Artykuł metodologiczny

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54426

⸱

27 września 2016

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.

Streszczenie

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat do scharakteryzowania ewolucyjnej ścieżki oporności na antybiotyki. Morbidostat to urządzenie do hodowli bakteryjnej, które w sposób ciągły monitoruje wzrost bakterii i dynamicznie dostosowuje stężenie leku, aby stale stanowić wyzwanie dla bakterii w miarę ich ewolucji w kierunku uzyskania oporności na leki. Urządzenie charakteryzuje się pojemnością roboczą ~10 ml i jest w pełni zautomatyzowane oraz wyposażone w optyczny pomiar gęstości oraz mikropompy do podawania pożywki i leków. Aby zweryfikować platformę, zmierzyliśmy stopniowe nabywanie oporności na trimetoprim u Escherichia coli MG 1655 i zintegrowaliśmy urządzenie z multipleksowaną platformą mikroprzepływową w celu zbadania morfologii komórek i wrażliwości na antybiotyki. Podejście to można rozszerzyć do badań laboratoryjnych nad opornością na antybiotyki i można je rozszerzyć o ewolucję adaptacyjną w celu ulepszenia szczepu w inżynierii metabolicznej i innych eksperymentach z kulturami bakteryjnymi.

Wprowadzenie

Od czasu wprowadzenia pierwszego antybiotyku penicyliny, oporność mikroorganizmów na antybiotyki stała się globalnym problemem zdrowotnym1. Chociaż nabycie oporności na antybiotyki może być retrospektywnie badane in vivo, warunki tych eksperymentów często nie są kontrolowane przez cały okres ewolucji2. Alternatywnie, adaptacyjna ewolucja laboratoryjna może ujawnić ewolucję molekularną gatunku drobnoustrojów pod wpływem stresów środowiskowych lub presji selekcyjnej ze strony antybiotyku3. Ostatnio wiele dobrze kontrolowanych eksperymentów ewolucyjnych dotyczących oporności na antybiotyki wyjaśniło pojawienie się oporności na antybiotyki. Na przykład, grupa Austina wykazała szybkie pojawienie się w odpowiednio zaprojektowanym środowisku mikroprzepływowym z przedziałami4. Niedawno opracowany morbidostat indukuje systematyczne mutacje pod presją selekcji leków5,6. Morbidostat, urządzenie do selekcji drobnoustrojów, które w sposób ciągły dostosowuje stężenie antybiotyku w celu utrzymania prawie stałej populacji, stanowi duży postęp w stosunku do testu fluktuacji stosowanego w mikrobiologii7,8. W teście fluktuacji antybiotyk jest wstrzykiwany w wysokim stężeniu, a mutanty, które przeżyły, są badane i liczone. Zamiast tego drobnoustroje w morbidostat są stale prowokowane i nabywają wiele mutacji.

Morbidostat działa podobnie do chemostatu, urządzenia hodowlanego wynalezionego przez Novicka i Szliarda w 1950 roku, które utrzymuje stałą populację poprzez ciągłe dostarczanie składników odżywczych, jednocześnie rozcieńczając populację mikroorganizmów9. Od czasu wprowadzenia chemostatu został on zaawansowany i ulepszony. Obecne chemostaty mikroprzepływowe osiągnęły pojemność nanolitrów i pojedynczych komórek. Jednak urządzenia te nie nadają się do eksperymentów ewolucji adaptacyjnej, które wymagają dużej populacji komórek z wieloma mutacjami10,11. Ostatnio opracowano również mini-chemostaty o objętości roboczej ~10 ml, aby wypełnić lukę między bioreaktorami w skali litrowej a chemostatem mikroprzepływowym12,13.

