatwo zastosowana do badania innych wydzielanych czynników wirulencji na różnych typach komórek gospodarza ssaków w celu zbadania specyficznej roli wydzielanego czynnika bakteryjnego w przebiegu infekcji.

Introduction

Zrozumienie funkcji czynników wirulencji bakteryjnej w kontekście infekcji komórek gospodarza jest głównym celem badań nad patogenezą bakterii. Wiele patogenów bakteryjnych aktywnie wydziela toksyny i inne rozpuszczalne czynniki, aby pomóc w niszczeniu tkanki gospodarza, inicjować zmiany sygnałowe w komórkach gospodarza lub manipulować odpowiedziami układu odpornościowego w trakcie infekcji ^1-10. Chociaż opracowano metody skutecznego oczyszczania i wytwarzania wielu z tych ważnych czynników wirulencji do badań, niektóre produkty bakteryjne mają unikalną strukturę lub rozległe modyfikacje potranslacyjne, które czynią je opornymi kandydatami do metod oczyszczania, a zatem nie mogą być badane w izolacji przy użyciu systemów in vitro. Na przykład Streptococcus grupy A, patogen bakteryjny odpowiedzialny za niezliczone infekcje, od zapalenia gardła po martwicze zapalenie powięzi i zespół wstrząsu toksycznego, wytwarza wydzielaną toksynę bakteryjną znaną jako Streptolysin S (SLS)^11-17. Ten rybosomalny peptyd jest kodowany przez klaster genu związanego ze streptolizyną S (sag), a dojrzały produkt szacuje się na 2,7 kDa w rozmiarze^14-17. Protooksyna, kodowana przez sagA, jest modyfikowana potranslacyjnie przez kilka enzymów (SagB, SagC i SagD) w celu wytworzenia dojrzałej, funkcjonalnej formy^15-17. Złożoność tych potranslacyjnych modyfikacji w połączeniu z niezwykłą sekwencją aminokwasową toksyny sprawiły, że toksyna stała się niekompatybilna ze wszystkimi próbami oczyszczenia i wyjaśnienia struktury, które próbowano do tej pory^{podjąć 15,17}. Wyzwania te skomplikowały wysiłki zmierzające do określenia specyficznej roli tej toksyny w patogenezie gospodarza.

W przypadkach, gdy przygotowanie oczyszczonych toksyn lub innych wydzielanych czynników jest albo skomplikowane, albo nie jest możliwe, mechanizmy wyjaśniające funkcję tych produktów były tradycyjnie badane poprzez przygotowanie przefiltrowanych supernatantów bakteryjnych, które są następnie stosowane do komórek gospodarza^18-20. Istnieje kilka wyzwań związanych z tą techniką. Po pierwsze, wiele z tych wydzielanych czynników, w tym SLS, nie utrzymuje maksymalnej lub stałej aktywności, gdy jest przechowywanych i stosowanych w komórkach gospodarza w późniejszym czasie. Dodatkowo, gdy supernatanty są zbierane w jednym punkcie czasowym, a następnie nakładane na komórki gospodarza, trudno jest określić znaczenie fizjologiczne i wyciągnąć bezpośrednie wnioski na temat naturalnego procesu infekcji, w którym czynniki wydzielane mogą gromadzić się w trakcie infekcji do fizjologicznie odpowiedniego stężenia. To drugie wyzwanie dotyczy nie tylko stosowania supernatantów bakteryjnych, ale także stosowania oczyszczonych toksyn w badaniach na komórkach gospodarza ^1-3,8. Aby rozwiązać te problemy, opracowano system infekcji oparty na przepuszczalnej błonie komórkowej, który ocenia wpływ SLS na komórki gospodarza w sposób, który utrzymuje optymalną aktywność toksyn, a także eliminuje zmienną bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. W tym systemie ludzkie komórki nabłonkowe są hodowane w monowarstwie w dolnej komorze studni dwukomorowej, a bakterie są wprowadzane do górnej komory tej samej studzienki. Porowata membrana (pory 0,4 μm) oddziela górną i dolną komorę, umożliwiając wymianę wydzielanych czynników między dwiema komorami, ale zapobiegając przedostawaniu się bakterii. System ten pozwolił na skuteczną ocenę odpowiedzi gospodarza, które są spowodowane wyłącznie długotrwałym wydzielaniem składników bakteryjnych, przy jednoczesnym wyeliminowaniu wszelkich reakcji, które mogą wystąpić w wyniku bezpośredniego kontaktu podczas infekcji paciorkowcowej grupy A. Chociaż inne wydzielane czynniki bakteryjne oprócz SLS mogą również przechodzić przez porowatą błonę, zastosowanie izogenicznego panelu mutantów, w tym typu dzikiego (WT), nokautu SLS (ΔsagA) i szczepu uzupełnionego sagA (ΔsagA+sagA) pozwala na precyzyjną ocenę odpowiedzi gospodarza, które są ściśle zależne od SLS²¹.

Chociaż podobne systemy przepuszczalnych wkładów membranowych zostały wykorzystane do badania wydzielanych czynników związanych z infekcjami wirusowymi, biologią nowotworów i migracją komórek odpornościowych ^22-26, niewiele badań dotyczących interakcji bakterii z komórkami gospodarza wykorzystywało to podejście^6,27,28. Nawet badania, w których wykorzystano takie systemy do zbadania interakcji między bakteriami a komórkami gospodarza, koncentrowały się przede wszystkim na migracji komórek zapalnych lub bakterii przez monowarstwę nabłonka lub śródbłonka pokrytą przepuszczalną wkładką membranową. Opisany w niniejszym dokumencie system infekcji oparty na przepuszczalnej wkładce błonowej jest prostą i skuteczną metodą, która opiera się na oddzieleniu bakterii i komórek gospodarza przez porowatą błonę w celu oceny wpływu wydzielanej toksyny, SLS, na integralność błony gospodarza, żywotność komórkową, transdukcję sygnału komórkowego i wydzielane czynniki komórek gospodarza. Technikę tę można zaadaptować do badania innych wydzielanych czynników wirulencji na różnych typach komórek gospodarza ssaków w celu zbadania roli określonego czynnika bakteryjnego w przebiegu infekcji.

