Method Article

Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

DOI:

10.3791/54416

⸱

August 16th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Neurophysiologie (CP601), ULB Neuroscience Institute (UNI), Université Libre de Bruxelles, 2Medical Molecular Sciences, Centre for Biomolecular Sciences, University of Nottingham, 3School of Life Sciences, University of Nottingham, 4Division of Cancer and Stem Cells, Centre for Biomolecular Sciences, School of Medicine, University of Nottingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy czułą immunochemiczną metodę mapowania przestrzennego rozkładu pochodnych utleniania 5mC opartą na użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja zasad cytozynowych (5-metylocytozyna, 5mC) występująca w genomach kręgowców jest zwykle związana z wyciszaniem transkrypcji. 5-hydroksylometylocytozyna (5hmC), 5-formylocytozyna (5fC) i 5-karboksylcytozyna (5caC) to niedawno odkryte zmodyfikowane zasady cytozyny wytwarzane przez enzymatyczne utlenianie 5mC, których funkcje biologiczne pozostają stosunkowo niejasne. Zastosowano szereg podejść, od technik biochemicznych po techniki oparte na przeciwciałach, aby zbadać dystrybucję genomu i globalną zawartość tych modyfikacji w różnych systemach biologicznych. Chociaż niektóre z tych podejść mogą być przydatne do ilościowej oceny tych zmodyfikowanych form 5mC, większość z tych metod nie dostarcza żadnych informacji przestrzennych dotyczących rozkładu tych modyfikacji DNA w różnych typach komórek, wymaganych do prawidłowego zrozumienia ich ról funkcjonalnych. W tym artykule przedstawiamy bardzo czułą metodę immunochemicznego wykrywania zmodyfikowanych form cytozyny. Metoda ta pozwala na jednoczesne wykrywanie tych znaczników epigenetycznych z markerami linii białek i może być wykorzystana do badania ich lokalizacji jądrowej, przyczyniając się w ten sposób do rozszyfrowania ich potencjalnych ról biologicznych w różnych kontekstach eksperymentalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja zasad cytozyny w DNA (5mC) stanowi główny znacznik epigenetyczny występujący w genomach kręgowców związany z wyciszaniem transkrypcji1. 5mC jest wprowadzane i utrzymywane przez metylotransferazy DNA2-5 i wykazano, że odgrywa ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym imprintingu genomu, inaktywacji chromosomu X, różnicowaniu i rozwoju komórek3, 6. W związku z tym zaburzenie wzorców genomowych 5mC wiąże się z wieloma chorobami7, 8-11. Pomimo postępów w zrozumieniu roli 5mC w rozwoju i chorobie, nadal pozostaje w dużej mierze nieznane, w jaki sposób ślad ten jest usuwany w tkankach rozwijających się i dorosłych. Ostatnio zaproponowano kilka potencjalnych mechanizmów demetylacji DNA, w tym aktywne i pasywne mechanizmy demetylacji12, 13, 14, 15. Odkrycie produktów sekwencyjnego utleniania 5mC, w którym pośredniczy 10-11 enzymów translokacyjnych (tet1/2/3), takich jak 5-hydroksylometylocytozyna (5hmC), 5-formylocytozyna (5fC) i 5-karboksylcytozyna (5caC) w eukariotycznym DNA 16, 17, 18, 19 wywołało spekulacje, czy mogą one służyć jako produkty pośrednie procesów demetylacji DNA lub działać jako stabilne znaczniki epigenetyczne same w sobie13. Podczas gdy wykazanie, że składnik naprawy przez wycinanie zasady, glikozylaza tymina-DNA (TDG) może wiązać i usuwać zarówno 5fC, jak i 5caC z DNA19, 20, sugeruje rolę zmodyfikowanych pochodnych 5mC w aktywnej demetylacji DNA. Ostatnie dowody wskazujące, że 5fC/5caC może modulować szybkość procesywności RNA II wskazują na potencjalny udział tych znaczników w regulacji transkrypcji29. Ze względu na to potencjalne znaczenie biologiczne utlenionych form 5mC, do badania ich dystrybucji genomowej i globalnej zawartości zastosowano szereg technik biochemicznych i opartych na przeciwciałach16, 19-24.