Tutaj prezentujemy projekt i zastosowanie taniego, zautomatyzowanego morbidostu do badania oporności na antybiotyki. Proponowany moduł może być stosowany w inkubatorze z wytrząsarką w laboratorium mikrobiologicznym przy minimalnym zapotrzebowaniu na sprzęt. Oprogramowanie układowe typu open source można również łatwo dostosować do konkretnych zastosowań ewolucji adaptacyjnej, takich jak inżynieria metaboliczna3. Na koniec morbidostat jest integrowany z multipleksowaną platformą mikroprzepływową do badania wrażliwości na antybiotyki14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Montaż i wstępne testowanie urządzenia Morbidostat

  1. Montaż Morbidostatu
    1. Przebić 3 otwory w wieczku fiolki z kulturą za pomocą igły ze strzykawką 18 G. Wytnij trzy kawałki rurki polietylenowej o długości ~7 cm. Włóż te trzy kawałki rurki polietylenowej na nasadkę.
    2. Użyj taśmy, aby owinąć krawędź nasadki, która posłuży jako odlew mieszaniny polidimetylosiloksanu (PDMS). Wymieszać 5 g składnika A i 0,5 g składnika B PDMS w plastikowym pojemniku o pojemności 150 ml, mieszając ręcznie wykałaczką. Załadować mieszaninę do strzykawki o pojemności 10 ml.
      1. Wylać mieszaninę PDMS na nakrętkę za pomocą strzykawki. Piecz całą nakrętkę, aby utwardzić PDMS przez 8 godzin w piekarniku w temperaturze 70 °C.
    3. anodę LED za pomocą drutu o średnicy 24 i katodę LED z rezystorem węglowym za pomocą lutownicy. rezystor węglowy 680 Ω z przewodem 24 G. Zaizoluj połączenie przewodów za pomocą taśmy izolacyjnej.
    4. kolektor fotodetektora przewodem 24 G, a emiter fotodetektora rezystorem węglowym 100 kΩ. Zaizoluj połączenie przewodów za pomocą taśmy izolacyjnej.
    5. Umieść diodę elektroluminescencyjną w uchwycie na fiolkę z kulturą. Postępując zgodnie ze schematem obwodu na rysunku uzupełniającym 2, podłącz diodę elektroluminescencyjną i zasil ją zasilaczem 5 V. Upewnij się, że dioda LED działa, używając kamery cyfrowej, która może wykrywać podczerwień (np. kamery w telefonie komórkowym).
    6. Umieścić fotodetektor w uchwycie na fiolkę z kulturą. Postępując zgodnie ze schematem obwodu na rysunku uzupełniającym 2, podłącz fotodetektor i zasil go zasilaczem 5 V. Podłącz przewód po obu stronach rezystorów fotodetektora, aby zmierzyć napięcie na elektronicznej tablicy sterowniczej.
    7. Przyklej magnes na wale wentylatora chłodzącego, który służy jako mieszadło magnetyczne. Należy pamiętać, że wyrównanie wału wentylatora z fiolką hodowlaną oraz odstęp między fiolką do hodowli a magnesem jest bardzo ważny dla prawidłowego działania mieszadła magnetycznego.
    8. Połącz każdy kawałek rurki polietylenowej fiolki hodowlanej z odpowiednim kawałkiem silikonowej rurki do mikropomp, pożywki i butelki na odpady. Włączyć pompę na 1 godzinę i zmierzyć całkowitą objętość pompowaną z pożywki do fiolki z kulturą, aby określić szybkość pompowania. Należy pamiętać, że typowa szybkość pompowania powinna wynosić ~ 4 ml / h, co odpowiada szybkości rozcieńczania D = 0,33 hr-1 dla 12 ml objętości roboczej fiolki z kulturą.
    9. Umieść cały zestaw na średniej wielkości inkubatorze z wytrząsarką (34 cm x 34 cm x 43,5 cm).
  2. Wstępne testowanie Morbidostat
    1. Ustaw napięcie zasilania chłodnego wentylatora na 5 V, aby uruchomić jego silnik w celu przetestowania mieszadła magnetycznego. Należy pamiętać, że mieszanie można sprawdzić wizualnie. Napięcie, które napędza silnik wentylatora chłodzącego, jest precyzyjnie kontrolowane przez modulację szerokości impulsu (PWM).
    2. Do kalibracji należy przygotować serię próbek E. coli typu dzikiego o gęstości optycznej przy długości fali 600 nm, zwykle w zakresie od 0,07 do 0,3. Umieścić próbkę testową E. coli w fiolce hodowlanej i zapisać napięcie fotodetektora.
      1. Umieścić ~100 μl tej samej próbki w czytniku płytek i zapisać gęstość optyczną. Użyj danych dotyczących napięcia fotodetektora w funkcji gęstości optycznej, aby wykreślić krzywą kalibracyjną. Należy zauważyć, że zazwyczaj jedna jednostka zmiany gęstości optycznej odpowiada zmianie ~7,6 V w fotodetektorze przy zastosowanym tutaj schemacie polaryzacji.

