Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Summary

Opisujemy tutaj system wykorzystujący specyficzny dla miejsca, odwracalny blok białkowy in vivo do zatrzymywania i zwijania widełek replikacyjnych u Escherichia coli. Ustanowienie bloku replikacji ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a do wizualizacji produktów pośrednich replikacji stosuje się neutralno-neutralną 2-wymiarową elektroforezę w żelu agarozowym.

Abstract

Przeszkody obecne na DNA, w tym ściśle związane białka i różne zmiany, mogą poważnie zahamować postęp maszynerii replikacyjnej komórki. Zatrzymanie replikosmu może prowadzić do jego dysocjacji od chromosomu, częściowo lub w całości, co prowadzi do zapadnięcia się widełek replikacyjnych. Powrót do zdrowia po tym zapadnięciu się jest niezbędny, aby komórka mogła dokładnie zakończyć duplikację chromosomów, a następnie podzielić. Dlatego, gdy dochodzi do zapadnięcia się, komórka wyewoluowała różne mechanizmy, które mają miejsce w celu przywrócenia widelca DNA i umożliwienia zakończenia replikacji z wysoką wiernością. Wcześniej te szlaki naprawy replikacji u bakterii były badane przy użyciu uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem UV, które ma tę wadę, że nie są zlokalizowane w znanym miejscu. Ten manuskrypt opisuje system wykorzystujący system operatora represora fluorescencji (FROS) do stworzenia specyficznego dla miejsca bloku białkowego, który może indukować zatrzymanie i zapadanie się widełek replikacyjnych w Escherichia coli. Protokoły szczegółowo opisują, w jaki sposób można wizualizować stan replikacji w pojedynczych żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a produkty pośrednie replikacji DNA można analizować za pomocą 2-wymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym. Wrażliwe na temperaturę mutanty składników replikosomów (np. DnaBts) mogą być włączane do systemu w celu wywołania synchronicznego zapadania się widełek replikacyjnych. Co więcej, role białek rekombinacyjnych i helikaz, które są zaangażowane w te procesy, można badać za pomocą nokautów genetycznych w tym systemie.

Introduction

Podczas replikacji DNA, replikom napotyka przeszkody na DNA, które utrudniają jego rozwój. Uszkodzenia DNA, w tym zmiany i luki, a także nieprawidłowe struktury, mogą uniemożliwić postęp replikosomu¹. Ostatnio stwierdzono, że białka związane z DNA są najczęstszym źródłem przeszkód w progresji widełek replikacyjnych². Wiedza o zdarzeniach następujących po zetknięciu się replikosomu z blokiem nukleoproteiny była wcześniej ograniczona przez niemożność wywołania takiej blokady w chromosomie żywej komórki w znanej lokalizacji. Analiza in vitro poszerzyła naszą wiedzę na temat kinetycznego zachowania aktywnego replikosmu w momencie napotkania blokady nukleoproteinowej³, a także szczegółów mechanistycznych samego replikosmu^4,5. Obecna wiedza na temat naprawy replikacji jest na ogół podejmowana z użyciem promieniowania UV jako czynnika uszkadzającego i badana przy użyciu plazmidowego DNA in vivo^6-8. Podczas gdy białka, które mogą być zaangażowane w naprawę DNA po napotkaniu bloku nukleoproteiny in vivo, są ogólnie zrozumiałe z tych badań, to, czy występują różnice w zdarzeniach molekularnych w szlakach naprawczych z powodu wyraźnej przyczyny w bloku replikacji, nadal nie zostało jeszcze ustalone.