Biorąc pod uwagę, że większość organów kręgowców składa się z różnych typów komórek i że rozkład zmodyfikowanych zasad cytozyny jest specyficzny dla tkanek i typów komórek 16-18, 20, 23, 25-27, określenie przestrzennego rozkładu utlenionych pochodnych 5mC w różnych tkankach staje się ważnym zadaniem eksperymentalnym niezbędnym do odkrycia ich funkcji biologicznych. Większość podejść biochemicznych i opartych na przeciwciałach nie dostarcza żadnych informacji przestrzennych dotyczących rozmieszczenia zmodyfikowanych form 5mC w różnych typach tkanek i komórek. W przeciwieństwie do tego, techniki oparte na immunochemii mogą zapewnić szybkie narzędzie do oceny rozkładu przestrzennego i lokalizacji jądrowej 5mC28 i jego utlenionych pochodnych20. To powiedziawszy, zgłaszana bardzo niska obfitość 5fC (20 na każde 106 cytozyny) i 5caC (3 na każde 106 cytozyny) w genomie myszy18 stanowi poważne wyzwanie dla standardowej immunochemii.

Tutaj opisujemy wysoce czułą metodę immunochemiczną, która zapewnia solidne i szybkie wykrywanie utlenionej formy cytozyny w tkance mózgowej ssaków. Poprzez włączenie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą w połączeniu z etapem amplifikacji sygnału, metoda ta pozwala uniknąć wyzwań związanych z wykrywaniem bardzo niskich ilości 5fC i 5caC. Ponadto technika ta może być wykorzystana do jednoczesnego wykrywania zmodyfikowanych form cytozyny z markerami specyficznymi dla linii, skutecznie uzupełniając inne podejścia w wyjaśnianiu biologicznych funkcji tych znaczników epigenetycznych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z komisją etyczną Uniwersytetu w Nottingham.

1. Wybór odpowiedniego preparatu tkankowego do barwienia immunologicznego

  1. Wygeneruj zatopiony w parafinie wycinek zarodków myszy CD1 typu dzikiego i dorosłych tkanek mózgowych, jak opisano wcześniej25. Do metody barwienia immunologicznego należy użyć skrawków tkanki mózgowej utrwalonych 4% formaldehydem (FA) lub 4% paraformaldehydem (PFA)25.
    nuta: Stosowanie skrawków tkanek osadzonych w parafinie wymaga dewaxingu przed znakowaniem przeciwciał. Ponieważ leczenie 2 - 4 M kwasem solnym (HCl) zastosowane w protokole denaturacji DNA nie jest zgodne z większością strategii odzyskiwania antygenu, zalecamy stosowanie skrawków krio- lub mikrotomowych do jednoczesnego wykrywania pochodnych utleniania 5 mC z markerami białkowymi.

2. Odparafinowywanie skrawków tkanek zatopionych w parafinie

  1. W działającej komorze bezpieczeństwa klasy II umyj skrawki tkanek zatopionych w parafinie w słoiku z kopliny wypełnionym ksylenem, 2 razy po 10 minut w temperaturze RT.
    nuta: Ważne jest, aby używać świeżego ksylenu, ponieważ niepełne usuwanie parafiny może prowadzić do niespójnych wzorów barwienia.
  2. Po odwoskowaniu należy szybko nawodnić skrawki tkanki, myjąc kolejno w 95, 75 i 50% etanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

3. Utrwalanie i przepuszczalność skrawków krio- i mikrotomów

  1. Napraw uwodnione skrawki tkanki, umieszczając je w lodowato zimnym 4% PFA lub 4% FA na 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć nadmiar utrwalacza, przemłukując skrawki solą fizjologiczną w PBS (bufor fosforanowy) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Skrawki tkanek należy przeniknąć, umieszczając je w słoiku z kopliny wypełnionym PBX (0,5% Triton X-100 w PBS) na 30 minut w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar PBX, myjąc skrawki na krótko w PBT (0,01% Tween 20 w PBS).

