W tych badaniach podajemy metodologię nowatorskich, noworodkowych, mysich rusztowań serca do wykorzystania w badaniach regeneracyjnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rusztowania serca noworodków: nowe matryce do badań regeneracyjnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jedyną ostateczną terapią w końcowym stadium niewydolności serca jest ortotopowy przeszczep serca. Szacuje się, że każdego rokuw Stanach Zjednoczonych do zabiegów transplantacji serca potrzeba ponad 100 000 serc dawców. Ze względu na ograniczoną liczbę dawców, każdego roku w Stanach Zjednoczonych wykonuje się tylko około 2400 przeszczepów. Podjęto wiele podejść, od badań nad terapią komórkową po wszczepianie mechanicznych urządzeń wspomagających, samodzielnie lub w połączeniu, w celu nakłonienia serca do samonaprawy lub odpoczynku niewydolnego serca3. Pomimo tych wysiłków, urządzenia wspomagające pracę komór są nadal w dużej mierze stosowane w celu zapewnienia pomostu do przeszczepu, a użyteczność terapii komórkowych, chociaż są one obiecujące pod względem leczniczym, jest nadal ograniczona do badań klinicznych. Ponadto podjęto próby bezpośredniej ksenotransplantacji, ale sukces był ograniczony ze względu na odrzucenie immunologiczne. Oczywiste jest, że potrzebna jest inna strategia produkcji dodatkowych narządów do przeszczepu, a w idealnej sytuacji narządy te byłyby autologiczne, aby uniknąć powikłań związanych z odrzuceniem przeszczepu i immunosupresją w ciągu całego życia. Decelularyzacja to proces usuwania rezydujących komórek z tkanek w celu odsłonięcia natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) lub rusztowania. Decelularyzacja perfuzyjna zapewnia całkowite zachowanie trójwymiarowej struktury tkanki, pozostawiając nienaruszoną większość właściwości mechanicznych tkanki4. Rusztowania te mogą być wykorzystane do ponownego zasiedlenia zdrowych komórek w celu wygenerowania modeli badawczych i, być może, bardzo potrzebnych narządów do przeszczepu. Wystawiliśmy rusztowania nowonarodzonych myszy (P3), o których wiadomo, że zachowują niezwykłe zdolności regeneracyjne serca,5-8 na decelularyzację za pośrednictwem detergentów i ponownie zasiedliliśmy te rusztowania mysimi komórkami serca. Badania te potwierdzają wykonalność inżynierii konstrukcji serca noworodka. Ponadto pozwalają na zbadanie, czy ECM serc we wczesnym okresie poporodowym może zawierać sygnały, które spowodują poprawę strategii recelularyzacji.
Wprowadzenie
Niewydolność serca jest powszechna i śmiertelna. Jest to choroba postępująca, która powoduje zmniejszenie kurczliwości serca, co upośledza przepływ krwi do narządów i pozostawia niezaspokojone wymagania metaboliczne organizmu. Szacuje się, że 5,7 miliona Amerykanów cierpi na niewydolność serca i jest to główna przyczyna hospitalizacji w Stanach Zjednoczonych9. Łączny koszt leczenia pacjentów z niewydolnością serca w Stanach Zjednoczonych przekracza 300 miliardów dolarów rocznie w godzinach 9-10. Jedyną ostateczną terapią schyłkowej niewydolności serca jest ortotopowy przeszczep serca. Szacuje się, że każdego rokuw Stanach Zjednoczonych do zabiegów transplantacji serca potrzeba ponad 100 000 serc dawców. Ze względu na ograniczoną liczbę dawców, każdego roku w Stanach Zjednoczonych wykonuje się tylko około 2400 przeszczepów. Oczywiste jest, że należy zająć się tym niedoborem narządów, ponieważ potrzebne są inne strategie produkcji dodatkowych narządów do przeszczepu, a najlepiej byłoby, gdyby narządy te były autologiczne, aby uniknąć powikłań związanych z odrzuceniem przeszczepu i immunosupresją w ciągu całego życia.