2. Uruchamianie Morbidostat

  1. Przygotowanie przed rozpoczęciem codziennego eksperymentu
    1. Przygotować fiolkę hodowlaną z trzema ultraodpornymi chemicznie rurkami Tygon o średnicy wewnętrznej 1/32 cala i średnicy zewnętrznej 3/32 cala dla wlotów do utworzenia urządzenia, jak w sekcji 1.1 i na rysunku uzupełniającym 1.
    2. Przygotować pożywkę zawierającą minimalny (0,2% glukozy) M9 i trimetoprim (TMP). Wysterylizować pożywkę, butelkę z pożywką, butelkę z pożywką z lekiem, butelkę na odpady i fiolkę z kulturą w autoklawie w temperaturze 121 °C.
      UWAGA: TMP jest roztworem podstawowym, który jest używany do późniejszego osiągnięcia stężeń w tabeli 1, a pożywka zawierająca lek TMP nie jest sterylizowana w autoklawie.
  2. Uruchamianie Morbidostat
    1. W pierwszym dniu eksperymentu rozmrozić 1 ml zamrożonych komórek MG1655 typu dzikiego E. coli przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść 120 μl komórek do fiolki hodowlanej zawierającej ~12 ml pożywki wzrostowej M9. Po pierwszym dniu rozmrozić 1 ml zamrożonych komórek E. coli z poprzedniego dnia przez 5 minut i przenieść 120 μl komórek do nowej fiolki hodowlanej zawierającej ~12 ml pożywki wzrostowej M9.
    2. Włączyć inkubator z wytrząsarką i ustawić temperaturę na 30 °C bez potrząsania.
    3. Rozpocznij operację morbidost, włączając mikropompę, mieszadło magnetyczne i pomiar gęstości optycznej.
      UWAGA: Podczas operacji używany jest algorytm progu sprzężenia zwrotnego do kontrolowania wstrzyknięcia leku. Gdy zmierzona gęstość optyczna przekroczy ustawiony próg, pompa do wstrzykiwania leku zostanie włączona, a pompa medium zostanie wyłączona. W przeciwnym razie pompa do wstrzykiwań leku pozostaje wyłączona, a pompa medium jest włączona.
    4. Od czasu do czasu monitoruj napięcie, aby upewnić się, że następuje rozwój drobnoustrojów.
      Uwaga: Ze względu na cykl zamrażania i rozmrażania, komórki E. coli wykazują opóźnienie ~ 4 godziny podczas wzrostu każdego dnia.
    5. Po ~23 godzinach zatrzymać mikropompę, wyłączając jej napięcie zasilania i wyjąć fiolkę z hodowlą. Dodać 15% glicerolu do fiolki hodowlanej i zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C do przechowywania.
    6. Powtórz kroki od 2.2.1 do 2.2.5.

3. Pomiar wrażliwości na antybiotyki w formacie 96 dołków

UWAGA: Wykonaj pomiar szybkości wzrostu w czytniku płytek z formatem 96 dołków, aby określić poziom oporności na antybiotyki.