Protocol

1. Kultura bakteryjna

1. Generowanie izogenicznych zmutowanych szczepów do wykorzystania w badaniu specyficznego czynnika wydzielanego będącego przedmiotem zainteresowania²¹.
   Uwaga: Szczepy GASM1T1 5448 wykorzystane w tych eksperymentach obejmowały WT GAS', mutanta z niedoborem SLSu kota sagAΔ (w skrócie w tekście jako ΔsagA) i szczep uzupełniony sagA (w skrócie w tekście jako ΔsagA+sagA)²¹.
2. Przygotuj przez noc płynne kultury interesujących nas szczepów bakterii. Hoduj szczepy GAS M1T1 5448 w -10 ml bulionu Todda-Hewitta w temperaturze 37 °C przez 16-20 godzin przed zakażeniem komórek ludzkich.
3. Odwirować nocne kultury bakterii (2 400 rcf przez 10 min) i ponownie zawiesić w świeżej pożywce bakteryjnej.
   Uwaga: Ponowne zawieszenie w tej samej objętości, w której hodowano kultury nocne (5-10 ml) na ogół daje pożądaną początkową gęstość optyczną.
4. Normalizować kultury bakteryjne do równych stężeń początkowych poprzez rozcieńczanie ponownie zawieszonych kultur w dodatkowym pożywce bakteryjnej, aż do uzyskania tej samej gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₀₀) dla wszystkich szczepów, które mają być badane (dla wygody zaleca się OD₆₀₀ około 1,0).
   Uwaga: W tych badaniach kultury bakteryjne w fazie stacjonarnej wykorzystano do zakażenia komórek gospodarza natychmiast po normalizacji. Ponieważ jednak niektóre szczepy bakterii wychodzą z fazy stacjonarnej niesynchronicznie, bardziej odpowiednie może być rozpoczęcie infekcji gospodarza od kultur w fazie logarytmicznej, jeśli okaże się, że ma to miejsce w przypadku szczepów będących przedmiotem zainteresowania.
5. Przed dalszą analizą należy wykonać test zliczania kolonii w celu określenia jednostek tworzących kolonie (CFU) na mililitr obecnych w kulturach wyjściowych, aby można było określić liczbę infekcji (MOI) lub stosunek bakterii na komórkę gospodarza.
   1. Przygotować 1 ml seryjnych rozcieńczeń kultur bakteryjnych, które zostały znormalizowane do pożądanej gęstości optycznej w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej (PBS) lub odpowiedniej pożywce bakteryjnej (w tych badaniach użyto bulionu Todda-Hewitta). Przygotuj rozcieńczenia w zakresie od ^10-1 do ^10-6, aby wytworzyć co najmniej jeden zestaw płytek agarowych z policzalnymi koloniami (30-300 kolonii). Wykonać wszystkie rozcieńczenia w trzech powtórzeniach.
   2. Przenieść 100 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na płytkę agarową zawierającą pożywkę odpowiednią dla analizowanych gatunków bakterii.
      Uwaga: W tych badaniach użyto agaru Todda-Hewitta.
   3. Użyj szklanego lub plastikowego rozsiewacza bakteryjnego, aby równomiernie rozprowadzić 100 μl porcji na całej powierzchni płytki agarowej i kontynuuj rozprowadzanie, aż płyn zostanie wchłonięty przez agar. Wykonuj pod ogniem przy użyciu sterylnej techniki.
   4. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C przez noc lub do momentu pojawienia się policzalnych kolonii.
   5. Policz kolonie, które rosną na każdej płytce i oblicz jtk/ml w oryginalnej kulturze według następującego wzoru: liczba kolonii x odwrotność szeregowego rozcieńczenia / objętość kultury podana w mililitrach.
      np. (200 kolonii x 1/^10-5 rozcieńczenia) / 0,1 ml w półmisku = 2,0 x 10⁸ jtk/ml

2. Hodowla komórek gospodarza

1. Uzyskać odpowiednią linię komórek gospodarza do żądanych analiz.
   Uwaga: Do badań wykorzystano ludzkie keratynocyty^{nabłonkowe HaCaT 29}, rodzaj daru od V. Nizeta.
   1. Utrzymuj komórki HaCaT w 100-milimetrowych szalkach hodowlanych w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

3. Zakażenie komórek gospodarza za pomocą systemu wkładek z przepuszczalną błoną

1. Umieść komórki w odpowiednich naczyniach do hodowli tkankowej i pozwól im rosnąć, aż osiągną 90% zlewności.
   Uwaga: Komórki HaCaT użyte w tych badaniach zazwyczaj osiągają konfluencję w ciągu 2-3 dni po posiewaniu.
   1. Do zbierania lizatu (np. analiza sygnalizacji i oznaczanie trifosforanu adenozyny (ATP)) umieść komórki HaCaT w 6 dołkach przy gęstości wysiewu około 3 x 10⁵ komórek/dołek.
   2. Do eksperymentów obrazowania immunofluorescencyjnego, płytki komórkowe na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych w 6 dołkach o gęstości wysiewu około 3 x 10⁵ komórek / dołek.
   3. W przypadku testów przepuszczalności błony homodimeru etydyny i uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) umieść komórki HaCaT w 24 dołkach przy gęstości wysiewu około 5 x 10⁴ komórek / studzienkę.
2. Bezpośrednio przed zabiegiem przemyć komórki 1x sterylnym PBS.
3. Nałóż świeżą pożywkę wzrostową na komórki. W opisanych tutaj warunkach należy zastosować 2 ml pożywki na dołek w przypadku płytek 6-dołkowych lub 0,5 ml pożywki na dołek w przypadku płytek 24-dołkowych. Jeśli testowane są terapie farmakologiczne, wymieszaj je ze świeżą pożywką i zastosuj na tym etapie.
   Uwaga: Niektóre testy mogą wymagać alternatywnych pożywek. Na przykład, ponieważ czerwień fenolowa i wysokie stężenia w surowicy zakłócają test uwalniania LDH, do tych eksperymentów wykorzystano DMEM wolny od czerwieni fenolowej uzupełniony 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (w / v), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu.
4. Po nałożeniu świeżej pożywki ostrożnie umieścić sterylną wkładkę membranową o przepuszczalności 0,4 μm w każdym dołku. Wykonaj ten krok w okapie z przepływem laminarnym i użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść przepuszczalną wkładkę membranową do każdej studzienki.
5. Zastosuj świeżą pożywkę do hodowli komórkowych do górnej komory każdej studzienki zgodnie z instrukcjami producenta. W opisanych tutaj warunkach należy zastosować 1 ml pożywki na dołek dla płytek 6-dołkowych lub 0,1 ml pożywki na basenik dla płytek 24-dołkowych.
6. Nałożyć odpowiednią objętość znormalizowanych kultur bakteryjnych (patrz sekcja 1) do górnej komory systemu wkładów membranowych przepuszczalnych. Stosować pożywkę bakteryjną do niezakażonych zabiegów kontrolnych. Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, dodaj 25 μl znormalizowanych kultur na komorę dla płytek 24-dołkowych i dodaj 100 μl kultur na komorę dla płytek 6-dołkowych.
   Uwaga: W tych badaniach GAS typu dzikiego lub zmutowanego zastosowano do komórek gospodarza przy MOI 10. MOI obliczono na podstawie końcowej liczby komórek eukariotycznych (np. 2 x 10⁶ komórek/studzienkę), tak że na początku okresu infekcji dodano 10 razy więcej bakterii na komórkę gospodarza (np. 2 x 10⁷ CFU na studzienkę). Odpowiedni MOI będzie się różnić w zależności od gatunku bakterii i pożądanych analiz uzupełniających.
   Uwaga: Oprócz stosowania pożywki bakteryjnej do niezakażonych kontroli, inne przydatne kontrole dla niektórych zastosowań tej techniki mogą obejmować bakterie zabijane termicznie lub zużyte pożywki bakteryjne dla porównania.
7. Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

