Uraz ścięgna zginacza myszy i chirurgia naprawcza

Podsumowanie

Ścięgna zginaczy w dłoni są często uszkadzane, co prowadzi do upośledzenia funkcji ręki. Jednak reakcja gojenia się tkanki bliznowatej nie jest dobrze scharakteryzowana. Przedstawiono tutaj mysi model gojenia ścięgien zginaczy. Model ten może przyczynić się do lepszego zrozumienia procesu gojenia i oceny podejść terapeutycznych w celu poprawy gojenia.

Streszczenie

Ścięgno łączy mięśnie szkieletowe i kości, ułatwiając poruszanie prawie całego ciała. W dłoni ścięgna zginaczy (FT) umożliwiają zgięcie palców i ogólne funkcjonowanie dłoni. Urazy FT są powszechne, a zadowalające gojenie jest często utrudnione z powodu nadmiaru tkanki bliznowatej i zrostów między ścięgnem a otaczającą tkanką. Jednak niewiele wiadomo na temat molekularnych i komórkowych składników naprawy FT. W tym celu opracowano i opisano wcześniej mysi model naprawy FT, który podsumowuje wiele aspektów gojenia u ludzi, w tym upośledzony zakres ruchu i zmniejszone właściwości mechaniczne. W tym miejscu przedstawiono dogłębną demonstrację tej procedury chirurgicznej, obejmującej przecięcie, a następnie naprawę ścięgna zginacza długiego palca (FDL) w tylnej łapie myszy. Technika ta może być wykorzystana do przeprowadzenia analizy linii różnych typów komórek, oceny skutków przyrostu lub utraty funkcji genów oraz do testowania skuteczności interwencji farmakologicznych w procesie gojenia. Istnieją jednak dwa podstawowe ograniczenia tego modelu: i) ścięgno FDL w środkowej części mysiej tylnej łapy, gdzie następuje przecięcie i naprawa, nie jest otoczone osłonką maziową. W związku z tym model ten nie uwzględnia potencjalnego udziału osłonki w procesie powstawania blizny. ii) Aby chronić integralność miejsca naprawy, FT jest uwalniany w połączeniu mięśniowo-ścięgnistym, zmniejszając siły mechaniczne ścięgna, co prawdopodobnie przyczynia się do zwiększonego tworzenia blizn. Wyizolowanie wystarczającej ilości komórek z tkanki ziarninowej FT podczas procesu gojenia do analizy metodą cytometrii przepływowej okazało się wyzwaniem; Wirowanie cytologiczne w celu zagęszczenia tych komórek jest alternatywną metodą stosowaną i pozwala na wytworzenie preparatów komórkowych, na których można przeprowadzić znakowanie immunofluorescencyjne. Dzięki tej metodzie możliwa staje się kwantyfikacja komórek lub białek będących przedmiotem zainteresowania podczas gojenia FT.

Wprowadzenie

Ścięgna zginaczy w dłoni współpracują z mięśniami zginaczy przedramienia i osłonkami cyfrowymi, umożliwiając zginanie palców i funkcję chwytania ręki. Ścięgna zginaczy biegną wzdłuż dłoniowej części dłoni; Ta stosunkowo powierzchowna lokalizacja często powoduje urazy ścięgien zginaczy podczas urazu ręki. Ścięgna goją się poprzez reakcję tkanki bliznowatej, a nie regenerację normalnej tkanki ścięgna ¹. Podczas gdy ta tkanka bliznowata zapewnia ciągłość ścięgna, funkcja jest dramatycznie zmniejszona w stosunku do zdrowego ścięgna. Kompozyty tkanki ścięgnistej i bliznowatej charakteryzują się upośledzonymi właściwościami ^{mechanicznymi1}, co zwiększa prawdopodobieństwo zerwania naprawionych ścięgien. Ponadto tkance bliznowatej brakuje organizacji natywnej struktury włókien kolagenowych ścięgien, co powoduje wzrost rozmiaru i objętości ścięgien. Biorąc pod uwagę ograniczenia anatomiczne jednostki ścięgno-pochewka, nawet niewielki wzrost rozmiaru ścięgna może drastycznie zmniejszyć funkcję ślizgania ścięgna, a tym samym zakres ruchu palców i funkcję dłoni.

