Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54421

⸱

18 września 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

W tym artykule

Podsumowanie

W tym modelu zapalenia jelita grubego napędzanego antygenem, limfocyty T OT-II CD4+ wyrażające białko czerwonej fluorescencji zostały adoptywnie przeniesione do myszy RAG-/-, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne w fagocytach jednojądrzastych (MP). Gospodarzom poddano prowokację Escherichia coli (E. coli) wykazującej ekspresję białka albuminy jaja kurzego (OVA) połączonego z cyjanowym białkiem fluorescencyjnym (CFP).

Streszczenie

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) to przewlekłe zapalenie przewodu pokarmowego (GIT). Jednym z najlepszych sposobów badania mechanizmów immunologicznych zaangażowanych w chorobę jest model transferu limfocytów T zapalenia jelita grubego. W tym modelu myszy z niedoborem odporności (biorcy RAG-/-) są odtwarzane za pomocą naiwnych limfocytów T CD4 + od zdrowych gospodarzy typu dzikiego.

Ten model pozwala na badanie najwcześniejszych zdarzeń immunologicznych prowadzących do chorób i przewlekłych stanów zapalnych, kiedy stan zapalny jelit trwa nadal, ale nie zależy od zdefiniowanego antygenu. Aby zbadać potencjalną rolę komórek prezentujących antygen (APC) w procesie chorobowym, pomocne jest posiadanie modelu choroby opartego na antygenie, w którym zdefiniowany antygen pochodzenia komensalnego prowadzi do zapalenia jelita grubego. W związku z tym opracowano model zapalenia jelita grubego sterowanego przez antygen. W tym modelu OT-II limfocyty T CD4 +, które mogą rozpoznawać tylko określone epitopy w białku OVA, są przenoszone do gospodarzy RAG /- prowokowanych E. coli wykazujących ekspresję CFP-OVA. Model ten pozwala na badanie oddziaływań między APC a limfocytami T w blaszce właściwej.

Wprowadzenie

Jelito to największa powierzchnia ciała, która jest wystawiona na działanie środowiska zewnętrznego. Ogromne ilości rezydujących mikroorganizmów kolonizują ludzkie jelito, tworząc mikrobiotę jelitową (lub mikroflorę). Szacuje się, że składa się on z nawet 100 bilionów komórek drobnoustrojów i stanowi jedno z najgęściej zaludnionych siedlisk bakteryjnych znanych w biologii1-3. W przewodzie pokarmowym bakterie kolonizują niszę jelitową, w której przeżywają i namnażają się4. W zamian mikrobiota wyposaża gospodarza w dodatkowe cechy funkcjonalne, które nie są zakodowane w jego genomie1. Na przykład mikrobiota stymuluje proliferację komórek nabłonka, wytwarza witaminy, których gospodarze nie są w stanie sami wyprodukować, reguluje metabolizm i chroni przed patogenami4-6. Biorąc pod uwagę ten korzystny związek, niektórzy autorzy sugerowali, że ludzie są "superorganizmami" lub "holobiontami", które są mieszanką genów bakteryjnych i ludzkich. Biorąc pod uwagę korzystny wpływ mikrobioty na gospodarza (ludzkiego), jelitowy układ odpornościowy musi tolerować drobnoustroje komensalne, aby umożliwić ich istnienie w świetle, ale także zabijać patogeny, które atakują od strony światła9-11. Jelitowy układ odpornościowy rozwinął mechanizmy rozróżniania nieszkodliwych i potencjalnie szkodliwych mikroorganizmów luminalnych; Mechanizmy te nie są jednak jeszcze dobrze poznane12. Utrzymanie integralności jelit wymaga ściśle regulowanej homeostazy immunologicznej, aby utrzymać równowagę między tolerancją a odpornością13. Brak równowagi w homeostazie immunologicznej przyczynia się do indukcji chorób jelit, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD)3,14.

Istnieją dwa główne typy IBD: choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC). Pacjenci z tymi chorobami zwykle cierpią z powodu krwawienia z odbytu, silnej biegunki i bólu brzucha15,16. Pojedyncza przyczyna IBD jest nadal nieznana, ale połączenie czynników genetycznych, wpływów środowiskowych i rozregulowanych odpowiedzi immunologicznych może być kluczowym wydarzeniem dla rozwoju choroby.