4. Pobieranie próbek

1. Aby pobrać pożywkę do hodowli komórkowych, lizaty komórek gospodarza lub szklane szkiełka nakrywkowe z nienaruszonymi komórkami do dalszych analiz, należy rozpocząć od ostrożnego usunięcia przepuszczalnej wkładki membranowej za pomocą sterylnych kleszczyków.
2. Do oceny wydzielanych protiensów żywiciela:
   1. Zebrać pożywkę z dolnej komory do probówek o pojemności 1,5 ml. Unikaj naruszania monowarstwy podczas zbierania.
   2. Odwirować próbki w temperaturze 14 000 rcf przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych.
   3. Usunąć całość z wyjątkiem 50 μl supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.
3. Do oceny listanów komórek gospodarza:
   1. Delikatnie zassać pożywkę powyżej monowarstwy komórek gospodarza. Należy unikać naruszania monowarstwy, ponieważ może to spowodować utratę próbki.
   2. Wypłucz komórki raz 1x PBS.
   3. Delikatnie odessać PBS. Natychmiast należy zastosować odpowiednią objętość lodowatego buforu do lizy, aby osiągnąć pożądane stężenie białka, i inkubować próbki na lodzie przez 15 minut. Zastosuj od 200 μl do 350 μl buforu do lizy na dołek z każdej płytki 6-dołkowej, aby osiągnąć stężenie białka między 0,5 a 1,5 mg/ml.
      Uwaga: Bufor do lizy stosowany w tych badaniach składał się z wody dejonizowanej, 1% (v/v) substytutu Nonidet P40, koktajlu inhibitorów fosfatazy i koktajlu inhibitorów proteazy. Konkretne odczynniki są wymienione w sekcji Materiały i sprzęt.
   4. Za pomocą skrobaka do komórek odłączyć komórki od powierzchni płytki każdego dołka i odpipetować całą zawartość każdej studzienki do probówki o pojemności 1,5 ml.
   5. Odwirować próbki w temperaturze 14 000 rcf przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Aby ocenić rozpuszczalne składniki lizatu, należy usunąć supernatant do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.
   7. Aby ocenić jądrowe lub inne nierozpuszczalne składniki lizatu, należy zachować osad i przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.
4. Do oceny za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego:
   1. Odessać pożywkę i przepłukać komórki w 1x zimnym PBS.
   2. Utrwal komórki przez noc w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) w PBS (w/v).
      Uwaga: W tych badaniach dodano 1 ml PFA na dołek z każdej płytki 6-dołkowej.