Tutaj opisujemy system, który pozwala na utworzenie bloku nukleoproteiny w określonym miejscu chromosomu za pomocą Fluorescencyjnego Systemu Operatora Represora (FROS). Wykorzystujemy szczep E. coli, który miał szereg 240 miejsc tetO włączonych do chromosomu⁹. Każde miejsce tetO w macierzy ma losową sekwencję 10 pz otaczającą ją, aby zwiększyć stabilność macierzy, zapobiegając rekombinacji za pośrednictwem RecA w macierzy. Ta matryca i jej odmiany były pierwotnie używane do zrozumienia dynamiki chromosomu E. coli ^10,11, ale następnie zostały przystosowane, aby zapobiec replikacji in vivo ¹². Stwierdzono, że macierz jest stabilnie utrzymywana i blokuje blisko 100% widełek replikacyjnych po powiązaniu przez TetR^10,12. Zastosowanie podobnej macierzy lacO in vitro wykazało, że zaledwie 22 miejsca były wystarczające do zablokowania 90% replikacji, chociaż ta krótsza matryca była mniej skuteczna in vivo¹³. Aby przystosować macierz do tworzenia blokady nukleoproteinowej, białko represorowe musi być wysoce nadprodukowane w zoptymalizowanych warunkach, w których następnie wiąże się z macierzą, tworząc blokadę drogową. Powstawanie blokady, a następnie jej uwalnianie, można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli stosuje się fluorescencyjnie znakowany wariant represora Tet. Stan replikacji w każdej komórce jest wskazywany przez liczbę widocznych ognisk, gdzie pojedynczy punkt ogniskowy oznacza, że w komórce znajduje się tylko jedna kopia tablicy, a wiele ognisk wskazuje na aktywną replikację. Ta aktywna replikacja jest możliwa, gdy blokada nukleoproteiny jest odwracana przez dodanie niepotrzebnego induktora, który zmniejsza powinowactwo wiązania TetR do miejsca operatora na tyle, aby replikom mógł przejść przez macierz. Białko represorowe jest nadal w stanie wiązać się z DNA z wystarczająco wysokim powinowactwem, aby można było zwizualizować wiele kopii macierzy.

Bardziej skomplikowane szczegóły zdarzeń w blokadzie nukleoproteinowej można odkryć za pomocą neutralnej-neutralnej dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym i południowej hybrydyzacji^14-16. Techniki te pozwalają na analizę struktur DNA w całej populacji. Można wizualizować produkty pośrednie replikacji, które powstają podczas zdarzenia i potencjalnie pozostają nienaprawione. Zmieniając zastosowany enzym restrykcyjny i sondę, produkty pośrednie można wizualizować nie tylko w regionie macierzy, ale także przed macierzą, gdy widełki replikacyjne cofają się^17,18. Regresja następuje po dysocjacji replikowej; wiodące i opóźnione powstające nici oddzielają się od nici matrycowych i wyżarzają się względem siebie, gdy nici matrycowe jednocześnie ponownie wyżarzają, co skutkuje czterokierunkową strukturą DNA (połączenie Holliday'a).

Korzystając z tego systemu, wykazano, że widelec replikacyjny nie jest stabilny, gdy napotka ten blok¹⁸. Ponadto wrażliwe na temperaturę pochodne składników replikomu mogą być wykorzystane do zapobiegania ponownemu ładowaniu widełek replikacyjnych po ich zapadnięciu. Po ustanowieniu bloku szczep można przesunąć do temperatury niedopuszczającej, aby zapewnić synchroniczną dezaktywację replikomu i kontrolowane zapobieganie ponownemu załadowaniu. Ta dezaktywacja wywołana temperaturą zapewnia, że wszystkie widełki w populacji zapadły się w danym momencie i pozwala ocenić, co się dzieje, gdy replikoom zapada się, jak przetwarzane jest DNA i co jest wymagane do ponownego uruchomienia procesu replikacji DNA.

Zaletą opisywanego tutaj systemu jest to, że blok nukleoproteinowy jest w pełni odwracalny; dlatego zdolność komórek do regeneracji z bloku nukleoproteinowego może być śledzona. Dodanie anhydrotetracykliny do komórek złagodzi ścisłe wiązanie represora, umożliwiając przejście widełek replikacyjnych i odzyskanie żywotności komórki. Ustąpienie zatoru można uwidocznić za pomocą neutralno-neutralnej dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym po 5 minutach i za pomocą mikroskopii w ciągu 10 minut. Co więcej, analiza żywotności może ujawnić zdolność szczepu do regeneracji po blokadzie replikacji i dalszego namnażania się.

Zmieniając genetyczne tło szczepów użytych w opisanej tutaj procedurze eksperymentalnej, można wyjaśnić ścieżki naprawy tego typu blokady.

