Artykuł metodologiczny

Proste podejście do manipulowania rozpuszczonym tlenem w celu obserwacji zachowania zwierząt

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54430

⸱

28 czerwca 2016

 , 
1Department of Biology, Juniata College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje prosty i powtarzalny protokół do manipulowania warunkami rozpuszczonego tlenu w warunkach laboratoryjnych do badań nad zachowaniem zwierząt. Protokół ten może być stosowany zarówno w warunkach dydaktycznych, jak i laboratoryjnych do oceny reakcji organizmu makrobezkręgowców, ryb lub na zmiany stężenia rozpuszczonego tlenu.

Streszczenie

Możliwość manipulowania rozpuszczonym tlenem (DO) w warunkach laboratoryjnych ma istotne zastosowanie do badania wielu zagadnień związanych z zachowaniem ekologicznym i organizmów. Opisany tutaj protokół zapewnia prostą, powtarzalną i kontrolowaną metodę manipulowania DO w celu badania reakcji behawioralnej organizmów wodnych wynikającej z warunków niedotlenienia i niedotlenienia. Chociaż odgazowanie wody za pomocą azotu jest powszechnie stosowane w warunkach laboratoryjnych, w literaturze nie ma wyraźnej metody do zastosowań ekologicznych (wodnych), a ten protokół jest pierwszym, który opisuje protokół odgazowywania wody w celu obserwacji reakcji organizmu. Ta technika i protokół zostały opracowane do bezpośredniego zastosowania u makrobezkręgowców wodnych; Jednak małe ryby, i inne kręgowce wodne można łatwo zastąpić. Pozwala na łatwą manipulację poziomami tlenu rozpuszczonego w zakresie od 2 mg/L do 11 mg/L ze stabilnością do 5-minutowego okresu obserwacji zwierząt. Po 5-minutowym okresie obserwacji temperatura wody zaczęła rosnąć, a przy 10-minutowym poziomie tlenu rozpuszczonego stała się zbyt niestabilna, aby ją utrzymać. Protokół jest skalowalny do organizmu badawczego, powtarzalny i niezawodny, co pozwala na szybkie wdrożenie w laboratoriach wprowadzających do nauczania i aplikacjach badawczych wysokiego poziomu. Oczekiwane wyniki tej techniki powinny wiązać zmiany rozpuszczonego tlenu z reakcjami behawioralnymi organizmów.

Wprowadzenie

Rozpuszczony tlen (DO) jest kluczowym parametrem fizykochemicznym ważnym w pośredniczeniu w wielu procesach biologicznych i ekologicznych w ekosystemach wodnych. Narażenie na ostre i przewlekłe subletalne niedotlenienie zmniejsza tempo wzrostu niektórych owadów wodnych i zmniejsza przeżywalność narażonych owadów1. Protokół ten został opracowany w celu zapewnienia kontrolowanej metody manipulowania poziomami tlenu rozpuszczonego w wodzie strumieniowej w celu obserwacji wpływu na zachowanie zwierząt. Ponieważ przetrwanie wszystkich tlenowych organizmów wodnych zależy od stężenia tlenu, aby mogły żyć i rozmnażać się, zmiany w stężeniu DO często znajdują odzwierciedlenie w zmianach zachowania organizmów. Zaobserwowano, że bardziej mobilne bezkręgowce wodne i ryby reagują na niskie stężenia tlenu (niedotlenienie), poszukując miejsc o wyższym DO2,3. W przypadku mniej ruchliwych organizmów wodnych adaptacje behawioralne w celu zwiększenia spożycia DO mogą być jedyną realną opcją. Zauważono, że wodny rząd makrobezkręgowców Plecoptera (stonefly) wykonuje ruchy "push-up" w celu zwiększenia przepływu wody i pobierania tlenu przez zewnętrzne skrzela 4-6. Te zachowania adaptacyjne zaobserwowano w środowisku naturalnym i w eksperymentach laboratoryjnych.

Laboratoryjna manipulacja DO w wodzie otwiera znaczące możliwości dla badań nad zachowaniem zwierząt, ale istnieją znaczące luki w metodologii wdrażania. Na przykład w jednym z badań wykorzystano duże akwaria do oceny czasu reakcji fizjologicznej bassa wielkogębowego (Micropterus salmoides) na środowisko niedotlenione po zagazowaniu azotem, ale podano niewiele szczegółów dotyczących metodologii7. Inne badanie przeprowadzone na danio pręgowanym (Danio rerio) opisywało użycie gazowego azotu i porowatego kamienia do dostarczania gazu do wody i zmniejszania DO w wodzie8. W przypadku zastosowań chemicznych metody odgazowania rozpuszczalników wykorzystują specjalistyczną aparaturę 9-11 do usuwania tlenu z rozpuszczalników, ale nie byłyby odpowiednie do badań nad zachowaniem zwierząt. Chociaż w badaniach tych stosuje się metody usuwania tlenu z wody, nie można zidentyfikować żadnej metody opisowej, która pozwoliłaby na ocenę zachowania zwierząt w odpowiedzi na zmiany tlenu rozpuszczonego.