  1. Rozmrażać codziennie zamrożoną próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut i przenieść 15 μl komórki do fiolki hodowlanej zawierającej ~15 ml pożywki M9. Pozwól im rosnąć, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie ~0,1. Podzielić 15 ml na butelki o pojemności 1 ml i dodać lek TMP na tym etapie, aby uzyskać pożądane stężenia leku, jak pokazano w Tabeli 1.
  2. Pobrać 200 μl próbki z kroku 3.1 i umieścić w każdym dołku w czytniku płytek i pozostawić do wzrostu przez 12 godzin5. Gęstość optyczna przy długości fali 600 nm jest rejestrowana automatycznie podczas pomiaru.
    UWAGA: Dla każdego punktu danych rejestrowane są trzy pomiary i uśredniane w celu zapewnienia spójności danych. Dane dotyczące gęstości optycznej w funkcji czasu można wykorzystać do uzyskania szybkości wzrostu.
  3. Wykreśl dane dotyczące szybkości wzrostu w funkcji stężenia leku, aby uzyskać IC50. Należy zauważyć, że IC50 definiuje się jako stężenie leku, przy którym szybkość wzrostu wynosi pięćdziesiąt procent maksymalnej szybkości wzrostu5.

4. Morfologia pojedynczych komórek i pomiar wrażliwości na antybiotyki w urządzeniach mikroprzepływowych

  1. Wykonanie urządzeń mikroprzepływowych za pomocą wielowarstwowej miękkiej litografii z PDMS, jak opisano w innym miejscu15.
    1. Użyj fotolitografii, aby wykonać formę fotorezystu dla warstw kontrolnych i przepływowych. Należy pamiętać, że w warstwie kontrolnej użyj ujemnego fotorezystu (wysokość ~15 μm) i dodatniego fotorezystu (wysokość ~8 μm), aby wytworzyć formę na gołej płytce krzemowej.
    2. Przygotować mieszaniny PDMS o współczynnikach usieciowania 5:1 i 20:1 odpowiednio dla warstwy kontrolnej i warstwy przepływowej. Umieścić mieszaniny w eksykatorze pod próżnią w celu usunięcia pęcherzyków na 1 godzinę.
    3. Wystawić warstwy kontrolnej formy fotorezystu na płytce krzemowej na działanie pary trimetylochlorosilanu (TMCS). Wykonać warstwę kontrolną o grubości ~6 mm poprzez odlewanie mieszaniny PDMS (o stosunku usieciowania 5:1) na płytkę krzemową na formie fotorezystu warstwy kontrolnej. Piecz warstwę kontrolną przez 40 minut w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w piekarniku.
    4. Wykonaj warstwę płynięcia poprzez wirowanie powłoki mieszaniny PDMS (ze stosunkiem usieciowania 20:1, prędkością wirowania 3,000 obr./min przez 60 sekund) na formie fotorezystu warstwy przepływowej. Piecz warstwę przepływową przez 30 minut w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w piekarniku.
    5. Za pomocą żyletki przyciąć warstwę kontrolną do żądanego rozmiaru wióra (zwykle 3 cm x 2 cm) i ręcznie oderwać warstwę kontrolną. Umieść warstwę kontrolną na warstwie przepływu i wyrównaj je pod mikroskopem stereoskopowym. Utwardź wyrównany zespół w temperaturze 80 °C w piekarniku przez noc. Następnie namocz zestaw w 250 ml dejonizowanej wody w plastikowym pojemniku na 5 godzin, aby rozpuścić resztki TMCS.
    6. Następnie przebić otwory wlotowe igłami 20 G i przymocować cały elastomer do szkiełka pokrytego ślepą warstwą PDMS (współczynnik sieciowania PDMS 5:1, prędkość wirowania 2 000 obr./min przez 30 sekund) poprzez obróbkę plazmą powietrzną przez 40 sekund przy ciśnieniu powietrza 1,2 Torra.
    7. Przeprowadzaj intensywne pieczenie przez 36 godzin w temperaturze 80 °C, aby zmniejszyć cytotoksyczne działanie PDMS. Należy pamiętać, że ten etap pieczenia ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania toksyczności dla komórek bakteryjnych.
  2. Eksperyment z rozwojem chipów
    1. Przed załadowaniem do urządzenia mikroprzepływowego należy je przepłukać wodą dejonizowaną przez 1 godzinę i pożywką M9 przez 1 godzinę.
