Artykuł metodologiczny

Multimodalne ilościowe obrazowanie fazowe z cyfrową mikroskopią holograficzną dokładnie ocenia stan zapalny jelit i gojenie się ran nabłonkowych

DOI:

10.3791/54460

⸱

13 września 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Institute of Palliative Care, University Hospital Münster, 3Biomedical Technology Center, University of Münster, 4Department of Gastroenterology, Klinikum Bielefeld

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładna ocena efektów przeciwzapalnych ma ogromne znaczenie dla oceny potencjalnych nowych leków do leczenia nieswoistych zapaleń jelit. Cyfrowa mikroskopia holograficzna umożliwia ocenę stanu zapalnego w próbkach tkanki mysiej i ludzkiej okrężnicy, a także zautomatyzowaną multimodalną ocenę gojenia się ran nabłonkowych in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częstość występowania chorób zapalnych jelit, tj. choroby Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, znacznie wzrosła w ciągu ostatniej dekady. Etiologia IBD pozostaje nieznana, a obecne strategie terapeutyczne opierają się na nieswoistej supresji układu odpornościowego. Opracowanie metod leczenia, które są ukierunkowane na zapalenie jelit i gojenie się ran nabłonkowych, może znacznie poprawić leczenie IBD, jednak wymaga to dokładnego wykrywania zmian zapalnych. Obecnie potencjalni kandydaci na leki są zwykle oceniani przy użyciu modeli zwierzęcych in vivo lub technik opartych na hodowlach komórkowych in vitro. Badanie histologiczne zwykle wymaga wybarwienia komórek lub tkanek będących przedmiotem zainteresowania, co może zmienić charakterystykę próbki, a ponadto interpretacja wyników może się różnić w zależności od wiedzy badacza. Cyfrowa mikroskopia holograficzna (DHM), oparta na detekcji opóźnienia długości ścieżki optycznej, umożliwia obrazowanie ilościowe z kontrastem fazowym bez plam. Pozwala to na bezpośrednie skorelowanie wyników z bezwzględnymi parametrami biofizycznymi. Pokazujemy, w jaki sposób pomiar zmian gęstości tkanek za pomocą DHM, oparty na pomiarze indeksu refrakcji, może określić ilościowo zmiany zapalne, bez barwienia, w różnych warstwach próbek tkanki okrężnicy od myszy i ludzi z zapaleniem jelita grubego. Dodatkowo demonstrujemy ciągłe, multimodalne, bezznacznikowe monitorowanie gojenia się ran nabłonkowych in vitro, możliwe przy użyciu DHM poprzez proste automatyczne oznaczanie zranionego obszaru i jednoczesne określanie parametrów morfologicznych, takich jak sucha masa i grubość warstwy migrujących komórek. Podsumowując, DHM stanowi cenne, nowatorskie i ilościowe narzędzie do oceny stanu zapalnego jelit z wartościami bezwzględnymi parametrów, możliwymi do uproszczenia określeniem ilościowym gojenia się ran nabłonkowych in vitro, a zatem ma duży potencjał do zastosowania w diagnostyce translacyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD), tj. wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) i choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) są idiopatycznymi zaburzeniami zapalnymi przewodu pokarmowego1. Szczególnie ważne są badania nad patofizjologią leżącą u podstaw IBD oraz ocena potencjalnych nowych leków lub nowatorskich podejść diagnostycznych. Zarówno w badaniach podstawowych, jak i w postępowaniu klinicznym z pacjentami z IBD, błona śluzowa jelit stała się przedmiotem zainteresowania2,3. Błona śluzowa stanowi anatomiczną granicę, na której interakcja między bakteriami komensalnymi, komórkami nabłonkowymi i różnymi składnikami komórkowymi jelitowego układu odpornościowego koordynuje homeostazę jelit4,5. Jednak u pacjentów z IBD niekontrolowane i uporczywe zapalenie jelit prowadzi do uszkodzenia błony śluzowej, wykrywalnego jako owrzodzenia lub zwężenie, co może ostatecznie doprowadzić do załamania funkcji bariery nabłonkowej, co z kolei nasila miejscowy stan zapalny6.