Przed 1960 rokiem urazy ścięgien zginaczy, szczególnie te w strefie II ręki, nie były rutynowo naprawiane z powodu poważnych komplikacji w gojeniu, które powstały podczas tych napraw ². Ten obszar dłoni był określany jako "ziemia niczyja" ³. Jednak ulepszenia w technikach chirurgicznych, wzorach szwów i protokołach rehabilitacji fizjoterapeutycznej znacznie poprawiły wyniki naprawy ścięgien zginaczy ². Pomimo tych postępów, do 40% napraw powoduje powstanie przyczepności na tyle dużo, aby utrudnić funkcjonowanie ręki ⁴. Dlatego wymagane jest podejście biologiczne, aby poprawić gojenie. Niestety, bardzo niewiele wiadomo na temat procesu gojenia się ścięgien na poziomie komórkowym i molekularnym. W związku z tym celem było opracowanie mysiego modelu, który mógłby zostać wykorzystany do lepszego zrozumienia podstawowych składników komórkowych i molekularnych gojenia ścięgien zginaczy oraz reakcji na tworzenie się blizn, jako sposób na zidentyfikowanie nowych celów terapeutycznych w celu poprawy gojenia.

Większe modele zwierzęce odegrały kluczową rolę w lepszym zrozumieniu procesu gojenia ścięgien zginaczy. Badania na psach i królikach wykazały zarówno wewnętrzną, jak i zewnętrzną zdolność gojenia ścięgien zginaczy ^5,6, znaczenie wczesnego kontrolowanego ruchu biernego w minimalizowaniu powstawania zrostów w stosunku do unieruchomienia ⁷, a także wpływ różnych wzorów szwów na proces gojenia ^8,9. Ponadto model psa okazał się przydatny w testowaniu translacyjnych metod inżynierii tkankowej w celu poprawy gojenia ¹⁰. Istnieje jednak kilka ważnych zalet korzystania z modelu mysiego w porównaniu z dużym modelem zwierzęcym, w tym względny koszt, dostępność odczynników specyficznych dla myszy oraz łatwość generowania globalnych nokautów lub specyficznych dla tkanki konstrukcji delecji/nadekspresji. Co więcej, podobieństwa funkcjonalne między człowiekiem a myszami w odniesieniu do ścięgien zginaczy ¹¹ wskazują na potencjalną użyteczność w opracowaniu modelu mysiego.

Opracowanie mysiego modelu przecięcia i naprawy ścięgna zginacza naśladuje wiele aspektów klinicznego gojenia, w tym tworzenie obfitych blizn i pogorszenie właściwości mechanicznych. Opisany tutaj model nie jest prawdziwym podsumowaniem praktyki klinicznej ze względu na przecięcie FDL w połączeniu mięśniowo-ścięgnistym w celu ochrony miejsca naprawy. Co więcej, model ten nie uwzględnia udziału komórek osłonki maziowej w odpowiedzi gojenia, ponieważ nie ma osłonki maziowej pokrywającej środkową część ścięgna, w której zachodzi naprawa. Pomimo tych ograniczeń, model ten ma tę zaletę, że generuje zrosty ograniczające ruch, co nie zostało jeszcze wykazane w modelach mysich, które są bardziej zbliżone do scenariusza klinicznego. Model ten został wykorzystany do oceny mysich modeli nokautujących ^12,13 oraz do testowania różnych podejść farmakologicznych w celu poprawy gojenia ^14-17. Analizy histologiczne tego modelu, wykorzystujące immunohistochemię i hybrydyzację in situ, mogą dostarczyć ważnych informacji na temat lokalizacji kluczowych genów i białek podczas gojenia. Jednak histologia zapewnia jedynie przekrojową analizę przestrzenną i nie pozwala na kwantyfikację w całej tkance. Cytometria przepływowa reprezentuje bardziej ilościowe podejście, ale tylko bardzo ograniczona liczba komórek może zostać wyizolowana z gojącej się tkanki ścięgna w modelu mysim, a liczba ta jest dodatkowo zmniejszana podczas etapów fiksacji, przepuszczalności i mycia. Biorąc to pod uwagę, cytometria przepływowa staje się niewykonalnym podejściem ze względu na liczbę zwierząt, które byłyby wymagane. Alternatywna metoda jest niezbędna do zachowania większości tej populacji małych komórek w celu dalszego scharakteryzowania środowiska leczniczego. Metoda zastosowana w tym celu, pokazana tutaj, polega na koncentracji wyizolowanych komórek poprzez wirowanie cytologiczne na szkiełku szkiełkowym, a następnie immunocytochemię. W niniejszym badaniu zastosowano inkorporację EdU (5-etynylo-2'deoksyurydyna, analog tymidyny), a następnie znakowanie w celu określenia względnego stanu proliferacyjnego komórek w miejscu gojenia. Podejście to można zastosować do badania skuteczności leczenia farmakologicznego w zakresie proliferacji komórek, nokautu lub nadekspresji genów lub do identyfikacji i ilościowego określenia różnych populacji komórek.

