Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54415

⸱

12 września 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati

W tym artykule

Podsumowanie

W obecnym klimacie ograniczonych zasobów, pojawiają się nowe technologie, które pozwalają badaczom prowadzić badania taniej, szybciej i z większą precyzją. W tym miejscu opisujemy rozwój multipleksowego testu immunologicznego na bazie przeciwciał ślinowych na bazie kulek do pomiaru narażenia ludzi na wiele patogenów środowiskowych jednocześnie.

Streszczenie

Etiologia i wpływ narażenia ludzi na patogeny środowiskowe są głównym problemem na całym świecie, dlatego nieodzowna byłaby możliwość oceny narażenia i infekcji przy użyciu efektywnych kosztowo, wysokoprzepustowych podejść. Niniejszy manuskrypt opisuje opracowanie i analizę multipleksowego testu immunologicznego opartego na kulkach, zdolnego do pomiaru obecności przeciwciał w ludzkiej ślinie przeciwko wielu patogenom jednocześnie. Ślina jest szczególnie atrakcyjna w tym zastosowaniu, ponieważ jest nieinwazyjna, tańsza i łatwiejsza do zebrania niż surowica. Antygeny patogenów środowiskowych sprzężono z karboksylowanymi mikrosferami (kulkami) i wykorzystano do pomiaru przeciwciał w bardzo małych objętościach próbek ludzkiej śliny za pomocą testu fazy roztworu na bazie kulek. Koraliki połączono z antygenami Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norowirusami (G I.1 i G II.4) i wirusem zapalenia wątroby typu A. Aby upewnić się, że antygeny są wystarczająco sprzężone z kulkami, potwierdzono sprzężenie za pomocą specyficznych dla gatunku, pierwotnych przeciwciał wychwytujących pochodzenia zwierzęcego, a następnie przeprowadzono inkubację z biotynylowanymi przeciwciałami wtórnego wykrywania przeciwciał antygatunkowych i reporterem streptawidyny-R-fikoerytryny (SAPE). Jako kontrola do pomiaru niespecyficznego wiązania, jeden zestaw koralików był traktowany identycznie jak inne, z wyjątkiem tego, że nie był sprzężony z żadnym antygenem. Kulki sprzężone z antygenem i kontrolne inkubowano następnie z prospektywnie pobranymi próbkami ludzkiej śliny, mierzonymi na analizatorze o wysokiej przepustowości w oparciu o zasady cytometrii przepływowej, a obecność przeciwciał przeciwko każdemu antygenowi mierzono w jednostkach mediany intensywności fluorescencji (MFI). Ten multipleksowy test immunologiczny ma wiele zalet, w tym więcej danych przy mniejszej próbce; obniżone koszty i robocizna; oraz możliwość dostosowania testu do wielu interesujących nas celów. Wyniki wskazują, że multipleksowy test immunologiczny śliny może być zdolny do identyfikacji wcześniejszych ekspozycji i infekcji, co może być szczególnie przydatne w badaniach nadzorczych z udziałem dużych populacji ludzkich.

Wprowadzenie

Osiemdziesiąt osiem procent chorób związanych z biegunką na całym świecie jest związanych z narażeniem ludzi na skażoną wodę, niebezpieczną żywność i złe warunki sanitarne/higieniczne, powodując około 1,5 miliona zgonów, z których większośćto dzieci1. Jest to główny powód do niepokoju dla urzędników zdrowia publicznego i decydentów. Starając się zbadać narażenie i choroby związane z patogenami przenoszonymi przez wodę i inne patogeny środowiskowe, opracowaliśmy multipleksowy test immunologiczny do pomiaru przeciwciał w próbkachludzkich 2-4. Metoda ta może być stosowana w badaniach epidemiologicznych w celu określenia narażenia ludzi na te patogeny oraz lepszego zdefiniowania immunoprewalencji i incydentów zakażeń.