5. Sugerowane zastosowania

1. Analiza transdukcji sygnału hosta za pomocą SDS-Page i Western Blotting
   1. Pobrać lizaty komórek gospodarza zgodnie z opisem w sekcji 4.3.
   2. Oznaczyć stężenie białka w każdej próbce lizatu za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) lub równoważnego przy użyciu wzorców białka³⁰.
   3. Znormalizować stężenia białka między próbkami przed załadowaniem i uruchomieniem próbek na 4-15% żelu poliakrylamidowym lub odpowiedniej alternatywie³¹.
      1. Znormalizować stężenia próbki, pipetując tę samą ilość białka z każdej próbki (np. 20 μg) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodając zmienne objętości buforu do lizy (objętość buforu = objętość całkowita - objętość dodanej próbki) do każdej probówki, aby uzyskać całkowitą objętość (np. 50 μl) i końcowe stężenie białka równoważne we wszystkich próbkach.
   4. Przenieść próbki do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (lub jej odpowiednika). Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, przenieś próbki pod napięciem 25 V przez 2 godziny, a następnie zwiększ napięcie do 70 V na dodatkowe 45 minut. Użyj buforu transferowego składającego się z 200 mM zasady Tris, 1,5 M glicyny i 20% metanolu (v/v) w wodzie dejonizowanej.
   5. Zablokuj membrany w 5% BSA + 0,1% Tween 20 w buforowanej soli fizjologicznej Tris (TBS). Należy odpowiednio dostosować w oparciu o zalecenia producenta dotyczące przeciwciała, które ma być stosowane.
   6. Inkubować błony z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C. Stosować w rozcieńczeniu zalecanym przez producenta.
   7. Myj membrany przez 1,5 godziny w TBS+0,1% Tween 20; odświeżaj bufor co 10-15 min.
   8. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:5 000 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
   9. Myć membrany przez 1,5 godziny w TBS + 0,1% Tween 20; odświeżać bufor co 10 - 15 min.
   10. Inkubować membrany z odczynnikiem do wykrywania chemiluminescencji przed wywołaniem na folii zgodnie z instrukcjami producenta. W razie potrzeby można zastosować inne metody wykrywania.
2. Barwienie i obrazowanie immunofluorescencyjne komórek gospodarza
   1. Utrwalić szkiełka nakrywkowe zawierające komórki gospodarza zgodnie z opisem w sekcji 4.4.
   2. Usunąć roztwór PFA i przemyć szkiełka nakrywkowe zawierające komórki poddane działaniu środka dwa razy w PBS, zasysając między płukaniami.
      Uwaga: PFA jest wysoce toksyczny i należy go odpowiednio zutylizować.
   3. Zablokuj szkiełka nakrywkowe na 2 godziny w temperaturze pokojowej w PBS z 1% (w/v) normalną kozią surowicą, 2% (v/v) Triton X-100 i 0,5% (v/v) Tween 20.
   4. Szkiełka nakrywkowe myć PBS przez 30 min, odświeżając bufor co 10 min.
   5. Szkiełka nakrywkowe inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w stosunku 1:50 (lub zgodnie z zaleceniami producenta) w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.
   6. Myj szkiełka nakrywkowe przez 1,5 godziny w PBS, odświeżając bufor co 30 minut.
   7. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w przeciwciałie drugorzędowym (w tych badaniach użyto koziego przeciwciała anty-króliczego IgG AlexaFluor488) przy użyciu stosunku przeciwciała do roztworu blokującego 1:200.
   8. Myj szkiełka nakrywkowe przez 1 godzinę, odświeżając bufor co 20 minut.
   9. Zastosuj żądane plamy.
      Uwaga: W badaniach tych wykorzystano DAPI (barwienie jądrowe) i rodaminę-falloidynę (barwienie aktyną) w proporcjach 1:1,000 w roztworze blokującym.
   10. Inkubować szkiełka nakrywkowe z barwnikami jądrowymi i aktynowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   11. Szkiełka nakrywkowe myć w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, odświeżając bufor co 10 minut.
   12. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych za pomocą medium montażowego.
   13. Pozostawić szkiełka nakrywkowe na szkiełkach do zastygnięcia na nocy przed uszczelnieniem i obrazowaniem. Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, zbierz obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu standardowego obiektywu 20X. Użyj ImageJ i oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, aby przetworzyć przechwycone obrazy.
3. Test śmierci komórek homodimeru etydyny
   1. Odessać pożywkę z każdej studzienki i dwukrotnie przemyć komórki sterylnym PBS.
   2. Zastosować 4 μM homodimer-1 etydyny-1 w PBS.
   3. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
   4. Wyznaczyć poziom fluorescencji za pomocą czytnika płytek ustawionych na wzbudzenie 528 nm i emisję 617 nm przy wartości odcięcia 590 nm.
   5. Dodać 0,1% (w/v) saponiny do każdego dołka po wstępnym odczycie i pozostawić płytkę do inkubacji przez dodatkowe 20 minut w temperaturze pokojowej (z kołysaniem) przed odczytaniem płytki po raz drugi przy tych samych ustawieniach.
   6. Określić procentową przepuszczalność błony indywidualnie dla każdej studzienki, dzieląc początkowy odczyt fluorescencji (po zabiegu) przez drugi odczyt fluorescencji (po saponinie).
4. Test oznaczania ATP
   1. Zebrać lizaty zgodnie z opisem w sekcji 4.3 powyżej.
   2. Normalizuj poziom białka w lizatach za pomocą testu BCA lub podobnego³⁰.
   3. Określ komórkowe poziomy ATP za pomocą zestawu do oznaczania ATP opartego na luminescencji lub odpowiednika zgodnie z instrukcjami producenta.
   4. Znormalizować wartości poddane działaniu substancji do odpowiednich niezakażonych próbek kontrolnych.
5. Test uwalniania LDH
   1. Po zakażeniu należy pobrać supernatanty w sposób opisany w punkcie 4.3.
   2. Oceń uwalnianie LDH za pomocą zestawu do wykrywania cytotoksyczności pod kątem uwalniania LDH zgodnie z instrukcjami producenta.

Results

Protokół systemu infekcji oparty na wkładce membrany przepuszczalnej, opracowany do badania wydzielanych czynników bakteryjnych, jest szczegółowo opisany na rysunku 1. System ten opiera się na oddzieleniu bakterii i komórek gospodarza przez porowatą błonę w celu oceny wpływu wydzielanych czynników bakteryjnych, w tym przypadku streptolizyny S (SLS), na odpowiedzi gospodarza, takie jak integralność błony gospodarza, żywotność komórkowa, transdukcja sygnału komórkowego i wydzielane czynniki komórek gospodarza. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne dane Western Blot pokazujące, że system ten może być wykorzystany do oceny zmian w aktywacji niezależnych od kontaktu białek sygnalizacyjnych gospodarza. W szczególności reprezentatywne dane wskazują na znacznie zwiększoną aktywację p38 MAPK w obecności szczepów GAS wytwarzających SLS. System ten może być również stosowany do wizualizacji wpływu wydzielanych czynników bakteryjnych na lokalizację białka gospodarza za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (ryc. 3). Dane wskazują na zależną od SLS aktywację kluczowego mediatora stanu zapalnego, czynnika jądrowego kappa B (NFκB), który przemieszcza się z cytoplazmy do jądra po aktywacji²¹. Wyniki na rycinach 2 i 3 wskazują, że obie zależne od SLS odpowiedzi sygnalizacji zapalnej nie wymagają bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. Ponieważ poprzednie eksperymenty wykazały już zależną od SLS aktywację p38 i NFκB w modelach infekcji bezpośredniej²¹, podobne poziomy aktywacji p38 lub NFκB wśród trzech szczepów GAS w systemie opartym na wkładce membranowej przepuszczalnej wskazywałyby, że odpowiedź wymagała bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. Rysunek 4 pokazuje, że ten system infekcji może być stosowany do oceny zależnych od toksyn zmian cytotoksyczności gospodarza za pomocą testów homodimeru etydyny i uwalniania LDH. Świadczy o tym znaczny wzrost zarówno przepuszczalności błony, jak i uwalniania LDH z komórek gospodarza narażonych na szczepy GAS zawierające SLS w porównaniu z komórkami niezakażonymi lub komórkami narażonymi na szczep z niedoborem SLS. Te zmiany cytotoksyczności nie są natychmiastowe, ponieważ znaczące efekty są widoczne dopiero po 12 godzinach od zakażenia w przypadku przepuszczalności błony i 16 godzin w przypadku uwalniania LDH. Reprezentatywne dane ilustrują znaczenie wyboru odpowiednich punktów czasowych i warunków infekcji dla oceny tych odpowiedzi gospodarza. Oprócz umożliwienia oceny zmian sygnalizacyjnych gospodarza i cytotoksyczności, system infekcji oparty na przepuszczalnej wkładce błonowej ma zastosowanie do badania zmian metabolicznych, takich jak dokładne określenie poziomów ATP gospodarza poprzez zapobieganie zanieczyszczeniu bakteryjnemu lizatów komórek gospodarza (ryc. 5). Dane te wskazują na znaczną utratę ATP keratynocytów w odpowiedzi na zakażenie GAS w ciągu 16 godzin po zakażeniu, ze zwiększoną utratą ATP w obecności SLS. Wyniki te są zgodne z obserwowanym zależnym od toksyn wzrostem sygnalizacji odpowiedzi na stres gospodarza i cytotoksyczności.