4. Barwienie immunologiczne dla pochodnych Oxi-5mC

  1. Umieścić przepuszczalne skrawki w 2 N HCl na 60 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia DNA.
    nuta: Chociaż wyższe stężenia HCl (np. 4 N) prowadzą do bardziej efektywnej denaturacji DNA, nie są one kompatybilne z jednoczesnym wykrywaniem oksy-mC z DAPI.
  2. Umieść skrawki w 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zneutralizować HCl. Alternatywnie, umyj sekcje trzy razy po 5 minut każda w PBS. Inkubować skrawki w PBT przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Ostrożnie usuń płyn z obszaru otaczającego część tkanki, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia części tkanki na dowolnym etapie, delikatnie potrząsając szkiełkiem. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby otoczyć sekcję bez dotykania sekcji.
    nuta: Hydrofobowy długopis barierowy zmniejsza objętość przeciwciała wymaganego do barwienia tkanki i może pozwolić na barwienie wielu sekcji różnymi przeciwciałami na tym samym szkiełku.
  4. Inkubować skrawki w 100 μl roztworu blokującego (10% albuminy surowicy bydlęcej w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
    nuta: Pominięcie tego kroku nie wpłynęłoby na skuteczność barwienia zmodyfikowanych zasad cytozynowych.
  5. Inkubować skrawki tkanek w 100 μl mysiego monoklonalnego anty-5hmC w rozcieńczeniu 1:5 000 i rozcieńczeniu 1:1 000 króliczych poliklonalnych przeciwciał pierwszorzędowych anty-5caC w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Alternatywnie, w razie potrzeby przeprowadzić inkubację przez noc w temperaturze 4 °C.
    nuta: Skrawki przetworzone bez przeciwciał pierwszorzędowych mogą służyć jako odpowiednie kontrole ujemne dla procedury barwienia. Mysie embrionalne skrawki mózgu z 12,5 dnia po stosunku wzbogacone w 5caC, 5fC i 5hmC 20 mogą być wykorzystane jako kontrola pozytywna.
  6. Usuń nadmiar przeciwciał, myjąc skrawki w słoiku Coplin wypełnionym PBT trzy razy przez 5 minut każda w słoiku Coplin w temperaturze RT.
    nuta: Zwiększenie objętości roztworów myjących może zmniejszyć plamienie tła.
  7. Usuń nadmiar PBT i, jeśli to konieczne, ponownie owiń sekcje hydrofobowym pisakiem barierowym, ponieważ PBT zawiera detergent, który może osłabić barierę hydrofobową.
  8. Wykonaj rozcieńczenie 1:400 koziego przeciwciała anty-królika sprzężonego z HRP i rozcieńczenie 1:400 przeciwciała anty-mysiego 555 w roztworze blokującym.
  9. Inkubować skrawki tkanek w 100 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych z kroku 4.9 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  10. Umyj skrawki tkanek w słoiku Coplin wypełnionym PBT trzy razy po 5 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Umieścić skrawki tkanki w 100 μl tyramidu rozcieńczonego w stosunku 1:200 w buforze wzmacniającym sygnał tyramidu na 2 minuty w temperaturze suchej.
  12. Natychmiast usunąć nadmiar roztworu tyramidu, myjąc szkiełka trzykrotnie po 5 minut każde w PBT.
  13. Ostrożnie usuń nadmiar PBT i natychmiast przykryj sekcje kroplą medium montażowego (patrz Lista materiałów).
  14. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na skrawkach chusteczki i natychmiast uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.
  15. Skrawki tkanek przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka godzin przed badaniem mikroskopowym. Zbadaj pod mikroskopem fluorescencyjnym przy 405, 488 i/lub 555 nm (powiększenie 10 - 40x).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić rozkład 5hmC w sekcjach tkanki mózgowej, przeprowadziliśmy wspólne wykrywanie tej modyfikacji epigenetycznej z markerem dla neuronów postmitotycznych, NeuN, wykorzystując komercyjne przeciwciało anty-5hmC, które specyficznie oddziałuje z tym znakiem, ale nie z innymi formami zmodyfikowanej cytozyny20, 25. Analiza immunohistochemiczna rozkładów 5hmC i 5caC w dorosłym mózgu wykazała, że podczas gdy wyraźne barwienie 5hmC kolokalizuje się z komórkami NeuN dodatnimi, komórki glejowe NeuN-ujemne mają niższe poziomy genomowego 5hmC (Figura 1) 20.