Gojenie się ran nabłonkowych jest zatem kluczowe dla regeneracji nabłonka po stanie zapalnym, ale jest również podstawowym wymogiem dla gojenia się wrzodów żołądkowo-jelitowych lub nieszczelności zespolenia po operacji przewodu pokarmowego7. Nabłonkowe gojenie się ran można symulować w testach gojenia ran in vitro oraz w mysich modelach zapalenia jelit8,9. Zarówno podejścia in vitro, jak i in vivo mają wady, które ograniczają dokładność oceny doświadczalnej. Testy in vitro, podobnie jak klasyczne testy zarysowania, wymagają długotrwałych procedur barwienia lub transfekcji za pomocą fluorescencyjnych chromoforów. Często są one ograniczone przez nieciągłe monitorowanie proliferacji i migracji komórek, którego nie można zautomatyzować10. Modele in vivo, takie jak zapalenie jelita grubego wywołane dekstranem siarczanem sodu (DSS), często nie mają solidnych odczytów, częściowo ze względu na znaczną zmienność obserwowaną w markerach laboratoryjnych, co sprawia, że takie markery są nieodpowiednie do oceny ciężkości zapalenia jelita grubego11,12. Analiza histologiczna błony śluzowej objętej stanem zapalnym jest obecnie nadal najbardziej odpowiednim podejściem do określania ciężkości zapalenia jelita grubego, ale to, podobnie jak testy gojenia się ran nabłonkowych in vitro, wymaga barwienia i zależy od wiedzy badacza13.

Ostatnio cyfrowa mikroskopia holograficzna (DHM), wariant ilościowej mikroskopii fazowej14, została uznana za użyteczne narzędzie do oceny gojenia się ran nabłonkowych in vitro i in vivo15. DHM umożliwia ocenę gęstości tkanki poprzez pomiar opóźnienia długości ścieżki optycznej (OPD), co pozwala na nową diagnozę raka16-18 i ilościowe określenie zmian w tkankach związanych ze stanem zapalnym19. Dodatkowo DHM umożliwia monitorowanie dynamiki morfologii komórek poprzez określenie grubości komórki, powierzchni pokrytej komórką oraz ilości wewnątrzkomórkowej (białka)15,20. W testach in vitro DHM umożliwia również analizę procesów fizjologicznych, np. przepuszczalności wody komórkowej poprzez ocenę zmian objętości i grubości komórek21,22. Co więcej, pomiary DHM można zautomatyzować, co zapobiega stronniczości próbki związanej z badaczami.

Tutaj demonstrujemy użycie DHM w mysim modelu zapalenia jelit, a także stosujemy DHM do analizy próbek tkanek ludzkich do ilościowego monitorowania gojenia się ran jako bezznacznikowego testu in vitro. Najpierw oceniamy zmiany zapalne różnych warstw ściany okrężnicy u myszy z coliką i skrawków tkanek od ludzi z IBD. Po opisaniu procedury obrazowania fazy ilościowej DHM, podajemy szczegółową instrukcję korzystania z elementów mikroskopu, przygotowania wycinków tkanek, a także opisujemy ocenę uzyskanych ilościowych obrazów fazowych.

Następnie pokazujemy, że DHM może być wykorzystany do ciągłego multimodalnego monitorowania gojenia się ran nabłonkowych in vitro, a analiza cech komórkowych, takich jak grubość warstwy komórkowej, sucha masa i objętość komórki, daje wgląd w indukowane lekami i fizjologiczne zmiany komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez regionalną komisję etyki (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Niemcy) zgodnie z niemieckim prawem o ochronie zwierząt. Lokalna komisja bioetyczna Uniwersytetu w Münster zatwierdziła wykorzystanie tkanek ludzkich do analizy histologicznej i mikroskopowej.

1. Zwierzęta i materiały

  1. Używaj samic lub samców myszy z wymaganego szczepu podatnego na DSS, które ważą od 20 do 25 g, i trzymaj je zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Zapewnij specjalną karmę dla gryzoni i autoklawowaną wodę pitną ad libitum.
  2. Wywołaj ostre zapalenie jelita grubego DSS, podając 3% w/v siarczanu dekstranu sodu (DSS, masa cząsteczkowa: 36 000-50 000 Da) w autoklawowanej wodzie z kranu przez 5 dni.
    nuta: Siła działania DSS jest bardzo zmienna w zależności od producenta i partii. Najpierw przetestuj DSS dostarczony przez dostawcę pod kątem indukcji aktywności choroby, dla której dzienna masa ciała jest wiarygodnym i obiektywnym wskaźnikiem.
  3. W celu oceny histologicznej próbek tkanki okrężnicy, należy poddać myszy eutanazji przez wdmuchiwanie CO2 (lub zgodnie z wytycznymi krajowymi i instytucjonalnymi) pod koniec eksperymentu.