Rycina 1: Schemat protokołu systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej w celu oceny wpływu wydzielanych czynników bakteryjnych na komórki gospodarza. Ludzkie keratynocyty są platerowane w dolnej komorze i hodowane do 90% zbieżności. Membrana pokryta kolagenem z porami 0,4 μm oddziela górną i dolną komorę, a bakterie są dodawane do górnej komory systemu wkładów membranowych przepuszczalnych na żądany okres infekcji. Supernatanty z hodowli komórkowych i komórki gospodarza mogą być pobierane po okresie infekcji i wykorzystywane do różnych analiz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: System infekcji oparty na wkładce membrany przepuszczalnej może być wykorzystany do analizy lizatu komórek gospodarza za pomocą SDS-PAGE i Western Blotting. Reprezentatywne dane pokazują, że SLS zwiększa aktywację szlaku p38 MAPK w zakażonych keratynocytach. (A) HaCaT były zakażone GAS przez 7 godzin za pośrednictwem przepuszczalnego systemu infekcji wkładki membranowej (przy MOI = 10), a lizaty oceniano pod kątem aktywacji p38. (B) Przeprowadzono densytometrię trzech niezależnych Western Blot w celu ilościowego określenia względnej aktywacji p38 w odpowiedzi na zakażenie GAS. Pokazane są średnie z trzech kontrprób biologicznych, ze słupkami błędu reprezentującymi odchylenie standardowe. Względna aktywacja p38 jest reprezentowana jako fosforylowany/całkowity poziom białka. Określono istotność statystyczną w porównaniu z komórkami niezakażonymi. Całkowita wartość p została określona za pomocą ANOVA (p = 0,0063). Testy Dunnetta zostały przeprowadzone post hoc w celu porównania każdego stanu z odpowiadającą mu średnią kontrolną niezakażoną. *, p = 0,01-0,05; **, p = 0,001-0,01; , p = 0,0001-0,001; , p <0,0001. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Flaherty et al. ^{2015 21}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ilustracja 3: system infekcji oparty na wkładce membrany przepuszczalnej umożliwia wizualizację zmian sygnalizacji gospodarza za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Reprezentatywne dane pokazują, że Streptolizyna S wzmacnia sygnalizację prozapalną poprzez aktywację NFκB. Ludzkie keratynocyty HaCaT zostały zakażone GAS przy MOI 10 przez 8 godzin przy użyciu systemu infekcji opartego na przepuszczalnej wkładce membranowej. (A i B) Lokalizację jądrową NFκB oceniano za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Procent komórek zlokalizowanych w jądrze obliczono, licząc liczbę komórek, w których NFκB przemieścił się z cytoplazmy do jądra dla danego pola i dzieląc tę liczbę przez całkowitą liczbę komórek dla tego samego pola. Podziałka skali wskazuje 100 μm. (A) Średnia z trzech kontrprób biologicznych jest przedstawiona dla każdego warunku, przy czym słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. Ogólna wartość p została określona przez ANOVA; p <0,0001. Testy Dunnetta zostały przeprowadzone w celu porównania każdego stanu z odpowiadającym mu niezakażonym stanem kontrolnym. *, p = 0,01-0,05; **, p = 0,001-0,01; , p = 0,0001-0,001; , p <0,0001. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Flaherty et al. ^{2015 21}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: System infekcji oparty na wkładce membrany przepuszczalnej pozwala na określenie przepuszczalności błony i cytotoksyczności za pośrednictwem bakterii przy braku bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. Reprezentatywne dane wskazują, że żywotność keratynocytów zmniejsza się w obecności aktywnej toksyny SLS. Śmierć komórkową indukowaną przez GAZ oceniano w komórkach HaCaT w obecności WT, niedoboru SLS lub GAS uzupełnionego sagA. Keratynocyty wystawiono na działanie GAS przy użyciu systemu infekcji opartego na przepuszczalnej wkładce membranowej przez 8-16 godzin przy MOI 10. (A) Żywotność oceniano za pomocą testu homodimeru etydyny lub (B) testu uwalniania LDH. W obu panelach 3 powtórzenia są uśredniane, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Istotność dla każdego punktu czasowego określono za pomocą ANOVA (A) 8 hr, p = 0,0241; 12 godz., p <0,0001 (B) 8 godz., p = 0,0287; 12 godz., p = 0,1977; 16 godzin, p = 0,0031. Testy Dunnetta zostały przeprowadzone w celu porównania średnich z każdego stanu z infekcją typu dzikiego w odpowiednim punkcie czasowym. *, p = 0,01-0,05; **, p = 0,001-0,01; , p = 0,0001-0,001; , p <0,0001. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Flaherty et al. ^{2015 21}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: System infekcji oparty na wkładce membrany przepuszczalnej pozwala na dokładne określenie poziomów ATP gospodarza poprzez zapobieganie zanieczyszczeniu bakteryjnemu lizatów komórek gospodarza. Reprezentatywne dane wskazują na zależną od SLS utratę ATP podczas zakażenia paciorkowcem grupy A. Komórki HaCaT były zakażone GAS przez 8-16 godzin przy użyciu systemu infekcji opartego na przepuszczalnej wkładce membranowej. Kontrpróby techniczne (n = 3) z jednej reprezentatywnej kontrpróby biologicznej (2 x 10⁶ komórek na próbkę) uśredniono dla każdego warunku, przy czym słupki błędu reprezentowały odchylenie standardowe. Ogólne wartości p określono za pomocą ANOVA (12 godz., p <0,0001; 16 godz., p <0,0001). Testy Dunnetta zostały przeprowadzone w celu porównania każdego stanu z infekcją typu dzikiego w odpowiednim punkcie czasowym. *, p = 0,01-0,05; **, p = 0,001-0,01; , p = 0,0001-0,001; , p <0,0001. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Flaherty et al. ^{2015 21}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W niniejszym artykule opisano metodę wykorzystującą system infekcji oparty na przepuszczalnej wkładce membranowej w celu zbadania wpływu toksyny bakteryjnej Streptolizyny S na ludzkie keratynocyty nabłonkowe w systemie in vitro. Protokół ten można dostosować do badania innych wydzielanych bakteryjnych czynników wirulencji, a także alternatywnych typów komórek gospodarza. Ten niedawno opracowany system ma kilka zalet w porównaniu z metodami eksperymentalnymi, które wykorzystują oczyszczone toksyny lub przefiltrowane supernatanty bakteryjne ^1-3,8,18-20. System oparty na wkładkach membranowych zapewnia stale utrzymywaną dawkę odpowiedniej toksyny bakteryjnej do komórek gospodarza w trakcie jej wytwarzania, co pozwala na utrzymanie maksymalnej aktywności toksyny, a także zwiększa spójność między eksperymentami. Ponadto system ten bardziej naśladuje warunki fizjologiczne, umożliwiając wydzielanie czynnika w czasie w miarę postępu infekcji i eliminując potrzebę arbitralnego wyboru określonych stężeń toksyn do zastosowania w komórkach gospodarza. Co więcej, system ten zapewniłby również badaczom środki do oceny, czy czynnik bakteryjny będący przedmiotem zainteresowania jest dostarczany do komórek gospodarza w sposób zależny od kontaktu. Zależność od kontaktu jest często testowana poprzez wytwarzanie izogenicznych mutantów bakteryjnych z niedoborem przylegania lub poprzez stosowanie odczynników, które zapobiegają przyleganiu. Opisany tutaj system stanowiłby prostą alternatywę, która uzupełniłaby lub zastąpiła te tradycyjne podejścia.

