Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Summary

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.

Abstract

Naturalna ewolucja obejmuje różnorodność genetyczną, taką jak zmiany środowiskowe i selekcja między małymi populacjami. Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna (ALE) odnosi się do sytuacji eksperymentalnej, w której ewolucję obserwuje się przy użyciu organizmów żywych w kontrolowanych warunkach i stresorach; W ten sposób organizmy są sztucznie zmuszane do dokonywania zmian ewolucyjnych. Mikroorganizmy są narażone na różne czynniki stresogenne w środowisku i są zdolne do regulowania niektórych białek indukowanych stresem, aby zwiększyć swoje szanse na przeżycie. Naturalnie występujące spontaniczne mutacje powodują zmiany w genomie drobnoustroju, które wpływają na jego szanse na przeżycie. Długotrwała ekspozycja na kulturę chemostatu powoduje akumulację spontanicznych mutacji i sprawia, że najbardziej elastyczny szczep staje się dominujący. W porównaniu z metodami transferu kolonii i transferu szeregowego, hodowla chemostatu pociąga za sobą największą liczbę podziałów komórkowych, a tym samym największą liczbę zróżnicowanych populacji. Chociaż hodowla chemostatu w przypadku ALE wymaga bardziej skomplikowanych urządzeń do hodowli, jest mniej pracochłonna po rozpoczęciu operacji. Porównawcze analizy genomiczne i transkryptomiczne przystosowanego szczepu dostarczają ewolucyjnych wskazówek na temat tego, w jaki sposób stresory przyczyniają się do mutacji, które przezwyciężają stres. Celem niniejszej pracy jest doprowadzenie do przyspieszenia ewolucji mikroorganizmów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Introduction

Mikroorganizmy mogą przetrwać i przystosować się do różnych środowisk. W przypadku silnego stresu adaptacja może nastąpić poprzez nabycie korzystnych fenotypów przez losowe mutacje genomowe i późniejszą selekcję pozytywną^1-3. Dlatego komórki drobnoustrojów mogą się przystosowywać, zmieniając sieci metaboliczne lub regulacyjne w celu optymalnego wzrostu, co nazywa się "ewolucją adaptacyjną". Ostatnie ważne tendencje mikrobiologiczne, takie jak wybuchy epidemii superbakterii i występowanie silnych szczepów drobnoustrojów, są bardzo ściśle związane z ewolucją adaptacyjną w stresujących warunkach. W określonych warunkach laboratoryjnych jesteśmy w stanie badać mechanizmy ewolucji molekularnej, a nawet kontrolować kierunek ewolucji drobnoustrojów dla różnych zastosowań. W przeciwieństwie do organizmów wielokomórkowych, organizmy jednokomórkowe dobrze nadają się do adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej (ALE) z następujących powodów: szybko się regenerują, utrzymują duże populacje i łatwo jest stworzyć i utrzymać jednorodne środowisko. W połączeniu z najnowszymi osiągnięciami w technikach sekwencjonowania DNA i technologiach wysokoprzepustowych, ALE pozwala na bezpośrednią obserwację zmian genomowych, które prowadzą do ogólnoustrojowych zmian regulacyjnych. Obserwuje się również dynamikę mutacji i zróżnicowanie populacji. Strategie inżynierii genetycznej można określić na podstawie analizy szczepów ALE^4,5.

Hodowla chemostatu to metoda używana do uzyskiwania komórek w stanie ustalonym i zwiększania produktywności w procesach fermentacji⁶. W trakcie procesu dodaje się świeże podłoże i zbiera się bulion kulturowy (ten ostatni obejmuje pożywkę i biomasę). Długotrwała hodowla chemostatu zmienia jednak produktywność kultury w stanie ustalonym i powoduje akumulację spontanicznych mutacji i selekcji podczas hodowli (ryc. 1a). Pod wpływem różnych presji selekcyjnych (stresorów) akumulacja mutacji jest zwiększona. Stopniowy wzrost stresu w długotrwałym chemostacie zapewnia ciągłą selekcję mutacji, które działają przeciwko danym stresorom, takim jak temperatura, pH, ciśnienie osmotyczne, głód składników odżywczych, utlenianie, toksyczne produkty końcowe itp. Transfer kolonii z pożywki stałej i transfer szeregowy z pożywki płynnej (powtarzana hodowla okresowa) również pozwala naukowcom uzyskać wyewoluowane mikroorganizmy (ryc. 1b i 1c). Chociaż hodowla chemostatu wymaga skomplikowanych metod, pula różnorodności (liczba replikacji i wielkość populacji) jest wyższa niż w przypadku technik transferu kolonii i transferu seryjnego. Stabilna ekspozycja na stres w poszczególnych komórkach i zmniejszona zmienność stanu komórkowego podczas hodowli chemostatu (stan ustalony) to inne korzyści płynące z ALE w porównaniu z technikami opartymi na hodowlach okresowych. W artykule przedstawiono wywołane stresem ALE Escherichia coli poddane warunkom wysokiej bursztynianu.

