Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.

Streszczenie

Naturalna ewolucja obejmuje różnorodność genetyczną, taką jak zmiany środowiskowe i selekcja między małymi populacjami. Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna (ALE) odnosi się do sytuacji eksperymentalnej, w której ewolucję obserwuje się przy użyciu organizmów żywych w kontrolowanych warunkach i stresorach; W ten sposób organizmy są sztucznie zmuszane do dokonywania zmian ewolucyjnych. Mikroorganizmy są narażone na różne czynniki stresogenne w środowisku i są zdolne do regulowania niektórych białek indukowanych stresem, aby zwiększyć swoje szanse na przeżycie. Naturalnie występujące spontaniczne mutacje powodują zmiany w genomie drobnoustroju, które wpływają na jego szanse na przeżycie. Długotrwała ekspozycja na kulturę chemostatu powoduje akumulację spontanicznych mutacji i sprawia, że najbardziej elastyczny szczep staje się dominujący. W porównaniu z metodami transferu kolonii i transferu szeregowego, hodowla chemostatu pociąga za sobą największą liczbę podziałów komórkowych, a tym samym największą liczbę zróżnicowanych populacji. Chociaż hodowla chemostatu w przypadku ALE wymaga bardziej skomplikowanych urządzeń do hodowli, jest mniej pracochłonna po rozpoczęciu operacji. Porównawcze analizy genomiczne i transkryptomiczne przystosowanego szczepu dostarczają ewolucyjnych wskazówek na temat tego, w jaki sposób stresory przyczyniają się do mutacji, które przezwyciężają stres. Celem niniejszej pracy jest doprowadzenie do przyspieszenia ewolucji mikroorganizmów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Wprowadzenie

Mikroorganizmy potrafią przetrwać i przystosować się do różnorodnych środowisk. W warunkach silnego stresu adaptacja może zachodzić poprzez nabycie korzystnych fenotypów w wyniku losowych mutacji genomicznych i następującej po nich selekcji pozytywnej^1-3. W związku z tym komórki mikrobowe mogą adaptować się poprzez zmianę sieci metabolicznych lub regulacyjnych w celu optymalizacji wzrostu, co określa się mianem „ewolucji adaptacyjnej”. Współczesne istotne tendencje mikrobiologiczne, takie jak epidemie superpatii czy pojawianie się odpornych szczepów drobnoustrojów, są ściśle powiązane z ewolucją adaptacyjną w warunkach stresowych. W zdefiniowanych warunkach laboratoryjnych jesteśmy w stanie badać mechanizmy ewolucji molekularnej, a nawet kontrolować kierunek ewolucji mikroorganizmów w różnych zastosowaniach. W przeciwieństwie do organizmów wielokomórkowych, organizmy jednokomórkowe są bardzo dobrze dostosowane do laboratoryjnej ewolucji adaptacyjnej (ALE) z następujących powodów: szybko się regenerują, utrzymują duże populacje oraz łatwo jest tworzyć i utrzymywać dla nich jednorodne środowiska. W połączeniu z ostatnimi postępami w technikach sekwencjonowania DNA i technologiami wysokoprzepustowymi, ALE pozwala na bezpośrednią obserwację zmian genomicznych, które prowadzą do systemowych zmian regulacyjnych. Możliwa jest również obserwacja dynamiki mutacyjnej oraz różnorodności populacji. Strategie inżynierii genetycznej mogą zostać opracowane na podstawie analizy szczepów poddanych ALE^4,5.

Hodowla w chemostacie to metoda stosowana w celu uzyskania komórek w stanie stacjonarnym oraz zwiększenia wydajności w procesach fermentacji⁶. W trakcie procesu dodawana jest świeża pożywka i pobierany jest bulion hodowlany (ten drugi obejmuje pożywkę i biomasę). Długotrwała hodowla w chemostacie zmienia jednak wydajność kultury w stanie stacjonarnym i prowadzi do akumulacji spontanicznych mutacji oraz selekcji w trakcie hodowli (Rycina 1a). Pod wpływem różnych presji selekcyjnych (stresorów) akumulacja mutacji ulega nasileniu. Stopniowy wzrost stresu w długotrwałym chemostacie zapewnia ciągłą selekcję mutacji przeciwdziałających danym stresorom, takim jak temperatura, pH, ciśnienie osmotyczne, głodowanie nutrientowe, utlenianie, toksyczne produkty końcowe itp. Przenoszenie kolonii z pożywki stałej oraz przenoszenie seryjne z pożywki płynnej (powtarzalna hodowla okresowa) również pozwalają badaczom na uzyskanie ewoluowanych mikroorganizmów (Rycina 1b i 1c). Choć hodowla w chemostacie wymaga skomplikowanych metod, pula różnorodności (liczba replikacji i wielkość populacji) jest większa niż ta uzyskiwana za pomocą technik przenoszenia kolonii i przenoszenia seryjnego. Stabilna ekspozycja poszczególnych komórek na stres oraz zmniejszona zmienność stanu komórkowego podczas hodowli w chemostacie (stan stacjonarny) to inne zalety ALE w porównaniu do technik opartych na hodowli okresowej. W niniejszym artykule przedstawiono indukowaną stresem ALE Escherichia coli poddaną wysokim stężeniom bursztynianu.