Dorosłe kardiomiocyty ssaków wykazują ograniczoną zdolność regeneracyjną po urazie, ale ostatnie dowody sugerują, że serca noworodków ssaków utrzymują niezwykłą zdolność regeneracyjną po urazie5-8. W szczególności, po częściowej resekcji chirurgicznej, odkryto okno regeneracyjne między urodzeniem a 7 dniem po urodzeniu. Ten okres regeneracyjny charakteryzuje się brakiem blizny zwłóknieniowej, powstawaniem neowaskularyzacji, uwalnianiem czynników angiogennych z nasierdzia i proliferacją kardiomiocytów 5-8,11. To regeneracyjne okno czasowe stwarza potencjał do wykorzystania serca noworodka jako nowego źródła materiału do opracowania biosztucznego serca.
Macierz zewnątrzkomórkowa jest znana z tego, że dostarcza ważnych wskazówek do promowania proliferacji i wzrostu kardiomiocytów. Zbadano wyraźne różnice w dostępności cząsteczek w matrycach noworodków i dorosłych12 oraz ich zdolność do wspomagania regeneracji13. Zdecellularizowane matryce dorosłych zostały wykorzystane w kilku badaniach w celu zapewnienia rusztowania ECM do ponownego zasiedlania komórek i generowania biosztucznego serca. Chociaż badania te i nowe odkrycia w technologiach komórek macierzystych szybko się rozwijają, kilka przeszkód nie zostało jeszcze pokonanych. Na przykład ograniczenia w zachowaniu natywnej struktury macierzy, integracji komórkowej ze ścianą macierzy oraz zdolności do wspierania proliferacji i wzrostu ograniczają powodzenie tego podejścia. Podczas gdy sercu noworodka przypisuje się lepsze właściwości regeneracyjne, praktyczne aspekty wykorzystania takiej tkanki ograniczyły jej eksplorację.
Opierając się na wykazanej zdolności regeneracyjnej serca noworodka, opracowaliśmy nowe matryce, rozwijając technikę decelularyzacji dla serca myszy P3. Serce P3 zostało wybrane do tych badań, ponieważ znajduje się w oknie regeneracji serca, jak wcześniej określono6, ale serce jest wystarczająco duże, aby zbierać, decelularyzować i recelularyzować. Celem tego badania jest wykazanie możliwości stworzenia matrycy z serca noworodka myszy. Nasze badania dostarczają dowodów na wykonalność decelularyzacji maleńkiego serca noworodka przy zachowaniu integralności strukturalnej i białkowej ECM. Wykazujemy również zdolność do recelularizacji tego ECM serca za pomocą kardiomiocytów eksprymujących mCherry i zbadaliśmy te kardiomiocyty pod kątem ekspresji różnych markerów sercowych po recelularyzacji. Technologia ta pozwoli na przetestowanie wyższości matrycy noworodka dla opracowania biosztucznego serca.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z amerykańską ustawą o dobrostanie zwierząt i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie w Minnesocie.
1. Metoda izolacji serca myszy
- Poddaj eutanazji nowonarodzoną mysz przez ścięcie głowy za pomocą jednorazowego ostrza.
- Przetrzyj klatkę piersiową 70% etanolem.
- Wypreparuj skórę z klatki piersiowej, odcinając ją od ściany klatki piersiowej standardowymi nożyczkami, jednocześnie ciągnąc skórę na boki za pomocą pary kleszczy #5.
- Przebij nożyczkami brzuch tuż poniżej mostka, przecinając ścianę brzucha. Chwytając wyrostek mieczykowaty kleszczami #5, cofnij mostek rostral od ciała, przecinając nożyczkami żebra po obu stronach klatki piersiowej. Klatka piersiowa odbija się lepiej od kleszczy, odsłaniając serce.
