Artykuł metodologiczny

Proste podejście do manipulowania rozpuszczonym tlenem w celu obserwacji zachowania zwierząt

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54430

⸱

28 czerwca 2016

 , 
1Department of Biology, Juniata College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje prosty i powtarzalny protokół do manipulowania warunkami rozpuszczonego tlenu w warunkach laboratoryjnych do badań nad zachowaniem zwierząt. Protokół ten może być stosowany zarówno w warunkach dydaktycznych, jak i laboratoryjnych do oceny reakcji organizmu makrobezkręgowców, ryb lub na zmiany stężenia rozpuszczonego tlenu.

Streszczenie

Możliwość manipulowania rozpuszczonym tlenem (DO) w warunkach laboratoryjnych ma istotne zastosowanie do badania wielu zagadnień związanych z zachowaniem ekologicznym i organizmów. Opisany tutaj protokół zapewnia prostą, powtarzalną i kontrolowaną metodę manipulowania DO w celu badania reakcji behawioralnej organizmów wodnych wynikającej z warunków niedotlenienia i niedotlenienia. Chociaż odgazowanie wody za pomocą azotu jest powszechnie stosowane w warunkach laboratoryjnych, w literaturze nie ma wyraźnej metody do zastosowań ekologicznych (wodnych), a ten protokół jest pierwszym, który opisuje protokół odgazowywania wody w celu obserwacji reakcji organizmu. Ta technika i protokół zostały opracowane do bezpośredniego zastosowania u makrobezkręgowców wodnych; Jednak małe ryby, i inne kręgowce wodne można łatwo zastąpić. Pozwala na łatwą manipulację poziomami tlenu rozpuszczonego w zakresie od 2 mg/L do 11 mg/L ze stabilnością do 5-minutowego okresu obserwacji zwierząt. Po 5-minutowym okresie obserwacji temperatura wody zaczęła rosnąć, a przy 10-minutowym poziomie tlenu rozpuszczonego stała się zbyt niestabilna, aby ją utrzymać. Protokół jest skalowalny do organizmu badawczego, powtarzalny i niezawodny, co pozwala na szybkie wdrożenie w laboratoriach wprowadzających do nauczania i aplikacjach badawczych wysokiego poziomu. Oczekiwane wyniki tej techniki powinny wiązać zmiany rozpuszczonego tlenu z reakcjami behawioralnymi organizmów.

Wprowadzenie

Rozpuszczony tlen (DO) jest kluczowym parametrem fizykochemicznym ważnym w pośredniczeniu w wielu procesach biologicznych i ekologicznych w ekosystemach wodnych. Narażenie na ostre i przewlekłe subletalne niedotlenienie zmniejsza tempo wzrostu niektórych owadów wodnych i zmniejsza przeżywalność narażonych owadów1. Protokół ten został opracowany w celu zapewnienia kontrolowanej metody manipulowania poziomami tlenu rozpuszczonego w wodzie strumieniowej w celu obserwacji wpływu na zachowanie zwierząt. Ponieważ przetrwanie wszystkich tlenowych organizmów wodnych zależy od stężenia tlenu, aby mogły żyć i rozmnażać się, zmiany w stężeniu DO często znajdują odzwierciedlenie w zmianach zachowania organizmów. Zaobserwowano, że bardziej mobilne bezkręgowce wodne i ryby reagują na niskie stężenia tlenu (niedotlenienie), poszukując miejsc o wyższym DO2,3. W przypadku mniej ruchliwych organizmów wodnych adaptacje behawioralne w celu zwiększenia spożycia DO mogą być jedyną realną opcją. Zauważono, że wodny rząd makrobezkręgowców Plecoptera (stonefly) wykonuje ruchy "push-up" w celu zwiększenia przepływu wody i pobierania tlenu przez zewnętrzne skrzela 4-6. Te zachowania adaptacyjne zaobserwowano w środowisku naturalnym i w eksperymentach laboratoryjnych.

Laboratoryjna manipulacja DO w wodzie otwiera znaczące możliwości dla badań nad zachowaniem zwierząt, ale istnieją znaczące luki w metodologii wdrażania. Na przykład w jednym z badań wykorzystano duże akwaria do oceny czasu reakcji fizjologicznej bassa wielkogębowego (Micropterus salmoides) na środowisko niedotlenione po zagazowaniu azotem, ale podano niewiele szczegółów dotyczących metodologii7. Inne badanie przeprowadzone na danio pręgowanym (Danio rerio) opisywało użycie gazowego azotu i porowatego kamienia do dostarczania gazu do wody i zmniejszania DO w wodzie8. W przypadku zastosowań chemicznych metody odgazowania rozpuszczalników wykorzystują specjalistyczną aparaturę 9-11 do usuwania tlenu z rozpuszczalników, ale nie byłyby odpowiednie do badań nad zachowaniem zwierząt. Chociaż w badaniach tych stosuje się metody usuwania tlenu z wody, nie można zidentyfikować żadnej metody opisowej, która pozwoliłaby na ocenę zachowania zwierząt w odpowiedzi na zmiany tlenu rozpuszczonego.