Rysunek 1: Metody adaptacyjnej ewolucji laboratorium. a) chemostat; (B) transfer szeregowy; C) transfer kolonii. Górne rysunki ilustrują koncepcję metod dla ALE, a dolne ilustrują liczbę komórek, które rosły podczas ALE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

1. Przygotowanie sprzętu

1. Zaopatrzyć się w słoik z chemostatem (150-250 ml) lub kolbę Erlenmeyera (250 ml) zawierającą króciec wlotowy i otwór wylotowy. Podłącz porty za pomocą silikonowych rurek, co pozwala na przepływ 10-100 ml / h. Opcjonalnie użyj odpowietrznika, portu wylotowego powietrza oraz portów wlotowych i wylotowych wody o kontrolowanej temperaturze.
2. Zaopatrzyć się w urządzenie odpowiednie do słoika z chemostatem, które zapewnia mieszanie i kontrolę temperatury (lub użyć inkubatora z obrotowym wytrząsaniem).
3. Zaopatrz się w dwie pompy perystaltyczne w celu dostarczenia świeżej pożywki i zebrania kultury.
4. Zaopatrz się w słoik zbiornika (10-20 l) zawierający średni port wylotowy i otwór wlotu powietrza.
5. Uzyskać rurkę silikonową odpowiednią do szybkości rozcieńczania (tj. ID 0,8 mm, zakres przepływu 0,06-36 ml/min; Rurki L/S 13).

2. Przygotowanie i sterylizacja podłoża

1. Podłoże początkowe
   1. Rozpuścić 0,3 g glukozy, 0,08 g NH₄Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na₂HPO₄·2H₂O i 0,3 g KH₂PO₄ w 90 ml wody destylowanej (DW) w słoiku z chemostatem.
   2. Zamknij słoik chemostatu wraz z rurką za pomocą zacisków. Nie uszczelniaj odpowietrznika.
   3. Sterylizować słoik z chemostatem w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po sterylizacji słoik z chemostatem należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
   4. Rozpuścić 0,02 g MgSO₄·_7H2O, 0,01 g CaCl₂ i 0,1 mg tiaminy w 10 ml DW (roztwór A).
   5. Roztwór filtracyjny A za pomocą strzykawki i wstępnie wysterylizowanego filtra strzykawkowego (filtr porowy 0,45 μm).
   6. Dodać roztwór A filtruje do słoika z chemostatem.
2. Średni stres
   1. Rozpuścić 30 g glukozy, 8 g NH₄Cl, 5 g NaCl, 75 g Na₂HPO₄·2H₂O, 30 g KH₂PO₄ i 300 g sześciowodnego bursztynianu disodowego (Na₂·bursztynian·6H₂O; stresor użyty w tym doświadczeniu) w 9,9 l s.w. w słoiku ze zbiornikiem.
   2. Uszczelnij słoik zbiornika wraz z rurką za pomocą clamps. Nie uszczelniaj odpowietrznika.
   3. Sterylizować słoik w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po sterylizacji przechowuj słoik w temperaturze pokojowej.
   4. Rozpuścić 2 g MgSO,₄·_7H2O, 1 g CaCl₂ i 10 mg tiaminy w 100 ml s.m. (roztwór A).
   5. Roztwór filtracyjny A ze strzykawką i wstępnie wysterylizowanym filtrem strzykawkowym (filtr porowy 0,45 μm).
   6. Dodać roztwór A przesączający się do słoika zbiornika.
   7. Aseptycznie podłącz wysterylizowane rurki silikonowe do słoika zbiornika i podłącz pompy perystaltyczne.
3. Wysoki poziom stresu Średni
   1. Przygotować pożywkę jak w sekcji 2.2, ale z większym stężeniem stresora (tj. o 3-5 g/l wyższym w adaptacji bursztynianu).
      Uwaga: Ten protokół służy do adaptacji do stresu, który może być dostarczony przez medium. W przypadku fizycznych czynników stresogennych, takich jak temperatura, pobudzenie lub oświetlenie, uprawa powinna być odpowiednio zaprojektowana.

3. Początkowa uprawa

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię E. coli typu dzikiego w 15 ml probówce zawierającej 4 ml pożywki początkowej.
2. Inkubować probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem przez 12 godzin w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.
3. Przenieść w asepcie 1 ml kultury wstępnej do słoika z chemostatem.
4. Inkubować słoik z chemostatem, zapewniając napowietrzanie (powietrze 50 ml/min) i mieszanie (200 obr./min), w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.