- Dosadnie rozetnij dwa główne płaty grasicy, ciągnąc na boki kleszczami #5, odsłaniając łuk aorty, a także żyły główne i płucne.
- Przeciąć główne tętnice od łuku aorty i samą aortę za pomocą 10 cm nożyczek sprężynowych. Zachowaj aortę między podstawą serca a tętnicą ramienno-głowową. Chwyć końce odciętych naczyń kleszczami #5, aby odbić serce do przodu, oddzielając je od tchawicy i przełyku.
- Przeciąć naczynia płucne i inne główne żyły, przecinając między płucami a sercem po obu stronach serca za pomocą 10-centymetrowych nożyczek sprężynowych. Żyły pozostają otwarte, aby zapewnić drenaż.
- Usuń serce ze śródpiersia za pomocą kleszczy #5, chwytając odcięte końce głównych naczyń. Umieścić serce w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm zawierającym sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu cewnikowania.
2. Metoda decelularyzacji metodą perfuzji Langendorffa
- Przygotuj wcześniej zespół cewnika. Narysuj 4-centymetrowy odcinek rurki PE 50 w małym płomieniu alkoholowym, aby utworzyć mniejszy, cieńszy cewnik. Przytnij końce ostrzem, aby odpowiadały wymiarom (ok. 300 μm średnicy zewnętrznej OD z kołnierzem o średnicy zewnętrznej ok. 500 μm) pokazanym na rysunku 1. Zapewni to dwa symetryczne cewniki z każdej strony pociągnięcia.
- Skieruj na chwilę odcięty koniec rurki do płomienia, aby stopić kołnierz na otworze na cienkim końcu.
- Napełnić strzykawkę o pojemności 12 ml PBS i założyć cewnik, umieszczając na strzykawce 3-kierunkowy kran odcinający. Dodaj igłę 22 G x 1 do kranu i wbij igłę przez przegrodę. Wsuń narysowany cewnik z rurką PE na igłę (rys. 1).
- Zmontowane części należy nawodnić PBS, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte.
- Wprowadzić cewnik, przygotowany w sposób opisany powyżej, do aorty izolowanego serca, nie wychodząc poza zastawkę aortalną i podwiązać za pomocą jednego szwu 7-0. Oprzyj kołnierz cewnika proksymalnie o opaskę, tworząc szczelne uszczelnienie i zapobiegając wypadaniu serca z cewnika.
- Obserwuj cewnikowanie w powiększeniu, jednocześnie delikatnie wykonując perfuzję serca za pomocą strzykawki zawierającej PBS. Upewnij się, że w systemie nie ma przecieków, a tkanka jednorodnie blednie po usunięciu utajonej krwi.
- Umieść przegrodę w szyjce adaptera wlotowego i uszczelnij ją, składając boki na szybie.
- Podłączyć zbiornik wypełniony 60 ml 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie destylowanej (dH2O) za pomocą przewodu o długości wystarczającej do wytworzenia kolumny wytwarzającej ciśnienie 20 mm Hg, jak pokazano na rys. 1. Obliczać ciśnienie z wysokości kolumny cieczy na podstawie zależności 1 mm Hg jest równe 1,3595 cm H2O.
Uwaga: SDS jest wysoce flokulantowym proszkiem o właściwościach drażniących. Należy unikać kontaktu. Z proszkiem należy obchodzić się przy użyciu odpowiedniej odzieży ochronnej. - Perfuzja serca za pomocą 1% SDS przez 14 godzin. Serce będzie miało półprzezroczysty wygląd, bez widocznych pozostałych tkanek.
- Przepłukać system do oporu do kranu pozostałego roztworu SDS i zastąpić go 10 ml dH2O. Przeprowadzić perfuzję serca 10 ml 1% Triton X-100 (rozcieńczony w wodzie destylowanej), następnie 10 ml dH2O, a następnie 60 ml PBS zawierającego 1x streptomycynę penicyliny (Pen-Strep).