Protokół

Uniwersytecki Komitet ds. Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Rochester zatwierdził wszystkie eksperymenty na zwierzętach. Użyto 10-12-tygodniowych samic myszy C57BL/6J.

1. Przygotowanie zwierząt do operacji ścięgna zginacza (~15 min)

1. Autoklaw narzędzi chirurgicznych do sterylizacji, noś sterylne rękawiczki przez cały czas i utrzymuj sterylne pole operacyjne.
2. Znieczulić mysz przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) z objętością ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) odpowiadającą masie ciała. Potwierdź głębokość sedacji poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp.
3. Analgezję zapobiegawczą należy podawać (buprenorfina, 0,05-0,1 mg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym. Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
4. Przygotuj miejsce operacji, przycinając futro na całej tylnej kończynie. Wysterylizuj skórę, szorując sekwencyjnie jodem powidonu, a następnie 70% etanolem i ponownie jodem powidonu.

2. Uraz ścięgna zginacza myszy i operacja naprawcza (~10 min)

1. Znajdź ścięgno zginacza długiego palca (FDL), widoczne powierzchownie w przyśrodkowej części łydki. Za pomocą skalpela wykonaj małe 0,5-1 cm nacięcie w skórze za pomocą mikronożyczek, aby odsłonić ścięgno.
2. Użyj kleszczy, aby oddzielić ścięgno FDL od otaczającej tkanki i prześledzić je aż do połączenia mięśniowo-ścięgnistego. Przetnij ścięgno na tym skrzyżowaniu nożyczkami sprężynowymi, aby je uwolnić, uważając, aby ominąć tylną tętnicę piszczelową.
3. Zamknij skórę nylonowymi szwami 5-0.
   Uwaga: Przecięcie i naprawa FDL (kroki 2.4) powinny być wykonane przy użyciu mikroskopu stereoskopowego.
4. Wykonaj 3 mm nacięcie nad tylno-boczną częścią tylnej łapy za pomocą mikronożyczek sprężynowych. Delikatnie cofnij otaczające tkanki miękkie i mięśnie za pomocą kleszczy, upewniając się, że zminimalizujesz uszkodzenie tkanek i zidentyfikuj ścięgno FDL.
   1. Delikatnie unieś ścięgno FDL i całkowicie je przetransektuj za pomocą mikronożyczek. Zszyj końce ścięgna FDL razem w zmodyfikowany wzór Kesslera z 8-0 szwy, unikając wysuszenia ścięgna poprzez okresowe zwilżanie go solą fizjologiczną.
   2. Wymień tkankę miękką i mięśnie nad ścięgnem, a następnie zamknij nacięcie nylonowymi szwami 5-0.
5. Umieść myszy na podgrzewaczu do szkiełek ustawionych na 37 °C, aby utrzymać temperaturę ciała do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia.
6. Monitoruj myszy po operacji pod kątem oznak upośledzenia lub infekcji, w tym zwiększonej wokalizacji i potarganej sierści. Wstrzykuj buprenorfinę (50 μl / mysz) jako środek przeciwbólowy co 12 godzin, aż myszy przestaną wykazywać oznaki bólu lub niepokoju.
7. Pozwól myszom zagoić się przez okres 10 dni po operacji, zanim przejdziesz do kolejnych kroków.
   Uwaga: Komórki można pobrać w dowolnym momencie po operacji. W tym przypadku na te reprezentatywne eksperymenty wybiera się 10 dni, biorąc pod uwagę stosunkowo wysoką komórkowość tkanki w tym czasie.