Niedawno pokazaliśmy, że zależne od Tet utlenianie 5mC działa podczas specyfikacji linii nerwowych komórek macierzystych (NSC) 20. Pomimo tego, że są immunochemicznie niewykrywalne w NSC, 5fC i 5caC wykazują wyraźne barwienie immunologiczne we wczesnych stadiach różnicowania NSC w kierunku linii neuronalnych i glejowych. Oba te znaczniki przejściowo kumulują się równocześnie z pojawieniem się markerów wczesnego różnicowania neuronalnego i glejowego20. Aby określić rozkład 5caC w różnicujących się NSC, przeprowadziliśmy współbarwienie tego znacznika markerem glejowym GFAP na utrwalonych kulturach NSC po 3 dniach od indukcji różnicowania glejowego. W przeciwieństwie do NSC lub dojrzałych astrocytów (dane nie pokazane), zaobserwowaliśmy silny sygnał 5caC w stosunkowo dużej części komórek eksprymujących GFAP w tych kulturach (Figura 2)20.

figure-results-1
Rysunek 1. Barwienie koimmunologiczne 5hmC (zielone) z NeuN (czerwone) w dorosłej tkance mózgowej barwionej przeciwstawnie DAPI (niebieskie). Wyświetlane są poszczególne kanały i widok scalony. Podziałka skali wynosi 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Jednoczesne barwienie 5caC z GFAP w hodowli NSC w 3. dniu różnicowania glejowego. Wyświetlane są poszczególne kanały i widok scalony. Podziałka skali wynosi 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż zgłaszana niska obfitość pochodnych utleniania 5mC, 5fC i 5caC w niektórych tkankach stanowiłaby znaczące ograniczenia dla standardowego protokołu immunochemicznego, włączenie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą pozwoliło na wykrycie tych modyfikacji cytozyny w utrwalonych tkankach i komórkach (Figura 2). Jednak optymalny czas inkubacji z roztworem tyramidu powinien być zoptymalizowany eksperymentalnie dla każdej pojedynczej partii zestawu do wzmacniania sygnału tyramidowego, w którym obserwuje się liniową zależność między intensywnością sygnału a czasem trwania wzmocnienia sygnału na podstawie tyramidu, szczegóły patrz Almeida i in. 2012 26. Ponadto stosunek sygnału do tła można znacznie poprawić, przenosząc płyny do płukania w słoiku z Coplinu, aby umożliwić skuteczne usunięcie nadmiaru przeciwciał. Po inkubacji z roztworem tyramidu ważne jest, aby natychmiast zatrzymać reakcję poprzez przemycie roztworem PBT w celu zmniejszenia zabarwienia tła. Bardzo ważne jest, aby skrawki nie wyschły w żadnym momencie zabiegu.

Skuteczność depulacji DNA można poprawić, przeprowadzając reakcję odpieniania w temperaturze 37 °C. Podczas gdy użycie 4 N HCl zamiast 2 N zwiększa barwienie zmodyfikowanych form 5mC przy użyciu 4 N HCl do depulacji DNA nie pozwoliłoby na jednoczesne barwienie z DAPI, ponieważ oddziałuje on wyłącznie z dwuniciowym DNA.

Chociaż technika ta może zapewnić solidną półilościową ocenę zmodyfikowanych form zasad cytozyny, jeśli są wykrywalne, nie można jej stosować do oceny bezwzględnych poziomów 5mC lub jego pochodnych utleniania. W związku z tym zalecamy stosowanie innych podejść uzupełniających, ale ilościowych16, 19 -24. Od czasu odkrycia pochodnych utleniania 5mC w genomach ssaków opracowano kilka podejść do badania ich ról biologicznych16, 19-24. Chociaż podejścia te mogą być cenne w określaniu bezwzględnych poziomów pochodnych utleniania 5mC, nie dostarczają informacji na temat ich rozkładu przestrzennego20, 26. Z powodzeniem zastosowaliśmy opisaną tutaj metodę do mapowania przestrzennego rozkładu i lokalizacji pochodnych utleniania 5mC w różnych typach komórek rozwijającego się i dorosłego mózgu20