2. Eksperymentalna konfiguracja do testów DSS-zapalenie jelita grubego i gojenie ran in vitro

  1. Hodowla komórkowa i ustalenie testu gojenia się ran.
    1. Hoduj komórki Caco-2 w środowisku o wilgotności 95% i 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Użyj pożywki RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
    2. Nasiona komórek Caco-2 o gęstości 4 x 105 komórek/cm2 na 35 mm szalkach Petriego z wkładką do hodowli (patrz rysunek 4A).
      nuta: Wkładka generuje dwa obszary pokryte komórkami, które są oddzielone zdefiniowaną wolną przestrzenią komórkową reprezentującą zraniony obszar, który ma być analizowany.
    3. Zmień podłoże dwa dni po wysianiu. Wykonać poprzez zasysanie pozostałej pożywki z resztkami komórek za pomocą pipety automatycznej, przepłukać 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodać świeżą pożywkę RPMI lub pożywkę pozbawioną surowicy.
    4. Hodowla komórek przez 24 godziny w pożywce pozbawionej surowicy (0,1% FBS) uzupełniona surowicą 20 ng EGF / ml lub 2 μg mitomycyny c / ml surowicy w celu wykrycia zmian w gojeniu się ran. Dodaj normalną pożywkę RPMI do komórek kontrolnych na 24 godziny.
    5. Po 24 godzinach hodowli należy usunąć i wyrzucić wkładki hodowlane zgodnie z opisem w kroku 3.4 i wykonać DHM.
  2. Indukcja ostrego zapalenia jelita grubego DSS
    1. Rozpuść 3 g DSS w 100 ml autoklawowanej wody, aby uzyskać 3% (w/v) roztwór DSS. Podawaj ten roztwór zamiast wody pitnej myszom ad libitum przez 7 dni. Obliczyć 5 ml roztworu DSS na mysz dziennie. Zapewnij wodę autoklawowaną bez DSS dla myszy kontrolnych ad libitum.
  3. Przygotowanie skriostatycznych przekrojów jelita grubego u myszy i człowieka
    1. Eutanazja myszy przez wdmuchiwanie CO2 pod koniec eksperymentu.
    2. Wypreparuj brzuch zwierząt przez laparotomię23. Ostrożnie usuń całą okrężnicę za pomocą pęsety i odetnij koniec jelita krętego i odbytnicy za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przetnij okrężnicę nożyczkami wzdłuż od jelita ślepego do końca odbytnicy i otwórz okrężnicę. Usuń cały kał z próbki za pomocą pęsety, a następnie przemyj PBS24.
    3. Przygotuj bułeczki szwajcarskie, zwijając całą okrężnicę wacikiem wzdłużnie od jelita ślepego do końca odbytnicy z błoną śluzową zakrzywioną do wewnątrz. Próbki okrężnicy należy zatopić w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    4. Osadź ludzką tkankę okrężnicy z próbki chirurgicznej w optymalnej temperaturze cięcia związku OCT i przechowuj w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
    5. Wyciąć odcinki o grubości 7 μm próbek zatopionych w związku OCT za pomocą kriotomu tuż przed badaniem.
      UWAGA: Optymalna grubość próbki zależy od trwałości i właściwości rozpraszania badanego typu tkanki. W opisanych eksperymentach z wykorzystaniem tkanki jelita grubego grubość warstwy > 10 μm powoduje znaczny wzrost szumu z powodu rozpraszania światła w ilościowych obrazach kontrastu fazowego DHM, podczas gdy próbki o grubości < 5 μm wykazują większe ryzyko artefaktów wywołanych uszkodzeniem w procesie cięcia kriogenicznego.
    6. Przenieś sekcje na szkiełko nośne na szklane przedmioty.