Ta metoda opisana poniżej jest próbą pełnego opisania protokołu manipulacji DO wody za pomocą gazowego azotu. Co więcej, metoda ta została opracowana w celu obserwacji związków między zachowaniem muchówek kamiennych (pompek) a DO, które zastosowano w laboratorium biologicznym na poziomie pierwszego roku. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że można ją łatwo wykonać w laboratorium przy użyciu powszechnie dostępnych wyrobów szklanych i materiałów dostępnych dla większości instytucji szkolnictwa średniego i wyższego. Protokół jest również łatwy do dostosowania, co pozwala osobom fizycznym na skalowanie procedury w celu spełnienia celów określonych dla zastosowań badawczych lub dydaktycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: W tym doświadczeniu nie wykorzystano kręgowców, w związku z czym nie było wymagane zatwierdzenie przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Juniata College. Jednakże osoby adaptujące tę metodę do pracy z kręgowcami powinny uzyskać zgodę IACUC.

1. Pobieranie próbek terenowych

  1. Wyznaczyć i ocenić potencjalne stanowiska terenowe pod kątem możliwości szybkiego odłowu, przechowywania i transportu muchówek z rzędu Plecoptera, aby zminimalizować czas transportu, który nie powinien przekroczyć zalecanych 1 hr.
  2. Przeprowadzić pobieranie próbek za pomocą sieci kopnej w wybranym miejscu terenowym, stosując standardowe procedury, aż do zebrania co najmniej 35 osobników Plecoptera12.
  3. Pobrać z potoku 50 L wody oraz kamienie o maksymalnej średnicy 2 cm.
  4. Umieścić akwaria w lodówce ustawionej na temperaturę panującą w miejscu poboru próbek. Rozmieścić zebrane kamienie w akwariach i napełnić każde z nich 4 L wody potokowej. Do każdego akwarium umieścić 20-30 zebranych muchówek oraz kamień napowietrzający podłączony do napowietrzacza akwariowego, a następnie włączyć urządzenia, aby stale doprowadzać powietrze do wody.
  5. Pozostawić muchówki w akwariach na 48 hr w celu aklimatyzacji do nowego środowiska.

figure-protocol-1
Rycina 1. Układ do manipulacji poziomem tlenu rozpuszczonego. (A) 1) Złącze rury miedzianej do męskiego króćca węża 2) Miejsce uszczelki korka do kontroli szczelności kolby. (B) 1) Kolba z bocznym wylotem o pojemności 2 L wypełniona 1,9 L wody 2) Rurka gazowa i bulgotacz powietrza (niebieski) używane odpowiednio do napowietrzania azotem oraz powietrzem pokojowym 3) Butla z azotem i zawory z manometrami 4) Kolba o pojemności 2 L wypełniona 0,4 L wody z zanurzoną rurką próżniową 5) Miernik tlenu rozpuszczonego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Układ eksperymentalny

  1. Na blacie laboratoryjnym podłącz standardową probówkę próżniową do ramienia bocznego kolby z ramieniem bocznym o pojemności 2 L, jak pokazano (1 na Rysunku 1B).
  2. Napełnij kolbę 1,9 L wody strumieniowej z 3 L plastikowych pojemników z zebraną wodą strumieniową przechowywaną w lodówce ustawionej na 12 °C.
  3. Umieść kolbę i rurkę na tacy wystarczająco dużej, aby pomieścić łaźnię lodową wokół kolby z ramieniem bocznym, nie zasłaniając widoku wnętrza kolby, a następnie wypełnij tacę lodem.
  4. Wywierć w gumowym korku dwa otwory o średnicy 3 mm, aby umożliwić wprowadzenie do kolby z ramieniem bocznym o pojemności 2 L (1 na Rysunku 1B): 1) miedzianej rurki do doprowadzania gazu do naczynia oraz 2) sondy miernika DO.
  5. Wykonaj nacięcie poprzeczne od krawędzi korka do jednego z otworów, aby umożliwić osadzenie przewodu sondy DO w korku.
  6. Podłącz złączkę z 3 mm męskim króćcem do odcinka miedzianej rurki o średnicy 2 mm (1 na Rysunku 1A). Upewnij się, że rurka ta jest wystarczająco długa, aby po przejściu przez korek sięgać do odległości 10 cm od dna kolby.
  7. Wprowadź rurkę ze złączką przez drugi otwór w korku tak, aby długość od spodu korka pozwalała na dotarcie do odległości 10 cm od dna kolby.
  8. Do złączki na rurce podłącz cienkościenną polietylenową rurkę gazową o długości 0,75 m i średnicy 3 mm.
  9. Wsuń zarówno sondę DO, jak i miedzianą rurkę do kolby, a następnie zamknij kolbę korkiem.
  10. Sprawdź szczelność połączenia między korkiem a kolbą oraz dopasowanie rurki i przewodu sondy wewnątrz korka.
  11. Napełnij kolbę o pojemności 1 L ilością 0,4 L wody z kranu i ustaw ją obok tacy z łaźnią lodową i kolbą próżniową.
  12. Zanurz polietylenową rurkę prowadzącą z dużej kolby próżniowej w wodzie w kolbie o pojemności 1 L. Zabezpiecz rurkę taśmą w taki sposób, aby pozostała zanurzona przez cały czas trwania eksperymentu.
  13. Podłącz linię gazową o średnicy 3 mm z kolby próżniowej do akwariowego napowietrzacza powietrza pokojowego. Rozpocznij napowietrzanie wody w kolbie 2 L, włączając napowietrzacz akwariowy, który wprowadza powietrze pokojowe i tlen do wody.
  14. Monitoruj stężenie DO i temperaturę wody za pomocą miernika DO przez 5 min lub do momentu ustanowienia się stanu równowagi DO w komorze, tak aby zmiany stężenia DO były minimalne.