Rysunek 1: Metody adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej. (A) Chemostat; (B) transfer seryjny; (C) transfer kolonialny. Górne schematy ilustrują koncepcję metod ALE, a dolne wykresy przedstawiają liczbę komórek, które namnożyły się podczas ALE. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przygotowanie sprzętu

1. Zaopatrzyć się w słoik z chemostatem (150-250 ml) lub kolbę Erlenmeyera (250 ml) zawierającą króciec wlotowy i otwór wylotowy. Podłącz porty za pomocą silikonowych rurek, co pozwala na przepływ 10-100 ml / h. Opcjonalnie użyj odpowietrznika, portu wylotowego powietrza oraz portów wlotowych i wylotowych wody o kontrolowanej temperaturze.
2. Zaopatrzyć się w urządzenie odpowiednie do słoika z chemostatem, które zapewnia mieszanie i kontrolę temperatury (lub użyć inkubatora z obrotowym wytrząsaniem).
3. Zaopatrz się w dwie pompy perystaltyczne w celu dostarczenia świeżej pożywki i zebrania kultury.
4. Zaopatrz się w słoik zbiornika (10-20 l) zawierający średni port wylotowy i otwór wlotu powietrza.
5. Uzyskać rurkę silikonową odpowiednią do szybkości rozcieńczania (tj. ID 0,8 mm, zakres przepływu 0,06-36 ml/min; Rurki L/S 13).

2. Przygotowanie i sterylizacja podłoża

1. Podłoże początkowe
   1. Rozpuścić 0,3 g glukozy, 0,08 g NH₄Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na₂HPO₄·2H₂O i 0,3 g KH₂PO₄ w 90 ml wody destylowanej (DW) w słoiku z chemostatem.
   2. Zamknij słoik chemostatu wraz z rurką za pomocą zacisków. Nie uszczelniaj odpowietrznika.
   3. Sterylizować słoik z chemostatem w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po sterylizacji słoik z chemostatem należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
   4. Rozpuścić 0,02 g MgSO₄·_7H2O, 0,01 g CaCl₂ i 0,1 mg tiaminy w 10 ml DW (roztwór A).
   5. Roztwór filtracyjny A za pomocą strzykawki i wstępnie wysterylizowanego filtra strzykawkowego (filtr porowy 0,45 μm).
   6. Dodać roztwór A filtruje do słoika z chemostatem.
2. Średni stres
   1. Rozpuścić 30 g glukozy, 8 g NH₄Cl, 5 g NaCl, 75 g Na₂HPO₄·2H₂O, 30 g KH₂PO₄ i 300 g sześciowodnego bursztynianu disodowego (Na₂·bursztynian·6H₂O; stresor użyty w tym doświadczeniu) w 9,9 l s.w. w słoiku ze zbiornikiem.
   2. Uszczelnij słoik zbiornika wraz z rurką za pomocą clamps. Nie uszczelniaj odpowietrznika.
   3. Sterylizować słoik w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po sterylizacji przechowuj słoik w temperaturze pokojowej.
   4. Rozpuścić 2 g MgSO,₄·_7H2O, 1 g CaCl₂ i 10 mg tiaminy w 100 ml s.m. (roztwór A).
   5. Roztwór filtracyjny A ze strzykawką i wstępnie wysterylizowanym filtrem strzykawkowym (filtr porowy 0,45 μm).
   6. Dodać roztwór A przesączający się do słoika zbiornika.
   7. Aseptycznie podłącz wysterylizowane rurki silikonowe do słoika zbiornika i podłącz pompy perystaltyczne.
3. Wysoki poziom stresu Średni
   1. Przygotować pożywkę jak w sekcji 2.2, ale z większym stężeniem stresora (tj. o 3-5 g/l wyższym w adaptacji bursztynianu).
      Uwaga: Ten protokół służy do adaptacji do stresu, który może być dostarczony przez medium. W przypadku fizycznych czynników stresogennych, takich jak temperatura, pobudzenie lub oświetlenie, uprawa powinna być odpowiednio zaprojektowana.

3. Początkowa uprawa

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię E. coli typu dzikiego w 15 ml probówce zawierającej 4 ml pożywki początkowej.
2. Inkubować probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem przez 12 godzin w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.
3. Przenieść w asepcie 1 ml kultury wstępnej do słoika z chemostatem.
4. Inkubować słoik z chemostatem, zapewniając napowietrzanie (powietrze 50 ml/min) i mieszanie (200 obr./min), w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.