Protocol

1. Blokowanie replikacji za pomocą FROS

1. Wywoływanie blokady replikacji
   1. Rozcieńczyć świeżą nocną kulturę szczepu E. coli przenoszącego macierz tetO i pKM1¹⁸ do OD_600nm = 0,01 w rozcieńczonym złożonym podłożu (0,1% tryptonu, 0,05% ekstraktu drożdżowego, 0,1% NaCl, 0,17 M KH₂PO₄, 0,72 M K₂HPO₄) antybiotykami zgodnie z wymaganiami selekcji.
      Uwaga: Nie dodawaj tetracykliny do selekcji, ponieważ nie jest ona kompatybilna z tym systemem. Sprawić, aby objętość kultury odpowiadała 10 ml na próbkę wymaganą. Na przykład objętość kultury dla projektu eksperymentalnego na rysunku 1 wynosi 60 ml.
   2. Rosnąć w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem do momentu uzyskania średnicy_{zewnętrznej 600 nm} = 0,05-0,1. Usunąć 10 ml próbki, która ma służyć jako nieindukowana kontrola i dodać 0,1% arabinozy do pozostałej kultury, aby indukować produkcję TetR-YFP z pKM1. Kontynuuj uprawę zarówno kultur nieindukowanych, jak i indukowanych. Po upływie 1 godziny sprawdzić, czy w każdej komórce indukowanej kultury znajduje się pojedynczy punkt ogniskowy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (patrz punkt 2).
   3. Jeśli potwierdzi się, że indukowane komórki są zablokowane (ponad 70% komórek ma pojedyncze ognisko), należy zapisać OD_{600 nm} i pobrać próbkę o objętości 7,5 ml do analizy za pomocą żeli 2D (patrz punkt 3). Pobrać równoważną próbkę z nieindukowanej kultury kontrolnej.
2. Zwalnianie blokady replikacji
   1. Aby uwolnić blok replikacji, dodać 100 ng ^ml-1 niezainteresowanego induktora anhydrotetracykliny (AT) do 10 ml próbki zablokowanych komórek. Kontynuować wzrost w temperaturze 30 °C przez 10 minut i pobrać próbki do analizy gęstości komórek (1 ml), analizy mikroskopowej (10 μl) i neutralnych 2-wymiarowych żeli agarozowych (7,5 ml).
3. Indukowanie upadku Replisome
   1. Jeżeli komórki zawierają allel wrażliwy na temperaturę, taki jak dnaBts lub dnaCts, który wymaga dezaktywacji, przesunąć kolbę zawierającą zablokowane komórki do temperatury 42 °C. Próbki do analizy pobiera się w wymaganych punktach czasowych (np. 1 godzinę po inkubacji). Po inkubacji komórek w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę, przesunąć komórki do temperatury 30 °C na 10 minut (patrz rysunek 1).
      Uwaga: Ogniwa można przesunąć do 30 °C w celu analizy ponownego uruchomienia.

Rysunek 1: Omówienie eksperymentalnej procedury bloku replikacji i wydania BROS. Szczepy E. coli przenoszące układ tetO są hodowane w temperaturze 30 °C. Gdy komórki osiągną OD_{600 nm} powyżej 0,05, produkcja TetR-YFP jest indukowana za pomocą arabinozy (ara; 0,1%). Kontynuuj wzrost subpopulacji nieindukowanych komórek, które działają jako kontrola w temperaturze 30 °C. Próbka indukowanych komórek jest analizowana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po 1 - 2 godzinach (patrz 2.1). Jeżeli potwierdzi się, że replikacja została zablokowana, pobiera się próbki do analizy żelu 2D wskazanej przez probówki (patrz ppkt 3.1) oraz do badań żywotności (fakultatywnie). Blokadę replikacji można usunąć za pomocą anhydrotetracykliny (AT; 0,1 μg/ml), a komórki przeanalizować 10 minut później. Jeśli komórki są nosicielami allelu wrażliwego na temperaturę (np. dnaBts), można go dezaktywować, przesuwając zablokowane komórki do temperatury 42 °C w celu przeprowadzenia odpowiedniej analizy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Mikroskopia fluorescencyjna