    2. Rozmrażaj codziennie zamrożoną próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut i zaszczep nową probówkę świeżą pożywką M9. Umieścić próbkę w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C na noc.
    3. Rozcieńczyć próbkę drobnoustrojów 10-krotnie pożywką M9 i załadować ją do urządzenia mikroprzepływowego, wywierając ciśnienie w pojemniku na próbkę drobnoustrojów pod ciśnieniem 5 psi. Następnie załaduj pożywkę z lekiem TMP do chipa, naciskając pojemnik na pożywkę lekiem pod ciśnieniem 5 psi. Wykonaj mieszanie drobnoustroju i leku, uruchamiając zawór mikromechaniczny między dwiema komorami na chipie mikroprzepływowym na 15 minut.
    4. Umieść chip mikroprzepływowy w inkubatorze mikroskopowym zamontowanym na mikroskopie odwróconym. Uzyskuj obraz komórki w komorze wzrostowej co godzinę przez 8 godzin za pomocą kamery CCD zamontowanej na odwróconym mikroskopie.
    5. Użyj niestandardowego skryptu programu, aby obliczyć numery komórek za pomocą algorytmu progowego na danych obrazu komórki18. Należy zauważyć, że dane dotyczące liczby komórek są zwykle uśredniane w trzech komorach mikroprzepływowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany powyżej morbidostat przedstawiono schematycznie na Rysunku 1. Typowe operacje morbidostatu, w tym ewolucja eksperymentalna, test wrażliwości na antybiotyki oraz kontrola morfologii komórek, zostały zwalidowane w kulturze E. coli MG1655 poddanej działaniu trimetoprimu (TMP), powszechnie stosowanego leku antybiotykowego5,6. TMP indukuje bardzo charakterystyczne, stopniowe wzrosty oporności na lek, a mutacje skupiają się wokół genu reduktazy dihyd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zademonstrowano urządzenie morbidostat o niewielkich rozmiarach wykonane z tanich komponentów. Wzrost poziomu oporności na leki zarejestrowany przez urządzenie jest zgodny z wcześniejszymi raportami5. Zaprojektowane z myślą o ewolucyjnych badaniach nad opornością na leki, urządzenie może mieć potencjalne zastosowanie w wielu innych eksperymentach. Po pierwsze, można stworzyć obszerną bazę danych mutacji wywołanych lekami dla dużego zestawu antybiotyków o znaczeniu klinicznym. Na przykład szlak ewolucyjny oporn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Sze-Bi Hsu i Pani Zhenzhen za użyteczne dyskusje i pomoc w analizie teoretycznej i symulacjach numerycznych. Y. T. Y. pragnie podziękować za wsparcie finansowe z Ministerstwa Nauki i Technologii w ramach grantów o numerach MOST 103-2220-E-007-026 i MOST 104-2220-E-007-011, oraz z Narodowego Uniwersytetu Tsing Hua pod numerami grantów 103N2042E1, 104N2042E1 oraz 105N518CE1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubator wytrząsarki środowiskowejBioSanES-20
Płyta Arduino LeonardoArduinoLeonardo
680 OhmDigikeyBias do
LED Rezystor węglowy 100k OhmDigikeyBias do fototranzystora
Dioda elektroluminescencyjna 940 nmBright LED ElectronicBIR-BM13E4G-2Pomiar gęstości optycznej
fototranzystor 940 nmKodenshi ST-2L2BPomiar gęstości optycznej
Para Darlington IC ToshibaMouserULN2803APGten układ scalony napędza mikropompy i mieszadło magnetyczne
Wentylator bezszczotkowy 5 V DCADDAAD0405LX-G70specyfikacja: napięcie zasilania 5 V i 80  mA; dostępne www.jameco.com
Mikropompa piezoelektrycznaCurieJetPS15I-FT-5LCiśnienie > 3  kPa; Przepływ >5 ml/min
Tygon 3350 TuningSaint GobainABW00001ID: 1/32" OD: 3/32" L: 50' 
Mieszadło magnetyczneCOWIEstożkowy kształt przyciemnienie: 10  mm x 4 mm
Szklana fiolka scyntylacyjna 20 mlDGSSzkło Pyrex 28 mm (średnica) x 61 mm (wysokość)
Uchwythodowli Wykonane na zamówienie z poliformaldehydu 
SilikonDow CorningSylgald 184służy do uszczelniania szklanej fiolki
Średnia butelkaVWR66022-065
Difco M9 minimalna sól 5xBDMedium
Kadaminy BDŚrednia
glukozaSigma
Agar BateriologicalOxoidna płytkę
agarowąLuria Bertani medium