3. Sprzęt techniczny, oprogramowanie i procedury do pozyskiwania i oceny hologramów cyfrowych

  1. Cyfrowy mikroskop holograficzny do ilościowego obrazowania komórek i tkanek
    1. Użyj pozaosiowego cyfrowego systemu mikroskopii holograficznej Mach-Zehnder do obrazowania żywych komórek25, jak pokazano na rysunku 1. Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w obiektyw mikroskopu 10X, stolik mikroskopowy z uchwytem na szkiełka podstawowe i szalki Petriego o średnicy 35 mm, komorę grzewczą do utrzymania temperatury fizjologicznej na poziomie 37 °C oraz oprogramowanie do ilościowego obrazowania fazowego25,
      nuta: Na przykład, jak opisano w Kemper i wsp.26 oraz Langehanenberg i wsp.27.
      nuta: Alternatywnie można użyć podobnego systemu, który jest w stanie wykonać mikroskopię jasnego pola i ilościowe obrazowanie fazowe żywych komórek i wypreparowanych preparatów tkankowych.
    2. Wyczyść soczewkę mikroskopu i kondensor papierem do czyszczenia soczewek i środkiem czyszczącym (np. etanolem) zgodnie z zaleceniami producenta mikroskopu w celu usunięcia kurzu lub innych zanieczyszczeń.
    3. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu mikroskopu DHM, wybierz tryb obrazowania "jasne pole" i włącz oświetlenie światłem białym. Upewnij się, że próbka jest oświetlona przez Köhlera zgodnie z zaleceniami producenta mikroskopu, obserwując próbkę w oknie obrazowania na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu (alternatywnie na tym etapie można użyć standardowego oprogramowania do akwizycji obrazu).
      nuta: Intensywność obrazu powinna być równomiernie rozłożona w polu widzenia, a pozycja próbki nie powinna się przesuwać podczas optycznego ustawiania ostrości za pomocą napędu ostrości mikroskopu.
    4. Wybierz tryb obrazowania "DHM", wyłącz podświetlenie światłem białym i włącz światło lasera. Sprawdzić, czy oświetlenie światłem laserowym jest jednorodne (tj. czy natężenie światła jest jednorodnie rozłożone w oknie obrazowania na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazowania mikroskopu DHM) i zaobserwować, czy na przechwyconych obrazach (hologramy cyfrowe) pojawia się wzór prążków interferencyjnych poza osią z odpowiednim kontrastem.
  2. Przygotowanie skrawków kriostatu do obrazowania za pomocą DHM
    1. Pobrać próbkę (skręp kriostatu na szklanym nośniku o grubości 7 μm, jak opisano w ppkt 2.3) z zamrażarki. Rozmrażanie próbki przez około 5 minut w temperaturze pokojowej i w normalnej atmosferze.
    2. Dodać 50 - 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako pożywkę do zatapiania na wycinku tkanki za pomocą pipety, aż do całkowitego pokrycia buforem. Przykryć próbkę czystym szkiełkiem nakrywkowym (grubość szkła 170 μm).
      UWAGA: Nadmierne suszenie może wywołać znaczące zmiany współczynnika załamania światła i właściwości rozpraszania próbki.
    3. Upewnij się, że spód szklanego nośnika i szkiełko nakrywkowe są oczyszczone z kurzu i innych zanieczyszczeń, które mogą powodować rozpraszanie światła. Próbka jest gotowa do badania za pomocą mikroskopii jasnego pola i DHM.
  3. Ilościowe obrazowanie fazowe wycinków tkanek za pomocą DHM
    1. Włącz cyfrowy mikroskop holograficzny, wybierz obiektyw mikroskopu 10X do obrazowania. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu mikroskopu DHM i wybierz tryb obrazowania jasnych plików.
    2. Umieść szkiełko tkankowe zgodnie z opisem w 2) w uchwycie szkiełka mikroskopowego, tak aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę obiektywu mikroskopu.
    3. Włączyć "włączenie" oświetlenia jasnego pola mikroskopu DHM. Ustawić próbkę na stoliku mikroskopu i upewnić się, że obszar zainteresowania tkanki jest widoczny w oknie monitorowania na żywo. Popraw ostrość obrazu za pomocą napędu ostrości mikroskopu.
      nuta: Oprócz obszaru zainteresowania, w polu widzenia powinien znajdować się również obszar szkiełka bez tkanki.
