Artykuł metodologiczny

Wdrożenie systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej w celu zbadania wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza ssaków

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54406

⸱

19 sierpnia 2016

 , 
1Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisana jest metoda wykorzystująca system infekcji oparty na wkładce membranowej do badania wpływu Streptolizyny S, wydzielanej toksyny wytwarzanej przez Streptococcus grupy A, na keratynocyty. System ten może być z łatwością zastosowany do badania innych wydzielanych białek bakteryjnych na różnych typach komórek gospodarza podczas infekcji.

Streszczenie

Wiele patogenów bakteryjnych wydziela silne toksyny, które pomagają w niszczeniu tkanki gospodarza, inicjowaniu zmian sygnalizacyjnych w komórkach gospodarza lub manipulowaniu reakcjami układu odpornościowego w trakcie infekcji. Chociaż opracowano metody skutecznego oczyszczania i wytwarzania wielu z tych ważnych czynników wirulencji, nadal istnieje wiele toksyn bakteryjnych, których unikalna struktura lub rozległe modyfikacje potranslacyjne utrudniają ich oczyszczanie i badanie w systemach in vitro. Co więcej, nawet jeśli można uzyskać czystą toksynę, istnieje wiele wyzwań związanych z badaniem konkretnych skutków toksyny w odpowiednich warunkach fizjologicznych. Większość modeli hodowli komórkowych in vitro zaprojektowanych do oceny wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza obejmuje inkubację komórek gospodarza z jednorazową dawką toksyny. Takie metody słabo przybliżają to, czego komórki gospodarza faktycznie doświadczają podczas infekcji, gdzie toksyna jest stale wytwarzana przez komórki bakteryjne i pozwala się jej stopniowo gromadzić w trakcie infekcji. Protokół ten opisuje projekt przepuszczalnego systemu infekcji bakteryjnych opartego na wkładce membranowej w celu zbadania wpływu Streptolizyny S, silnej toksyny wytwarzanej przez paciorkowce grupy A, na ludzkie keratynocyty nabłonkowe. System ten bardziej naśladuje naturalne środowisko fizjologiczne podczas infekcji niż metody, w których czysta toksyna lub supernatanty bakteryjne są bezpośrednio stosowane do komórek gospodarza. Co ważne, metoda ta eliminuje również stronniczość reakcji gospodarza, która wynika z bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. System ten został wykorzystany do skutecznej oceny wpływu streptolizyny S (SLS) na integralność błony gospodarza, żywotność komórkową i odpowiedzi sygnalizacji komórkowej. Technika ta może być łatwo zastosowana do badania innych wydzielanych czynników wirulencji na różnych typach komórek gospodarza ssaków w celu zbadania specyficznej roli wydzielanego czynnika bakteryjnego w przebiegu infekcji.

Wprowadzenie

Zrozumienie funkcji czynników wirulencji bakteryjnej w kontekście infekcji komórek gospodarza jest głównym celem badań nad patogenezą bakterii. Wiele patogenów bakteryjnych aktywnie wydziela toksyny i inne rozpuszczalne czynniki, aby pomóc w niszczeniu tkanki gospodarza, inicjować zmiany sygnałowe w komórkach gospodarza lub manipulować odpowiedziami układu odpornościowego w trakcie infekcji 1-10. Chociaż opracowano metody skutecznego oczyszczania i wytwarzania wielu z tych ważnych czynników wirulencji do badań, niektóre produkty bakteryjne mają unikalną strukturę lub rozległe modyfikacje potranslacyjne, które czynią je opornymi kandydatami do metod oczyszczania, a zatem nie mogą być badane w izolacji przy użyciu systemów in vitro. Na przykład Streptococcus grupy A, patogen bakteryjny odpowiedzialny za niezliczone infekcje, od zapalenia gardła po martwicze zapalenie powięzi i zespół wstrząsu toksycznego, wytwarza wydzielaną toksynę bakteryjną znaną jako Streptolysin S (SLS)11-17. Ten rybosomalny peptyd jest kodowany przez klaster genu związanego ze streptolizyną S (sag), a dojrzały produkt szacuje się na 2,7 kDa w rozmiarze14-17. Protooksyna, kodowana przez sagA, jest modyfikowana potranslacyjnie przez kilka enzymów (SagB, SagC i SagD) w celu wytworzenia dojrzałej, funkcjonalnej formy15-17. Złożoność tych potranslacyjnych modyfikacji w połączeniu z niezwykłą sekwencją aminokwasową toksyny sprawiły, że toksyna stała się niekompatybilna ze wszystkimi próbami oczyszczenia i wyjaśnienia struktury, które próbowano do tej porypodjąć 15,17. Wyzwania te skomplikowały wysiłki zmierzające do określenia specyficznej roli tej toksyny w patogenezie gospodarza.

W przypadkach, gdy przygotowanie oczyszczonych toksyn lub innych wydzielanych czynników jest albo skomplikowane, albo nie jest możliwe, mechanizmy wyjaśniające funkcję tych produktów były tradycyjnie badane poprzez przygotowanie przefiltrowanych supernatantów bakteryjnych, które są następnie stosowane do komórek gospodarza18-20. Istnieje kilka wyzwań związanych z tą techniką. Po pierwsze, wiele z tych wydzielanych czynników, w tym SLS, nie utrzymuje maksymalnej lub stałej aktywności, gdy jest przechowywanych i stosowanych w komórkach gospodarza w późniejszym czasie. Dodatkowo, gdy supernatanty są zbierane w jednym punkcie czasowym, a następnie nakładane na komórki gospodarza, trudno jest określić znaczenie fizjologiczne i wyciągnąć bezpośrednie wnioski na temat naturalnego procesu infekcji, w którym czynniki wydzielane mogą gromadzić się w trakcie infekcji do fizjologicznie odpowiedniego stężenia. To drugie wyzwanie dotyczy nie tylko stosowania supernatantów bakteryjnych, ale także stosowania oczyszczonych toksyn w badaniach na komórkach gospodarza 1-3,8. Aby rozwiązać te problemy, opracowano system infekcji oparty na przepuszczalnej błonie komórkowej, który ocenia wpływ SLS na komórki gospodarza w sposób, który utrzymuje optymalną aktywność toksyn, a także eliminuje zmienną bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. W tym systemie ludzkie komórki nabłonkowe są hodowane w monowarstwie w dolnej komorze studni dwukomorowej, a bakterie są wprowadzane do górnej komory tej samej studzienki. Porowata membrana (pory 0,4 μm) oddziela górną i dolną komorę, umożliwiając wymianę wydzielanych czynników między dwiema komorami, ale zapobiegając przedostawaniu się bakterii. System ten pozwolił na skuteczną ocenę odpowiedzi gospodarza, które są spowodowane wyłącznie długotrwałym wydzielaniem składników bakteryjnych, przy jednoczesnym wyeliminowaniu wszelkich reakcji, które mogą wystąpić w wyniku bezpośredniego kontaktu podczas infekcji paciorkowcowej grupy A. Chociaż inne wydzielane czynniki bakteryjne oprócz SLS mogą również przechodzić przez porowatą błonę, zastosowanie izogenicznego panelu mutantów, w tym typu dzikiego (WT), nokautu SLS (ΔsagA) i szczepu uzupełnionego sagA (ΔsagA+sagA) pozwala na precyzyjną ocenę odpowiedzi gospodarza, które są ściśle zależne od SLS21.

