Testy do wykrywania struktur odbijających promieniowanie UV i określania ich znaczenia w preferencjach mate przy użyciu Sailfin Molly Poecilia latipinna

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie spektrofotometrii do wykrywania struktur odbijających promieniowanie ultrafioletowe na organizmach (w tym przykładzie żaglopłetwy Poecilia latipinna) i opisuje dychotomiczne testy wyboru dla ryb, które pozwalają na wnioskowanie o roli sygnałów ultrafioletowych podczas wyboru partnera.

Streszczenie

Wiele organizmów używa wskazówek i sygnałów wykraczających poza ludzką wrażliwość podczas interakcji społecznych. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, jak organizmy postrzegają swój świat, próbując zrozumieć ich zachowanie i ekologię. Wrażliwość na widmo ultrafioletowe (UV; 300 - 400 nm) występuje u wielu rodzajów ptaków, ryb,,, a nawet ssaków. Protokół ten opisuje technikę badania organizmów pod kątem obecności struktur odbijających promieniowanie UV oraz metodę testowania, czy te sygnały są wykorzystywane jako sygnały społeczne w kontekście wyboru partnera. Spektrofotometr służy do wykrywania obecności odbicia promieniowania UV i różnic w intensywności odbicia między osobami i płciami. Przedstawiono przykład tej techniki, w której dychotomiczny test wyboru partnera naraża osoby wrażliwe seksualnie na osoby płci przeciwnej, których wyglądem można manipulować za pomocą filtrów, które albo transmitują pełne spektrum, albo blokują długości fal UV. System ten pozwolił na ustalenie, że samice, ale nie samce, molinezyków żaglopłetwych (Poecilia latipinna) używały oznaczeń UV jako części swoich decyzji godowych. Tego typu badania służą poszerzeniu naszej wiedzy na temat szeregu organizmów, które wykorzystują promieniowanie UV i dostarczają informacji na temat tego, jaką rolę odgrywa promieniowanie UV w ich życiu.

Wprowadzenie

Zrozumienie wskazówek i sygnałów używanych w interakcjach społecznych zwierząt pozwala nam zrozumieć zmienność fenotypową zarówno wewnątrz, jak i między gatunkami. Ta zmienność odgrywa ważną rolę w procesach ewolucyjnych, takich jak dywergencja populacji, dobór płciowy i specjacja. Często jednak badacze ograniczają się do badania sygnałów najbardziej oczywistych dla ludzkich systemów sensorycznych, zwłaszcza tych w sferze wzrokowej lub słuchowej. Zastosowanie spektrofotometrii pozwala nam jednak rozszerzyć nasze badania poza widmo widzialne człowieka i na długości fal, które mogą być ważne w interakcjach społecznych u innych gatunków.

W szczególności, komunikacja krótkiego zasięgu, jaką zapewnia czułość ultrafioletu (UV; 300 - 400 nm), może być potencjalnie bardzo korzystna podczas wyboru partnera¹. Na przykład wiele wizualnie polujących drapieżników ptaków i ryb nie jest w stanie wykryć promieniowania UV. W systemach, w których samce prezentują się samicom w sposób skomplikowany, samce te zmniejszyłyby ryzyko drapieżnictwa, zachowując jednocześnie zdolność do przyciągania partnerów poprzez wykorzystanie widma UV, a nie rozwijanie sygnałów wykrywalnych w widmie widzialnym^2,3. Jeśli nie weźmie się pod uwagę możliwości, że organizmy komunikują się ze sobą za pomocą tych "prywatnych kanałów komunikacyjnych", można pominąć istotne czynniki wpływające na zachowanie i ewolucję.

Ten protokół przedstawia zarys badań nad wykorzystaniem sygnałów UV do wyboru partnera u żaglopłetwego, Poecilia latipinna, poligamicznej ryby, która wcześniej nie miała znanej zdolności do wykrywania UV lub używania znaków UV. Ten gatunek ryb ma bliską filogenetyczną bliskość z innymi wrażliwymi na promieniowanie UV żywymi rybami⁴ i istnieją mikrospektroskopowe dowody na to, że P. latipinna, wraz z innymi gatunkami molly, takimi jak P. mexicana i P. formosa, posiadają klasę czopków (komórek fotoreceptorowych odpowiedzialnych za widzenie kolorów), które są najbardziej wrażliwe na długości fal UV⁵. U tego dymorficznego płciowo gatunku wybór samicy odegrał dużą rolę w ewolucji jaskrawo ubarwionych i powiększonych płetw samców^6-9. Ta metodologia pozwala nam zbadać, czy promieniowanie UV jest dodatkowym medium, za pomocą którego samice oceniają jakość samców.