Ślina jest bardzo obiecująca jako alternatywa dla surowicy do badań nad ludzkimi biomarkerami. Wśród zalet stosowania śliny jest nieinwazyjność i łatwość pobierania próbek, niski koszt, a próbki można łatwo pobrać od dzieciw wieku 5-7 lat. Próbki surowicy i śliny zostały dokładnie przebadane na obecność przeciwciał przeciwko H. pylori2,3,8, Plasmodium falciparum9, Entamoeba histolytica10, Cryptosporidium parvum3,11, Streptococcus pneumonia12, wirusom zapalenia wątroby A i C13-14, norowirusom2-4,15, T. gondii2-4, wirusowi dengi16, ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV)17 oraz Escherichia coli O157:H718.

Multipleksowy test immunologiczny pozwala na analizę wielu analitów jednocześnie w obrębie jednej objętości próbki i w ramach jednego cyklu lub przebiegu. Multipleksowane antygeny C. jejuni, T. gondii, H. pylori, wirusa zapalenia wątroby typu A i dwóch norowirusów wykorzystano do pomiaru odpowiedzi ludzkich przeciwciał IgG2-4 i IgA3,4 i IgA2,3 oraz osocza na te patogeny za pomocą testu immunologicznego multipleksowego opartego na koralikach. W połączeniu z badaniami epidemiologicznymi dotyczącymi narażenia na drobnoustroje w wodzie, glebie i żywności, rodzaj testu opisany w tym badaniu może dostarczyć cennych informacji w celu lepszego zrozumienia zakażeń wywołanych przez patogeny środowiskowe. Co więcej, dane dotyczące przeciwciał w ślinie uzyskane z takich badań mogą być wykorzystane do ulepszenia modeli oceny ryzyka19-22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uzyskano zgodę od Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) na pobieranie stymulowanych próbek śliny szczelinowej od plażowiczów na plaży Boquerón, Puerto Rico, w ramach Krajowego Badania Epidemiologicznego i Środowiskowego Rekreacyjnego (NEEAR) Agencji Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (USEPA)23 w celu oceny narażenia i chorób związanych z pływaniem. Uczestnicy badania wyrazili świadomą zgodę i zostali poinstruowani w zakresie korzystania z urządzenia do pobierania śliny przez przeszkolonych wykonawców USEPA. Próbki śliny zostały wysłane na lodzie, a po otrzymaniu zostały odwirowane i przechowywane w temperaturze -80 °C, jak opisano4.

1. Aktywacja koralików

  1. Zawiesić wywar z zestawu kulek przez wirowanie i sonikację przez 20 sekund i przenieść około 5,0 x10 6 kulek (400 μl) do probówek mikrowirówek.
    Uwaga: Koraliki są dostarczane w stężeniu 12,5 x 106 kulek/ml.
  2. Granulki bulionowe osadzać przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 2 minuty.
  3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulowane kulki w 100 μl wody destylowanej (dH2O) za pomocą wiru i sonikacji przez 20 sekund. Powtórzyć krok 1.2.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić przemyte kulki w 80 μl 100 mM jednozasadowego fosforanu sodu o pH 6,2 przez wirowanie i sonikację przez 20 sekund.
  5. Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór N-hydroksysulfosuccinimidu (Sulfo-NHS) o stężeniu 50 mg/ml, dodając 200 μl dH2O do 10 mg podwielokrotności Sulfo-NHS. Wymieszaj wirem.
  6. Dodać 10 μl 50 mg/ml Sulfo-NHS do kulek. Wymieszaj wirem.
  7. Bezpośrednio przed użyciem sporządzić 50 mg/ml roztworu chlorowodorku 1-etylo-[3dimetyloaminopropylo]karmodimidu (EDC), dodając 200 μl wody destylowanej (dH2O) do podwielokrotności 10 mg EDC. Wymieszaj wirem.
  8. Dodać 10 μl 50 mg/ml roztworu EDC do kulek. Wymieszaj wirem. Inkubować kulki przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności, z mieszaniem wirowym w odstępach 10-minutowych. Aktywowane kulki osadzać przez mikrowirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 2 minuty.
  9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 250 μl 50 mM kwasu 2-[N-Morfolino]etanosulfonowego (MES), pH 5,0 przez wirowanie i sonikację przez 20 sekund.
  10. Aktywowane kulki osadzać przez mikrowirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 2 minuty.
  11. Powtórz kroki 1.9 i 1.10.
    Uwaga: Zapewnia to w sumie dwa prania z 50 mM MES, pH 5,0.
  12. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl 50 mM MES, pH 5,0 za pomocą wiru i sonikacji przez 20 sekund.