Chociaż podobne systemy przepuszczalnych wkładów membranowych zostały wykorzystane do badania wydzielanych czynników związanych z infekcjami wirusowymi, biologią nowotworów i migracją komórek odpornościowych 22-26, niewiele badań dotyczących interakcji bakterii z komórkami gospodarza wykorzystywało to podejście6,27,28. Nawet badania, w których wykorzystano takie systemy do zbadania interakcji między bakteriami a komórkami gospodarza, koncentrowały się przede wszystkim na migracji komórek zapalnych lub bakterii przez monowarstwę nabłonka lub śródbłonka pokrytą przepuszczalną wkładką membranową. Opisany w niniejszym dokumencie system infekcji oparty na przepuszczalnej wkładce błonowej jest prostą i skuteczną metodą, która opiera się na oddzieleniu bakterii i komórek gospodarza przez porowatą błonę w celu oceny wpływu wydzielanej toksyny, SLS, na integralność błony gospodarza, żywotność komórkową, transdukcję sygnału komórkowego i wydzielane czynniki komórek gospodarza. Technikę tę można zaadaptować do badania innych wydzielanych czynników wirulencji na różnych typach komórek gospodarza ssaków w celu zbadania roli określonego czynnika bakteryjnego w przebiegu infekcji.

Protokół

1. Kultura bakteryjna

  1. Generowanie izogenicznych zmutowanych szczepów do wykorzystania w badaniu specyficznego czynnika wydzielanego będącego przedmiotem zainteresowania21.
    Uwaga: Szczepy GASM1T1 5448 wykorzystane w tych eksperymentach obejmowały WT GAS', mutanta z niedoborem SLSu kota sagAΔ (w skrócie w tekście jako ΔsagA) i szczep uzupełniony sagA (w skrócie w tekście jako ΔsagA+sagA)21.
  2. Przygotuj przez noc płynne kultury interesujących nas szczepów bakterii. Hoduj szczepy GAS M1T1 5448 w -10 ml bulionu Todda-Hewitta w temperaturze 37 °C przez 16-20 godzin przed zakażeniem komórek ludzkich.
  3. Odwirować nocne kultury bakterii (2 400 rcf przez 10 min) i ponownie zawiesić w świeżej pożywce bakteryjnej.
    Uwaga: Ponowne zawieszenie w tej samej objętości, w której hodowano kultury nocne (5-10 ml) na ogół daje pożądaną początkową gęstość optyczną.
  4. Normalizować kultury bakteryjne do równych stężeń początkowych poprzez rozcieńczanie ponownie zawieszonych kultur w dodatkowym pożywce bakteryjnej, aż do uzyskania tej samej gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) dla wszystkich szczepów, które mają być badane (dla wygody zaleca się OD600 około 1,0).
    Uwaga: W tych badaniach kultury bakteryjne w fazie stacjonarnej wykorzystano do zakażenia komórek gospodarza natychmiast po normalizacji. Ponieważ jednak niektóre szczepy bakterii wychodzą z fazy stacjonarnej niesynchronicznie, bardziej odpowiednie może być rozpoczęcie infekcji gospodarza od kultur w fazie logarytmicznej, jeśli okaże się, że ma to miejsce w przypadku szczepów będących przedmiotem zainteresowania.
  5. Przed dalszą analizą należy wykonać test zliczania kolonii w celu określenia jednostek tworzących kolonie (CFU) na mililitr obecnych w kulturach wyjściowych, aby można było określić liczbę infekcji (MOI) lub stosunek bakterii na komórkę gospodarza.
    1. Przygotować 1 ml seryjnych rozcieńczeń kultur bakteryjnych, które zostały znormalizowane do pożądanej gęstości optycznej w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej (PBS) lub odpowiedniej pożywce bakteryjnej (w tych badaniach użyto bulionu Todda-Hewitta). Przygotuj rozcieńczenia w zakresie od 10-1 do 10-6, aby wytworzyć co najmniej jeden zestaw płytek agarowych z policzalnymi koloniami (30-300 kolonii). Wykonać wszystkie rozcieńczenia w trzech powtórzeniach.
    2. Przenieść 100 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na płytkę agarową zawierającą pożywkę odpowiednią dla analizowanych gatunków bakterii.
      Uwaga: W tych badaniach użyto agaru Todda-Hewitta.
    3. Użyj szklanego lub plastikowego rozsiewacza bakteryjnego, aby równomiernie rozprowadzić 100 μl porcji na całej powierzchni płytki agarowej i kontynuuj rozprowadzanie, aż płyn zostanie wchłonięty przez agar. Wykonuj pod ogniem przy użyciu sterylnej techniki.
    4. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C przez noc lub do momentu pojawienia się policzalnych kolonii.
    5. Policz kolonie, które rosną na każdej płytce i oblicz jtk/ml w oryginalnej kulturze według następującego wzoru: liczba kolonii x odwrotność szeregowego rozcieńczenia / objętość kultury podana w mililitrach.
      np. (200 kolonii x 1/10-5 rozcieńczenia) / 0,1 ml w półmisku = 2,0 x 108 jtk/ml

2. Hodowla komórek gospodarza

  1. Uzyskać odpowiednią linię komórek gospodarza do żądanych analiz.
    Uwaga: Do badań wykorzystano ludzkie keratynocytynabłonkowe HaCaT 29, rodzaj daru od V. Nizeta.
    1. Utrzymuj komórki HaCaT w 100-milimetrowych szalkach hodowlanych w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

3. Zakażenie komórek gospodarza za pomocą systemu wkładek z przepuszczalną błoną

  1. Umieść komórki w odpowiednich naczyniach do hodowli tkankowej i pozwól im rosnąć, aż osiągną 90% zlewności.
    Uwaga: Komórki HaCaT użyte w tych badaniach zazwyczaj osiągają konfluencję w ciągu 2-3 dni po posiewaniu.
    1. Do zbierania lizatu (np. analiza sygnalizacji i oznaczanie trifosforanu adenozyny (ATP)) umieść komórki HaCaT w 6 dołkach przy gęstości wysiewu około 3 x 105 komórek/dołek.
    2. Do eksperymentów obrazowania immunofluorescencyjnego, płytki komórkowe na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych w 6 dołkach o gęstości wysiewu około 3 x 105 komórek / dołek.
    3. W przypadku testów przepuszczalności błony homodimeru etydyny i uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) umieść komórki HaCaT w 24 dołkach przy gęstości wysiewu około 5 x 104 komórek / studzienkę.
  2. Bezpośrednio przed zabiegiem przemyć komórki 1x sterylnym PBS.
  3. Nałóż świeżą pożywkę wzrostową na komórki. W opisanych tutaj warunkach należy zastosować 2 ml pożywki na dołek w przypadku płytek 6-dołkowych lub 0,5 ml pożywki na dołek w przypadku płytek 24-dołkowych. Jeśli testowane są terapie farmakologiczne, wymieszaj je ze świeżą pożywką i zastosuj na tym etapie.
    Uwaga: Niektóre testy mogą wymagać alternatywnych pożywek. Na przykład, ponieważ czerwień fenolowa i wysokie stężenia w surowicy zakłócają test uwalniania LDH, do tych eksperymentów wykorzystano DMEM wolny od czerwieni fenolowej uzupełniony 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (w / v), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu.
  4. Po nałożeniu świeżej pożywki ostrożnie umieścić sterylną wkładkę membranową o przepuszczalności 0,4 μm w każdym dołku. Wykonaj ten krok w okapie z przepływem laminarnym i użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść przepuszczalną wkładkę membranową do każdej studzienki.
  5. Zastosuj świeżą pożywkę do hodowli komórkowych do górnej komory każdej studzienki zgodnie z instrukcjami producenta. W opisanych tutaj warunkach należy zastosować 1 ml pożywki na dołek dla płytek 6-dołkowych lub 0,1 ml pożywki na basenik dla płytek 24-dołkowych.
  6. Nałożyć odpowiednią objętość znormalizowanych kultur bakteryjnych (patrz sekcja 1) do górnej komory systemu wkładów membranowych przepuszczalnych. Stosować pożywkę bakteryjną do niezakażonych zabiegów kontrolnych. Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, dodaj 25 μl znormalizowanych kultur na komorę dla płytek 24-dołkowych i dodaj 100 μl kultur na komorę dla płytek 6-dołkowych.
    Uwaga: W tych badaniach GAS typu dzikiego lub zmutowanego zastosowano do komórek gospodarza przy MOI 10. MOI obliczono na podstawie końcowej liczby komórek eukariotycznych (np. 2 x 106 komórek/studzienkę), tak że na początku okresu infekcji dodano 10 razy więcej bakterii na komórkę gospodarza (np. 2 x 107 CFU na studzienkę). Odpowiedni MOI będzie się różnić w zależności od gatunku bakterii i pożądanych analiz uzupełniających.
    Uwaga: Oprócz stosowania pożywki bakteryjnej do niezakażonych kontroli, inne przydatne kontrole dla niektórych zastosowań tej techniki mogą obejmować bakterie zabijane termicznie lub zużyte pożywki bakteryjne dla porównania.
  7. Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