Ta metoda opisana poniżej jest próbą pełnego opisania protokołu manipulacji DO wody za pomocą gazowego azotu. Co więcej, metoda ta została opracowana w celu obserwacji związków między zachowaniem muchówek kamiennych (pompek) a DO, które zastosowano w laboratorium biologicznym na poziomie pierwszego roku. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że można ją łatwo wykonać w laboratorium przy użyciu powszechnie dostępnych wyrobów szklanych i materiałów dostępnych dla większości instytucji szkolnictwa średniego i wyższego. Protokół jest również łatwy do dostosowania, co pozwala osobom fizycznym na skalowanie procedury w celu spełnienia celów określonych dla zastosowań badawczych lub dydaktycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: W tym eksperymencie nie wykorzystano kręgowców, w związku z czym nie wymagał on zatwierdzenia przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Juniata College. Jednakże osoby adaptujące tę metodę do pracy z kręgowcami powinny uzyskać zgodę IACUC.

1. Pobieranie próbek terenowych

  1. Wybrać i ocenić potencjalne stanowiska terenowe pod kątem możliwości szybkiego odłowu, przechowywania i transportu jętzek, aby zminimalizować czas transportu, który nie powinien przekraczać 1 hr.
  2. Przeprowadzić próbkowanie za pomocą sieci kopanej w wybranym miejscu terenowym zgodnie ze standardowymi procedurami, powtarzając czynność tyle razy, aby odłowić co najmniej 35 jętzek12.
  3. Pobrać z potoku 50 L wody oraz kamienie o maksymalnej średnicy 2 cm.
  4. Umieścić akwaria w lodówce ustawionej na temperaturę panującą w miejscu poboru próbek. Rozmieścić zebrane kamienie w akwariach i napełnić każde z nich 4 L wody potokowej. Do każdego akwarium umieścić 20-30 odłowionych jętzek oraz kamień napowietrzający podłączony do pompy akwariowej, a następnie włączyć pompy, aby zapewnić ciągłe napowietrzanie wody powietrzem z otoczenia.
  5. Pozostawić jętki w akwariach na 48 hr, aby zaadaptowały się do nowego środowiska.

Układ reakcji chemicznej; aparat do dyfuzji gazów; manometr; łaźnia lodowa do kontroli temperatury.
Rycina 1. Układ do manipulacji poziomem tlenu rozpuszczonego. (A) 1) Złączka rurki miedzianej do męskiego króćca węża 2) Miejsce uszczelnienia korka do sprawdzenia szczelności kolby. (B) 1) Kolba z bocznym wylotem o pojemności 2 L wypełniona 1,9 L wody 2) Rurka gazowa i bulgotka powietrzna (niebieska) stosowane odpowiednio do napowietrzania azotem i powietrzem pokojowym 3) Butla z azotem i zawory z manometrami 4) Kolba 2 L wypełniona 0,4 L wody z zanurzoną rurką próżniową 5) Miernik tlenu rozpuszczonego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Układ eksperymentalny

  1. Na blacie laboratoryjnym połącz standardową probówkę próżniową z ramieniem bocznym kolby z ramieniem bocznym o pojemności 2 L, jak pokazano (1 na Rysunku 1B).
  2. Napełnij kolbę 1,9 L wody strumieniowej z 3 L plastikowych pojemników z zebraną wodą strumieniową przechowywanych w lodówce ustawionej na 12 °C.
  3. Umieść kolbę i przewody na tacy wystarczająco dużej, aby pomieścić kąpiel lodową wokół kolby z ramieniem bocznym, nie zasłaniając widoczności wnętrza kolby, a następnie wypełnij tacę lodem.
  4. Wywierć dwa otwory o średnicy 3 mm w gumowym korku, aby umożliwić wprowadzenie do kolby z ramieniem bocznym o pojemności 2 L (1 na Rysunku 1B) 1) miedzianej rurki do doprowadzania gazu do naczynia oraz 2) sondy miernika DO.
  5. Wykonaj nacięcie boczne od krawędzi korka do jednego z otworów, aby umożliwić osadzenie przewodu sondy DO w korku.
  6. Połącz złączkę z 3 mm męskim kolcem do węża z fragmentem miedzianej rurki o średnicy 2 mm (1 na Rysunku 1A). Upewnij się, że rurka ta jest wystarczająco długa, aby po przejściu przez korek sięgać do odległości 10 cm od dna kolby.
  7. Wprowadź rurkę ze złączką przez drugi otwór w korku, tak aby długość od spodu korka była wystarczająca do dotarcia na odległość 10 cm od dna kolby.
  8. Do złączki na rurce podłącz cienkościenną polietylenową rurkę gazową o średnicy 3 mm i długości 0,75 m.
  9. Wsuń zarówno sondę DO, jak i miedzianą rurkę do kolby, a następnie zamknij kolbę korkiem.
  10. Sprawdź szczelność połączenia między korkiem a kolbą oraz dopasowanie rurki i przewodu sondy wewnątrz korka.
  11. Napełnij kolbę o pojemności 1 L ilością 0,4 L wody z kranu i ustaw ją obok tacy z kąpielą lodową i kolbą próżniową.
  12. Zanurz polietylenową rurkę wychodzącą z dużej kolby próżniowej w wodzie w kolbie 1 L. Przymocuj rurkę taśmą tak, aby pozostała zanurzona przez cały czas trwania eksperymentu.
  13. Podłącz linię gazową o średnicy 3 mm z kolby próżniowej do akwariowej pompki napowietrzającej powietrzem pokojowym. Rozpocznij napowietrzanie wody w kolbie 2 L, włączając pompkę akwariową, która wprowadza do wody powietrze pokojowe i tlen.
  14. Monitoruj stężenie DO i temperaturę wody za pomocą miernika DO przez 5 min lub do czasu osiągnięcia stanu równowagi DO w komorze, tak aby zmiany DO były minimalne.