4. Adaptacja do stresu

1. Podłączyć w asepcie koniec silikonowej rurki od pomp do słoika z chemostatem.
2. Uruchomić pompę wylotową (10 ml/godz. lub wyższą) i zebrać kulturę.
   Uwaga: Kultura powinna znajdować się w fazie wykładniczej, zwykle 4-8 godzin po początkowej uprawie.
3. Sprawdź gęstość optyczną (600 nm) kultury z rurki wylotowej.
4. Uruchomić pompę wlotową (10 ml/h, co odpowiada szybkości rozcieńczenia 0,1 ^h-1).
5. Sprawdzaj gęstość optyczną kultury przy 600 nm z rurki wylotowej co 24 godziny.
6. Używaj chemostatu przez 96 godzin (9,6-krotny obrót) lub dłużej. Jeśli gęstość optyczna jest stabilna, wymień zbiornik zawierający medium o wysokim naprężeniu. Jeśli gęstość optyczna jest mniejsza niż 0,2, zatrzymaj pompę zasilającą na 6 godzin. Uruchom ponownie pompę wlotową i sprawdź, czy gęstość optyczna przekracza 0,2.
7. Stopniowo zwiększaj stężenie stresora, zmieniając go na zbiornik zawierający wyższe stężenie stresora.
8. Pobiera próbki przystosowanej kultury za każdym razem, gdy osiąga ona kamień milowy (np. szczep przystosowany do stresu bursztynianowego 100 g/l) i przechowuje je do dalszej analizy genomowej.
9. W celu przechowywania próbki należy zmieszać próbkę kultury (0,5 ml) ze wysterylizowanym 80% roztworem glicerolu (0,5 ml) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   Uwaga: Jeśli mikroorganizm uzyska zdolność do degradacji stresora podczas procesu ALE, stężenie stresora w słoiku fermentacyjnym nie jest takie samo jak w świeżym zbiorniku.

5. Izolacja pojedynczej kolonii szczepu przystosowanego do stresu

1. Przygotować podłoże na płytce agarowej (1,6% agaru) zawierające ten sam stresor i o tym samym stężeniu pożywki.
2. Umieścić na płytce kulturę wylotową (0,1 ml) z chemostatu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
3. Za pomocą sterylnej wykałaczki należy pobrać pojedyncze kolonie z płytki i zaszczepić je w 15 ml probówkach zawierających ten sam stresor i w tym samym stężeniu podłoża co w chemostacie i inkubować przez 6 godzin.
4. Przenieść 1 ml bulionu hodowlanego do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki. Zbierz 0,5 ml bulionu kulturowego co 1 godzinę i zmierz średnicę zewnętrzną przy 600 nm. Porównaj tempo wzrostu dostosowanego szczepu z tempem wzrostu szczepu dzikiego, biorąc pod uwagę stresor.

Results

Dla adaptacji do stresu o wysokim poziomie bursztynianu, dziki szczep E. coli W3110 hodowano w chemostacie w temperaturze D = 0,1 godz^.-1 przez 270 dni (Rysunek 2).

Rycina 2: Adaptacja E. coli W3110 do stresu o wysokiej zawartości bursztynianu przy użyciu kultury chemostatu. Cienkie strzałki wskazują czasy, w których stężenie stre...

Discussion

Mikroorganizmy są w stanie przystosować się do prawie wszystkich środowisk ze względu na szybkie tempo wzrostu i różnorodność genetyczną. Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna umożliwia mikroorganizmom ewolucję w zaprojektowanych warunkach, co zapewnia sposób selekcji poszczególnych organizmów posiadających spontaniczne mutacje, które są korzystne w danych warunkach.

Technika chemostatu jest bardziej skuteczna w osiąganiu sztucznie sterowanej ewolucji niż techniki transferu z następujących powodó...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-fermentor chemostat	Biotron Inc.	-	wyprodukowane na specjalne zamówienie
rurki silikonowe	Cole-Parmer	Masterflex L / S 13	rozmiar rurki można zmieniać w zależności od stopnia rozcieńczenia i wielkości słoika fermentora.
słoik zbiornikowy	Butelka do przechowywania	Bellco	20 L
chemikalia	Sigma-Aldrich-odczynnik		klasy
glukozy	Sigma-Aldrich	G5767	Odczynnik ACS
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	do biologii molekularnej, odpowiedni do hodowli komórkowych, ≥ 99,5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	odczynnik ACS, ≥ 99%
Na2HPO4· 2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	odczynnik ACS, ≥ 99%
MgSO4· 7H2O	Odczynnik ACS do Sigma-Aldrich	230391	, ≥ 98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	odczynnik ACS, ≥ 96%
tiamina i kropka środkowa; Klasa odczynnika HCl	Sigma-Aldrich	T4625	, ≥ 99%
Na2· bursztynian i middot; 6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥ 99%