Modele zwierzęce dla IBD są używane od ponad 50 lat. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano nowe systemy modelowe IBD w celu przetestowania różnych hipotez dotyczących patogenezy IBD17,18. Najlepiej scharakteryzowanym modelem przewlekłego zapalenia jelita grubego jest model transferu komórek T, który indukuje zakłócenie homeostazy komórek T19,20. Model ten polega na przeniesieniu naiwnych limfocytów T z myszy immunokompetentnych do gospodarzy, którzy nie mają limfocytów T i B (takich jak myszy RAG-/- i SCID)16,21. Rozwój choroby w tym modelu jest monitorowany przez 3-10 tygodni poprzez ocenę obecności biegunki, zmniejszonej aktywności fizycznej i utraty masy ciała. Jest to tak zwany syndrom wyniszczenia16. W porównaniu ze zdrowymi myszami tkanka okrężnicy przeszczepionych gospodarzy jest grubsza, krótsza i cięższa16. Korzystając z modelu transferu limfocytów T, można zrozumieć, w jaki sposób różne populacje limfocytów T mogą przyczyniać się do patogenezy IBD22. Model transferu limfocytów T nie analizuje interakcji między APC a limfocytami T w procesie chorobowym w sposób specyficzny dla antygenu. Wykazano, że interakcja między komórkami szpikowymi a komórkami limfoidalnymi może być odpowiedzialna za rozwój zapalenia jelit23. Chociaż wiele aspektów IBD zostało wyjaśnionych, początkowe zdarzenia, które prowadzą do rozwoju choroby, nadal muszą być jasno zrozumiane.

Wykazano, że w przypadku braku przenoszenia mikrobioty nie można stwierdzić zapalenia jelita grubego24. Ostatnio kilka teorii sugeruje, że IBD może być wynikiem odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakteriom komensalnym25. Autorzy zasugerowali również, że bakterie komensalne są niezbędne do wywołania stanu zapalnego w dalszej części jelita26. U zwierząt wolnych od zarazków (GF) jelitowy układ odpornościowy jest na ogół upośledzony27,28, ale kolonizacja tych myszy mieszaniną bakterii wolnych od specyficznych patogenów powoduje rozwój w pełni kompetentnego jelitowego układu odpornościowego29. W związku z tym mikrobiota wydaje się być kluczowym elementem w patogenezie IBD, zarówno jako mechanizm predysponujący do rozwoju zapalenia jelit, jak i chroniący przed jego rozwojem30,31. Obecne teorie sugerują, że IBD jest wynikiem braku równowagi mikrobiologicznej, zwanej dysbiozą, u pacjentów predysponowanych genetycznie32, ale nie jest jeszcze jasne, czy dysbioza jest przyczyną, czy konsekwencją choroby12. Biorąc pod uwagę rolę mikroorganizmów w rozwoju IBD, eksperymenty in vitro wykazały, że limfocyty T CD4 + mogą być aktywowane przez APC pulsowane bakteriami jelitowymi33,34.

Ponadto, wykazano, że antygeny różnych gatunków bakterii komensalnych, takich jak E. coli, Bacteroides, Eubacterium i Proteus, są w stanie aktywować limfocyty T CD4+ 35. Wskazuje to, że prezentacja antygenów bakteryjnych limfocytom T ma znaczenie dla rozwoju IBD. Aby zmniejszyć złożoność wielu antygenów pochodzących z mikroflory w procesie chorobowym, stworzono szczep E. coli, który wytwarza antygen OVA. Transferowe zapalenie jelita grubego wywołano przez wstrzyknięcie limfocytów T specyficznych dla OVA zwierzętom skolonizowanym przez E. coli wykazujące ekspresję OVA.