2. Sprzężenie koralików

  1. Sprzęgnąć antygeny z zestawami kulek, stosując stężenia pokazane w tabeli 1.
  2. Dodaj każdy antygen do aktywowanych kulek i doprowadź całkowitą objętość do 500 μl w 50 mM MES, pH 5,0. Wymieszaj antygeny i kulki za pomocą wiru.
  3. Inkubować antygeny i kulki przez 2 godziny z mieszaniem przez rotację (~15 obr./min) w temperaturze pokojowej w ciemności. Sprzężone kulki osadzać przez mikrowirowanie przy 10 000 x g przez 2 minuty.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 500 μl buforowanej solą fizjologiczną (PBS) z buforem fosforanowym (PBS) - albuminą surowicy bydlęcej (BSA) - monolaurynianem polioksyetylenosorbitanu (Tween-20) - azydkiem sodu (PBS-TBN) o pH 7,4 za pomocą wiru i sonikacji. Granulki osadzać przez mikrowirowanie przy 10 000 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant.
    Uwaga: Azydek sodu jest bardzo toksyczną substancją chemiczną. Jest śmiertelny w przypadku połknięcia lub kontaktu ze skórą. Nie wdychać pyłu/dymu/gazu/mgły/oparów ani rozpylonej cieczy. Podczas obchodzenia się z odpowiednimi środkami ochrony osobistej należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i utylizować je zgodnie z odpowiednimi przepisami.
  5. Zawiesić kulki w 1 ml PBS-TBN za pomocą wiru i sonikacji na 20 sekund.
  6. Granulki granulować przez mikrowirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 2 minuty.
  7. Powtórz kroki 2.5 i 2.6.
    Uwaga: Zapewnia to w sumie dwa prania z PBS-TBN.
  8. Ponownie zawiesić sprzężone i umyte kulki w 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% Azide, pH 7,4. Przechowuj sprzężone koraliki w lodówce o temperaturze 2-8 °C w ciemności.

3. Liczba koralików

  1. Przygotować rozcieńczenie sprzężonych kulek w stosunku 1:10 w wodzie lub buforze PBS.
  2. Załadować 10 μl rozcieńczenia kulki na hemocytometr w miejscu wprowadzenia próbki.
  3. Policz koraliki widoczne w jednej z siatek narożnych 4 x 4. Obliczyć całkowitą liczbę sprzężonych kulek, korzystając z następującego wzoru: Liczba (1 róg siatki 4 x 4) x (1 x 104) x (współczynnik rozcieńczenia) x objętość rekompozycji w ml.