Oprócz przetestowanych aplikacji opisanych w sekcji 5 protokołu, inne zastosowania, do których ten system infekcji można łatwo dostosować, obejmują pobieranie próbek do macierzy cytokin i testy ELISA. W obu tych przypadkach można zastosować protokół podobny do opisanego dla testów uwalniania LDH. Chociaż nie pokazano tutaj, system ten został wykorzystany do skutecznego zbierania próbek komórek gospodarza do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. W tym zastosowaniu przepuszczalna wkładka membranowa jest usuwana po okresie infekcji, komórki są myte w celu usunięcia pożywki do hodowli komórkowych i stosuje się trypsynę, aby umożliwić pobranie komórek do analizy. Fizyczne oddzielenie bakterii od komórek gospodarza jest szczególnie przydatne w tym zastosowaniu, ponieważ pomaga zapobiegać tworzeniu się dużych agregatów składających się z przylegających bakterii i komórek gospodarza, które w przeciwnym razie mogłyby zakłócać dokładne zliczanie komórek przez cytometr przepływowy.

Chociaż zaobserwowano bardzo spójne odpowiedzi gospodarza, porównując wyniki badań infekcji opartych na wkładce membrany przepuszczalnej z tradycyjnymi badaniami infekcji bezpośrednich, zaobserwowano pewne znaczące różnice w kinetyce tych odpowiedzi gospodarza²¹. Na przykład zmiany w sygnalizacji gospodarza i cytotoksyczności opartej na błonie potrzebują o 30-50% więcej czasu, aby zajść w modelu infekcji opartej na przepuszczalnej wkładce błonowej niż w odpowiadających im modelach infekcji bezpośredniej. Ponieważ system oparty na wkładkach membranowych wymaga nałożenia pożywki na górne i dolne komory każdej studzienki, system opracowany na potrzeby opisanych tutaj badań wymagał 30% wzrostu całkowitej objętości podłoża na studzienkę w porównaniu z odpowiednimi modelami infekcji bezpośredniej stosowanymi wcześniej²¹. Ta różnica w całkowitej objętości pożywki, w połączeniu ze zwiększoną odległością między bakteriami a komórkami gospodarza, gdy bezpośredni kontakt jest zabroniony, prawdopodobnie wydłuża czas potrzebny SLS na dyfuzję przez pożywkę, aby dotrzeć do komórek gospodarza i wywołać obserwowane efekty. Ponadto system oparty na wkładce membranowej usuwa wiele czynników wirulencji GAS, które mogą przyczyniać się do uszkodzenia komórek gospodarza; Brak tych dodatkowych czynników w tym systemie prawdopodobnie również przyczyni się do opóźnienia śmierci komórki gospodarza i inicjacji zdarzeń sygnalizacyjnych gospodarza w porównaniu z bezpośrednią infekcją²¹. Czynniki te powinny być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentów mających na celu ocenę innych wydzielanych składników bakteryjnych.