- Przechowywać serce w PBS z 1x Pen-Strep w temperaturze 4 °C. Jeśli zamierzone zastosowanie po decelularyzacji wymaga perfuzji, należy utrzymać cewnik w aorcie, w przeciwnym razie przeciąć wiązanie szwów i usunąć cewnik.
3. Oznaczanie DNA
- Przygotuj trawienie zdecelularizowanego ECM lub serca kontrolnego przy użyciu 200 μg/ml proteinazy K w 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,45% Tween 20 w 10 mM Tris (pH 8,3).
- Inkubować tkankę w temperaturze 55 °C z mieszaniem aż do rozpuszczenia tkanki, zwykle 4-5 godzin.
- Oznaczyć ilościowo zawartość DNA w homogenacie za pomocą testu wiązania DNA4,11.
4. Utrwalanie i cięcie tkanki
- Utrwal serca zdecellularizowane, recellularowane lub kontrolne P3 w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj chusteczkę w PBS 3x.
- Umieścić tkankę w roztworze 7,5% sacharozy w 0,1 M buforze fosforanowym w temperaturze 4 °C, aż opadnie.
- Zmienić roztwór na 15% sacharozy w 0,1 M buforze fosforanowym w temperaturze 4 °C, ponownie, aż do zatonięcia.
- Ogrzać tkankę do temperatury 37 °C, zastąpić połowę objętości roztworem żelatyny w 15% sacharozie i 0,1 M buforze fosforanowym i zrównoważyć przez noc. Stężenie żelatyny zwiększa się stopniowo o 1%, 2,5%, 5% i ostatecznie dwukrotnie o 7,5%.
- Umieść próbki w krioformach przy użyciu świeżej 7,5% żelatyny. Aby przywrócić kształt zdecelularyzowanym próbkom, płynna żelatyna może być perfundowana do komór podczas formowania serc. Zamrozić, unosząc krioformy na ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Wyciąć odcinki (o grubości 10 μm) za pomocą kriostatu. Zbliż suwak do powierzchni przekroju i obserwuj, jak sekcja odsuwa się od noża na powierzchnię z powodu ładunku na szkiełkach poddanych obróbce elektrostatycznej. Wysuszyć szkiełka przez noc i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.
- Wyjąć szkiełka z zamrażarki, zrównoważyć do temperatury pokojowej, a następnie umieścić w słoiku Coplin zawierającym PBS na 20 minut w temperaturze 37 °C w celu rozpuszczenia żelatyny.
- Wycięte odcinki z kroku 4.7 zabarwić hematoksyliną i eozyną. Umieść szkiełka w słoiku Coplin. Preparaty uwodnione w kroku 4.8 należy poddać działaniu hematoksyliny przez 45 sekund, wody z kranu przez 1,5 min, buforu przez 3 min, wody z kranu przez 1 min, środka niebieszczącego przez 1,5 min, 80% etanolu przez 1 min, alkoholowej eozyny Y przez 8 sekund, 80% etanolu przez 1 min, 100% etanolu przez 1 min 2x, środka czyszczącego (substytut ksylenu) przez 1 min 3x, Szkiełko nakrywkowe z medium montażowym na bazie żywicy. Zbadaj szkiełka pod mikroskopem.
- Aby potwierdzić zachowanie reaktywności białka ECM w ECM serca, wybarwić białka strukturalne ECM, takie jak kolagen IV, umieszczając uwodnione szkiełka w wilgotnej komorze i potraktować 10% normalną surowicą osła (NDS) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej z 0,1% Triton-X100 (PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Użyj wystarczającej objętości, aby pokryć skrawki tkanki.
- Zastąp roztwór wybranym pierwszorzędowym przeciwciałem w empirycznie określonym rozcieńczeniu w 5% NDS / PBST. Na przykład przeciwciało Collagen IV rozcieńczono w stosunku 1:150. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Umyć szkiełka PBST 3x i nałożyć wybrane przeciwciało drugorzędowe sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym. Rozcieńczyć przeciwciało o empirycznie określoną ilość. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć PBS 3x.