4. Potwierdzenie sprzężenia antygenów

  1. Zawiesić podstawową mieszaninę kulek sprzężonych z antygenami będącymi przedmiotem zainteresowania za pomocą wiru i sonikacji na 20 sekund.
  2. Przygotować roboczą mieszaninę kulek, rozcieńczając sprzężone półkulki do końcowego stężenia 100 kulek / μl każdego unikalnego zestawu kulek w buforze PBS-1% BSA (PBS-1% BSA, pH 7,4).
  3. Przygotować co najmniej 7 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń przeciwciała pierwszorzędowego antygatunku IgG zgodnie z zaleceniami producenta w 96-dołkowej okrągłej płytce dennej z buforem PBS-1% BSA.
  4. Wstępnie zwilżyć oddzielną 8-dołkową kolumnę (8 rzędów) 96-dołkowej dolnej płytki filtra dla każdego testu potwierdzającego sprzężenie antygenu 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Dodać 50 μl mieszaniny kulek roboczych (kulki sprzężone z antygenem) do wstępnie zwilżonych studzienek.
  5. Dodać 50 μl rozcieńczeń przeciwciał do rzędów 1-7 każdej kolumny 96-dołkowej płytki filtracyjnej i 50 μl buforu PBS-1% BSA do rzędu 8 zamiast rozcieńczonego przeciwciała, które ma służyć jako studzienki tła. Wymieszać z pipetorem wielokanałowym, pipetując 5 razy w górę i w dół. Wykonaj tę samą procedurę dla każdego zestawu koralików sprzężonych z antygenem, który ma zostać potwierdzony.
  6. Przykryć i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 500 obr./min. Usunąć supernatant za pomocą próżni.
  7. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz 1x. Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.
  8. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało wtórne do wykrywania przeciwciał IgG swoistych dla danego gatunku do 16 μg/ml w PBS-1% BSA.
  9. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki, pipetując w górę i w dół 5 razy.
  10. Przykryć płytkę filtracyjną i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.
  11. Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.
  12. Rozcieńczyć reporter streptawidyny-R-fikoerytryny (SAPE) do 24 μg/ml w PBS-1% BSA.
  13. Dodać 50 μl reportera do każdego dołka i mieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy.
  14. Przykryć płytkę filtracyjną i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.
  15. Zawiesić kulki w 100 μl PBS-1% BSA i przeanalizować 50 μl za pomocą analizatora29.
    Uwaga: Wyniki multipleksowego testu immunologicznego opartego na kulkach są mierzone w medianie intensywności fluorescencji (MFI). Zawsze odwołuj się do najnowszej wersji instrukcji oprogramowania, jeśli jest dostępna, aby uniknąć błędów.

5. Test immunologiczny Multiplex w ślinie

  1. Usuń ślinę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
  2. Ponownie zawiesić zapasy kulek sprzężonych z antygenem za pomocą wiru i sonikacji na 20 sekund.
  3. Przygotować roboczą mieszaninę kulek, rozcieńczając sprzężone granulki do końcowego stężenia 100 kulek/μl każdego unikalnego zestawu kulek w buforze PBS-1% BSA.
  4. Przygotować rozcieńczenie śliny w stosunku 1:4 z buforem PBS-1% BSA w 96-dołkowej płytce z głębokim dołkiem.
  5. Wstępnie zwilżyć płytę filtracyjną ze 100 μl buforu płuczącego i usunąć supernatant za pomocą podciśnienia.
  6. Dodać 50 μl roboczej mieszaniny kulek i równą objętość rozcieńczonej śliny do 95 dołków z 96-dołkowymi płytkami filtracyjnymi w celu ostatecznego rozcieńczenia 1:8. Wymieszać reakcje za pomocą pipetora wielokanałowego. Do jednej studzienki kontrolnej dodaj 50 μl kulek sprzężonych z antygenem oraz 50 μl buforu BSA PBS-1% (jako zamiennik śliny).
  7. Przykryć i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 500 obr./min. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.
  8. Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.
  9. Rozcieńczyć biotynylowane kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG o wtórnym wykrywaniu do 16 μg/ml w PBS-1% BSA.
  10. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki i wymieszać zawartość za pomocą pipetora wielokanałowego.
  11. Przykryć płytkę filtracyjną i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.
  12. Zawiesić kulki w 50 μl PBS-1% BSA za pomocą pipetora wielokanałowego.
  13. Rozcieńczyć reporter streptawidyny-R-fikoerytryny (SAPE) do 24 μg/ml w PBS-1% BSA.
  14. Dodać 50 μl reportera do każdego dołka i wymieszać z pipettorem wielokanałowym.
  15. Przykryć płytkę filtracyjną i pozostawić do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej. Usunąć supernatant za pomocą próżni. Przemyć studzienki 100 μl buforu do przemywania i usunąć supernatant za pomocą próżni. Powtórz pranie 1x.
  16. Zawiesić kulki w 100 μl PBS-1% BSA i przeanalizować 50 μl za pomocą analizatora29.
    Uwaga: Wyniki multipleksowego testu immunologicznego są mierzone w jednostkach mediany intensywności fluorescencji (MFI). Zawsze odwołuj się do najnowszej wersji instrukcji oprogramowania, jeśli jest dostępna, aby uniknąć błędów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeden unikalny zestaw kuleczek wykorzystano jako kontrolę w celu pomiaru nieswoistego wiązania oraz zmienności między próbkami. Kuleczki te traktowano identycznie jak kuleczki sprzężone z antygenem, z wyjątkiem tego, że w etapie sprzęgania nie inkubowano ich z żadnym antygenem. Wartości MFI >500 uzyskane z kuleczek kontrolnych inkubowanych ze wszystkimi próbkami śliny zostały usunięte z dalszych analiz ze względu na podejrzenie kontaminacji surowicą, a pozostałe odpowiedzi rozkładano l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyniki te wskazują, że metoda multipleksowego testu immunologicznego jest przydatna do rozróżniania próbek śliny, które są immunododatnie lub immunoujemne. Aby określić immunopozytywność, opracowano pojedynczy punkt odcięcia, obliczając średnią plus trzy odchylenia standardowe przekształconych logarytmicznie odpowiedzi MFI kontrolnych niesprzężonych kulek testowanych na wszystkich próbkach śliny. Punkt odcięcia umożliwił ocenę narażenia i immunoprewalencji na jeden lub wiele patogenów. Ta zdolność dyskryminacyjna może by...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska poprzez swoje Biuro Badań i Rozwoju finansowała i zarządzała opisanymi tutaj badaniami. Został on poddany przeglądowi administracyjnemu Agencji i zatwierdzony do publikacji. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.