Mikroskop odwróconyLeica MicrosystemsLeica DMI-LEDużywany do pomiarów mikroprzepływowych Użyj obiektywu 40X NA = 0,55
Inkubator mikroskopowyInstrument do żywych komórekCU-109używany do pomiarów mikroprzepływowych
Zawory elektromagnetycznePneumadyneS10MM-31-12-3Normalnie otwarty 1,3 W 12 Vdc
Karta interfejsu USBfirmy Hobby EngineeringUSBIO24-R do pomiarów mikrofluidycznych
Sprężarka powietrzaRocker ScientificROCKER 440Źródło ciśnienia do mikrofluidów; Max. Ciśnienie 80 psi
Męskie złączki luer-lock do 1/8" zadziorValuePlastics.com MTLL230-1używany do sterowania mikroprzepływowego
Króciec 1/8" do portu gwintowanego 10-32ValuePlastics.comB-1używany do sterowania mikroprzepływowego
Złączki żeńskie typu luer-lock do portugwintowanego 10-32ValuePlastics.comKFTL-1używany do sterowania mikroprzepływowego
NPN tranzystor Darlingtona 500 mA, 40  V (2N6427)DigiKey.com2N6427GOS-NDstosowany do sterowania mikroprzepływowego
10 kOhm, rezystor węglowy, 0,25 WDigiKey.comP10KBACT-NDstosowany do sterowania mikroprzepływowego
Kondensator tantalowy, 10  μ F, 25 V, 10%DigiKey.com478-1841-NDużywany do sterowania mikroprzepływowego
Kamera CCDAndorZyla 4.2 Plus SCMOSużywany do obrazowania mikroprzepływowego na chipie
czytnik
dwuskładnikowy silikon MomentiveRTV 615używany do produkcji chipów mikroprzepływowych
Fotorezystor SU-8MicrchemSU8 2015używany do produkcji chipów mikroprzepływowych
Fotorezystor AZ4620ClariantAZ 4620używany do produkcji chipów mikroprzepływowych
Środek do czyszczenia plazmyHarrick PlasmaPDC 32Gużywany do produkcji chipów mikroprzepływowych
Igła strzykawkowa o rozmiarze 20 BDużywany do produkcji chipów mikroprzepływowych
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
Polimeraza DNAToyoboKDO PlusPCR amplifikacja
TrimethoprimSigma
Plate czytnikBiotekSynergy H1 hybrid Pomiar oporności na antybiotyki
Rezystor węglowy Rezystor Rezystor na fiolkę do Cyfrowy moduł I/O płytek ELISA

Bibliografia

  1. Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
  2. Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451(2007).
  3. Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64(2013).
  4. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
  5. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
  6. Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
  7. Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
  8. Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
  9. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  10. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  11. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  12. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262(2013).
  13. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
  14. Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
  15. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  16. Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713(2014).
  17. Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126(2015).
  18. Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
  19. Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
  20. Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
  21. Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
  22. Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
  23. Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
  24. Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267(2014).
  25. Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
  26. Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
  27. Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oporno na antybiotykiewolucja bakteriipomiar g sto ci optycznejdostarczanie za pomoc mikropompyoporno na trimetoprimEscherichia coliplatforma mikroprzep ywowaregulacja st enia leku

Powiązane artykuły