4. Pobieranie próbek

  1. Aby pobrać pożywkę do hodowli komórkowych, lizaty komórek gospodarza lub szklane szkiełka nakrywkowe z nienaruszonymi komórkami do dalszych analiz, należy rozpocząć od ostrożnego usunięcia przepuszczalnej wkładki membranowej za pomocą sterylnych kleszczyków.
  2. Do oceny wydzielanych protiensów żywiciela:
    1. Zebrać pożywkę z dolnej komory do probówek o pojemności 1,5 ml. Unikaj naruszania monowarstwy podczas zbierania.
    2. Odwirować próbki w temperaturze 14 000 rcf przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych.
    3. Usunąć całość z wyjątkiem 50 μl supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.
  3. Do oceny listanów komórek gospodarza:
    1. Delikatnie zassać pożywkę powyżej monowarstwy komórek gospodarza. Należy unikać naruszania monowarstwy, ponieważ może to spowodować utratę próbki.
    2. Wypłucz komórki raz 1x PBS.
    3. Delikatnie odessać PBS. Natychmiast należy zastosować odpowiednią objętość lodowatego buforu do lizy, aby osiągnąć pożądane stężenie białka, i inkubować próbki na lodzie przez 15 minut. Zastosuj od 200 μl do 350 μl buforu do lizy na dołek z każdej płytki 6-dołkowej, aby osiągnąć stężenie białka między 0,5 a 1,5 mg/ml.
      Uwaga: Bufor do lizy stosowany w tych badaniach składał się z wody dejonizowanej, 1% (v/v) substytutu Nonidet P40, koktajlu inhibitorów fosfatazy i koktajlu inhibitorów proteazy. Konkretne odczynniki są wymienione w sekcji Materiały i sprzęt.
    4. Za pomocą skrobaka do komórek odłączyć komórki od powierzchni płytki każdego dołka i odpipetować całą zawartość każdej studzienki do probówki o pojemności 1,5 ml.
    5. Odwirować próbki w temperaturze 14 000 rcf przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Aby ocenić rozpuszczalne składniki lizatu, należy usunąć supernatant do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.
    7. Aby ocenić jądrowe lub inne nierozpuszczalne składniki lizatu, należy zachować osad i przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.
  4. Do oceny za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego:
    1. Odessać pożywkę i przepłukać komórki w 1x zimnym PBS.
    2. Utrwal komórki przez noc w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) w PBS (w/v).
      Uwaga: W tych badaniach dodano 1 ml PFA na dołek z każdej płytki 6-dołkowej.

5. Sugerowane zastosowania

  1. Analiza transdukcji sygnału hosta za pomocą SDS-Page i Western Blotting
    1. Pobrać lizaty komórek gospodarza zgodnie z opisem w sekcji 4.3.
    2. Oznaczyć stężenie białka w każdej próbce lizatu za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) lub równoważnego przy użyciu wzorców białka30.
    3. Znormalizować stężenia białka między próbkami przed załadowaniem i uruchomieniem próbek na 4-15% żelu poliakrylamidowym lub odpowiedniej alternatywie31.
      1. Znormalizować stężenia próbki, pipetując tę samą ilość białka z każdej próbki (np. 20 μg) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodając zmienne objętości buforu do lizy (objętość buforu = objętość całkowita - objętość dodanej próbki) do każdej probówki, aby uzyskać całkowitą objętość (np. 50 μl) i końcowe stężenie białka równoważne we wszystkich próbkach.
    4. Przenieść próbki do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (lub jej odpowiednika). Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, przenieś próbki pod napięciem 25 V przez 2 godziny, a następnie zwiększ napięcie do 70 V na dodatkowe 45 minut. Użyj buforu transferowego składającego się z 200 mM zasady Tris, 1,5 M glicyny i 20% metanolu (v/v) w wodzie dejonizowanej.
    5. Zablokuj membrany w 5% BSA + 0,1% Tween 20 w buforowanej soli fizjologicznej Tris (TBS). Należy odpowiednio dostosować w oparciu o zalecenia producenta dotyczące przeciwciała, które ma być stosowane.
    6. Inkubować błony z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C. Stosować w rozcieńczeniu zalecanym przez producenta.
    7. Myj membrany przez 1,5 godziny w TBS+0,1% Tween 20; odświeżaj bufor co 10-15 min.
    8. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:5 000 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
    9. Myć membrany przez 1,5 godziny w TBS + 0,1% Tween 20; odświeżać bufor co 10 - 15 min.
    10. Inkubować membrany z odczynnikiem do wykrywania chemiluminescencji przed wywołaniem na folii zgodnie z instrukcjami producenta. W razie potrzeby można zastosować inne metody wykrywania.
  2. Barwienie i obrazowanie immunofluorescencyjne komórek gospodarza
    1. Utrwalić szkiełka nakrywkowe zawierające komórki gospodarza zgodnie z opisem w sekcji 4.4.
    2. Usunąć roztwór PFA i przemyć szkiełka nakrywkowe zawierające komórki poddane działaniu środka dwa razy w PBS, zasysając między płukaniami.
      Uwaga: PFA jest wysoce toksyczny i należy go odpowiednio zutylizować.
    3. Zablokuj szkiełka nakrywkowe na 2 godziny w temperaturze pokojowej w PBS z 1% (w/v) normalną kozią surowicą, 2% (v/v) Triton X-100 i 0,5% (v/v) Tween 20.
    4. Szkiełka nakrywkowe myć PBS przez 30 min, odświeżając bufor co 10 min.
    5. Szkiełka nakrywkowe inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w stosunku 1:50 (lub zgodnie z zaleceniami producenta) w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.
    6. Myj szkiełka nakrywkowe przez 1,5 godziny w PBS, odświeżając bufor co 30 minut.
    7. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w przeciwciałie drugorzędowym (w tych badaniach użyto koziego przeciwciała anty-króliczego IgG AlexaFluor488) przy użyciu stosunku przeciwciała do roztworu blokującego 1:200.
    8. Myj szkiełka nakrywkowe przez 1 godzinę, odświeżając bufor co 20 minut.
    9. Zastosuj żądane plamy.
      Uwaga: W badaniach tych wykorzystano DAPI (barwienie jądrowe) i rodaminę-falloidynę (barwienie aktyną) w proporcjach 1:1,000 w roztworze blokującym.
    10. Inkubować szkiełka nakrywkowe z barwnikami jądrowymi i aktynowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Szkiełka nakrywkowe myć w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, odświeżając bufor co 10 minut.
    12. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych za pomocą medium montażowego.
    13. Pozostawić szkiełka nakrywkowe na szkiełkach do zastygnięcia na nocy przed uszczelnieniem i obrazowaniem. Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, zbierz obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu standardowego obiektywu 20X. Użyj ImageJ i oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, aby przetworzyć przechwycone obrazy.
  3. Test śmierci komórek homodimeru etydyny
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki i dwukrotnie przemyć komórki sterylnym PBS.
    2. Zastosować 4 μM homodimer-1 etydyny-1 w PBS.
    3. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
    4. Wyznaczyć poziom fluorescencji za pomocą czytnika płytek ustawionych na wzbudzenie 528 nm i emisję 617 nm przy wartości odcięcia 590 nm.
    5. Dodać 0,1% (w/v) saponiny do każdego dołka po wstępnym odczycie i pozostawić płytkę do inkubacji przez dodatkowe 20 minut w temperaturze pokojowej (z kołysaniem) przed odczytaniem płytki po raz drugi przy tych samych ustawieniach.
    6. Określić procentową przepuszczalność błony indywidualnie dla każdej studzienki, dzieląc początkowy odczyt fluorescencji (po zabiegu) przez drugi odczyt fluorescencji (po saponinie).
  4. Test oznaczania ATP
    1. Zebrać lizaty zgodnie z opisem w sekcji 4.3 powyżej.
    2. Normalizuj poziom białka w lizatach za pomocą testu BCA lub podobnego30.
    3. Określ komórkowe poziomy ATP za pomocą zestawu do oznaczania ATP opartego na luminescencji lub odpowiednika zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Znormalizować wartości poddane działaniu substancji do odpowiednich niezakażonych próbek kontrolnych.
  5. Test uwalniania LDH
    1. Po zakażeniu należy pobrać supernatanty w sposób opisany w punkcie 4.3.
    2. Oceń uwalnianie LDH za pomocą zestawu do wykrywania cytotoksyczności pod kątem uwalniania LDH zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki

Protokół systemu infekcji opartego na wkładkach z przepuszczalnej membrany, opracowany do badania wydzielanych czynników bakteryjnych, szczegółowo przedstawiono na Rysunku 1. System ten opiera się na rozdzieleniu bakterii i komórek gospodarza za pomocą porowatej membrany w celu oceny wpływu wydzielanych czynników bakteryjnych, w tym przypadku streptolizyny S (SLS), na odpowiedzi gospodarza, takie jak integralność błony gospodarza, żywotność komórek, transdukcja sygnałów komórkowych oraz wydzielane czynniki komórek gospodarza. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne dane z analizy Western Blot, wykazując, że system ten może być wykorzystany do oceny zmian w aktywacji białek sygnalizacyjnych gospodarza niezależnych od kontaktu. W szczególności reprezentatywne dane wykazują znacząco zwiększoną aktywację p38 MAPK w obecności szczepów GAS produkujących SLS. System ten może być również zastosowany do wizualizacji wpływu wydzielanych czynników bakteryjnych na lokalizację białek gospodarza za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (Rysunek 3). Dane wykazują zależną od SLS aktywację kluczowego mediatora stanu zapalnego, czynnika jądrowego kappa B (NFκB), który po aktywacji translokuje się z cytoplazmy do jądra komórkowego21. Wyniki przedstawione na Rysunkach 2 i 3 wskazują, że obie zależne od SLS odpowiedzi sygnalizacyjne stanu zapalnego nie wymagają bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. Ponieważ wcześniejsze eksperymenty wykazały już zależną od SLS aktywację p38 i NFκB w modelach infekcji bezpośredniej21, podobne poziomy aktywacji p38 lub NFκB pomiędzy trzema szczepami GAS w systemie opartym na wkładkach z przepuszczalnej membrany wskazywałyby na to, że odpowiedź wymaga bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. Rysunek 4 demonstruje, że system infekcji ten może być zastosowany do oceny zależnych od toksyn zmian cytotoksyczności gospodarza za pomocą testów z użyciem etydium homodimeru oraz uwalniania LDH. Świadczy o tym znaczący wzrost zarówno permeabilizacji błony, jak i uwalniania LDH z komórek gospodarza eksponowanych na szczepy GAS zawierające SLS, w porównaniu z komórkami nieinfekowanymi lub komórkami eksponowanymi na szczep pozbawiony SLS. Zmiany cytotoksyczności te nie są natychmiastowe, ponieważ znaczące efekty nie są widoczne aż do 12 hr po infekcji w przypadku permeabilizacji błony i 16 hr w przypadku uwalniania LDH. Reprezentatywne dane ilustrują znaczenie wyboru odpowiednich punktów czasowych i warunków infekcji dla oceny tych odpowiedzi gospodarza. Oprócz umożliwienia oceny zmian sygnalizacyjnych i cytotoksyczności gospodarza, system infekcji oparty na wkładkach z przepuszczalnej membrany jest przydatny do badania zmian metabolicznych, takich jak dokładne oznaczenie poziomów ATP gospodarza poprzez zapobieganie kontaminacji lizatów komórek gospodarza bakteriami (Rysunek 5). Dane te wykazują znaczną utratę ATP w keratynocytach w odpowiedzi na infekcję GAS do 16 godzin po infekcji, ze zwiększoną utratą ATP w obecności SLS. Wyniki te są zgodne z obserwowanym zależnym od toksyn wzrostem sygnalizacji odpowiedzi stresowej i cytotoksyczności gospodarza.