Ten model opiera się na najnowszych dowodach sugerujących, że CX3CR1+ MP, główny podzbiór komórek w blaszce właściwej okrężnicy (cLP)36, oddziałują z limfocytami T CD4+ podczas transferowego zapalenia jelita grubego37. Posłowie pobierają próbki światła jelita na obecność antygenu cząsteczkowego, takiego jak bakterie, za pomocą dendrytów36, 38,39. Wcześniejsze badania wykazały, że MP mogą również pobierać rozpuszczalne antygeny, takie jak OVA, wprowadzone do światła jelita40,41. Biorąc pod uwagę obfitość CX3CR1 + MP w cLP, możliwe jest, że komórki te mogą pobierać próbki bakterii luminalnych i wchodzić w interakcje z limfocytami T CD4. Obrazowanie konfokalne myszy przeszczepionych z limfocytami T CD4 + specyficznymi dla OVA skolonizowanymi E. coli CFP-OVA pokazuje, że CX3CR1 + MP mają kontakt z limfocytami T CD4 + OT-II podczas rozwoju zapalenia jelita grubego wywołanego antygenem. Model ten umożliwia badanie procesu prezentacji antygenu między jelitowymi APC a limfocytami T specyficznymi tylko dla określonych bakterii wykazujących ekspresję antygenu w świetle jelita.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy były hodowane i trzymane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w obiekcie dla zwierząt Uniwersytetu w Ulm (Ulm, Niemcy). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi lokalnego komitetu ds. wykorzystywania i opieki nad zwierzętami oraz Krajową Ustawą o Dobrostanie Zwierząt.

1. Budowa plazmidu pCFP-OVA

  1. Amplifikuj pełnowymiarowy gen OVA za pomocą starterów Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTTTTTGATGTATT-5') i Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5')37 przy użyciu plazmidu pCI-OVA (opornego na ampicylinę)42 jako matrycy. Sklonować produkt PCR (tj. sekwencję kodującą OVA) do dostępnego na rynku środkowego wektora faga, wykorzystując miejsca ograniczeń SpeI i ClaI starterów i wektora, aby uzyskać specyficzny plazmid OVA.
  2. Amplifikuj gen kodujący CFP wraz z silnym konstytutywnym promotorem Phyper za pomocą plazmidu pAD 1-cCFP (odpornego na chloramfenikol) 43 jako matrycy i starterów CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5') i CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCACCACCACCATGTAGAGTTCATCCATCCATGC-5')37.
  3. Sklonuj gen kodujący CFP do specyficznego plazmidu OVA (odpornego na ampicylinę) przy użyciu miejsc restrykcyjnych SpeI i SacI starterów i wektora37. W ten sposób wprowadza się dystans 6 reszt glicyny między kodowaniem CFP a sekwencją kodowania OVA.

2. Budowa E.coli pCFP-OVA

  1. Wyhodować szczep E.coli DH10B w 100 ml pożywki Luria Bertani (LB) tlenowo w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej przez noc.
  2. Zmieszać 800 μl kultury bakteryjnej z 200 μl glicerolu, aby utworzyć bulion glicerolowy i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Dodać 50 μl szczepu E.coli DH10B z bulionu glicerolowego do 5 ml pożywki LB i hodować je tlenowo w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej przez noc.
  4. Przenieść kulturę do przegrody o pojemności 1 l kolby Erlenmeyera z 250 ml pożywki LB w temperaturze 37 °C w obrotowym wstrząsie.
  5. Hodować bakterie do gęstości optycznej 0,5 przy długości fali 600 nm (OD600), a następnie schładzać kulturę na lodzie przez 30 minut. Odwirować bakterie przy 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zawiesić bakterie w 100 ml lodowatego sterylnegoH2Oi odwirować bakterie przy 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Ponownie zawiesić bakterie w 100 ml lodowatego 10% glicerolu i odwirować bakterie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powtórz ten ostatni krok dwukrotnie.
  7. Po ostatnim etapie mycia ponownie zawiesić bakterie w 700 μl 10% glicerolu. Zamrozić 50 μl podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  8. Rozmrozić podwielokrotność 50 μl na lodzie i przenieść do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji (odległość elektrody 2 mm).
  9. Dodać 5 μl plazmidowego DNA (100 ng) do 50 μl podwielokrotności E. coli. Wykonaj elektroporację pojedynczym impulsem przy 25 μF, 200 omach (Ω) i napięciu 2,5 kV.
  10. Zawiesić bakterie w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki SOC (5 g/l ekstraktu drożdżowego, 2 g/l tryptonu, 10 mM chlorku sodu, 2,5 mM chlorku potasu, 10 mM chlorku magnezu, 10 mM siarczanu magnezu) i inkubować w temperaturze 37 °C tlenowo przez 1 godzinę.
  11. Bakterie na płytkach LB-agar uzupełnione ampicyliną 100 μg/ml (dodać 100 μl bulionu 100 mg/ml ampicyliny do 100 ml LB-agaru) i inkubować przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C.
  12. Zebrać pojedyncze kolonie i ponownie umieścić je na płytkach z agarem LB uzupełnionych ampicyliną 100 μg/ml. Inkubować przez noc w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C.
  13. Wybierz pojedyncze kolonie i hoduj je przez noc w 10 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną 100 μg/ml w celu izolacji plazmidu. Użyj dostępnego w handlu mini zestawu do przygotowania plazmidu i wymyj plazmidowe DNA za pomocą 30 μldH 2O (woda destylowana) zgodnie z protokołem producenta. Zweryfikuj plazmidy za pomocą analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania DNA37,42,43.
  14. Umieścić kulturę dodatnich klonów E. coli pCFP-OVA w 100 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną 100 μg/ml. Uprawiać tlenowo w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej przez noc.
  15. Zmieszać 800 μl kultury bakteryjnej z 200 μl czystego glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  16. Resztę nocnej kultury odwirować przy 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) i ponownie zawiesić osad w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Umieścić 10 μl zawiesiny na szkiełku podstawowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
  17. Obserwować próbki w standardowej mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić ekspresję fluorescencji CFP-OVA (wzbudzenie CFP przy 450 nm, emisja przy 480 nm). Analizuj bakterie, zaczynając od powiększenia 400X.
  18. Odwirować 1 ml bakterii z nocnych kultur przy 5 000 x g przez 10 minut, RT. Zawiesić osad w 40 μl PBS i gotować w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  19. Odwirować próbki o masie 30 000 x g przez 10 minut i użyć supernatantów do analizy Western blot37. Użyj wyhodowanego przez królika przeciwciała poliklonalnego anty-OVA rozcieńczonego w stosunku 1:400.