- Wybarwić szkiełka barwnikiem wiążącym DNA, takim jak DAPI, aby sprawdzić brak jąder komórkowych za pomocą pożywki montażowej zawierającej DAPI podczas wsuwania szkiełek na okładkę.
- Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pod kątem od 50 do 400X.
5. P1 Noworodkowe mysie kardiomiocyty komorowe do recelularyzacji
- Spryskaj każde szczenię 70% etanolem i odetnij głowę jednym ostrzem.
- Trzymaj każde szczenię między kciukiem a palcem wskazującym, podczas gdy klatka piersiowa jest podzielona na linii środkowej małymi sterylnymi nożyczkami, aby odsłonić klatkę piersiową. Zastosuj nacisk, aby serce mogło swobodnie wystawać z klatki piersiowej, podczas gdy jest odcięte od głównych naczyń i przedsionków, pozostawiając tylko tkankę komorową.
- Umieść każde serce bezpośrednio w 50 ml probówce zawierającej 20 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej Hanka bez wodorowęglanów z 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (CBFHH), aż wszystkie serca zostaną zebrane.
- Zassać CBFHH i dodać 10-15 ml świeżego CBFHH (lodowaty) do probówki. Umyj chusteczkę, kilkakrotnie obracając chusteczkę w tubce.
- Zdekantować roztwór zawierający serca na plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm.
- Wypreparuj utajoną tkankę przedsionkową z serc w powiększeniu na lodzie, przycinając ją od serc nożyczkami sprężynowymi. Zmiel komory na małe kawałki o jednorodnej wielkości. Usuń oddzieloną tkankę niekomorową z naczynia za pomocą kleszczy #5.
- Odpipetować tyle roztworu CBFHH, ile jest potrzebne do przeniesienia fragmentów tkanek do małej sterylnej fiolki zawierającej sterylną mikromieszadło.
- Pozwolić, aby tkanka osiadła na dnie fiolki i usunąć roztwór CBFHH.
- Uzupełnić 50 ml roztworu enzymatycznego 1,75 mg/ml trypsyny, 20 μg/ml DNazy II w CBFHH. Odmierzyć pipetą 5 ml roztworu enzymu i dodać go do probówki zawierającej rozdrobnioną tkankę komorową i umieścić na mieszadle magnetycznym. Mieszać ze stałą szybkością (340 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 8 min.
UWAGA: Mieszanie powinno być delikatne, a jednocześnie umożliwiać zawieszenie gnojowicy. - Wyjąć fiolkę z płytki mieszającej i pozostawić zawiesinę do osadzenia się przez 3 minuty. Odpipetować i wyrzucić wstępny supernatant do trawienia, ponieważ zawiera on głównie komórki krwi i resztki tkanek.
- Odpipetować drugą porcję 5 ml roztworu enzymu i dodać ją do komory trawiennej. Mieszaj przez 8 minut i pozwól mu osiąść przez kolejne 3 minuty. Przed rozpoczęciem trawienia należy przygotować dwie probówki o pojemności 50 ml (oznaczone punktami 1 i 2), z których każda zawiera 12 ml lodowatej płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Umieść sitko o wielkości 40 μm na każdej probówce. Odmierzyć pipetę sklarowanego osadu przez filtr znajdujący się na probówce 1.
- Powtórzyć proces trawienia dodatkowo 8 razy, umieszczając naprzemiennie supernatant trawiący między dwiema probówkami zawierającymi FBS. Podzielić ostatni supernatant równo między probówki 1 i 2, aby zapewnić równe objętości w każdej probówce.
UWAGA: Każda probówka będzie teraz zawierać 32,5 ml całkowitej objętości zawiesiny komórek. - Odwirować probówki zawierające sklarent 150 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
- Zbierając podwielokrotności trawienia, przygotuj pięć 100 mm płytek do hodowli tkankowych z 6 ml pożywki (Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) z 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamina) na płytkę. Inkubować te podwielokrotności w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut w celu zrównoważenia pożywki.