Wykrywanie i pomiar znaczników UV na P. latipinna za pomocą spektrofotometru z sondą światłowodową jest szczegółowo opisane tutaj. Ponadto omówiono to, czy receptywne samice molinezji różnie kojarzą się z samcami oglądanymi przez filtr optyczny przepuszczający światło o pełnym spektrum, w tym UV-A ([UV+]; 320 - 700 nm) i samcami oglądanymi przez filtr blokujący promieniowanie UV ([UV-]; 400 - 700 nm). Metoda ta ma szerokie zastosowanie w odkrywaniu wrażliwości na promieniowanie UV i wzorców kolorów u ryb i innych organizmów, umożliwiając badania nad różnymi kwestiami dotyczącymi promieniowania UV i jego roli w zachowaniu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Ohio Wesleyan.

1. Rejestracja odbicia UV ryb za pomocą spektrofotometru

1. Zkalibruj spektrofotometr i źródło światła za pomocą znanego wzorca białego w zakresie mierzonej długości fal, zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia lub oprogramowania.
2. Zanurz rybę w 0,5% roztworze soli metanosulfonowej etylu 3-aminobenzoesanu (MS-2) buforowanym równą ilością wodorowęglanu sodu w celu znieczulenia, aż do utraty reakcji przez zwierzę. Po utracie reakcji natychmiast umieść rybę na czarnym, nierefleksyjnym tle. Uwaga: MS-22 jest potencjalnie toksyczny, dlatego należy przez cały czas używać rękawiczek.
3. Wszystkie pomiary wykonuj w zaciemnionym pomieszczeniu, aby zminimalizować wpływ nadmiaru światła poza światłem z poziomu źródła spektrometru.
4. Zmierz współczynnik odbicia, używając sondy światłowodowej przyciśniętej do ciała organizmu. Upewnij się, że między światłowodem a ciałem tworzy się stały kąt 45°, co jest wbudowane w niektóre konstrukcje sond. Uwaga: Dla zapewnienia spójności pomiarów warto wyciągnąć średnią z kilku skanów (2 - 5) na dany obszar ciała.
5. Zarejestruj dane o odbiciu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy reflekcji. Uwaga: Użyte tutaj oprogramowanie zostało ustawione na: czas całkowania = 2,0 sec, średnia liczba skanów = 2 oraz wygładzanie pikseli = 5. Dane zostały skopiowane i wklejone do arkusza kalkulacyjnego.
6. Powtórz pomiary w wielu obszarach ciała, aby określić obecność lub brak odbicia UV oraz zakres zmienności fenotypowej między organizmami. Uwaga: Może być konieczne wykonanie wstępnych skanów, aby ustalić, które obszary ciała (jeśli takie istnieją) stale wykazują oznakowanie UV.
7. Przenieś rybę do dobrze natlenionego akwarium hodowlanego aż do pełnego dojścia do siebie, co objawia się prawidłowym ruchem operculum i zachowaniem pływackim. Uwaga: W celu wsparcia regeneracji skóry można dodać komercyjny preparat ochronny do odtworzenia warstwy śluzowej na ciele.
8. Powtórz procedurę u wielu osobników, w tym obu płci, jeśli jest to wymagane.
9. W arkuszu kalkulacyjnym, do którego skopiowano wszystkie dane, przedstaw wyniki na wykresie rozrzutu, gdzie na osi Y znajduje się współczynnik odbicia, a na osi X długość fali. Piki amplitudy w zakresie UV (30 - 40 nm) wskazują na obecność odbicia UV u ryby.

2. Dychotomiczne próby kojarzenia

UWAGA: Przeprowadź obserwacje kontrolne, w których zastosowano ryby ogniskowe, filtry UV oraz filtry nieprzezroczyste. W tych próbach, po usunięciu filtrów nieprzezroczystych, ryby ogniskowe zostaną wystawione na części zbiornika wykazujące obecność i brak światła UV, lecz pozbawione potencjalnych partnerów do rozrodu. Szczegółowe informacje na temat ważności testów wyboru dychotomicznego w tym eksperymencie znajdują się w pracy Palmera i Hankisona (2015)¹⁰, choć należy zauważyć, że testy te mają również pewne wady¹¹.

1. Jako organizmy ogniskowe należy wykorzystać osobniki podatne na kopulację. Należy użyć samic. P. latipinna < 48 godzin po porodzie⁵ or samce izolowano przez co najmniej 24 h przed testowaniem, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wystąpienia motywacji seksualnej.
2. Umieść pojedynczego osobnika ogniskowego w neutralnej strefie sąsiadującej z dwiema komorami wyboru. Dla P. latipinna, użyć akwarium testowego o pojemności 75,7 L (30,5 cm x 30,5 cm x 75 cm; Rysunek 1) podzielony na trzy sekcje przezroczyste przegrody z pleksiglasu, tworzące centralny obszar dla osobnika ogniskowego, flankowany przez dwie komory wyboru o tej samej wielkości. Należy upewnić się, że między poszczególnymi sekcjami zbiornika nie przenikają sygnały wodne ani zapachowe. Powtórzyć procedurę dla każdego osobnika przeznaczonego do obserwacji.