3. Generacja OT-II/Czerwonych Myszy

  1. Skrzyżowanie samca / samicy myszy OT-II z samicą / samcem myszy wykazującej ekspresję białka czerwonej fluorescencji (oba szczepy dostępne na rynku) w celu wygenerowania myszy OT-II / czerwonych37.

4. Izolacja komórek śledziony

  1. Poddaj eutanazji myszy OT-II/Red przez zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu przez wdychanie dowolnego eteru chlorowcowanego (do 5% do indukcji) dostępnego na rynku.
  2. Użyj nożyczek, aby przeciąć lewą górną część brzucha myszy. Pod tą częścią brzuszną znajduje się śledziona (owalny kształt o ciemnoczerwonym kolorze). Użyj nożyczek i pęsety, aby go usunąć.
    1. Ekstrahować śledzionę myszy OT-II/Red i przepuścić ją przez sitko o wielkości 100 μm umieszczone na probówce o pojemności 50 ml za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Umyć sitko dwukrotnie 10 ml PBS uzupełnionego 1% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS).
  3. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 390 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 5 ml wstępnie podgrzanego buforu do lizy (144 mM NH4Cl, 17 mM Tris, pH = 7,2) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Przemyć próbkę 25 ml PBS uzupełnionego 1% FBS. Wirować przy 390 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 10 ml PBS uzupełnionego 1% FBS.
  5. Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Inkubować przez 1-2 minuty.
    1. Napełnij komorę hemocytometru 10 μl barwionych komórek. Policz komórki pod mikroskopem w czterech kwadratach 1 x 1 mm2 jednej komory i określ średnią liczbę komórek na kwadrat. Żywe komórki wydają się białe, martwe komórki wydają się niebieskie. Aby określić liczbę komórek/ml, pomnóż liczbę komórek przez współczynnik rozcieńczenia. Jeśli liczone są 2-4 ćwiartki, podziel przez liczbę kwadrantów.