3. Testowanie stabilności układu eksperymentalnego

  1. Przed dodaniem muchówek sprawdzić stabilność DO w każdym układzie.
  2. Do kolby o pojemności 2 L dodać trzy lub cztery kamienie, aby muchówki miały podłoże sprzyjające wykonywaniu ruchów typu „push-up”.
  3. Rozpocząć próbną manipulację DO, odłączając rurkę gazową od napowietrzacza i podłączając ją do linii z azotem.
  4. Rozpocząć bąbelkowanie azotu z przepływem 20 cubic feet per hr (CFH) przez około 40 s do 1 min.
  5. Gdy DO spadnie do wartości w granicach 0,5 mg/L od stężenia docelowego, zmniejszyć przepływ do 15 CFH i pozwolić stężeniu spaść do wartości docelowej.
  6. Natychmiast przerwać przepływ azotu po osiągnięciu stężenia docelowego.
  7. W przypadku spadku DO poniżej wartości docelowej, użyć akwariowego napowietrzacza powietrzem pokojowym, aby przywrócić stężenie docelowe.
  8. Jeśli podczas testowania układu DO jest niestabilne, sprawdzić, czy objętość wody nadal wynosi 1,9 L i czy woda nie wypłynęła w postaci pęcherzyków, czy temperatura wody jest stabilna i nie zmienia się oraz czy wszystkie uszczelki na złączkach są szczelne.
  9. Po przeprowadzeniu trzech prób i uzyskaniu pewności co do możliwości kontrolowania DO, podłączyć linię gazową do napowietrzacza i ponownie doprowadzić do stanu równowagi poprzez bąbelkowanie.
  10. Doprowadzić do stanu równowagi, podłączając linię gazową o średnicy 3 mm do napowietrzacza akwariowego i rozpoczynając napowietrzanie wody powietrzem pokojowym, aż stężenie tlenu w wodzie nie będzie wzrastać ani zmieniać się przez 3 min.
  11. Po osiągnięciu stanu równowagi przerwać bąbelkowanie i odszczelnić kolbę.

4. Eksperyment z pompkami u jętek skalnych

  1. Podziel całkowitą liczbę jętek przez liczbę obserwatorów, aby określić liczbę prób do przeprowadzenia.
  2. Wyznacz różne poziomy DO w zakresie od 2 do 10 mg/L, aby ocenić reakcję behawioralną jętek (liczbę „pompek”).
  3. Przygotuj jedną kolbę na każdą próbę i umieść w niej taką samą liczbę jętek, jaka jest liczba obserwatorów (w tym projekcie 4 jętki); włóż sondę i rurkę z powrotem do kolby, a następnie uszczelnij ją gumowym korkiem.
    Uwaga: Początkowe stężenie DO wynoszące 10 mg/L wybrano jako pierwszy punkt obserwacyjny, ponieważ odpowiadało ono stężeniu DO w strumieniu, z którego pobrano próbki jętek.
  4. Gdy stężenie tlenu w wodzie osiągnie 10 mg/L poprzez napowietrzanie zgodnie z krokami 2.10-2.11, zapisz początkową temperaturę wody i pozwól jętkom przytwierdzić się do skalnego podłoża w kolbie.
  5. Przypisz tylko jednego obserwatora do śledzenia jednej jętki, aby zapewnić dokładne liczenie zachowań typu „pompki”, czyli ruchów ciała w górę i w dół wykonywanych przez jętki.
  6. Policz i zapisz liczbę zaobserwowanych „pompek” w ciągu 3-minutowego okresu obserwacji.
  7. Zmień DO na kolejny eksperymentalny poziom tlenu i powtórz 3-minutowy okres obserwacji dla pozostałych poziomów eksperymentalnych.
    Uwaga: W tym projekcie eksperymentalnym oceniono trzy różne poziomy DO.