    4. Uchwyć obraz w jasnym polu ostro ostrej próbki za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu.
    5. Wybierz tryb obrazowania "DHM", wyłącz podświetlenie światłem białym i włącz podświetlenie światła laserowego. Wybierz "czas ekspozycji" dla zapisu hologramu poniżej 3 ms, obserwuj, czy holograficzne prążki interferencyjne poza osią pojawiają się z odpowiednim kontrastem w oknie obrazowania na żywo oprogramowania do akwizycji obrazu i uchwyć hologram cyfrowy.
    6. Powtarzać kroki 3.3.3 - 3.3.5 aż do zarejestrowania wystarczającej liczby obrazów w jasnym polu i hologramów cyfrowych różnych obszarów próbki. Pozyskiwanie hologramu zostało zakończone.
  4. Przygotowanie testów gojenia się ran do obrazowania DHM
    1. Włączyć komorę grzewczą na szalkę Petriego w mikroskopie DHM na około 1 - 3 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić stabilne warunki temperaturowe podczas pomiarów DHM.
    2. Przygotować stół warsztatowy z wymaganym wyposażeniem (szalka Petriego do oznaczania gojenia ran jest opisana w ppkt 2.3): pipety, pęseta, szklana pokrywka do szalki Petriego, 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowa pożywka z kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) o temperaturze fizjologicznej (37 °C) do przygotowania próbki w sterylnym środowisku.
      UWAGA: Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco składa się z 10% płodowej surowicy cieląt (FCS), 20 mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) i 850 mg/L NaHCO3.
    3. Zdjąć plastikową pokrywkę z szalki Petriego i usunąć pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety. Wyjmij wkładkę z dna szalki Petriego za pomocą pęsety.
    4. Przemyć próbkę 1-2 razy 1 ml buforowanej pożywki do hodowli komórkowych HEPES w celu usunięcia martwych komórek i pozostałych składników komórkowych (np. surowicy) w obszarze rany. Dodać 2 ml buforowanej pożywki do hodowli komórkowych HEPES i przykryć szalkę Petriego szklaną pokrywką.
    5. Upewnij się, że szklana pokrywa i dno szalki Petriego zostały oczyszczone z kurzu i innych zanieczyszczeń. Próbka jest gotowa do obserwacji poklatkowej za pomocą DHM.
  5. Ciągłe multimodalne monitorowanie gojenia się ran in vitro za pomocą DHM
    1. Włączyć komorę grzewczą na szalkę Petriego w mikroskopie DHM na około 1 - 3 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić stabilne warunki temperaturowe podczas pomiarów DHM.
    2. Włącz cyfrowy mikroskop holograficzny, wybierz obiektyw mikroskopu 10X do obrazowania. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu mikroskopu DHM i wybierz tryb obrazowania "jasne pole". Upewnij się, że komora grzewcza szalki Petriego ma temperaturę fizjologiczną (37 °C).
    3. Umieścić szalkę Petriego z testem gojenia się ran, przygotowanym zgodnie z opisem w pkt 4), w komorze grzewczej mikroskopu DHM.
    4. Wybierz tryb obrazowania w jasnym polu i ustaw próbkę za pomocą stolika mikroskopu, obserwując ją w oknie monitorowania na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu mikroskopu DHM. Zwróć uwagę, że żądany obszar próbki wydaje się ostro skupiony w świetle białym.
    5. Rejestruj obrazy w jasnym polu różnych obszarów próbki (obszar rany i otaczające obszary ze zbiegającymi się komórkami) w świetle białym za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu i dokumentuj wygląd, gęstość i jednorodność komórek.
    6. Wybierz tryb obrazowania "jasne pole" mikroskopu DHM. Wybierz odpowiedni obszar rany przy oświetleniu światłem białym w oknie monitorowania na żywo za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu DHM. Upewnij się, że obszar rany jest wolny od martwych komórek i nie ma pozostałości surowicy oraz upewnij się, że obie strony zawierają pojedynczą jednorodną warstwę komórek, najlepiej z prostymi obrzeżami.
    7. Uchwyć obraz w świetle białym początkowego obszaru rany w trybie obrazowania w jasnym polu za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu DHM.