5. Wzbogacanie limfocytów T CD4 + CD62 L+

  1. Wzbogać komórki śledziony w limfocyty T CD4 + CD62L + za pomocą zestawu do izolacji magnetycznej przy użyciu zasad selekcji negatywnej lub dodatniej. Tutaj użyj selekcji negatywnej, aby wyizolować limfocyty T CD4 + i użyj selekcji pozytywnej, aby jeszcze bardziej wzbogacić populację CD62L + w puli limfocytów T CD4 +.
    UWAGA: W procedurze selekcji negatywnej komórki, które nie zostaną wyizolowane (tutaj: wszystkie komórki CD4-ujemne) są znakowane specyficznymi przeciwciałami sprzężonymi z mikrokulkami magnetycznymi. Podczas etapów mycia kolumny limfocyty T CD4 + przechodzą przez kolumnę, dzięki czemu można je łatwo zebrać. W procedurze selekcji pozytywnej komórki, które mają zostać wyizolowane, są znakowane odpowiednim przeciwciałem sprzężonym z mikrokulkami magnetycznymi. Podczas etapów mycia kolumny oznakowane komórki pozostaną w kolumnie i można je zebrać poprzez usunięcie kolumny z pola magnetycznego i przepłukanie jej buforem.
  2. W przypadku procedury selekcji negatywnej należy ponownie zawiesić 107 całkowitych komórek śledziony w 40 μl zimnego PBS uzupełnionego 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Dodać 10 μl koktajlu przeciwciał znakowanych biotyną dostarczonego z zestawem do izolacji magnetycznej (specyficzne przeciwciała wiążące limfocyty T inne niż CD4+) i inkubować 15 minut na lodzie.
    1. Dodać 30 μl zimnego PBS uzupełnionego 0,5% BSA i 20 μl mikrogranulek antybiotyny. Inkubować 20 minut na lodzie.
    2. Dodać do próbki 10 ml PBS uzupełnionego 0,5% BSA i wirować przy 390 x g przez 5 minut. Powtórzyć ten krok dwukrotnie. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego PBS uzupełnionego 0,5% BSA.
    3. Umieścić kolumnę przeznaczoną do procedury selekcji negatywnej w polu magnetycznym i przepłukać ją 3 ml zimnego PBS uzupełnionego 0,5% BSA. Dodać zawiesinę komórkową do kolumny i przemyć 3 razy 3 ml zimnego PBS uzupełnionego 0,5% BSA.
    4. Odwirować komórki ścieku przy 390 x g przez 5 minut. Ścieki przechodzące przez kolumnę zawierają nieznakowane limfocyty T CD4+. Zawiesić osad w 1 ml PBS uzupełnionym 0,5% BSA i policzyć komórki.
    5. Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Inkubować przez 1-2 minuty.
      1. Napełnij komorę hemocytometru 10 μl barwionych komórek. Policz komórki pod mikroskopem w czterech kwadratach 1 x 1 mm2 jednej komory i określ średnią liczbę komórek na kwadrat. Żywe komórki wydają się białe, martwe komórki wydają się niebieskie. Aby określić liczbę komórek/ml, pomnóż liczbę komórek przez współczynnik rozcieńczenia. Jeśli liczone są 2-4 ćwiartki, podziel przez liczbę kwadrantów.
  3. W przypadku procedury selekcji pozytywnej należy dodać 10 μl mikrogranulek CD62L na 107 wstępnie wzbogaconych frakcji limfocytów T CD4+. Inkubować 15 minut na lodzie.
    1. Dodać do próbki 10 ml PBS uzupełnionego 0,5% BSA i wirować przy 390 x g przez 5 minut. Powtórzyć ten krok dwukrotnie. Zawiesić w 500 μl zimnego PBS uzupełnionego 0,5% BSA.
    2. Umieścić specjalną kolumnę do procedury selekcji negatywnej w polu magnetycznym i przepłukać 500 μl zimnego PBS uzupełnionego 0,5% BSA na kolumnę. Dodać zawiesinę komórkową do kolumny i przemyć 3 razy 500 μl zimnego PBS uzupełnionego 0,5% BSA.
    3. Usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na odpowiedniej probówce zbiorczej. Dodać 1 ml PBS uzupełnionego 0,5% BSA do kolumny i wypłukać limfocyty T CD4+ CD62L+ zatrzymane w kolumnie, mocno wciskając tłok do kolumny.
      UWAGA: Wyizolowane limfocyty T CD4+ CD62L+ są teraz gotowe do dalszych zastosowań, takich jak eksperymenty in vivo. Zgodnie z instrukcją producenta z zestawu do izolacji limfocytów T CD4+ CD62L+, mikrogranulki nie są toksyczne. Ze względu na mały rozmiar (około 50 nm) nie aktywują komórek i nie nasycają epitopów na powierzchni komórki. Dlatego wyizolowane komórki można przenieść do myszy z niedoborem odporności w celu wywołania zapalenia jelita grubego37,44,45.
    4. Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Inkubować przez 1-2 minuty.
      1. Napełnij komorę hemocytometru 10 μl barwionych komórek. Policz komórki pod mikroskopem w czterech kwadratach 1 x 1 mm2 jednej komory i określ średnią liczbę komórek na kwadrat. Żywe komórki wydają się białe, martwe komórki wydają się niebieskie. Aby określić liczbę komórek/ml, pomnóż liczbę komórek przez współczynnik rozcieńczenia. Jeśli liczone są od 2 do 4 ćwiartek, podziel przez liczbę kwadrantów.