- Odessać mieszaninę enzymów CBFHH i ponownie zawiesić komórki w 30 ml pożywki hodowlanej przygotowanej powyżej, łącząc komórki z obu probówek do pobierania krwi.
- Umieścić 6 ml zawiesiny komórek na każdej z płytek o średnicy 100 mm i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
- Pod koniec inkubacji przenieś nieprzylegające komórki do 5 nowych szalek i ponownie inkubuj przez 45 minut (frakcja fibroblastów zacznie przylegać do szalek i w razie potrzeby może być hodowana oddzielnie).
- Pod koniec drugiej rundy wstępnego powlekania zebrać pożywkę i nieprzylegające komórki z szalek i obracać pożywkę o masie 150 x g przez 6 minut.
- Odciągnąć nadmiar pożywki, aby doprowadzić komórki do przybliżonego pożądanego stężenia (4,0 x 105 komórek na konstrukt w 100 μl perfuzatu). Usunąć podwielokrotność do liczenia i/lub testowania żywotności14.
6. Recelularyzacja macierzy serca P3 w bioreaktorze
- Przed dodaniem komórek należy wstępnie potraktować izolowaną macierz serca pożywką hodowlaną (patrz krok 5.15).
- Zmontuj elementy systemu Langendorffa, jak pokazano na rys. 2. Autoklaw szklanych części i tlenek etylenu sterylizują plastikowe części, aby zapewnić sterylność. Różne podzespoły systemu mogą być montowane w okapie z przepływem laminarnym przed zamontowaniem na stojaku nośnym. Kąpiel z wodą obiegową i ścieżka przepływu podgrzanej wody zostały pominięte dla jasności.
- Napełnić zmontowany system 120 ml pożywki do hodowli tkankowych (patrz krok 5.15).
- Umieścić cewnikowaną matrycę serca z kroku 2.14 w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm w powiększeniu i podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 22 G x 1 załadowaną zawiesiną komórek z kroku 5.20 do cewnika. Upewnij się, że ten zespół jest wolny od pęcherzyków powietrza, aby uniknąć zatoru serca.
- Delikatnie perfunduj 100 μl zawiesiny komórkowej do macierzy serca przez tętnice wieńcowe. Po zakończeniu odłączyć kombinację strzykawka-igła.
UWAGA: Wymagana jest powolna perfuzja ok. 20 μl na minutę, aby zapobiec wydostawaniu się komórek z żył, przechodząc przez serce. - Za pomocą króćca o wadze 22 g przymocowanego do złączki Luer na spodzie pokrywy słoika serca bioreaktora, wepchnij cewnik na króciec.
- Uruchom pompę perystaltyczną i obserwuj, czy przepływ przebiega zgodnie z opisem na rysunku 2. Przepływ przebiega ze zbiornika przez pompę przez pułapkę pęcherzykową do cewnika umieszczonego w aorcie w kroku 2.5 (czerwona ścieżka na rys. 2). Obserwuj przepływ krążenia sercowego z żył i kapie z wierzchołka, recyrkulując do zbiornika pożywki.
UWAGA: Szybkość przepływu perfuzyjnego zależy od indywidualnych czynników, takich jak opór naczyniowy konstrukcji i wielkość serca, ale szybkość od 50 do 100 μl/min jest dobrym punktem wyjścia. W pośrednich punktach czasowych można przeprowadzić oceny funkcjonalne. Skala wielkości noworodkowego serca recellularnego ogranicza oceny, które można przeprowadzić, ale ustaliliśmy, że systemy optycznie oparte mogą być używane do ilościowego określania zachowań związanych z biciem, tak jak były używane w sercach dorosłych szczurów. 4 Konstrukt może być perfuzjowany przez dłuższy czas (do 23 godzin).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Decelularyzacja
Średni czas decelularyzacji serca w stadium P3 z zastosowaniem tego protokołu wynosi około 14 hr, przy średniej masie serca noworodka P3 wynoszącej 23 mg.