Podziękowania

Clarissa Curioso otrzymała wsparcie poprzez nominację do Programu Uczestnictwa w Badaniach w Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska administrowanej przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy międzyagencyjnej umowy między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a Amerykańską Agencją Ochrony Środowiska.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt i oprogramowanie
MicrowirówkaThermo Electron Corporation75002446Służy do wirowania próbek
Mieszalnik wirowyVWRG560Służy do mieszania próbek
Sonicator (mini)Fisher Scientific15-337-22Służy do oddzielania kulek
Pipetory P10, P20, P100, P1000, 8 kanałów. CappRóżne
hemacytometry (jasna linia)Housser Scientific 3200Służy do liczenia sprzężonych koralików
Wielositowy rozdzielacz próżniowyMilliporeMSVMHTS00Stosowany na etapach mycia w celu usunięcia supernatantu
MicroShakerVWR12620-926Służy do mieszania kulek podczas inkubacji
Stojak na probówki (1,5 ml i 0,5 ml) (różne)VWR30128-346
WagaMettler lub innaSłuży do pomiaru odczynników płuczących do wytwarzania
Mieszalnik próbek DynabeadInvitrogen947-01Używany podczas etapu inkubacji sprzęgającej
MatLab (R2014b)MathWorks, Inc.Służy do analizy danych odpowiedzi przeciwciał
Microsoft Excel 2014Microsoft CorporationSłuży do analizy danych odpowiedzi przeciwciał
Luminex Analyzer z oprogramowaniem xPonent 3.1Luminex CorporationLX200-XPON3.1Przyrząd i oprogramowanie używane do przeprowadzania testu
Antigens
GI.1 Wirus Norwalk: cząstkap Xi Jiang (CCHMC)*NA* Szpital Dziecięcy w Cincinnati. Stężenie końcowe 5 &mikro;g.
GII.4 Norowirus VA387: cząstka pXi Jiang (CCHMC)*NA*Szpital Dziecięcy w Cincinnati. Stężenie końcowe 5 &mikro;g.
Wirus zapalenia wątroby typu A: koncentrat II stopnia z hodowli komórkowejMeridian Life Sciences8505Antygen sprzężony w 100 &mikro; g
Helicobacter pylori: lizatMeridian Life SciencesR14101Antygen sprzężony przy 25 &mikro; g
Toxoplasma gondii: rekombinowany antygen p30 (SAG1)Meridian Life SciencesR18426sprzężony przy 25 &mikro; g
Campylobacter jejuni: zabijane termicznie całe komórkiKPL50-92-93Antygen sprzężony przy 50 &mikro; g
Przeciwciała pierwotne
anty-Norowirus świnki morskiej(CCHMC)*NAUżywany do potwierdzania sprzężenia
Mysz przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A IgGMeridian Life SciencesC65885MUżywany do potwierdzania sprzężenia
Mysz przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A IgGMeridian Life SciencesC65885MUżywany do potwierdzania sprzężenia
BacTraceAffinity Oczyszczone przeciwciało przeciwko Helicobacter pyloriKPL01-93-94Służy do potwierdzania sprzężenia
Kozia pAb do Toxoplasma gondiiAbcamAb23507Służy do potwierdzania sprzężenia
BacTrace Goat anty-Campylobactergatunek KPL01-92-93Służy do potwierdzania
sprzężeniaDrugorzędny  Przeciwciała
Biotyna-SP-sprzężona AffiniPure Donkey anty-kozia IgG (H+L)Jackson705-065-149Służy do potwierdzania sprzężenia
Biotynylowany królik anty-kozi IgG (H+L)KPL16-13-06Służy do potwierdzania sprzężenia
Biotynylowany kozioł anty-mysi IgG (H+L)KPL16-18-06Służy do potwierdzania
sprzężeniaPowinowactwo Oczyszczone przeciwciało Biotyna Znakowane kozie anty-królicze IgG (H + L)KPL176-1506Służy do potwierdzania sprzężenia