1. Przygotować wacik z agarozą, pipetując 500 μl stopionej agarozy (1% w wodzie) na szkiełko mikroskopowe; nałożyć szkiełko nakrywkowe bezpośrednio przed zastygnięciem agarozy. Przechowywać szkiełka (szkiełka) w wilgotnych chusteczkach w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
2. Gdy agaroza zastygnie, usuń szkiełko nakrywkowe z podkładki agarozowej i odpipetuj 10 μl kultury bakteryjnej na środek podkładki, aby zapobiec ruchowi komórek podczas wizualizacji. Po wyschnięciu próbki (około 5 minut) wymienić szkiełko nakrywkowe. Umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku nakrywkowym i umieść szkiełko pod optyką.
3. Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopii fazowej w 100-krotnym powiększeniu.
   1. W oknie dialogowym Acquire (Pobieranie) w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu ustaw czas ekspozycji na 100 ms. Przechwyć obraz, wybierając opcję Acquire (Uzyskaj). Nie przesuwaj sceny. W oknie dialogowym Acquire (Pobieranie) wybierz opcję YFP (YFP) jako podświetlenie migawki zewnętrznej połączonej z kamerą. Ustaw czas ekspozycji na 1 000 ms. Wyłącz światło sceny. Przechwyć obraz fluorescencyjny, wybierając opcję Acquire.
      Uwaga: Czas może się różnić w zależności od używanego źródła światła, mikroskopu i kamery.
   2. Aby nałożyć na siebie obrazy fazowe i fluorescencyjne, wybierz opcję Color Combine (Łączenie kolorów) z menu Display (Wyświetlanie). W oknie dialogowym Łączenie kolorów wybierz obraz YFP jako składnik zielony, a obraz fazowy jako składnik niebieski. Kliknij kombinację kolorów. Określ, czy replikacja populacji została pomyślnie zablokowana, ustalając, czy większość komórek ma jedno ognisko na komórkę.
      Uwaga: Porównanie z próbką z próby kontrolnej bez dodatku arabinozy jest przydatne do wizualnej identyfikacji różnicy w produkcji eYFP.

3. Ekstrakcja DNA/Korki agarozowe

1. Dodać azydek sodu (końcowe stężenie 0,1%) do 7,5 ml próbek kultur z etapów 1.1.3 i 1.2.1. Inkubować na lodzie przez co najmniej 5 minut.
   Uwaga: Azydek sodu jest wyjątkowo toksyczny. Przed rozpoczęciem pracy należy zapoznać się z kartą charakterystyki i nie dotykać jej, dopóki wszystkie środki ostrożności nie zostaną przeczytane i zrozumiane.
2. Odwirować komórki 5 000 x g przez 10 minut do osadzania komórek. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu Pett IV (PIV) (10 mM Tris:HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Mikrowirówka (13 000 x g przez 2 min) do komórek osadzania. Odrzucić supernatant. Na tym etapie granulki są dalej przetwarzane lub przechowywane w temperaturze -20 °C.
3. Ponownie zawiesić komórki o najmniejszej gęstości komórek w 50 μl PIV i umieścić w temperaturze 50 °C. W przypadku wszystkich innych próbek należy dostosować objętości PIV tak, aby końcowa gęstość komórek była taka sama w każdej probówce (np. próbka 1 (OD_600nm = 0,128) zawieszona w 50 μl; Próbka 2 (OD_600nm = 0,138) zawieszona w 54 μl).
   1. Dodać równą objętość świeżo przygotowanego 0,8% roztworu agarozy w PIV (końcowe stężenie 0,4%; Na przykład. Próbka 1 50 μl, próbka 2 54 μl). Upewnij się, że próbki, agaroza i PIV mają temperaturę powyżej 50 °C, aby zapobiec krzepnięciu.
4. Szkiełko mikroskopowe należy poddać działaniu 40 μl odpowiedniego roztworu szkła hydrofobowego lub silikonowego. Przetrzyj szkiełko chusteczką, aż wyschnie.
   Uwaga: Można to zrobić z wyprzedzeniem, a szkiełka poddane obróbce przechowywać przez długi czas w temperaturze pokojowej.
5. Umieść 20 μl kropli zawiesiny komórek/agarozy na szkiełku, aby uzyskać półkuliste zatyczki.
   Uwaga: Pierwsza próbka (zawieszona w 50 μl PIV) wytworzy 5 zatyczek na jednym szkiełku.
6. Gdy zatyczki zestalą się, wsuń je delikatnie do probówki do mikrofuzy i dodaj 1 ml buforu do lizy komórek (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,2% deoksycholanu sodu, 0,5% soli sodowej N-lauroilosarkozyny (sarkozylu), 100 μg ^ml-1 lizozymu, 50 μg ^ml-1 RNazy A). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
7. Usunąć bufor do lizy komórek i dodać 1 ml roztworu EDTA/sarkozylu/proteinazy K (ESP) (0,5 M EDTA, 1% sól sodowa N-lauroilosarkozyny (sarkozyl), 1 mg ml⁻¹ proteinazy K). Inkubować w temperaturze 50 °C przez noc lub do momentu, gdy zatyczki staną się przezroczyste. Jeśli wymagana jest druga inkubacja przez noc, po około 18 godzinach zastąpić roztwór elektrofiltru świeżym buforem.
8. Usunąć bufor ESP i umyć korki 5 razy 12 ml buforu Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), umożliwiając 30-minutową równowagę przy każdym płukaniu. Przechowywać w temperaturze 4 °C w 1 ml buforu TE.