6. Indukcja zapalenia jelita grubego wywołanego przez antygen

  1. Wstrzyknąć dootrzewnowo 3 x 105 limfocytów T OT-II/Red CD4 + CD62L + do myszy CX3CR1GFP /+ x RAG-/-. W celu indukcji swoistego dla antygenu zapalenia jelita grubego należy podawać E. coli pCFP-OVA co drugi dzień w dawce 1 x 108 jednostki tworzącej kolonię (CFU) w 100 μl PBS na zwierzę przez zgłębnik lub wkroplenie doustne za siekaczami.
  2. Dwa razy w tygodniu należy monitorować masę ciała przeszczepionych myszy i ich stan kliniczny (obecność krwi w stolcu, konsystencja stolca i aktywność myszy).

7. Próbki tkanek do badania histopatologicznego

  1. Pobrać próbki tkanek z jelita grubego myszy, utrwalić je w neutralnie buforowanej formalinie (10%) i zatopić w parafinie, jak opisano wcześniej36,46.
  2. Próbki parafiny należy przeciąć na mikrotom, zamontować na szkiełkach podstawowych i wykonać barwienie H&E47,48.
  3. Kategoryzuj histologię jelita grubego zgodnie z wcześniejszymi publikacjami47,48: normalne (wynik 0); łagodne zapalenie jelita grubego (wynik 1), umiarkowane zapalenie jelita grubego (wynik 2) i ciężkie zapalenie jelita grubego (wynik 3).

8. Izolacja komórek blaszki właściwej okrężnicy

  1. Eutanazja przeszczepionych myszy przez zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu przez wdychanie dowolnego halogenowanego eteru (do 5% do indukcji) dostępnego na rynku.
  2. Połóż zwierzę brzuchem do góry. Użyj kleszczy, aby chwycić skórę z przodu do ujścia cewki moczowej. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę wzdłuż brzusznej linii środkowej od pachwiny do klatki piersiowej. Odciągnij skórę do tyłu po bokach.
  3. Przeciąć przezroczystą ścianę mięśnia otrzewnej i otworzyć jamę ciała. Zidentyfikuj okrężnicę, która biegnie od odbytu do kątnicy49. Wytnij 2 kończyny i uwolnij tkankę z tłuszczu.
  4. Otwórz okrężnicę wzdłużnie za pomocą nożyczek do preparowania. Za pomocą pęsety potrząśnij tkanką jelita grubego na szalce Petriego zawierającej 25 ml PBS uzupełnionego 1% FBS w celu usunięcia zanieczyszczeń i śluzu. Pokrój okrężnicę na 5 - 8 mm kawałki.
  5. Umieścić segmenty jelita grubego w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml buforu do mycia. Bufor do przemywania zawiera 500 ml DPBS, 10 mM Hepes i 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
  6. Obracaj rurkę przez 30 sekund z maksymalną prędkością.
  7. Inkubować probówkę z segmentami jelita grubego w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, wytrząsając przez 10 minut.
  8. Po inkubacji wirować probówkę przez 30 sekund z maksymalną prędkością.
  9. Odrzucić supernatanty i umieścić próbki tkanek w nowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml buforu do przemywania wodą. Powtórz kroki 6-9 trzy razy
  10. Odrzucić sklarowane osady i umieścić próbki tkanek na płytce Petriego zawierającej 25 ml PBS. Za pomocą pęsety delikatnie potrząsaj próbkami tkanek na szalce Petriego przez kilka sekund, aby usunąć resztki komórek nabłonka. Powtórz ten krok trzy razy.
  11. Pociąć tkanki okrężnicy na 2 x 2 mm2 kawałki i wytrawić je przez inkubację w 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z 0,5 mg/ml kolagenazy typu VIII z Clostridium histolyticum i 10 U/ml DNaseI.
  12. Obracaj rurkę przez 30 sekund z maksymalną prędkością.
  13. Inkubować fragmenty jelita grubego w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez 35 minut, a następnie wirować probówkę przez 30 sekund z maksymalną prędkością co 5 minut.
  14. Pod koniec inkubacji wiruj rurkę przez 30 sekund z maksymalną prędkością.
  15. Zebrać strawione fragmenty, przepuszczając je przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na nowej probówce o pojemności 50 ml.
  16. Przemyć próbkę, dodając 20 ml DPBS i odwirować przy 400 g przez 5 minut. Następnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml DPBS.
  17. Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Inkubować przez 1-2 minuty.
    1. Napełnij komorę hemocytometru 10 μl barwionych komórek. Policz komórki pod mikroskopem w czterech kwadratach 1 x 1 mm2 jednej komory i określ średnią liczbę komórek na kwadrat. Żywe komórki wydają się białe, martwe komórki wydają się niebieskie. Aby określić liczbę komórek/ml, pomnóż liczbę komórek przez współczynnik rozcieńczenia. Jeśli liczone są 2-4 ćwiartki, podziel przez liczbę kwadrantów.