Acellularność
Rycina 3a przedstawia w pełni nienaruszony neonatalny serce w 3. dniu po urodzeniu (P3) (preparat całego narządu). Rycina 3b pokazuje to samo serce po decelularyzacji. Ryciny 4a i ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zależność tej techniki od powtarzających się perfuzji serca sprawia, że uniknięcie zatoru jest kluczowym elementem pomyślnego wyniku. Od początkowego cewnikowania serca w krokach 2.2-2.6, do zmian roztworu między krokami 2.8-2.14, istnieją manipulacje, które mogą pozwolić na wprowadzenie pęcherzyków powietrza, które utrudniają przepływ perfuzatu do mięśnia sercowego. Ze względu na niewielki rozmiar serca noworodka, nawet drobne pęcherzyki w układzie naczyniowym mogą spowodować zawał techniczny, powodując w ten sposób nie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Pani Cynthii DeKay za przygotowanie figur.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1. Materiały do izolacji serca myszy | |||
| P1 szczeniąt myszy (jak pokazano; B6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | lub równoważny |
| 60 mm Naczynie hodowlane | BD Falcon | 353004 | lub równoważne |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 (sterylna) | Hyklon | SH30256,01 | lub równoważny |
| Ostrze jednorazowego użytku | Stanley | 28-510 | lub równoważne |
| Nożyczki standardowe | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | lub odpowiednik |
| Nożyczki sprężynowe 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | lub równoważne |
| Nożyczki sprężynowe Vannas - 3 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | lub odpowiednik |
| #5 Kleszcze | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | lub równoważne |
| 2. Materiały do decelularyzacji | |||
| Adapter wlotowy | Chemglass | CG-1013 | autoklawowalny |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoklawowalny |
| 1/8 cala. ID x 3/8 OD C-Flex rurka | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoklawowalny |
| męski luer do 1/8 "adapter zadzioru węża | McMaster-Carr | 51525K33 | autoklawowalny |
| żeński luer do adaptera zadzioru węża 1/8" | McMaster-Carr | 51525K26 | autoklawowalny |
| szew chirurgiczny Prolene 7-0 | Ethicon | 8648G | lub równoważny |
| Stojak pierścieniowy | Fisher Scientific | S47807 | lub równoważny |
| Zacisk | Fisher Scientific | 05-769-6Q | lub równoważny |
| Uchwyt zaciskowy zwykły | Fisher Scientific | 05-754Q | lub równoważny |
| Lufa strzykawki o pojemności 60 cm³ | Coviden | 1186000777T | lub równoważny |
| Zlewka | Kimble | 14000250 | lub równoważna |
| igła strzykawkowa 22 G x 1 | BD | 305155 | lub równoważna |
| strzykawka 12 cm³ | Coviden | 8881512878 | lub równoważny |
| 3-drogowy kurek | Medical | MX5311L | lub równoważny rurka |
| PE50 | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Musi być podatny na formowanie pod wpływem ciepła. Zalecany polietylen. |
| Zalecany 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Gatunek ultraczysty. Uzupełnić świeży roztwór i przefiltrować, wysterylizować przed użyciem. |
| 1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Przygotuj świeży roztwór z 10% wywaru i przefiltruj sterylizację przed użyciem. |
| Sterylny dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Lub oczyszczona woda w systemie MilliQ. |
| 1x Długopis/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | lub równoważny |
| 3. Materiały do oznaczania ilościowego DNA | |||
| Proteinaza K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg aktywność |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | lub równoważna |
| MgCl2· 6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | lub równoważny |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | lub równoważna |
| zasada/chlorowodorek Tris | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | lub równoważny |
| zestaw do oznaczania dsDNA Pico-Green | Life Technologies | P7589 | wymaga fluorymetru do odczytu |
| 4. Metoda utrwalania i cięcia tkanki | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | lub równoważna |
| żelatyna typu A ze skóry świni | Sigma-Aldrich | G2500 | musi mieć 300 lub więcej nalotu |
| 5. Metoda histologii tkankowej | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | lub równoważny |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | lub równoważny |