4. Neutralna-neutralna 2-wymiarowa elektroforeza żelowa

1. Przenieść korek agarozowy z kroku 3.8 do świeżej probówki do mikrofuge i dodać 150 μl buforu enzymu restrykcyjnego (1x stężenie). Dodaj 25-100 jednostek enzymu restrykcyjnego (np. 60 jednostek EcoRV; (zob. rysunek 3A)). Trawić w temperaturze 37 °C przez 6-8 godzin.
2. W temperaturze 4 °C wlać 0,4% żel agarozowy (300 ml) do 1x Tris/Boran/EDTA (TBE) do tacki na żel o wymiarach około 25 x 25 cm. Włóż grzebień, aby zrobić studzienki o mniej więcej tej samej szerokości co średnica korka. Gdy żel stężeje, wyjmij grzebień i przenieś żel do temperatury pokojowej.
3. Wsuń jedną z strawionych zatyczek agarozowych do studzienki, umieszczając płaską szkiełko zatyczki po stronie studzienki, z której DNA dostanie się do żelu. Włóż pojedynczą zatyczkę w ten sam sposób do co drugiej studzienki.
4. Pipetą odpipetować stopioną 0,4% agarozę do studzienek, aby uszczelnić korki na miejscu.
5. Załadować drabinkę DNA o pojemności 1 kb do pustej studzienki, ponownie pozostawiając przerwę między drabinką a próbkami, a następnie przepuścić żel przez noc (16 godzin, 55 V) w 1x TBE w temperaturze pokojowej.
6. Żel wybarwić w łaźni wodnej zawierającej bromek etydyny (0,3 μg ^ml-1) przez 20 min.
   Uwaga: Bromek etydyny jest uważany za silny mutagen i toksynę. Przed rozpoczęciem pracy należy zapoznać się z kartą charakterystyki i nie dotykać jej, dopóki wszystkie środki ostrożności nie zostaną przeczytane i zrozumiane.
7. Wizualizuj DNA za pomocą długofalowego transiluminatora UV i wycinaj każdy fragment pasa prostym, równym cięciem, minimalizując włączenie nadmiaru agarozy po obu stronach pasa.
   Uwaga: Na przykład, jeśli interesujący nas fragment ma 5,5 kb, wytnij fragment o długości 7,5 cm, aby uwzględnić fragmenty DNA od 5 kb do około 12 kb (patrz rysunek 3A).
8. Umieść wycięty pas żelu w tacki z żelem pod kątem 90° do kierunku migracji DNA.
   Uwaga: Dwa rzędy po 3 fragmenty żelu mogą zmieścić się w tacce na żel o wymiarach 25 x 25^{2 cm}. Pierwszy rząd pasów żelowych znajduje się w górnej części tacy, drugi rząd na wysokości 12,5 cm.
9. Przygotować 300 ml agarozy do żelu drugiego wymiaru (0,9% w 1x TBE z 0,3 μg ^ml-1 bromku etydyny). Gdy agaroza zostanie schłodzona do 50 °C, odpipetuj stopioną agarozę wokół plastrów żelu, aby zestalić ich położenie. Wlej pozostałą agarozę do tacki na głębokość co najmniej na poziomie plasterków żelu.
10. Po zestaleniu żelu poddać elektroforezę w temperaturze 4 °C w 1x TBE zawierającym 0,3 μg ^ml-1 bromku etydyny pod napięciem 220 V, aż DNA przeniesie się na około 10 cm.
    Uwaga: 4 godziny są wystarczające dla fragmentu o rozmiarze 5,5 kb, ale mniejszy fragment będzie potrzebował mniej czasu.
11. Za pomocą krawędzi metalowej linijki należy wyciąć bloki, w których obecne jest genomowe DNA, w tym żel znajdujący się nad nim, aby uwzględnić DNA, które nie jest widoczne (patrz rysunek 3C).