Schemat testu Transwell; kokultura bakterii i komórek gospodarza, oznaczanie CFU, inkubacja, analiza.
Rycina 1: Schemat protokołu systemu infekcji opartego na wkładkach z przepuszczalną membraną do oceny wpływu wydzielanych czynników bakteryjnych na komórki gospodarza. ludzkie keratynocyty są wysiewane w dolnej komorze i hodowane do uzyskania 90% konfluencji. Membrana pokryta kolagenem z porami o rozmiarze 0.4 µm oddziela komorę górną od dolnej, a bakterie są dodawane do górnej komory systemu wkładek z przepuszczalną membraną na wybrany czas infekcji. Po okresie infekcji można zebrać nadsącz z hodowli komórkowej oraz komórki gospodarza i wykorzystać je do różnych analiz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Western blot i wykres słupkowy analizujący fosforylację p38 w różnych warunkach genetycznych.
Rycina 2: System infekcji oparty na insertach z przepuszczalnej membrany może być wykorzystany do analizy lizatów komórek gospodarza za pomocą SDS-PAGE i Western blottingu. Reprezentatywne dane pokazują, że SLS zwiększa aktywację szlaku p38 MAPK w zainfekowanych keratynocytach. (A) Komórki HaCaTs zostały zainfekowane GAS przez 7 hr za pomocą systemu infekcji z insertem z przepuszczalnej membrany (przy MOI = 10), a lizaty oceniono pod kątem aktywacji p38. (B) Przeprowadzono densytometrię trzech niezależnych analiz Western blot w celu ilościowego określenia względnej aktywacji p38 w odpowiedzi na infekcję GAS. Przedstawiono średnie z trzech powtórzeń biologicznych, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Względna aktywacja p38 jest przedstawiona jako stosunek poziomu białka fosforylowanego do całkowitego. Istotność statystyczną określono w porównaniu z komórkami niezinfekowanymi. Ogólną wartość p wyznaczono za pomocą ANOVA (p = 0.0063). Testy Dunnetta wykonano post hoc, aby porównać każdy stan z odpowiadającą mu średnią kontrolną dla komórek niezinfekowanych. *, p = 0.01-0.05; **, p = 0.001-0.01; ***, p = 0.0001-0.001; ****, p <0.0001. Rycina ta została zmodyfikowana z pracy Flaherty et al. 201521. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Badanie lokalizacji NFκB; wykres słupkowy, mikroskopia fluorescencyjna, analiza ekspresji białek, efekty ΔsagA.
Rysunek 3: System infekcji oparty na wkładkach z przepuszczalnej membrany umożliwia wizualizację zmian w sygnalizacji gospodarza za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Reprezentatywne dane pokazują, że streptolizyna S nasila sygnalizację prozapalną poprzez aktywację NFκB. Ludzkie keratynocyty HaCaT zainfekowano GAS przy MOI wynoszącym 10 przez 8 hr, korzystając z systemu infekcji opartego na wkładkach z przepuszczalnej membrany. (A i B) Lokalizację jądrową NFκB oceniono za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Procent komórek z lokalizacją jądrową obliczono, licząc liczbę komórek, w których NFκB przemieścił się z cytoplazmy do jądra w danym polu, a następnie dzieląc tę liczbę przez całkowitą liczbę komórek w tym samym polu. Paski skali wskazują 100 µm. (A) Dla każdego stanu przedstawiono średnią z trzech powtórzeń biologicznych, a słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. Ogólną wartość p określono za pomocą ANOVA; p <0,0001. Przeprowadzono testy Dunnetta, aby porównać każdy stan z odpowiadającą mu kontrolą niezinfekowaną. *, p = 0,01-0,05; **, p = 0,001-0,01; ***, p = 0,0001-0,001; ****, p <0,0001. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Flaherty et al. 201521. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres przepuszczalności błony; wykres słupkowy; integralność błony, analiza uwalniania LDH w szczepach bakteryjnych.
Rysunek 4: System infekcyjny oparty na wkładkach z przepuszczalnej membrany pozwala na oznaczenie bakteryjnie indukowanej permeabilizacji błony oraz cytotoksyczności w warunkach braku bezpośredniego kontaktu między bakteriami a komórkami gospodarza. Reprezentatywne dane wykazują, że żywotność keratynocytów spada w obecności aktywnej toksyny SLS. GAS-indukowaną śmierć komórkową oceniono w komórkach HaCaT w obecności WT, deficientnych w SLS lub sagA uzupełniony GAS. Keratynocyty poddano ekspozycji na GAS z wykorzystaniem systemu infekcji opartego na wkładkach z przepuszczalną membraną przez 8–16 h przy MOI wynoszącym 10. (A) Żywotność oceniono za pomocą testu z etydyną homodimerem lub (B) test uwalniania LDH. Na obu panelach przedstawiono średnią z 3 powtórzeń, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Istotność dla każdego punktu czasowego określono za pomocą analizy ANOVA (A) 8 h, p = 0,0241; 12 h, p <0.0001 (B) 8 h, p = 0,0287; 12 h, p = 0,1977; 16 h, p = 0,0031. Przeprowadzono testy Dunnetta w celu porównania średnich z każdego stanu z infekcją typu dzikiego dla odpowiadającego punktu czasowego. *, p = 0,01–0,05; **, p = 0,001–0,01; ***, p = 0,0001–0,001; ****, p <0.0001. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Flaherty i wsp. 201521. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Znormalizowane poziomy ATP; wykres słupkowy; eksperymentalny; porównanie kontroli, typu dzikiego oraz wariantów sagA.
Rycina 5: System infekcji oparty na wkładkach z przepuszczalnej membrany umożliwia dokładne oznaczenie poziomów ATP gospodarza poprzez zapobieganie kontaminacji lizatów komórek gospodarza bakteriami. Przedstawione reprezentatywne dane wykazują zależną od SLS utratę ATP podczas infekcji Streptococcus grupy A. Komórki HaCaT zainfekowano GAS przez 8-16 hr, stosując system infekcji oparty na wkładkach z przepuszczalnej membrany. Wyciągnięto średnią z powtórzeń technicznych (n = 3) z jednego reprezentatywnego powtórzenia biologicznego (2 x 106 komórek na próbkę) dla każdego warunku, a słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. Ogólne wartości p określono za pomocą analizy ANOVA (12 hr, p <0.0001; 16 hr, p <0.0001). Przeprowadzono testy Dunnetta w celu porównania każdego warunku z infekcją typem dzikim dla odpowiadającego punktu czasowego. *, p = 0.01-0.05; **, p = 0.001-0.01; ***, p = 0.0001-0.001; ****, p <0.0001. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Flaherty et al. 201521. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

W niniejszym artykule opisano metodę wykorzystującą system infekcji oparty na przepuszczalnej wkładce membranowej w celu zbadania wpływu toksyny bakteryjnej Streptolizyny S na ludzkie keratynocyty nabłonkowe w systemie in vitro. Protokół ten można dostosować do badania innych wydzielanych bakteryjnych czynników wirulencji, a także alternatywnych typów komórek gospodarza. Ten niedawno opracowany system ma kilka zalet w porównaniu z metodami eksperymentalnymi, które wykorzystują oczyszczone toksyny lub przefiltrowane supernatanty bakteryjne 1-3,8,18-20. System oparty na wkładkach membranowych zapewnia stale utrzymywaną dawkę odpowiedniej toksyny bakteryjnej do komórek gospodarza w trakcie jej wytwarzania, co pozwala na utrzymanie maksymalnej aktywności toksyny, a także zwiększa spójność między eksperymentami. Ponadto system ten bardziej naśladuje warunki fizjologiczne, umożliwiając wydzielanie czynnika w czasie w miarę postępu infekcji i eliminując potrzebę arbitralnego wyboru określonych stężeń toksyn do zastosowania w komórkach gospodarza. Co więcej, system ten zapewniłby również badaczom środki do oceny, czy czynnik bakteryjny będący przedmiotem zainteresowania jest dostarczany do komórek gospodarza w sposób zależny od kontaktu. Zależność od kontaktu jest często testowana poprzez wytwarzanie izogenicznych mutantów bakteryjnych z niedoborem przylegania lub poprzez stosowanie odczynników, które zapobiegają przyleganiu. Opisany tutaj system stanowiłby prostą alternatywę, która uzupełniłaby lub zastąpiła te tradycyjne podejścia.