3. Etykietowanie komórek cyklicznych (~10 min)

1. Przygotować roztwór EdU (5-etynylo-2'deoksyurydyna) (10 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS] + 1% dimetylosulfotlenku [DMSO] w celu zwiększenia rozpuszczalności).
2. Wstrzyknąć myszom 100 μl EdU (50 mg / kg) przez wstrzyknięcie dożylne 24 godziny przed uśmierceniem.

4. Pobieranie komórek do wirowania cytologicznego (2,5 godziny, ~30 minut czasu praktycznego)

1. Przygotować 3 mg/ml kolagenazy I w PBS.
2. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla przy natężeniu przepływu nie większym niż 3 l/min i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy jako środek wtórny.
3. Zlokalizuj naprawione ścięgno, wykonując krok 2.4 powyżej, i wyizoluj tkankę ścięgna, przecinając około 2 mm po obu stronach miejsca urazu za pomocą mikronożyczek.
   1. Tkankę rozdrobnić skalpelem na szalce Petriego z 1 ml kolagenazy o stężeniu 3 mg/ml, a następnie kilkakrotnie przepuścić mieszaninę przez igłę o sile 18 g w celu rozdrobnienia tkanki. Zebrać mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   2. Trawić tkankę ścięgna przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
   3. Odwirować tkankę w dół (300 x g przez 5 minut), odessać kolagenazę, a następnie ponownie zawiesić komórki/tkanki za pomocą 500 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, pipetując kilkakrotnie w górę iw dół.
   4. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń i dużych kawałków ścięgien i odłożyć do inkubatora o temperaturze 37 °C.
   5. Umieść tkankę ścięgna w innej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odśwież 1 ml roztworu kolagenazy, pipetując w górę iw dół, aby wymieszać.
   6. Inkubować tkankę przez kolejną godzinę w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
   7. Odwirować strawioną tkankę ścięgna (300 x g przez 5 minut), a następnie ponownie zawiesić w 500 μl 3% BSA w PBS, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.
   8. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm, połączyć z zawiesiną wyizolowaną w ppkt 4.3.3, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
   9. Ponownie przemyć komórki za pomocą 3% BSA w PBS, a następnie ponownie zawiesić do 3-6 x 10⁴/100 μl.
4. Przymocuj lejek cytologiczny do dodatnio naładowanego szkiełka i zablokuj go w nośniku. Włożyć cały aparat do wirówki cytologicznej i dodać 100 μl zawiesiny komórek do lejka. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby rozproszyć komórki na szkiełku.

5. Immunocytochemia do wykrywania EdU (2 godziny, ~45 min czasu praktycznego)

Uwaga: Wszystkie etapy inkubacji powinny być wykonywane w ciemności, aby ograniczyć fotowybielanie fluoroforów.