9. Barwienie zewnątrzkomórkowe do analizy FCM

  1. Odwirować komórki cLP przez 5 minut przy 390 x g. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml FACS A (PBS uzupełniony 1% BSA i 0,1% azydkiem sodu)
    UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny. Może powodować niedociśnienie, hipotermię, ból głowy, drgawki lub śmierć. Rozcieńczone roztwory azydku sodu (0,1 do 1,0%) zwykle nie stanowią nadzwyczajnego zagrożenia dla użytkownika, ale działają drażniąco na oczy i skórę. Dlatego należy używać azydku sodu tylko w kapturze chemicznym, mając na sobie fartuch laboratoryjny i podwójną parę jednorazowych rękawiczek nitrylowych.
  2. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze RT z przeciwciałem monoklonalnym (mAb) 2,4G2 skierowanym przeciwko FcγRIII/II CD16/CD32 (0,5-1 μg mAb/106 komórek) rozcieńczonym w FACS A.
  3. Dodać 200 μl FACS A do komórek i odwirować przez 5 minut przy 390 x g. Powtórz ten krok dwukrotnie. Inkubować komórki z 0,5 ng/106 komórek odpowiedniego mAb przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć przeciwciała w FACS A.
  4. Dodać 200 μl FACS A do komórek i odwirować przez 5 minut przy 390 x g. Powtórz ten krok dwukrotnie. Zawiesić próbki w 100 μl FACS A.
  5. Analizuj limfocyty T z myszy CX3CR1GFP / + x RAG -/- rozpuszczonych za pomocą limfocytów T OT-II / Red CD4 w cytometrze przepływowym37.
  6. Analizuj dane za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania.

10. Analiza mikroskopii konfokalnej

  1. Przeanalizuj okrężnicę myszy CX3CR1GFP / + rozpuszczonych lub nie z komórkami T OT-II / Red CD4 + CD62L + i karmionych doustnie co drugi dzień 1 x 108 CFU szczepu E. coli DH10B pCFP-OVA.
  2. Usuń okrężnicę z myszy za pomocą nożyczek i pęsety. Otwórz go wzdłużnie za pomocą nożyczek preparacyjnych.
  3. Wyciąć nożyczkami 5-8 mm kawałek jelita grubego, nałożyć na szkiełka podstawowe i przykryć szkiełkami nakrywkowymi.
  4. Analizuj próbki jelita grubego za pomocą mikroskopu konfokalnego w powiększeniu 40/1,30.
  5. Wykryj CX3CR1+ MPs, znakowane zielonym białkiem fluoresceinowym (GFP), za pomocą zestawu filtrów ze wzbudzeniem przy 488 nm i emisją przy 509 nm.
  6. Wykryj limfocyt T CD4 + wykazujący ekspresję białka czerwonego za pomocą zestawu filtrów ze wzbudzeniem przy 554 nm i emisją przy 586 nm.
  7. Wykrywanie E. coli pCFP-OVA za pomocą zestawu filtrów ze wzbudzeniem przy 450 nm i emisją przy 480 nm.
  8. Zdefiniuj obszar zainteresowania i wygeneruj diagramy punktowe zgodnie z wcześniejszym opisem50, aby przeprowadzić analizę kolokalizacji. Użyj 2 różnych wzorów: współczynnika nakładania się według Mandersa i współczynnika Pearsona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby stworzyć model zapalenia jelita grubego indukowanego antygenem, n E. coli szczep został skonstruowany, zawierający plazmid, w którym gen CFP jest połączony z sekwencją kodującą białko owalbuminy kurczaka, a konstrukt fuzyjny jest ekspresowany pod kontrolą silnego promotora konstytutywnego Pnadmierny (Rycina 1A). Mikroskopia fluorescencyjna wykazuje, że rekombinowany *E. coli* pCFP-OVA, ale nie szczep parentalny E. col...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podobnie jak w przypadku każdego innego modelu, opisany powyżej model zapalenia jelita grubego oparty na antygenach może stwarzać kilka problemów, o których musi wiedzieć badacz wykonujący tę technikę. Podczas wstrzykiwania komórek OT-II/Red+ CD4+ T CD62L+ do gospodarzy, badacz musi być bardzo delikatny i ostrożny, aby wprowadzić igłę do jamy otrzewnej. Niezastosowanie się do tego może spowodować rozerwanie jelita myszy, co może prowadzić do śmierci, lub podskórne podanie komórek, które n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