5. Południowa hybrydyzacja

1. Przygotowanie roztworu
   1. Przygotować bufor do oczyszczania (0,125 M roztwór HCl).
      Uwaga: Ten bufor może być ponownie użyty i jest stabilny w temperaturze pokojowej przez okres do 1 miesiąca.
   2. Przygotować bufor denaturacyjny (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH).
      Uwaga: Bufor denaturacyjny może być ponownie użyty i jest stabilny do 3 miesięcy w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotować bufor neutralizacyjny (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Dostosuj do pH 7,5 za pomocą HCl.
      Uwaga: Bufor neutralizacyjny może być ponownie użyty i jest stabilny do 3 miesięcy w temperaturze pokojowej.
   4. Przygotować 10 razy bufor z roztworem cytrynianu sodu (SSC) (0,15 M cytrynian trójsodu, 1,5 M NaCl, pH wynosi 7 - 8) do użycia w krokach 5.2.4 i 5.2.6. Z tego bufora utwórz zapas 2x SSC (do użycia w kroku 5.2.9).
      Uwaga: 10x SSC i 2x SSC są stabilne w RT przez 3 miesiące.
   5. Przygotuj zmodyfikowany bufor hybrydyzacyjny Churcha i Gilberta¹⁹ (0,5 M bufor fosforanowy [pH 7,2], 7% (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS), 10 mM EDTA). Pozostawić w temperaturze 65 °C do całkowitego rozpuszczenia przed użyciem.
2. przelać
   1. Wycięte bloki żelu płukać w roztworze do odurzania przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wahaczu lub wytrząsarce orbitalnej. Utrzymuj niską prędkość mieszania, aby uniknąć uszkodzenia bloków agarozy.
   2. Bloki żelu przepłukać krótko wodą destylowaną, a następnie buforem denaturacyjnym przez 30 minut. Ponownie krótko spłukać w wodzie destylowanej, a następnie inkubować bloki żelu w buforze neutralizacyjnym przez 30 minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej.
   3. Przytnij nylonową membranę do dokładnego rozmiaru żelu(ów). Wytnij nacięcie w prawym górnym rogu, aby pomóc w orientacji membrany w przyszłych krokach.
      Uwaga: Na jednej membranie można uwidocznić dwa bloki żelu (6 próbek).
   4. Wlej tyle 10x SSC do tacy, aby nie wyschła przez noc. Utwórz platformę około 5 cm nad poziomem bufora. Nasącz 3 arkusze bibuły chromatograficznej 3MM 10x SSC i umieść na platformie. Przyciąć bibułę chromatograficzną tak, aby była wystarczająco długa, aby można ją było zanurzyć w buforze na obu końcach i wystarczająco szeroka, aby zmieścił się na niej żel membranowy.
   5. Umieścić żel(e) na nasączonej bibule chromatograficznej. Owiń żel folią spożywczą, aby zapobiec omijaniu żelu przez bufor podczas przenoszenia. Ostrożnie połóż przeciętą membranę na żelu (żelach). Usunąć pęcherzyki powietrza między membraną a żelem, delikatnie przetaczając butelkę lub pipetę serologiczną po membranie.
   6. Przyciąć trzy arkusze bibuły chromatograficznej 3 mm do tego samego rozmiaru co membrana. Nasącz arkusze bibuły chromatograficznej 10x SSC i umieść na wierzchu membrany. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, które się utworzyły.
   7. Ułóż ręczniki papierowe o wysokości co najmniej 5 cm na bibułce, a następnie solidną podporę (przybliżona waga 1 kg dla membrany o wymiarach 23 x 16 cm). Pozwól, aby transfer trwał przez noc.
   8. Wystaw błonę (DNA stroną do góry) na działanie 1,200 J/^m2 promieniowania UV, aby usieciować DNA z błoną. Nie spłukuj przed tym krokiem.