1. Zakreśl komórki hydrofobowym pisakiem barierowym, aby zminimalizować roztwór potrzebny do wykonania kolejnych kroków, a następnie natychmiast utrwal 150 μl 3% paraformaldehydu w PBS 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
   1. Umyć dwukrotnie przez 5 minut 150 μl 3% BSA w PBS.
   2. Permeabilizuj komórki za pomocą 0,5% Triton-X 100 w PBS 20 min w RT.
   3. Powtórzyć etap prania jak w ppkt 5.1.1.
2. Koktajl reakcyjny EdU należy przygotować zgodnie z instrukcją zestawu nie później niż 30 minut przed użyciem.
   1. Dodaj 150 μl koktajlu do każdego szkiełka, inkubuj 30 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Powtórzyć etap prania jak w ppkt 5.1.1.
3. Inkubować ze 150 μl jądrowego barwnika przeciwstawnego Hoechst33342 rozcieńczonego 1:2,000 w PBS 30 min w temperaturze suchej.
   1. Umyć dwukrotnie przez 5 minut 150 μl 1x PBS.
4. Dodaj 1-2 krople środka montażowego zapobiegającego blaknięciu do komórek, a następnie powoli opuść szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.
   1. Pozostawić podłoże montażowe do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
   2. Użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe do szkiełka.
5. Obraz jest wyświetlany w 40-krotnym powiększeniu przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry wzbudzenia/emisji zdolne do wykrywania DAPI (Hoeschst33342) i Texas Red (Alexa Fluor 594).

Wyniki

Mięsień zginacz długi palców (FDL), znajdujący się w łydce, odpowiada za zginanie palców tylnej łapy myszy poprzez ścięgno zginacza (obrysowane na niebiesko na Rysunku 1A i przedstawione histologicznie na Rysunku 2A), które biegnie proksymalnie od połączenia mięśniowo-ścięgnistego i kończy się w paliczkach dystalnych. W tym modelu gojenia ścięgna zginacza, ścięgno FDL jest przecinane i naprawiane w połowie stopy, proksymalnie względem rozwidlenia do palcó...

Dyskusja

W pracy przedstawiono procedurę chirurgiczną mysiego modelu całkowitego przecięcia i naprawy ścięgna zginacza długiego palca palca. Ponadto zademonstrowano nowatorskie zastosowanie koncentracji populacji małych komórek za pomocą wirówki cytologicznej, co pozwala na ilościową analizę immunocytochemiczną środowiska komórkowego podczas gojenia ścięgna zginaczy. Ten model naprawy ścięgna zginacza wykazuje powtarzalną odpowiedź gojenia, którą można wykorzystać do oceny zmian w procesie gojenia za pomocą modeli nokautujących l...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Preparat chirurgiczny
myszy C57BL/6J	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorfina	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0,9% chlorek sodu do nawadniania	Hospira	NDC# 0409-6138-03	Do przygotowania roztworów ketaminy/ksylazyny i buprenorfiny
1 ml strzykawka	BD	309659
30 G igła	BD	305106
Roztwór powidonu i jodu	Aplicare	82-226
70% etanol
Maść okulistyczna weterynaryjna Puralube	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzia chirurgiczne
Waga przenośna 200 g	Ohaus	SP202
Nożyczki sprężynowe	Fine Science Tools	15124-12
Kleszcze Dumont #5	Narzędzia do nauki o nauce	11251-30
Uchwyty do igieł	Fine Science Tools	91201-13
Nożyczki z mikro sprężynami	Fine Science Tools	15003-08
Uchwyty do mikroigieł	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nici nylonowe	Ethicon	668G
8-0 nici nylonowe do mikrochirurgii	Ethicon	2808G
Lab-Line histologiczne podgrzewacz do szkiełek	Barnstead International	26025
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cytospin method
Collagenaza typu I, liofilizowana	Life Technologies	1700-017
Technologie sygnalizacji komórkowej	albuminy w surowicy bydlęcej	9998S
1x	PBS Thermo Fisher	10010-023
Lejki cytologiczne	Fisher HealthCare	10-354
Szkiełka mikroskopowe HistoBond+	VWR	16005-110
Wirówka Cytospin 2	Shandon	SH-CYTO2
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Immunocytochemia
Tacka do barwienia szkiełek z czarną pokrywką	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Zawiera EdU i  Hoeschst 33342
Hydrofobowy długopis barierowy Immedge	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamentowe medium montażowe	Thermo Fisher	P36970
Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 50 mm #1.5
Bezbarwny lakier

do paznokci