JHN jest wspierany przez Szwajcarską Fundację Narodową (SNSF 310030_146290).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Rotary ShakeReiss Laborbedarf e. K.Model 3020 GFL
mm szlufki szczelinowe Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlicerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell system BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
Zestaw do izolacji plazmidu o wysokiej czystościRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Lodowaty kwas octowySigma-Aldrich537020 
Komora żelowa PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Ładowanie barwnikaThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb Drabinka DNA Thermo FisherSM0312
Roztwór bromku etydynyCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
System dokumentacji fotograficznej Decon Science Tech GmbHDeVision G 
Sekwencjonowanie DNA MWG-Biotech GmbH
Solanka buforowana fosforanami (PBS)BiochromL182-50
Mikroskop fluorescencyjny ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Drabinka do wstępnie barwionych białek Fermentas, St. Leon-Rot, Niemcy
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, Wielka Brytania
Membrana nitrocelulozowa Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Bibuła elektryczna Biometra GmbH846-015-600
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Przeciwciało anty-albuminy jaja kurzego Abcamab181688
Przeciw królikom IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell SitkaFischer Scientific 08-771-2
Chlorek amonuSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ Zestaw izolacyjny T Miltenyi Biotec130-093-227 
Kolumny MACS LS Miltenyi Biotec130-042-401
Kolumny MACS MS Miltenyi Biotec130-042-201
Separator MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Separator MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Igła do karmienia 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Roztwór formaliny, neutralny buforowany, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParafinaSigma-Aldrich1496904
HematoksylinaSigma-AldrichH9627
Eozyna YSigma-Aldrich230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
Kolagenaza typu VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) podłożeAppliChemA2044, 9050
Azydek soduSigma-Aldrich438456
Mysz BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC-sprzężone wiązanie mAb Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
sprzężony z APC mAb wiążący CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
Kaliber FACS Oprogramowanie BD Biosciences
FCS Express V3DeNovo
Meta ZeissLSM 710 
Stacja robocza ZeissZeissLSM 7
Oprogramowanie Zeiss ZEN Zeissv4.2.0.121
Maxisorp NUNC, Roskilde442404
Streptawidyna sprzężona fosfataza alkalicznaJackson Immuno Research016-050-084
Podłoże fosfatazy alkalicznej Sól disodowa fosforanu 4-nitrofenylu sześciowodnaSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN mikropłytka-czytnik ELISATecan
EasyWinTecan
DNase I rekombinowane4536282001
2 Skaningowy mikroskop konfokalny Płytki immunologiczne Oprogramowanie

Bibliografia

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
  3. Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
  4. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
  5. Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
  6. Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
  7. Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
  8. Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
  9. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
  10. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
  11. Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111(2011).
  12. Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
  13. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
  14. Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
  15. Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
  16. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
  17. Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
  18. Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
  19. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
  20. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
  21. Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
  22. Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
  23. Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
  24. Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
  25. Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
  26. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
  27. Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
  28. Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
  29. Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
  30. Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
  31. van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
  32. Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
  33. Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
  34. Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
  35. Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
  36. Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  37. Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
  38. Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
  39. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
  40. Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
  41. Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
  42. Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
  43. Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
  44. Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
  45. Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
  46. Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
  47. Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
  48. Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
  49. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
  50. Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
  51. Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
  52. Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
  53. Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404(2012).
  54. Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model transferu limfocyt w Tb ona w a ciwa okr nicylimfocyty T CD4 OT IIE coli wykazuj ce ekspresj CFP OVAanaliza cytometrycznaobrazowanie mikroskopem konfokalnymprotok izolacji kom rekmetoda trawienia tkanki
Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.