Oprócz przetestowanych aplikacji opisanych w sekcji 5 protokołu, inne zastosowania, do których ten system infekcji można łatwo dostosować, obejmują pobieranie próbek do macierzy cytokin i testy ELISA. W obu tych przypadkach można zastosować protokół podobny do opisanego dla testów uwalniania LDH. Chociaż nie pokazano tutaj, system ten został wykorzystany do skutecznego zbierania próbek komórek gospodarza do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. W tym zastosowaniu przepuszczalna wkładka membranowa jest usuwana po okresie infekcji, komórki są myte w celu usunięcia pożywki do hodowli komórkowych i stosuje się trypsynę, aby umożliwić pobranie komórek do analizy. Fizyczne oddzielenie bakterii od komórek gospodarza jest szczególnie przydatne w tym zastosowaniu, ponieważ pomaga zapobiegać tworzeniu się dużych agregatów składających się z przylegających bakterii i komórek gospodarza, które w przeciwnym razie mogłyby zakłócać dokładne zliczanie komórek przez cytometr przepływowy.

Chociaż zaobserwowano bardzo spójne odpowiedzi gospodarza, porównując wyniki badań infekcji opartych na wkładce membrany przepuszczalnej z tradycyjnymi badaniami infekcji bezpośrednich, zaobserwowano pewne znaczące różnice w kinetyce tych odpowiedzi gospodarza21. Na przykład zmiany w sygnalizacji gospodarza i cytotoksyczności opartej na błonie potrzebują o 30-50% więcej czasu, aby zajść w modelu infekcji opartej na przepuszczalnej wkładce błonowej niż w odpowiadających im modelach infekcji bezpośredniej. Ponieważ system oparty na wkładkach membranowych wymaga nałożenia pożywki na górne i dolne komory każdej studzienki, system opracowany na potrzeby opisanych tutaj badań wymagał 30% wzrostu całkowitej objętości podłoża na studzienkę w porównaniu z odpowiednimi modelami infekcji bezpośredniej stosowanymi wcześniej21. Ta różnica w całkowitej objętości pożywki, w połączeniu ze zwiększoną odległością między bakteriami a komórkami gospodarza, gdy bezpośredni kontakt jest zabroniony, prawdopodobnie wydłuża czas potrzebny SLS na dyfuzję przez pożywkę, aby dotrzeć do komórek gospodarza i wywołać obserwowane efekty. Ponadto system oparty na wkładce membranowej usuwa wiele czynników wirulencji GAS, które mogą przyczyniać się do uszkodzenia komórek gospodarza; Brak tych dodatkowych czynników w tym systemie prawdopodobnie również przyczyni się do opóźnienia śmierci komórki gospodarza i inicjacji zdarzeń sygnalizacyjnych gospodarza w porównaniu z bezpośrednią infekcją21. Czynniki te powinny być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentów mających na celu ocenę innych wydzielanych składników bakteryjnych.

W celu zidentyfikowania najbardziej znaczących warunków do testowania wpływu wydzielanych czynników bakteryjnych na komórki gospodarza, zaleca się testowanie szeregu punktów czasowych dla każdego zastosowania systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej. Ważne jest, aby rozważyć, w jakich warunkach określony czynnik wirulencji, będący przedmiotem zainteresowania, jest optymalnie wytwarzany (np. faza logarytmiczna, faza stacjonarna, w odpowiedzi na określone sygnały środowiskowe itp.), aby skutecznie zaobserwować jego skutki. W eksperymentach skoncentrowanych na ocenie zmian w białkach sygnalizacyjnych gospodarza konieczne było wybranie punktów czasowych, które pozwalały SLS na dotarcie do komórek gospodarza i wytwarzanie w ilościach wystarczających do wywołania zmian sygnalizacyjnych 21. Jednocześnie ocena zmian w sygnalizacji gospodarza musiała zostać przeprowadzona przed przepuszczalnością błony wywołaną przez SLS, ponieważ efekt ten komplikuje pobieranie lizatów komórek gospodarza do analizy. Śmierć komórki indukowaną przez SLS można optymalnie zaobserwować zarówno w bezpośrednich, jak i przepuszczalnych modelach infekcji opartych na wstawkach błonowych kilka godzin po zainicjowaniu zgłoszonych zdarzeń sygnalizacyjnych21. Ponadto, wybierając interesujące punkty czasowe, ważne jest również, aby upewnić się, że badane bakterie nie są w stanie przeniknąć przez porowatą membranę wkładki w okresie badania. Wytwarzanie niektórych składników bakteryjnych przez dłuższy czas może zakłócić integralność błony i umożliwić przejście bakterii do dolnej komory. Aby ustalić, czy jest to potencjalny problem w systemie będącym przedmiotem zainteresowania, szczepy bakterii, które mają być badane, można zastosować w górnej komorze systemu opartego na wkładce membranowej przepuszczalnej w różnych punktach czasowych. W każdym punkcie czasowym wkładka może być ostrożnie usunięta, a pożywka z dolnej komory może zostać zebrana i wykorzystana w standardowym teście liczenia kolonii (patrz sekcja 1.5). Jeżeli z pożywki do hodowli komórkowych w dolnej komorze nie zostaną utworzone żadne kolonie, można założyć, że membrana wsadowa skutecznie zapobiega przechodzeniu bakterii w badanym punkcie czasowym i obciążeniu bakteryjnym.

Innym eksperymentalnym elementem projektu, który prawdopodobnie będzie wymagał optymalizacji w celu skutecznej analizy wydzielanych czynników bakteryjnych, jest wielość infekcji (MOI). MOI odnosi się do stosunku komórek bakteryjnych do komórki gospodarza, a zatem ma na niego wpływ zbieganie się komórek gospodarza w czasie infekcji oraz liczba jednostek tworzących kolonie bakteryjne (CFU) zastosowanych do komórek. W tych badaniach komórki keratynocytów wyhodowano do 90% konfluencji, co pozwoliło tym komórkom utworzyć spójną monowarstwę z nienaruszonymi ścisłymi połączeniami. Przemyślane rozważenie fizjologicznej organizacji komórek gospodarza, które mają być badane, jest konieczne, aby wybrać odpowiednią konfluencję do eksperymentów z infekcją. Po określeniu odpowiedniej liczby komórek gospodarza na studzienkę, można obliczyć odpowiednią bakteryjną CFU na podstawie pożądanego MOI. W opisanych tutaj badaniach GAS zastosowano do komórek gospodarza przy MOI 10. Odpowiedni MOI będzie się różnić w zależności od różnych bakterii i pożądanych analiz uzupełniających. Niski początkowy MOI jest zazwyczaj bardziej istotny fizjologicznie i pozwala na powolną akumulację czynnika bakteryjnego, który jest przedmiotem zainteresowania, aby uchwycić subtelne zmiany w sygnalizacji komórek gospodarza, zanim widoczne będą dramatyczne zmiany w żywotności komórek gospodarza. Wyższe MOI są stosowane w wielu badaniach oceniających cytotoksyczność, ale efekt ten można również osiągnąć, zaczynając od niskiego MOI i pozwalając infekcji postępować przez dłuższy czas. Ważne jest, aby określić dokładny stosunek CFU do gęstości optycznej dla wszystkich szczepów bakteryjnych, które mają być badane, ponieważ mutanty izogeniczne mogą mieć zmienioną szybkość wzrostu w porównaniu z bakteriami typu dzikiego i dlatego mogą wymagać dodania wyższej lub niższej CFU na studzienkę, aby zapewnić odpowiednie porównanie odpowiedzi gospodarza między szczepami. W przypadkach, gdy badane komórki gospodarza ssaków są zdolne do zabijania bakterii lub hamowania ich wzrostu lub jeśli podejrzewa się niesynchroniczny wzrost między szczepami bakterii, przydatne może być również przeprowadzenie badań w celu oceny końcowego obciążenia bakteryjnego pod koniec okresu infekcji. Można to osiągnąć poprzez zebranie zawartości przepuszczalnej wkładki i wykonanie testu zliczania kolonii podobnego do opisanego w sekcji 1.5 procedury.

