Method Article

Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T

DOI:

10.3791/54421

⸱

September 18th, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym modelu zapalenia jelita grubego napędzanego antygenem, limfocyty T OT-II CD4+ wyrażające białko czerwonej fluorescencji zostały adoptywnie przeniesione do myszy RAG-/-, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne w fagocytach jednojądrzastych (MP). Gospodarzom poddano prowokację Escherichia coli (E. coli) wykazującej ekspresję białka albuminy jaja kurzego (OVA) połączonego z cyjanowym białkiem fluorescencyjnym (CFP).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) to przewlekłe zapalenie przewodu pokarmowego (GIT). Jednym z najlepszych sposobów badania mechanizmów immunologicznych zaangażowanych w chorobę jest model transferu limfocytów T zapalenia jelita grubego. W tym modelu myszy z niedoborem odporności (biorcy RAG-/-) są odtwarzane za pomocą naiwnych limfocytów T CD4 + od zdrowych gospodarzy typu dzikiego.

Ten model pozwala na badanie najwcześniejszych zdarzeń immunologicznych prowadzących do chorób i przewlekłych stanów zapalnych, kiedy stan zapalny jelit trwa nadal, ale nie zależy od zdefiniowanego antygenu. Aby zbadać potencjalną rolę komórek prezentujących antygen (APC) w procesie chorobowym, pomocne jest posiadanie modelu choroby opartego na antygenie, w którym zdefiniowany antygen pochodzenia komensalnego prowadzi do zapalenia jelita grubego. W związku z tym opracowano model zapalenia jelita grubego sterowanego przez antygen. W tym modelu OT-II limfocyty T CD4 +, które mogą rozpoznawać tylko określone epitopy w białku OVA, są przenoszone do gospodarzy RAG /- prowokowanych E. coli wykazujących ekspresję CFP-OVA. Model ten pozwala na badanie oddziaływań między APC a limfocytami T w blaszce właściwej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jelito to największa powierzchnia ciała, która jest wystawiona na działanie środowiska zewnętrznego. Ogromne ilości rezydujących mikroorganizmów kolonizują ludzkie jelito, tworząc mikrobiotę jelitową (lub mikroflorę). Szacuje się, że składa się on z nawet 100 bilionów komórek drobnoustrojów i stanowi jedno z najgęściej zaludnionych siedlisk bakteryjnych znanych w biologii1-3. W przewodzie pokarmowym bakterie kolonizują niszę jelitową, w której przeżywają i namnażają się4. W zamian mikrobiota wyposaża gospodarza w dodatkowe cechy funkcjonalne, które nie są zakodowane w jego genomie1. Na przykład mikrobiota stymuluje proliferację komórek....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy były hodowane i trzymane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w obiekcie dla zwierząt Uniwersytetu w Ulm (Ulm, Niemcy). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi lokalnego komitetu ds. wykorzystywania i opieki nad zwierzętami oraz Krajową Ustawą o Dobrostanie Zwierząt.

1. Budowa plazmidu pCFP-OVA

  1. Amplifikuj pełnowymiarowy gen OVA za pomocą starterów Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTTTTTGATGTATT-5') i Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5')37 przy użyciu plazmidu pCI-OVA (opornego na ampicylinę)42 jako matrycy. Sklonow....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ustalić model zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem, skonstruowano szczep E. coli, który zawiera plazmid, w którym gen CFP jest połączony z sekwencją kodującą białko albuminy jaja kurzego, a konstrukt fuzyjny ulega ekspresji pod kontrolą silnego konstytutywnego promotora Phyper (Rysunek 1A). Mikroskopia fluorescencyjna pokazuje, że rekombinowana E. coli pCFP-OVA, ale nie rodzicielska E. coli DH10B, wykaz.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobnie jak w przypadku każdego innego modelu, opisany powyżej model zapalenia jelita grubego oparty na antygenach może stwarzać kilka problemów, o których musi wiedzieć badacz wykonujący tę technikę. Podczas wstrzykiwania komórek OT-II/Red+ CD4+ T CD62L+ do gospodarzy, badacz musi być bardzo delikatny i ostrożny, aby wprowadzić igłę do jamy otrzewnej. Niezastosowanie się do tego może spowodować rozerwanie jelita myszy, co może prowadzić do śmierci, lub podskórne podanie komórek, które n.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JHN jest wspierany przez Szwajcarską Fundację Narodową (SNSF 310030_146290).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Rotary ShakeReiss Laborbedarf e. K.Model 3020 GFL
mm szlufki szczelinowe Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlicerolSigma-AldrichG5516-100ML
Gene Pulser Xcell system BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
Zestaw do izolacji plazmidu o wysokiej czystościRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Lodowaty kwas octowySigma-Aldrich537020 
Komora żelowa PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Ładowanie barwnikaThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb Drabinka DNA Thermo FisherSM0312
Roztwór bromku etydynyCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
System dokumentacji fotograficznej Decon Science Tech GmbHDeVision G 
Sekwencjonowanie DNA MWG-Biotech GmbH
Solanka buforowana fosforanami (PBS)BiochromL182-50
Mikroskop fluorescencyjny ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Drabinka do wstępnie barwionych białek Fermentas, St. Leon-Rot, Niemcy
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, Wielka Brytania
Membrana nitrocelulozowa Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Bibuła elektryczna Biometra GmbH846-015-600
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Przeciwciało anty-albuminy jaja kurzego Abcamab181688
Przeciw królikom IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell SitkaFischer Scientific 08-771-2
Chlorek amonuSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ Zestaw izolacyjny T Miltenyi Biotec130-093-227 
Kolumny MACS LS Miltenyi Biotec130-042-401
Kolumny MACS MS Miltenyi Biotec130-042-201
Separator MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Separator MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Igła do karmienia 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Roztwór formaliny, neutralny buforowany, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParafinaSigma-Aldrich1496904
HematoksylinaSigma-AldrichH9627
Eozyna YSigma-Aldrich230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
Kolagenaza typu VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) podłożeAppliChemA2044, 9050
Azydek soduSigma-Aldrich438456
Mysz BD Fc BlockBD Pharmingen553141
FITC-sprzężone wiązanie mAb Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
sprzężony z APC mAb wiążący CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
Kaliber FACS Oprogramowanie BD Biosciences
FCS Express V3DeNovo
Meta ZeissLSM 710 
Stacja robocza ZeissZeissLSM 7
Oprogramowanie Zeiss ZEN Zeissv4.2.0.121
Maxisorp NUNC, Roskilde442404
Streptawidyna sprzężona fosfataza alkalicznaJackson Immuno Research016-050-084
Podłoże fosfatazy alkalicznej Sól disodowa fosforanu 4-nitrofenylu sześciowodnaSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN mikropłytka-czytnik ELISATecan
EasyWinTecan
DNase I rekombinowane4536282001
2 Skaningowy mikroskop konfokalny Płytki immunologiczne Oprogramowanie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antigen Driven Colitis ModelT Cell Transfer ModelColonic Lamina PropriaAntigen Presenting CellsOT II CD4 T CellsCFP OVA Expressing E coliFlow Cytometry AnalysisConfocal Microscopy ImagingCell Isolation ProtocolTissue Digestion Method

Related Articles