W celu zidentyfikowania najbardziej znaczących warunków do testowania wpływu wydzielanych czynników bakteryjnych na komórki gospodarza, zaleca się testowanie szeregu punktów czasowych dla każdego zastosowania systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej. Ważne jest, aby rozważyć, w jakich warunkach określony czynnik wirulencji, będący przedmiotem zainteresowania, jest optymalnie wytwarzany (np. faza logarytmiczna, faza stacjonarna, w odpowiedzi na określone sygnały środowiskowe itp.), aby skutecznie zaobserwować jego skutki. W eksperymentach skoncentrowanych na ocenie zmian w białkach sygnalizacyjnych gospodarza konieczne było wybranie punktów czasowych, które pozwalały SLS na dotarcie do komórek gospodarza i wytwarzanie w ilościach wystarczających do wywołania zmian sygnalizacyjnych ²¹. Jednocześnie ocena zmian w sygnalizacji gospodarza musiała zostać przeprowadzona przed przepuszczalnością błony wywołaną przez SLS, ponieważ efekt ten komplikuje pobieranie lizatów komórek gospodarza do analizy. Śmierć komórki indukowaną przez SLS można optymalnie zaobserwować zarówno w bezpośrednich, jak i przepuszczalnych modelach infekcji opartych na wstawkach błonowych kilka godzin po zainicjowaniu zgłoszonych zdarzeń sygnalizacyjnych²¹. Ponadto, wybierając interesujące punkty czasowe, ważne jest również, aby upewnić się, że badane bakterie nie są w stanie przeniknąć przez porowatą membranę wkładki w okresie badania. Wytwarzanie niektórych składników bakteryjnych przez dłuższy czas może zakłócić integralność błony i umożliwić przejście bakterii do dolnej komory. Aby ustalić, czy jest to potencjalny problem w systemie będącym przedmiotem zainteresowania, szczepy bakterii, które mają być badane, można zastosować w górnej komorze systemu opartego na wkładce membranowej przepuszczalnej w różnych punktach czasowych. W każdym punkcie czasowym wkładka może być ostrożnie usunięta, a pożywka z dolnej komory może zostać zebrana i wykorzystana w standardowym teście liczenia kolonii (patrz sekcja 1.5). Jeżeli z pożywki do hodowli komórkowych w dolnej komorze nie zostaną utworzone żadne kolonie, można założyć, że membrana wsadowa skutecznie zapobiega przechodzeniu bakterii w badanym punkcie czasowym i obciążeniu bakteryjnym.

Innym eksperymentalnym elementem projektu, który prawdopodobnie będzie wymagał optymalizacji w celu skutecznej analizy wydzielanych czynników bakteryjnych, jest wielość infekcji (MOI). MOI odnosi się do stosunku komórek bakteryjnych do komórki gospodarza, a zatem ma na niego wpływ zbieganie się komórek gospodarza w czasie infekcji oraz liczba jednostek tworzących kolonie bakteryjne (CFU) zastosowanych do komórek. W tych badaniach komórki keratynocytów wyhodowano do 90% konfluencji, co pozwoliło tym komórkom utworzyć spójną monowarstwę z nienaruszonymi ścisłymi połączeniami. Przemyślane rozważenie fizjologicznej organizacji komórek gospodarza, które mają być badane, jest konieczne, aby wybrać odpowiednią konfluencję do eksperymentów z infekcją. Po określeniu odpowiedniej liczby komórek gospodarza na studzienkę, można obliczyć odpowiednią bakteryjną CFU na podstawie pożądanego MOI. W opisanych tutaj badaniach GAS zastosowano do komórek gospodarza przy MOI 10. Odpowiedni MOI będzie się różnić w zależności od różnych bakterii i pożądanych analiz uzupełniających. Niski początkowy MOI jest zazwyczaj bardziej istotny fizjologicznie i pozwala na powolną akumulację czynnika bakteryjnego, który jest przedmiotem zainteresowania, aby uchwycić subtelne zmiany w sygnalizacji komórek gospodarza, zanim widoczne będą dramatyczne zmiany w żywotności komórek gospodarza. Wyższe MOI są stosowane w wielu badaniach oceniających cytotoksyczność, ale efekt ten można również osiągnąć, zaczynając od niskiego MOI i pozwalając infekcji postępować przez dłuższy czas. Ważne jest, aby określić dokładny stosunek CFU do gęstości optycznej dla wszystkich szczepów bakteryjnych, które mają być badane, ponieważ mutanty izogeniczne mogą mieć zmienioną szybkość wzrostu w porównaniu z bakteriami typu dzikiego i dlatego mogą wymagać dodania wyższej lub niższej CFU na studzienkę, aby zapewnić odpowiednie porównanie odpowiedzi gospodarza między szczepami. W przypadkach, gdy badane komórki gospodarza ssaków są zdolne do zabijania bakterii lub hamowania ich wzrostu lub jeśli podejrzewa się niesynchroniczny wzrost między szczepami bakterii, przydatne może być również przeprowadzenie badań w celu oceny końcowego obciążenia bakteryjnego pod koniec okresu infekcji. Można to osiągnąć poprzez zebranie zawartości przepuszczalnej wkładki i wykonanie testu zliczania kolonii podobnego do opisanego w sekcji 1.5 procedury.