   9. Dokładnie wypłucz membranę w 2x SSC, aby zapobiec wysokiemu tłu na obrazach plam. Natychmiast użyć blot do hybrydyzacji (patrz ppkt 5.3) lub wysuszyć w temperaturze pokojowej, zawinąć w folię spożywczą i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. krzyżowanie
   1. Rozgrzej piekarnik do hybrydyzacji i butelki do 55 °C.
   2. Dodać 100 μg ^ml-1 albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 10 μg ^ml-1 niespecyficznego DNA (np. DNA plemników łososia) do wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego.
   3. Aby umożliwić równomierne pokrycie buforu hybrydyzacyjnego, gdy membrana jest zwinięta, umieść plamę na podobnej wielkości kwadratowej siatce nylonowej, tak aby strona błony związana z DNA była skierowana do góry. Zwiń plamę wzdłuż jej dłuższej krawędzi. Wsuń blot/siatkę do butelki do hybrydyzacji. Dodać odpowiednią ilość wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego w celu rozwinięcia bleksu (np. 30 ml dla membrany o wymiarach 23 x 16^cm2).
   4. Inkubować w nagrzanym piekarniku, obracając butelki przez 1 godzinę.
   5. Przygotować sondę, mieszając 50 ng oczyszczonego produktu PCR homologicznego dla obszaru zainteresowania, 150 ng losowych starterów heksameru, buforu dla fragmentu Klenowa i_H2O, aby uzyskać objętość 13 μl. Gotować przez 3 minuty, a następnie natychmiast umieścić na lodzie. Dodać 1 μl 1 mM mieszaniny dCTP/dGTP/dTTP, 1 μl fragmentu Klenowa (5U) i 50 μCi deoksyadenozyno5'-trifosforanu znakowanego radioaktywnie na alfa-fosforanie-(α³²P-dATP).
   6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Dodać 1 μl 1 mM mieszanki dNTP i 1 μl fragmentu Klenowa. Inkubacja 20 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Gotuj sondę przez 5 minut i natychmiast dodaj do probówek hybrydyzacyjnych. Hybrydyzować przez noc w temperaturze 55 °C, z rotacją.
   8. Zdekantować sondę z membrany.
      Uwaga: Sonda może być ponownie użyta jeden raz.
   9. Krótko przepłukać membranę we wstępnie podgrzanym buforze do płukania o niskiej rygorystyczności (2x SSC, 0,1% (w/v) SDS). Dodać świeży bufor do płukania o niskiej rygorystyczności i inkubować przez 5 minut w temperaturze 55 °C z rotacją. Powtórzyć.
   10. Prać dwukrotnie w buforze do płukania o średniej rygorystyczności (1x SSC, 0,1% (w/v) SDS) przez 10 minut w temperaturze 55 °C z rotacją.
   11. Prać dwukrotnie w buforze do płukania o wysokiej rygorystyczności (0,1x SSC, 0,1% (w/v) SDS) przez 5 minut w temperaturze 55 °C z rotacją.
   12. Usuń membranę i przetrzyj chusteczką, aby usunąć nadmiar płynu. Zawiń w folię spożywczą, upewniając się, że na folii nie ma pozostałej wilgoci i umieść w kasecie ekspozycyjnej z wstępnie zaślepionym ekranem luminoforowym do przechowywania. Zamknij kasetę i naświetlaj przez co najmniej 2 godziny przed wizualizacją za pomocą imagera luminoforowego.

Results

FROS to indukowalny, specyficzny dla miejsca blok nukleoproteinowy, który umożliwia wizualizację produktów pośrednich replikacji w żywych komórkach^12,18. Ogólny projekt eksperymentalny dla komórek do pobierania próbek przedstawiono na rysunku 1. Czas pobierania próbek i różnice w tle genetycznym sprawiają, że jest to wszechstronny system do badania naprawy takiego bloku. Schemat ilustruje, w jaki sposób mutanty wrażliwe na temperaturę, takie jak dnaBts...