Rysunek 1. Układ eksperymentalnego akwarium. Prostokątne akwarium podzielone na trzy sekcje: obszar centralny, w którym znajdował się osobnik ogniskowy, oraz dwie przedziały końcowe z parami obiektów (na rysunku przedstawiono samicę w środku oraz obiekty imitujące samce na końcach). Nad szklanymi przegrodami oddzielającymi sekcje z samcem i samicą można było umieścić wymienne filtry, które blokowały lub przepuszczały odbicie UV. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Palmer i Hankison (2015). ¹⁰. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

3. W warunkach oświetlenia pełnowidmowego (oświetlenia, którego widmo rozciąga się do zakresu UV-A), odizoluj jednego potencjalnego partnera do rozrodu w każdej z końcowych komór (komór wyboru) akwarium testowego. Upewnij się, że potencjalni partnerzy do rozrodu są do siebie jak najbardziej zbliżeni pod względem rozmiaru, ubarwienia i cech behawioralnych podczas prezentacji, tak aby główną różnicą między dwoma odizolowanymi partnerami było to, czy znajdują się oni za filtrem blokującym, czy przepuszczającym światło UV.
   UWAGA: W celu uzyskania jak najlepszego dopasowania kolorów można zastosować pomiar odbicia w spektrum widzialnym, choć w niniejszym przypadku dopasowanie wykonano wizualnie.
4. Aklimatyzuj osobniki w warunkach izolacji wizualnej (nieprzezroczyste filtry) przez 15 min. Upewnij się, że w tym czasie założone są filtry UV+ oraz UV-. Po aklimatyzacji usuń nieprzezroczyste filtry. Aby wyeliminować możliwe błędy wynikające z preferencji bocznych (wrodzonej preferencji jednej strony zbiornika, niezależnie od obiektu), losowo przypisz filtry UV⁺ oraz UV^- ściany zbiornika dla każdej próby.
5. Za pomocą stoperów należy zarejestrować czas, jaki osobnik ogniskowy spędza w określonych strefach preferencji (obszarach w pobliżu komór wyboru, w tym przypadku w odległości około dwóch standardowych długości ciała). W przypadku samic jest to czas spędzony w pobliżu każdego z dwóch samców, a w przypadku osobników ogniskowych płci męskiej – odwrotnie.
   UWAGA: Do rejestracji można również wykorzystać oprogramowanie Event recorder. W niniejszym eksperymencie zastosowano próby trwające piętnaście minut, a ryby, które nie odwiedziły każdej z wybranych stref preferencji przynajmniej raz, zostały wykluczone z wyników jako nieaktywne.
6. Rejestracja i analiza czasu, jaki ryby spędzają w pobliżu pustego urządzenia UV⁺ oraz UV^- przegrody, aby wykluczyć występowanie wrodzonego błędu wynikającego z konkretnego środowiska oświetleniowego, który mógłby wpłynąć na wybór partnera przez ryby. W celu ustalenia, czy osobniki preferują określone warunki UV, należy zastosować testy t-studenta dla prób zależnych.

Wyniki

Rysunki 1 oraz 2 przedstawiają konfigurację akwarium do badania preferencji kopulacyjnych oraz miejsca pomiaru UV w naszych eksperymentach.

Pomiar odbicia promieniowania UV pozwolił ustalić, że P. latipinna posiadają cechy UV, szczególnie wzdłuż boków ciała (Rysunek 3), a także wykazują zmienność osobniczą tych cech. Po zidentyfikowaniu cech UV, testy wykazały, że samic...

Dyskusja

Spektrofotometria odniosła sukces w identyfikacji oznaczeń UV na P. latipinna. Obie płcie P. latipinna posiadają oznaczenia UV wzdłuż swoich boków. Ponadto niektóre samce miały oznaczenia UV na płetwach grzbietowych, cechy, które wcześniej uznano za ważne w preferencjach godowych samic7^.

Zalecamy stosowanie spektrofotometrii UV jako mechanizmu wykrywania obecności oznaczeń UV. Dalsze badania mogą określić jego rolę w interakcjach społecznych, w tym preferencje godo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrofotometr, P1000	Ocean Optics		dostępne są nowsze modele
Ksenoniowe źródło światła UV DT 1000	Dostępne są nowsze modele	Ocean Optics
Overture Oprogramowanie	Nowsze oprogramowanie	sonda światłowodowa
R200-Angle-UV (fala prowadzona)	są nowsze modele	Ocean Optics
Certyfikowany standard odbicia, biała	labsphere
75,7 L Akwarium, podzielona	Eksperymentalna
żarówka budowlana o pełnym spektrum	Nature's Sunlight
Arkusz blokujący promieniowanie UV	Arkusz

Ocean Optics Ocean Optics jest dostępne Dwuwidlna Dostępne GAM UV