Wybór studzienek o odpowiedniej wielkości dla pożądanego testu jest również ważny dla uzyskania optymalnych wyników. Przepuszczalne wkładki membranowe są dostępne w różnych rozmiarach, ale najbardziej spójne wyniki w przedstawionych tutaj badaniach zaobserwowano przy użyciu wkładek zaprojektowanych dla 24-dołkowych i 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Te rozmiary wkładek są stosunkowo łatwe w obsłudze za pomocą sterylnych kleszczy, a łatwość manipulacji ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania niepożądanemu przenoszeniu bakterii z górnej komory do dolnej komory studzienki. W przypadku eksperymentów obejmujących pobieranie lizatów komórek gospodarza, 6 dołków zapewnia odpowiednią liczbę komórek na warunek dla większości analiz i są wystarczająco duże, aby pomieścić skrobaki do komórek do pobierania próbek. W przypadku testów cytotoksyczności, w których komórki gospodarza pozostają przylegające i są znakowane barwnikiem fluorescencyjnym lub kolorometrycznym, który można zmierzyć na czytniku płytek (np. test homodimeru etydyny, test wykluczenia błękitu trypanowego), zaleca się użycie płytki 24-dołkowej z odpowiednimi wkładkami. Do eksperymentów, w których zostanie pobrana i przeanalizowana pożywka do hodowli komórkowej (np. uwalnianie LDH, badania cytokin), można użyć płytek 24-dołkowych lub 6-dołkowych, chociaż mniejsze studzienki zazwyczaj zapewniają odpowiednią objętość próbki do tych analiz i minimalizują użycie wymaganych odczynników. Ogólnie rzecz biorąc, metoda jest bardzo wszechstronna i może być dostosowywana w zależności od potrzeb w celu przygotowania próbek do wielu dalszych zastosowań.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy naszym kolegom z Lee Lab, którzy dostarczyli cennych spostrzeżeń i wiedzy, które bardzo pomogły w tych badaniach. Praca ta została wsparta nagrodą Young Innovator Award przyznawaną przez National Institute of Health, przyznaną S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty jest wspierany przez stypendium Albertus Magnus Fellowship zapewnione przez dr Roberta C. Boguslaskiego oraz asystenturę dydaktyczną w Eck Institute for Global Health na Uniwersytecie Notre Dame.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rosół Todda-HewittaAcumedia7161AUżyj odpowiedniego bulionu dla interesujących gatunków bakterii.
BioSpectrometerEppendorfmodel podstawowyKażdy spektrofotometr UV-Vis jest odpowiedni. 
Szalki PetriegoFisher ScientificFB0875713Odpowiednie są inne marki.
AgarSigmaA1296-1kgInne marki są odpowiednie.
Ludzkie keratynocytyDar z laboratorium Victora Nizeta.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies11995-073Użyj odpowiednich pożywek dla interesującej nas linii komórkowej.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)BiowestS162HStosować odpowiednie dodatki do pożywek dla interesującej nas linii komórkowej.
Naczynia do hodowli tkankowych 10 cmNunc150350Odpowiednie są inne marki.
6-dołkowe naczynia do hodowli tkankowychCytoOnecc7682-7506Inne marki są odpowiednie, ale muszą być kompatybilne z wkładką Corning.
24-dołkowe naczynia do hodowli tkankowychCytoOnecc7682-7524Inne marki są odpowiednie, ale muszą być kompatybilne z wkładką Corning.
Szkiełka nakrywkowe szklaneFisherbrand12-541-BPrzed użyciem należy je sterylizować w autoklawie do powlekania komórek.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco10010-023
Phenol Red Free DMEMLife Technologies31053028Pożywka Phenol Red Free jest wymagana tylko do testu uwalniania LDH.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
L-glutaminaGibco25030149Wymagana tylko do uzupełnienia pożywki do hodowli komórkowych do testu uwalniania LDH.
Pirogronian soduGibcoBP356100Wymagany tylko do uzupełnienia pożywki do hodowli komórkowych do testu uwalniania LDH.
Powlekany kolagenem 0,4 &m; m Wkładki Transwell (6 dołków)Corning3540
Powlekane kolagenem 0,4 μ m Wkładki Transwell (24 dołki)Kleszcze Corning3595
Fisher3120018Muszą one zostać wysterylizowane etanolem przed użyciem wkładek Transwell.
Skrobaki do komórekFisherbrand08-100-241Są one wymagane tylko do zbierania lizatów komórkowych.
ParaformaldehydFisher Scientific04042-500TOKSYCZNY.  Jest to wymagane tylko w przypadku obrazowania immunofluorescencyjnego.
Zestaw do oznaczania kwasu bicunchoninowego (BCA)Pierce23227Można stosować inne testy ilościowe białka.
Tris-glicyna 4 - 15% żele poliakrylamidoweBioRad4561083System buforowy i procent poliakrylamidu należy dobierać na podstawie interesujących białek.
Kaseta do elektroforezy dostarczaBioRad1658063Wymagane tylko do Western Blotting.
Zasilacz do elektroforezyBioRad1645050Wymagany tylko do Western Blotting.
Kaseta transferowa Western blotBioRadWymagana tylko do Western Blot.
Membrana z poliwinylidenu (PVDF)EMD MilliporeIPVH00010wymagana tylko w przypadku Western Blotting.
Tween 20SigmaP1379-500ml
Przeciwciało drugorzędowe królika IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologysc2030Przeciwciało drugorzędowe należy oznaczyć na podstawie wybranej metody wykrywania.
Mysie przeciwciało drugorzędowe IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologysc2031Przeciwciało drugorzędowe należy oznaczyć na podstawie wybranej metody wykrywania. 
Phospho-p38 (T180 + T182) Przeciwciało MAPKSygnalizacja komórkowa4511Wybierz odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe na podstawie interesujących białek.
Całkowite przeciwciało p38 MAPKSygnalizacja komórkowa8690Wybierz odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe na podstawie interesujących białek.
Kozie przeciwciała anty-królicze IgG Alexafluor 488Sondy molekularneA-11034Inne przeciwciała drugorzędowe mogą być stosowane do wykrywania obrazowania immunofluorescencyjnego.
Odczynnik LumiGLO DetectionKPL54-61-00Wymagany tylko do Western Blotting z detekcją na folii.
Folia detekcyjnaBiodotBDB57Wymagana tylko do Western Blotting z detekcją na folii.
Mikroskop fluorescencyjny DeltaVision Nikon 90iNikonInne mikroskopy fluorescencyjne są odpowiednie do tych analiz.
Normalna surowica koziaThermo Scientific31873
Triton X-100SigmaT9284-500mL
DAPI barwienie jądroweSygnalizacja komórkowa4083Wybierz barwienia na podstawie określonych zastosowań immunofluorescencyjnych, które Cię interesują.
Sondy molekularnebarwiące aktyną rodaminowo-falloidynowąR415Wybierz barwienia na podstawie specyficznych zastosowań immunofluorescencyjnych.
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Wymagany tylko do obrazowania immunofluorescencyjnego.
Sondy molekularnehomodimeru etydyny 1E1169Wymagane tylko do testu cytotoksyczności przepuszczalności błony.
Czytnik mikropłytek Spectramax M5molekularneInne czytniki mikropłytek zdolne do wykrywania UV-vis, fluorescencji i luminescencji mogą być odpowiednie.
SaponinaSigma47036-50G-FWymagana tylko do testu cytotoksyczności przepuszczalności błony.
Sondy molekularne Zestaw do oznaczania ATP Life TechnologiesA22066Inne zestawy prawdopodobnie będą odpowiednie.
Zestaw do wykrywania cytotoksyczności do uwalniania LDHRoche11644793001Inne zestawy prawdopodobnie będą odpowiednie.
Nonidet P40 ZamiennikSigma74385-1LInni dostawcy są odpowiedni.
HALT Koktajl z inhibitorami fosfatazyThermo Scientific78420BInne koktajle prawdopodobnie będą odpowiednie.
SIGMAFAST Tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy, bez EDTASigmaS8830-2TABInne koktajle prawdopodobnie będą odpowiednie.
nabłonkowe HaCaT Urządzenia