Discussion

Podczas duplikacji chromosomów maszyneria replikacyjna napotka różne przeszkody, które uniemożliwiają jej postęp. Aby zapewnić replikację całego chromosomu pojedynczego pochodzenia, bakterie mają wiele ścieżek naprawy DNA, które następnie umożliwiają ponowne załadowanie replikomu^20,21. Uszkodzenia, pęknięcia jednoniciowe, pęknięcia dwuniciowe i białka ściśle związane z DNA mogą być leczone za pomocą dedykowanego szlaku, chociaż istnieje prawdopodobieństwo, że szlaki te w znacznym stopniu się pokrywają. Najczęs...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypton	Sigma-Aldrich	16922	Składnik pożywki wzrostowej
Chlorek sodu	VWR	27810.364	Składnik pożywki wzrostowej
Ekstrakt drożdżowy	Sigma-Aldrich	92144	Składnik pożywki wzrostowej
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P9791	Składnik podłoża wzrostowego; Składnik buforowy potasu
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	P3786	Składnik pożywki wzrostowej; Składnik buforowy potasu
L-arabinoza	Sigma-Aldrich	A3256	Do indukcji produkcji TetR-YFP
Chlorowodorek anhydrotetracykliny	Sigma-Aldrich	37919	Uwalnianie blopakage replikacji
Axioskop 2 Mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	452310	Wizualizacja komórek
Zestaw filtrów eYFP	Chroma Technology	41028	Wizualizacja
kamery YFP CCD	Hamamatsu	Orca-AG	Wizualizacja komórek
MetaMorph  Oprogramowanie (urządzenia molekularne)	SDR Scientific	31282	Wersja 7.8.0.0 użyte do przygotowania tego manuskryptu
Agarose	Bioline	BIO-41025	Do korków agarozowych i elektroforezy żelowej
Oryginalny szklany wodoodporny (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	Do produkcji korków agarozowych
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, element
buforowy TBEKwas etylenodiaminotetraoctowy	Ajax Finechem	AJA180	0,5 M roztwór soli disodowej EDTA dostosowany do pH 8,0 z NaOH.
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002	Środek bakteriostatyczny
Kwas solny	Sigma-Aldrich	258148	składnik buforowy TE
Deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750	Składnik buforowy do lizy komórek
Sól sodowa N-lauroilsarkozyny (Sarkozylo)	Sigma-Aldrich	L5125	Liza komórek i składnik buforowy ESP
Rnaza A	Sigma-Aldrich	R6513	Składnik buforowy do lizy komórek
Lizozym	Amresco	6300	Składnik buforowy do lizy komórek
Proteinaza K	Amresco	AM0706	Składnik buforowy ESP
Model subkomórkowy 192 Komórka	BioRad	1704507	System elektroforezy
Oświetlacz UV 2000	BioRad	1708110	Wizualizacja DNA
Bromek etydyny	BioRad	1610433	Wizualizacja DNA
Kwas borowy	VWR	PROL20185.360	Składnik TBE
Hybond-XL nylonowy memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) Może być również stosowany
bibuła chromatograficzna 3MM Whatman	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Sieciowanie DNA i hybrydyzacja
Kwas dezoksyrybonukleinowy z nasienia łososia	Sigma-Aldrich	31149	Składnik buforowy do hybrydyzacji
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S5881	Składnik buforowy denaturacji
Cytrynian trisodowy dwuwodny	VWR	PROL27833.363	Bufor transferowy
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Amresco	227	Składnik buforowy do płukania
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A7906	Składnik buforu hybrydyzacyjnego
Losowe startery heksamerowe	Bioline	BIO-38028
Fragment Klenowa	New England BioLabs	M0212L
dNTP Zestaw	Bioline	BIO-39025
Adenozyno-5'-trifosforan-< sup>32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Ekran fosforowy do przechowywania	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E uniwersalny standardowy ekran 35 cm x 43 cm
Tajfun FLA 7000	GE Healthcare Nauki Przyrodnicze	28-9558-09	Wizualizacja blot
Butelka hybrydyzacji	UVP	07-0194-02	35 mm x 300 mm