5. Analiza statystyczna

  1. W celu przeprowadzenia analizy statystycznej należy wykorzystać średnią liczbę pompek wykonanych przez cztery muchówki w obrębie grupy dla danej próby DO.
  2. Użyj bezpłatnego oprogramowania do obliczeń statystycznych R12, aby przeprowadzić analizę wariancji (ANOVA) dla liczby pompek i stężeń DO, przyjmując kolejność każdej próby doświadczalnej (poziom DO) oraz temperaturę jako kowarianty. Analizuj DO jako dyskretne poziomy pojedynczego czynnika.
  3. Aby sprawdzić normalność rozkładu, zastosuj test normalności Andersona-Darlinga dla reszt13.
  4. Przeprowadź regresję liniową danych, wykreślając średnią liczbę pompek w zależności od stężeń DO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W warunkach laboratorium dydaktycznego 24 studentów pierwszego roku przeprowadziło sześć prób opisanego układu, aby określić liczbę „pompek”, jakie wykonują jętki w odpowiedzi na różne stężenia DO w wodzie. Średnią liczbę pompek wykonanych dla danego poziomu DO w każdej z prób zestawiono, aby przedstawić zależność liczby pompek od poziomu DO na Rysunku 2. Wstępnie przeprowadzono analizę ANOVA, uwzględniając stężenie DO, sekwencyjną kolejność prób, temperaturę oraz interak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kroki krytyczne
Procedura ta zapewnia prosty i skuteczny sposób manipulowania DO w warunkach laboratoryjnych w celu przeprowadzenia badań behawioralnych na organizmach wodnych. Odkryliśmy, że istnieje kilka krytycznych kroków/elementów, o których należy pamiętać podczas przeprowadzania tego eksperymentu, a które bezpośrednio odnoszą się do wyników. W ramach próby bardzo ważne jest utrzymanie ciśnienia w komorze, aby uniknąć zmian ciśnienia parcjalnego gazów nad wodą i wynikających z tego wahań tlenu rozpuszczonego. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy na wstępie chcieliby podziękować wszystkim studentom z pierwszego roku laboratorium Modułu Biologii 121 w Juniata College za pomoc w generowaniu danych użytych w tym badaniu. Chcielibyśmy również podziękować dr Randy'emu Bennettowi, Chrisowi Wallsowi, Sherry Isenberg i Taylorowi Coxowi za pomoc w zdobyciu materiałów niezbędnych do opracowania tej metodologii. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować dr Norrisowi Muthowi i dr Johnowi Ungerowi za ich porady dotyczące rozwoju metodologicznego oraz dr Jill Keeney i wydziałowi biologii za wsparcie tego przedsięwzięcia. Chcielibyśmy również podziękować anonimowym recenzentom, którzy pomogli ukształtować i ukierunkować ten manuskrypt. Na koniec chciałbym podziękować Hudsonowi Grantowi za jego pomoc w przygotowaniu początkowej kolekcji muchówek, która zostanie wykorzystana w rozwoju tej techniki

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolba filtracyjna 2 LPyrex5340
Gumowy korek rozmiar 6Sigma-AldrichZ164534
Nalgene 180 Przezroczysta plastikowa rurkaThermo Scienfitic8001-1216
Whisper 60 Tetra
Standard elastyczna rurka do przewodów powietrznychPenn PlaxST25
0,25 cala Rurka miedzianaLowes Home Improvement23050
Męski zadzior wężaGrainger5LWH1
Złącze żeńskieGrainger20YZ22
Miernik tlenu rozpuszczonego o dużej wytrzymałościExtech407510
Gazowy azotMatheson TRIGAS
Radnor AF150-580 RegulatorAirgasRAD64003036

Bibliografia

  1. Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
  2. Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
  3. Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
  4. Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
  5. McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
  6. Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
  7. Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
  8. Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
  9. Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. , 3,853,500 (1974).
  10. Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. , 6,258,154 (2001).
  11. Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
  12. Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
  13. Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
  14. Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
  15. Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
  16. Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
  17. Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
  18. Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Manipulacja rozpuszczonym tlenemzachowanie zwierz t wodnychdegazacja azotupompki much wekmonitorowanie sond DOstabilno temperatury wodykonfiguracja napowietrzacza akwariowegotestowanie warunk w hipoksycznychpomiar reakcji behawioralnejlaboratoryjna kontrola poziomu tlenu

Powiązane artykuły