Wybór studzienek o odpowiedniej wielkości dla pożądanego testu jest również ważny dla uzyskania optymalnych wyników. Przepuszczalne wkładki membranowe są dostępne w różnych rozmiarach, ale najbardziej spójne wyniki w przedstawionych tutaj badaniach zaobserwowano przy użyciu wkładek zaprojektowanych dla 24-dołkowych i 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Te rozmiary wkładek są stosunkowo łatwe w obsłudze za pomocą sterylnych kleszczy, a łatwość manipulacji ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania niepożądanemu przenoszeniu bakterii z górnej komory do dolnej komory studzienki. W przypadku eksperymentów obejmujących pobieranie lizatów komórek gospodarza, 6 dołków zapewnia odpowiednią liczbę komórek na warunek dla większości analiz i są wystarczająco duże, aby pomieścić skrobaki do komórek do pobierania próbek. W przypadku testów cytotoksyczności, w których komórki gospodarza pozostają przylegające i są znakowane barwnikiem fluorescencyjnym lub kolorometrycznym, który można zmierzyć na czytniku płytek (np. test homodimeru etydyny, test wykluczenia błękitu trypanowego), zaleca się użycie płytki 24-dołkowej z odpowiednimi wkładkami. Do eksperymentów, w których zostanie pobrana i przeanalizowana pożywka do hodowli komórkowej (np. uwalnianie LDH, badania cytokin), można użyć płytek 24-dołkowych lub 6-dołkowych, chociaż mniejsze studzienki zazwyczaj zapewniają odpowiednią objętość próbki do tych analiz i minimalizują użycie wymaganych odczynników. Ogólnie rzecz biorąc, metoda jest bardzo wszechstronna i może być dostosowywana w zależności od potrzeb w celu przygotowania próbek do wielu dalszych zastosowań.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rosół Todda-Hewitta	Acumedia	7161A	Użyj odpowiedniego bulionu dla interesujących gatunków bakterii.
BioSpectrometer	Eppendorf	model podstawowy	Każdy spektrofotometr UV-Vis jest odpowiedni.
Szalki Petriego	Fisher Scientific	FB0875713	Odpowiednie są inne marki.
Agar	Sigma	A1296-1kg	Inne marki są odpowiednie.
Ludzkie keratynocyty			Dar z laboratorium Victora Nizeta.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073	Użyj odpowiednich pożywek dla interesującej nas linii komórkowej.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biowest	S162H	Stosować odpowiednie dodatki do pożywek dla interesującej nas linii komórkowej.
Naczynia do hodowli tkankowych 10 cm	Nunc	150350	Odpowiednie są inne marki.
6-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych	CytoOne	cc7682-7506	Inne marki są odpowiednie, ale muszą być kompatybilne z wkładką Corning.
24-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych	CytoOne	cc7682-7524	Inne marki są odpowiednie, ale muszą być kompatybilne z wkładką Corning.
Szkiełka nakrywkowe szklane	Fisherbrand	12-541-B	Przed użyciem należy je sterylizować w autoklawie do powlekania komórek.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco	10010-023
Phenol Red Free DMEM	Life Technologies	31053028	Pożywka Phenol Red Free jest wymagana tylko do testu uwalniania LDH.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100
L-glutamina	Gibco	25030149	Wymagana tylko do uzupełnienia pożywki do hodowli komórkowych do testu uwalniania LDH.
Pirogronian sodu	Gibco	BP356100	Wymagany tylko do uzupełnienia pożywki do hodowli komórkowych do testu uwalniania LDH.
Powlekany kolagenem 0,4 &m; m Wkładki Transwell (6 dołków)	Corning	3540
Powlekane kolagenem 0,4 μ m Wkładki Transwell (24 dołki)	Kleszcze Corning	3595
	Fisher	3120018	Muszą one zostać wysterylizowane etanolem przed użyciem wkładek Transwell.
Skrobaki do komórek	Fisherbrand	08-100-241	Są one wymagane tylko do zbierania lizatów komórkowych.
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	04042-500	TOKSYCZNY.  Jest to wymagane tylko w przypadku obrazowania immunofluorescencyjnego.
Zestaw do oznaczania kwasu bicunchoninowego (BCA)	Pierce	23227	Można stosować inne testy ilościowe białka.
Tris-glicyna 4 - 15% żele poliakrylamidowe	BioRad	4561083	System buforowy i procent poliakrylamidu należy dobierać na podstawie interesujących białek.
Kaseta do elektroforezy dostarcza	BioRad	1658063	Wymagane tylko do Western Blotting.
Zasilacz do elektroforezy	BioRad	1645050	Wymagany tylko do Western Blotting.
Kaseta transferowa Western blot	BioRad		Wymagana tylko do Western Blot.
Membrana z poliwinylidenu (PVDF)	EMD Millipore	IPVH00010	wymagana tylko w przypadku Western Blotting.
Tween 20	Sigma	P1379-500ml
Przeciwciało drugorzędowe królika IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc2030	Przeciwciało drugorzędowe należy oznaczyć na podstawie wybranej metody wykrywania.
Mysie przeciwciało drugorzędowe IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc2031	Przeciwciało drugorzędowe należy oznaczyć na podstawie wybranej metody wykrywania.
Phospho-p38 (T180 + T182) Przeciwciało MAPK	Sygnalizacja komórkowa	4511	Wybierz odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe na podstawie interesujących białek.
Całkowite przeciwciało p38 MAPK	Sygnalizacja komórkowa	8690	Wybierz odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe na podstawie interesujących białek.
Kozie przeciwciała anty-królicze IgG Alexafluor 488	Sondy molekularne	A-11034	Inne przeciwciała drugorzędowe mogą być stosowane do wykrywania obrazowania immunofluorescencyjnego.
Odczynnik LumiGLO Detection	KPL	54-61-00	Wymagany tylko do Western Blotting z detekcją na folii.
Folia detekcyjna	Biodot	BDB57	Wymagana tylko do Western Blotting z detekcją na folii.
Mikroskop fluorescencyjny DeltaVision Nikon 90i	Nikon		Inne mikroskopy fluorescencyjne są odpowiednie do tych analiz.
Normalna surowica kozia	Thermo Scientific	31873
Triton X-100	Sigma	T9284-500mL
DAPI barwienie jądrowe	Sygnalizacja komórkowa	4083	Wybierz barwienia na podstawie określonych zastosowań immunofluorescencyjnych, które Cię interesują.
Sondy molekularne	barwiące aktyną rodaminowo-falloidynową	R415	Wybierz barwienia na podstawie specyficznych zastosowań immunofluorescencyjnych.
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Wymagany tylko do obrazowania immunofluorescencyjnego.
Sondy molekularne	homodimeru etydyny 1	E1169	Wymagane tylko do testu cytotoksyczności przepuszczalności błony.
Czytnik mikropłytek Spectramax M5		molekularne	Inne czytniki mikropłytek zdolne do wykrywania UV-vis, fluorescencji i luminescencji mogą być odpowiednie.
Saponina	Sigma	47036-50G-F	Wymagana tylko do testu cytotoksyczności przepuszczalności błony.
Sondy molekularne Zestaw do oznaczania ATP Life Technologies		A22066	Inne zestawy prawdopodobnie będą odpowiednie.
Zestaw do wykrywania cytotoksyczności do uwalniania LDH	Roche	11644793001	Inne zestawy prawdopodobnie będą odpowiednie.
Nonidet P40 Zamiennik	Sigma	74385-1L	Inni dostawcy są odpowiedni.
HALT Koktajl z inhibitorami fosfatazy	Thermo Scientific	78420B	Inne koktajle prawdopodobnie będą odpowiednie.
SIGMAFAST Tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy, bez EDTA	Sigma	S8830-2TAB	Inne koktajle prawdopodobnie będą odpowiednie.