3. Badanie stabilności układu eksperymentalnego

  1. Przed dodaniem muchówek sprawdzić stabilność DO w każdym układzie.
  2. Do kolby o pojemności 2 L dodać trzy lub cztery kamienie, aby muchówki miały podłoże sprzyjające wykonywaniu ruchów typu „pompka”.
  3. Rozpocząć próbną manipulację DO, odłączając rurkę gazową od napowietrzacza i podłączając ją do linii z azotem.
  4. Rozpocząć napowietrzanie azotem z przepływem 20 cubic feet per hr (CFH) przez około 40 s do 1 min.
  5. Gdy DO spadnie do poziomu w obrębie 0,5 mg/L od stężenia docelowego, zmniejszyć przepływ do 15 CFH i pozwolić stężeniu spaść do wartości docelowej.
  6. Natychmiast przerwać przepływ azotu po osiągnięciu stężenia docelowego.
  7. Użyć akwariowego napowietrzacza powietrzem pokojowym, aby przywrócić stężenie docelowe, jeśli DO spadnie poniżej tej wartości.
  8. Jeśli DO jest niestabilne podczas testowania układu, sprawdzić, czy objętość wody nadal wynosi 1,9 L i czy woda nie wypłynęła w wyniku bąbelkowania, czy temperatura wody jest stabilna i nie ulega zmianom oraz czy uszczelki we wszystkich złączkach są szczelne.
  9. Po przeprowadzeniu trzech prób i upewnieniu się badacza co do możliwości kontrolowania DO, podłączyć linię gazową do napowietrzacza i ponownie napowietrzać do osiągnięcia stanu równowagi.
  10. Osiągnąć stan równowagi poprzez podłączenie linii gazowej o średnicy 3 mm do napowietrzacza akwariowego i rozpoczęcie podawania powietrza pokojowego do wody, aż stężenie tlenu w wodzie nie będzie wzrastać ani zmieniać się przez 3 min.
  11. Po osiągnięciu stanu równowagi przerwać napowietrzanie i odszczelnić kolbę.

4. Eksperyment z „pompkami” u jętki skalnej

  1. Podziel całkowitą liczbę muchówek przez liczbę obserwatorów, aby określić liczbę prób do przeprowadzenia.
  2. Wyznacz różne poziomy DO w zakresie od 2 do 10 mg/L, aby ocenić reakcję behawioralną muchówek (liczbę „pompek”).
  3. Przygotuj jedną kolbę na każdą próbę i umieść w niej taką samą liczbę muchówek, jaka jest liczba obserwatorów (w tym schemacie 4 muchówki); włóż sondę i rurkę z powrotem do kolby, a następnie zamknij ją gumowym korkiem.
    Uwaga: Początkowe stężenie DO wynoszące 10 mg/L wybrano jako pierwszy punkt obserwacyjny, ponieważ odpowiadało ono stężeniu DO w strumieniu, z którego pobrano próbki muchówek.
  4. Gdy woda osiągnie poziom 10 mg/L poprzez napowietrzanie zgodnie z krokami 2.10-2.11, zapisz początkową temperaturę wody i pozwól muchówkom przytwierdzić się do skalnego podłoża w kolbie.
  5. Przypisz tylko jednego obserwatora do obserwacji pojedynczej muchówki, aby zapewnić dokładne liczenie zachowań typu „pompki”, czyli ruchów ciała w górę i w dół wykonywanych przez muchówkę.
  6. Policz i zapisz liczbę zaobserwowanych „pompek” w ciągu 3 min okresu obserwacji.
  7. Zmień poziom DO na następny poziom eksperymentalny i powtórz 3 min okres obserwacji dla pozostałych poziomów eksperymentalnych.
    Uwaga: W tym schemacie eksperymentalnym oceniono trzy różne poziomy DO.