< mocne>Materiały eksploatacyjne< / mocne>
1,5 ml probówki wirówkowe z kopolimeruUSA Scientific1415-2500Używane jako probówki do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania
10 i mikro; l wkłady do końcówek do pipetBioVentures5030050C
200 & mikro; l wkłady do końcówek do pipetBioVentures5030080C
1,000 µ l Wkłady do końcówek do pipetBioVentures5130140C
Folia aluminiowaRóżni dostawcyUżywane utrzymują koraliki w ciemności podczas inkubacji
Płytki Deep WellVWR40002-009Służy do rozcieńczania próbek śliny
Wielositowe płytki filtracyjneMilliporeMABVN1250Służy do przeprowadzania testów
System zbierania śliny OracolMalvern Medical Developments LimitedSłuży do pobierania śliny
Odczynniki
Karboksylowane mikrosfery (kulki)Luminex CorporationW zależności od zestawu kulekAntygeny są sprzężone z mikrosferami
EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu)Pierce77149 lub 22980Stosowany w aktywacji
kulekSulfo-NHS (N-hydroksysulfosuccinimid)Pierce24510Stosowany w aktywacji kulek
Steptawidyna-R-fikoerytryna (1 mg / ml)Sondy molekularneS-866Stosowany jako reporter
MES (kwas 2-[N-Morfolino]etanosulfonowy)SigmaM-2933Używany do sprzężenia
Tween-20 (monolaurynian polioksyetylenosorbitanu)SigmaP-9416Stosowany w buforze płuczącym do usuwania niespecyficznych wiążących
< silnych>białkowych< / strong>
PBS-TBN Bufor blokujący/magazynujący (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azide, pH 7,4)**Filtruj Sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 & stopni; C
PBS, pH 7,4SigmaP-3813138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
BSASigmaA-78880,1% (w/v)
Tween-20SigmaP-94160,2% (v/v)
Azydek sodu (0,05% azydek)**SigmaS-8032**Uwaga: Azydek sodu jest bardzo toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Utylizować zgodnie z obowiązującymi przepisami.
MES/Bufor sprzęgający (0,05 M MES, pH 5,0)
MES (kwas 2-[N-Morfolino]etanosulfonowy)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
Bufor testowy (PBS, 1% BSA, pH 7,4)  Filter Sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
PBS, 1% BSA, pH 7,4SigmaP-3688138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA
silny>bufor aktywacji (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)Filter Sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 & C
NaH2PO4 (Fosforan sodu, jednozasadowy bezwodny)SigmaS-31390,1 M NaH2PO4
5 N NaOHFisherSS256-500
Wash Buffer (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)Filter Sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 ° C
PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4SigmaP-3563138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN
<

Bibliografia

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104(2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046(2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040(2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
  29. Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

test oparty na kuleczkachcytometria przep ywowasprz ganie antygenuludzka linadetekcja wt rnastreptawidyna R PEmediana intensywno ci fluorescencji
Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.