Ujawniając ich rozmieszczenie przestrzenne20, technika ta może mieć kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologicznych implikacji i losu utlenionych pochodnych 5mC w różnych kontekstach biologicznych, w których można wykryć te zmodyfikowane pochodne 5mC, w tym różnicowanie komórkowe, rozwój i chorobę. Ponadto opisana tutaj metoda może dać półilościową ocenę utlenionych pochodnych 5mC w różnych tkankach, oceniając kinetykę reakcji peroksydazy (która jest proporcjonalna do intensywności barwienia) w różnych czasach inkubacji tyramidem26.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jednostce Zaawansowanej Mikroskopii (Szkoła Nauk Przyrodniczych, Uniwersytet w Nottingham) oraz zespołowi Histologii MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edynburg), Instytutowi Neuronauki w ULB i FNRS za pomoc i wsparcie. Prace te były wspierane przez MRC (MR/L001047/1 do A.D.J.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Słoik z kopinyCole-ParmerUY-48585-30Ksylen
Używaj tylko w komorze bezpieczeństwa klasy II
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)Fisher Scientific12821680pH 7,5, filtrowany przed użyciem
4% paraformaldehydu (PFA)Sigma AldrichP6148Po przygotowaniu może być przechowywany w temperaturze -20 ° C w porcjach przez kilka miesięcy
4% formaldehydu  Panie przewodniczący, panie i panowie!Sigma AldrichF8775Po wyprodukowaniu może być przechowywany w temperaturze -20 & deg; C w podakach przez kilka miesięcy
Etanol, bezwodny denaturowany, stopień histologicznySigma Aldrich64-17-595, 75, 50% w PBS
0,01% Tween 20 w PBSSigma AldrichP9416PBT
0,5% Triton X-100 w PBSSigma AldrichX100PBX
2 N HClSigma Aldrich71826ostrzeżenie skrajnie toksyczny
100 mM Tris-HCl PromegaH5121pH dostosowane do 8,5
hydrofobowy długopis barierowyAbcamab2601do immunohistochemii
Szkiełkowa komora wilgotnościowaLaboratorium Urządzeń Naukowych197-BL
mysie przeciwciało anty-5mCDiagenodeC15200081monoklonalne przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało anty-5hmCMotyw aktywny39791królik poliklonalny przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało anty-5caCMotyw aktywny61225królicze poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe
sprzężone z peroksydazą przeciwciało anty-królicze secondayDakoK1497
555-kongjuowane kozie przeciwciało anty-mysieSondy molekularneA-11005  przeciwciało drugorzędowe
10% BSASigma AldrichA9418Roztwór blokujący
22 x 32 mm Szkiełka nakrywkowe szklaneBDH406/0188/24
System wzmacniania sygnału tyramidowegoPerkin ElmerNEL741001KTInne sprzężone z fluorochomami przeciwciała seconday mogą być stosowane do kodetekcji oksy-5mC 
  Podłoże montażowe z DAPIVector LabsH-1200
Bezbarwny lakier
poliklonalne przeciwciało poliklonalne anty-GFAP z kurczakaThermo ScientificPA5-185981:400 rozcieńczenie
anty-NeuN mysie przeciwciało monoklonalneMerck miliporeMAB377Brozcieńczenie 1:400
wykonany ze szkła do paznokci

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).">Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
  2. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).">Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
  3. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).">Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
  4. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).">Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
  5. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).">Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
  6. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).">Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
  7. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).">Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  8. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).">Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
  9. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).">Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
  10. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).">Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
  11. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).">Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
  12. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).">Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
  13. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).">Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
  14. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).">Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
  15. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).">Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
  16. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).">Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
  17. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).">Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  18. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).">Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
  19. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).">He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
  20. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).">Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
  21. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).">Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
  22. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).">Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
  23. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367(2010).">Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367(2010).
  24. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181(2010).">Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181(2010).
  25. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).">Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
  26. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).">Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
  27. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905(2013).">Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905(2013).
  28. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).">Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
  29. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).">Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modified Cytosine DetectionImmunohistochemistry ProtocolTyramide Signal Amplification5hmC 5caC AnalysisDNA Methylation StudyEpigenetic Mark DetectionNuclear Localization AnalysisCo detection With MarkersTissue Section ProcessingConfocal Imaging Application

Related Articles