| Szkiełka mikroskopowe 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | lub równoważne |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | lub równoważny |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | lub równoważny |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | lub równoważny |
| Niebieski bufor | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | lub równoważny |
| Alkohol Eozyna Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | lub równoważny |
| substytut ksylenu Formula 83 | CBG Biotechnologia | CH0104B | lub równoważny |
| średni montaż Permount | Fisher Chemical | SP15-500 | lub równoważny |
| Przeciwciało Kolagen IV | Rockland | 600-401-106.1 | lub równoważne |
| i alfa-aktynina Przeciwciało | Abcam | AB9465 | lub równoważne |
| mCherry Przeciwciało | Abcam | AB205402 | lub równoważne |
| NKX2.5 Przeciwciało | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | lub równoważne |
| Osioł anty-mysz AF488 Przeciwciało | Life Technology | A21202 | lub równoważne |
| Przeciwciało przeciwko kurczakom AF594 Osioł | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | lub równoważne |
| Przeciwciało anty-kozie CY5 przeciwko kozom Jacksona | Immunoresearch | 705-175-147 | lub równoważny |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | lub równoważny |
| Prolong Gold Antifade Mountant z DAPI | ThermoFisher | P36930 | lub równoważny |
| 6. Izolacja kardiomiocytów komorowych noworodków za pomocą wstępnie posiewu | |||
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclon | SH30031.02 | lub równoważny |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | lub równoważny |
| Sitko do komórek | BD Falcon | 352340 | lub równoważne |
| 50 ml probówka | BD Falcon | 352070 | lub równoważne |
| Primeria 100 mm płytki | Corning | 353803 | Powierzchnia Primeria zwiększa przyczepność fibroblastów, promując wyższą czystość miocytów |
| Trypsyna | Difco | 215240 | lub równoważna |
| DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | lub równoważna |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyklon | SH30022.01 | lub równoważny |
| Witamina B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | lub równoważne |
| BD Bioscience | 354501 | lub równoważny | |
| Płodowa surowica bydlęca | Hyclone | SH30910.03 | lub równoważny |
| Szkło do bioreaktora serca | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Musi nadawać się do sterylizacji w autoklawie lub gazie. |
Bibliografia
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: A report from the american heart association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Kapelios, C. J., Nanas, J. N., Malliaras, K. Allogeneic cardiosphere-derived cells for myocardial regeneration: current progress and recent results. Future Cardiol. 12 (1), 87-100 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Porrello, E. R., Olson, E. O. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Research. 13 (3 Pt B), 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Sci Transl Med. 7 (281), 281ra45(2015).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Ambrosy, A. P., et al. The Global Health and Economic Burden of Hospitalizations for Heart Failure: Lessons Learned From Hospitalized Heart Failure Registries. J Am Coll Cardiol. 63 (12), 1123-1133 (2014).
- Roger, V. L., et al. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics-2012 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 125 (22), 188-197 (2012).
- Kennedy-Lydon, T., Rosenthal, N. Cardiac regeneration: epicardial mediated repair. Proc R Soc B. 282 (1821), 2147-2172 (2015).
- Williams, C., Sullivan, K., Black, L. D. Partially Digested Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Cardiomyocyte Proliferation In Vitro. Adv Healthcare Mat. 4 (10), 1545-1554 (2015).
- Borg, T. K., et al. Recognition of extracellular matrix components by neonatal and adult cardiac myocytes. Dev Biol. 104 (1), 86-96 (1984).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immnol. 111, A3-B1-3 (2015).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng Part C Methods. 17 (9), 915-926 (2011).
- Lu, T. Y., et al. Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells. Nat Commun. 4 (2307), 1-11 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