5. Analiza statystyczna

  1. Do analizy statystycznej należy wykorzystać średnią liczbę pompek wykonanych przez cztery muchówki w obrębie grupy dla danej próby DO.
  2. Należy użyć bezpłatnego oprogramowania do obliczeń statystycznych R12, aby przeprowadzić analizę wariancji (ANOVA) dla liczby pompek i stężeń DO, przyjmując kolejność każdej próby eksperymentalnej (poziom DO) oraz temperaturę jako współzmienne. DO należy analizować jako dyskretne poziomy pojedynczego czynnika.
  3. W celu sprawdzenia normalności rozkładu należy zastosować test normalności Andersona-Darlinga dla reszt13.
  4. Należy przeprowadzić regresję liniową danych, wykreślając średnią liczbę pompek w funkcji stężeń DO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W warunkach laboratorium dydaktycznego 24 studentów pierwszego roku przeprowadziło sześć prób opisanego układu, aby określić liczbę „pompek”, jakie wykonują jętki w odpowiedzi na różne stężenia DO w wodzie. Średnia liczba pompek wykonanych dla danego poziomu DO w każdej próbie została połączona, aby przedstawić zależność liczby pompek od poziomu DO na Rysunku 2. Wstępnie przeprowadzono analizę ANOVA, wykorzystując stężenie DO, kolejność prób, temperaturę oraz interakcje m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kroki krytyczne
Procedura ta zapewnia prosty i skuteczny sposób manipulowania DO w warunkach laboratoryjnych w celu przeprowadzenia badań behawioralnych na organizmach wodnych. Odkryliśmy, że istnieje kilka krytycznych kroków/elementów, o których należy pamiętać podczas przeprowadzania tego eksperymentu, a które bezpośrednio odnoszą się do wyników. W ramach próby bardzo ważne jest utrzymanie ciśnienia w komorze, aby uniknąć zmian ciśnienia parcjalnego gazów nad wodą i wynikających z tego wahań tlenu rozpuszczonego. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy na wstępie chcieliby podziękować wszystkim studentom z pierwszego roku laboratorium Modułu Biologii 121 w Juniata College za pomoc w generowaniu danych użytych w tym badaniu. Chcielibyśmy również podziękować dr Randy'emu Bennettowi, Chrisowi Wallsowi, Sherry Isenberg i Taylorowi Coxowi za pomoc w zdobyciu materiałów niezbędnych do opracowania tej metodologii. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować dr Norrisowi Muthowi i dr Johnowi Ungerowi za ich porady dotyczące rozwoju metodologicznego oraz dr Jill Keeney i wydziałowi biologii za wsparcie tego przedsięwzięcia. Chcielibyśmy również podziękować anonimowym recenzentom, którzy pomogli ukształtować i ukierunkować ten manuskrypt. Na koniec chciałbym podziękować Hudsonowi Grantowi za jego pomoc w przygotowaniu początkowej kolekcji muchówek, która zostanie wykorzystana w rozwoju tej techniki

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolba filtracyjna 2 LPyrex5340
Gumowy korek rozmiar 6Sigma-AldrichZ164534
Nalgene 180 Przezroczysta plastikowa rurkaThermo Scienfitic8001-1216
Whisper 60 Tetra
Standard elastyczna rurka do przewodów powietrznychPenn PlaxST25
0,25 cala Rurka miedzianaLowes Home Improvement23050
Męski zadzior wężaGrainger5LWH1
Złącze żeńskieGrainger20YZ22
Miernik tlenu rozpuszczonego o dużej wytrzymałościExtech407510
Gazowy azotMatheson TRIGAS
Radnor AF150-580 RegulatorAirgasRAD64003036

Bibliografia

  1. Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
  2. Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
  3. Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
  4. Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
  5. McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
  6. Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
  7. Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
  8. Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
  9. Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. , 3,853,500 (1974).
  10. Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. , 6,258,154 (2001).
  11. Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
  12. Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
  13. Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
  14. Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
  15. Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
  16. Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
  17. Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
  18. Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Manipulacja rozpuszczonym tlenemzachowanie zwierz t wodnychdegazacja azotupompki much wekmonitorowanie sond DOstabilno temperatury wodykonfiguracja napowietrzacza akwariowegotestowanie warunk w hipoksycznychpomiar reakcji behawioralnejlaboratoryjna kontrola poziomu tlenu

Powiązane artykuły