Bibliografia

  1. Wiles, T. J., Dhakal, B. K., Eto, D. S., Mulvey, M. A. Inactivation of host Akt/protein kinase B signaling by bacterial pore-forming toxins. Mol Biol Cell. 19 (4), 1427-1438 (2008).
  2. Kao, C. Y., Los, F. C. O., et al. Global functional analyses of cellular responses to pore-forming toxins. PLoS Pathog. 7 (3), e1001314(2011).
  3. Ma, X., Chang, W., Zhang, C., Zhou, X., Yu, F. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils. PLoS ONE. 7 (4), e34970(2012).
  4. Sumitomo, T., Nakata, M., et al. Streptolysin S contributes to group A streptococcal translocation across an epithelial barrier. J Biol Chem. 286 (4), 2750-2761 (2011).
  5. Miyoshi-Akiyama, T., Takamatsu, D., Koyanagi, M., Zhao, J., Imanishi, K., Uchiyama, T. Cytocidal effect of Streptococcus pyogenes on mouse neutrophils in vivo and the critical role of streptolysin S. J Infect Dis. 192 (1), 107-116 (2005).
  6. Goldmann, O., Sastalla, I., Wos-oxley, M., Rohde, M., Medina, E. Streptococcus pyogenes induces oncosis in macrophages through the activation of an inflammatory programmed cell death pathway. Cell Microbiol. 11 (1), 138-155 (2009).
  7. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  8. Ratner, A. J., Hippe, K. R., Aguilar, J. L., Bender, M. H., Nelson, A. L., Weiser, J. N. Epithelial cells are sensitive detectors of bacterial pore-forming toxins. J Biol Chem. 281 (18), 12994-12998 (2006).
  9. Stassen, M., Müller, C., et al. The streptococcal exotoxin streptolysin O activates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase- and protein kinase C-dependent pathways. Infect Immun. 71 (11), 6171-6177 (2003).
  10. Porta, H., Cancino-Rodezno, A., Soberón, M., Bravo, A. Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins. Peptides. 32 (3), 601-606 (2011).
  11. Walker, M. J., Barnett, T. C., et al. Disease manifestations and pathogenic mechanisms of group a Streptococcus. Clin Microbiol Rev. 27 (2), 264-301 (2014).
  12. Carapetis, J. R., Steer, A. C., Mulholland, E. K., Weber, M. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis. 5 (11), 685-694 (2005).
  13. Cunningham, M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev. 13 (3), 470-511 (2000).
  14. Molloy, E. M., Cotter, P. D., Hill, C., Mitchell, D. A., Ross, R. P. Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nature Rev Microbiol. 9 (9), 670-681 (2011).
  15. Datta, V., Myskowski, S. M., et al. Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection. Mol Microbiol. 56 (3), 681-695 (2005).
  16. Lee, S. W., Mitchell, D. A., et al. Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5879-5884 (2008).
  17. Mitchell, D. A., Lee, S. W., et al. Structural and functional dissection of the heterocyclic peptide cytotoxin streptolysin S. J Biol Chem. 284 (19), 13004-13012 (2009).
  18. Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., et al. Characterization of Clostridium perfringens TpeL Toxin Gene Carriage Production, Cytotoxic Contributions, and Trypsin Sensitivity. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (6), 2369-2381 (2015).
  19. Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., Winterhalter, M., Zakharian, E., Balashova, N. Pore forming activity of the potent RTX-toxin produced by pediatric pathogen Kingella kingae: Characterization and comparison to other RTX-family members. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (7), 1536-1544 (2015).
  20. Carr, A., Sledjeski, D. D., Podbielski, A., Boyle, M. D., Kreikemeyer, B. Similarities between complement-mediated and streptolysin S-mediated hemolysis. J Biol Chem. 276 (45), 41790-41796 (2001).
  21. Flaherty, R. A., Puricelli, J. M., Higashi, D. L., Park, C. J., Lee, S. W. Streptolysin S Promotes Programmed Cell Death and Enhances Inflammatory Signaling in Epithelial Keratinocytes during Group A Streptococcus Infection. Infect Immun. 83 (10), 4118-4133 (2015).
  22. Guedon, J. T., Luo, K., Zhang, H., Markham, R. B. Monoclonal and Single Domain Antibodies Targeting β-Integrin Subunits Block Sexual Transmission of HIV-1 in In Vitro and In Vivo Model Systems. J Acquir Immune Defic Syndr. 69 (3), 278-285 (2015).
  23. Hu, D., Zhou, J., Wang, F., Shi, H., Li, Y., Li, B. HPV-16 E6/E7 promotes cell migration and invasion in cervical cancer via regulating cadherin switch in vitro and in vivo. Arch Gynecol Obstet. 292 (6), 1345-1354 (2015).
  24. Gangl, K., Waltl, E. E., et al. Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer. Int Arch Allergy Immunol. 166 (4), 291-296 (2015).
  25. Peng, X., Zhang, Q., Zeng, Y., Li, J., Wang, L., Ai, P. Evodiamine inhibits the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro via repressing MMP-2 expression. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1173-1184 (2015).
  26. Zheng, Y., Guo, J., et al. FoxM1 transactivates PTTG1 and promotes colorectal cancer cell migration and invasion. BMC Med Genomics. 8, 49(2015).
  27. Losa, D., Köhler, T., et al. Airway Epithelial Cell Integrity Protects from Cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signals. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (2), 265-275 (2015).
  28. Cook, K. W., Letley, D. P., et al. CCL20/CCR6-mediated migration of regulatory T cells to the Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa. Gut. 63 (10), 1550-1559 (2014).
  29. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  30. Krieg, R. C., Dong, Y., Schwamborn, K., Knuechel, R. Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. J Biochem Biophys Methods. 65 (1), 13-19 (2005).
  31. Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Badanie toksyn bakteryjnychstreptolizyna Sodpowiedzi kom rek gospodarzapaciorkowce grupy Akeratynocyty HaCaTanaliza Western blotobrazowanie immunofluorescencyjnetest permeabilizacji b onytest uwalniania LDH
Wdrożenie systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej w celu zbadania wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.