4. Adaptacja do stresu

1. Podłączyć w asepcie koniec silikonowej rurki od pomp do słoika z chemostatem.
2. Uruchomić pompę wylotową (10 ml/godz. lub wyższą) i zebrać kulturę.
   Uwaga: Kultura powinna znajdować się w fazie wykładniczej, zwykle 4-8 godzin po początkowej uprawie.
3. Sprawdź gęstość optyczną (600 nm) kultury z rurki wylotowej.
4. Uruchomić pompę wlotową (10 ml/h, co odpowiada szybkości rozcieńczenia 0,1 ^h-1).
5. Sprawdzaj gęstość optyczną kultury przy 600 nm z rurki wylotowej co 24 godziny.
6. Używaj chemostatu przez 96 godzin (9,6-krotny obrót) lub dłużej. Jeśli gęstość optyczna jest stabilna, wymień zbiornik zawierający medium o wysokim naprężeniu. Jeśli gęstość optyczna jest mniejsza niż 0,2, zatrzymaj pompę zasilającą na 6 godzin. Uruchom ponownie pompę wlotową i sprawdź, czy gęstość optyczna przekracza 0,2.
7. Stopniowo zwiększaj stężenie stresora, zmieniając go na zbiornik zawierający wyższe stężenie stresora.
8. Pobiera próbki przystosowanej kultury za każdym razem, gdy osiąga ona kamień milowy (np. szczep przystosowany do stresu bursztynianowego 100 g/l) i przechowuje je do dalszej analizy genomowej.
9. W celu przechowywania próbki należy zmieszać próbkę kultury (0,5 ml) ze wysterylizowanym 80% roztworem glicerolu (0,5 ml) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   Uwaga: Jeśli mikroorganizm uzyska zdolność do degradacji stresora podczas procesu ALE, stężenie stresora w słoiku fermentacyjnym nie jest takie samo jak w świeżym zbiorniku.

5. Izolacja pojedynczej kolonii szczepu przystosowanego do stresu

1. Przygotować podłoże na płytce agarowej (1,6% agaru) zawierające ten sam stresor i o tym samym stężeniu pożywki.
2. Umieścić na płytce kulturę wylotową (0,1 ml) z chemostatu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
3. Za pomocą sterylnej wykałaczki należy pobrać pojedyncze kolonie z płytki i zaszczepić je w 15 ml probówkach zawierających ten sam stresor i w tym samym stężeniu podłoża co w chemostacie i inkubować przez 6 godzin.
4. Przenieść 1 ml bulionu hodowlanego do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki. Zbierz 0,5 ml bulionu kulturowego co 1 godzinę i zmierz średnicę zewnętrzną przy 600 nm. Porównaj tempo wzrostu dostosowanego szczepu z tempem wzrostu szczepu dzikiego, biorąc pod uwagę stresor.

Wyniki

W celu adaptacji do stresu wywołanego wysokim stężeniem bursztynianu, szczep dziki E. coli W3110 hodowano w chemostacie przy D = 0,1 hr^-1 przez 270 dni (Rysunek 2).

Rycina 2: Adaptacja do stresu wywołane...

Dyskusja

Mikroorganizmy są w stanie przystosować się do prawie wszystkich środowisk ze względu na szybkie tempo wzrostu i różnorodność genetyczną. Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna umożliwia mikroorganizmom ewolucję w zaprojektowanych warunkach, co zapewnia sposób selekcji poszczególnych organizmów posiadających spontaniczne mutacje, które są korzystne w danych warunkach.

Technika chemostatu jest bardziej skuteczna w osiąganiu sztucznie sterowanej ewolucji niż techniki transferu z następujących powodó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mini-fermentor chemostat	Biotron Inc.	-	wyprodukowane na specjalne zamówienie
rurki silikonowe	Cole-Parmer	Masterflex L / S 13	rozmiar rurki można zmieniać w zależności od stopnia rozcieńczenia i wielkości słoika fermentora.
słoik zbiornikowy	Butelka do przechowywania	Bellco	20 L
chemikalia	Sigma-Aldrich-odczynnik		klasy
glukozy	Sigma-Aldrich	G5767	Odczynnik ACS
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	do biologii molekularnej, odpowiedni do hodowli komórkowych, ≥ 99,5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	odczynnik ACS, ≥ 99%
Na2HPO4· 2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	odczynnik ACS, ≥ 99%
MgSO4· 7H2O	Odczynnik ACS do Sigma-Aldrich	230391	, ≥ 98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	odczynnik ACS, ≥ 96%
tiamina i kropka środkowa; Klasa odczynnika HCl	Sigma-Aldrich	T4625	, ≥ 99%
Na2· bursztynian i middot; 6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥ 99%

Media