    8. Wyłącz podświetlenie światłem białym, wybierz tryb "DHM" i włącz oświetlenie laserowe. Wybierz czas naświetlania poniżej 3 ms dla zapisu hologramu (zwróć uwagę, że holograficzne prążki interferencyjne poza osią pojawiają się z odpowiednim kontrastem w oknie obrazowania na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu mikroskopu DHM) i uchwyć hologram cyfrowy.
    9. Uchwyć hologram próbki w trybie DHM za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu i zrekonstruuj ilościowy obraz fazowy za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji mikroskopu DHM w celu sprawdzenia jakości obrazu.
    10. Wybierz odpowiednie opóźnienie czasowe (np. 3 - 5 min) dla akwizycji hologramu poklatkowego za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu DHM.
    11. Wybierz tryb akwizycji poklatkowej w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, w którym próbka jest oświetlana tylko światłem laserowym podczas akwizycji hologramu.
    12. Rozpocznij poklatkową obserwację DHM w teście gojenia się ran.
    13. Zatrzymaj akwizycję poklatkową po zamierzonym czasie, wybierz tryb obrazowania w jasnym polu i udokumentuj ostateczny wygląd próbki w obrazowaniu w świetle białym.
  6. Rekonstrukcja cyfrowych hologramów wypreparowanych tkanek i określenie średniego współczynnika załamania światła jako parametru do ilościowego określenia gęstości tkanek
    1. Rekonstrukcja ilościowych obrazów fazowych z hologramów cyfrowych wypreparowanych tkanek za pomocą oprogramowania mikroskopu DHM, np. zgodnie z opisem w Kemper i wsp.26 oraz Langehanenberg i wsp.Lokal mieszkalny 27.
    2. Określ średni kontrast fazowy Δφ w różnych warstwach tkanek (nabłonek, błona podśluzowa, zrąb) w odpowiednio dobranych obszarach zainteresowania (ROI)19.
    3. Określić współczynnik załamania światła ośrodka osadzającego za pomocą refraktometru lub alternatywnie, używając odpowiedniej wartości z literatury. (wartości współczynnika załamania światła dla typowych pożywek do zatapiania: nwody = 1,334 28, nsoli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) = 1,337 29, npożywki do hodowli komórkowych = 1,337-1,339 29,30).
    4. Oblicz współczynniki załamania światła różnych warstw tkankowych na podstawie średnich wartości kontrastu fazowego19
      figure-protocol-1 (1)
      nuta: W równaniu 1 λ to długość fali światła laserowego (tutaj: λ = 532 nm), d to grubość wypreparowanych tkanek (tutaj: 7 μm), a nośrodek to współczynnik załamania światła ośrodka zatapiającego (tutaj: nmedium = nPBS = 1,337, wyznaczony za pomocą refraktometru Abbego).
  7. Rekonstrukcja i ocena hologramów cyfrowych na podstawie obserwacji serii gojenia się ran poklatkowych
    1. Rekonstrukcja ilościowych obrazów fazowych z serii hologramów poklatkowych uzyskanych podczas obserwacji gojenia się ran za pomocą oprogramowania mikroskopowego DHM26,27.
    2. Normalizuj każdą serię ilościowych obrazów fazowych do obrazu z maksymalnym kontrastem fazowym.
    3. Określ obszar Scc, który jest pokryty przez komórki w ilościowych obrazach fazy DHM poprzez segmentację obrazu, którą można wykonać za pomocą bezpłatnego programowego profilera komórek (www.cellprofiler.org31).
    4. Obliczyć średni kontrast fazowy komórek Δφkomórki w obszarze Sc.
    5. Pobrać komórkową suchą masę masy zkomórki Δφ o średnim kontraście fazowym w obszarze Sc15
      figure-protocol-2 (2)
      nuta: W równaniu 2 DM oznacza suchą masę komórkową, Sc przedstawia powierzchnię zajmowaną przez komórki i α = 0,002 m2 / kg.
    6. Określić całkowy komórkowy współczynnik załamania światła nkomórek i współczynnik załamania światła pożywki do hodowli komórkowych npożywki. Oznaczyć nkomórek oddzielnie doświadczalnie od zawieszonych komórek, jak opisano w pkt 30 i zmierzyć npożywki za pomocą refraktometru. Alternatywnie można użyć wartości literatury dla nkomórki30 i npożywki29,30.
    7. Obliczyć średnią grubość komórki dkomórki z λ, Δφkomórki, nkomórki i npożywki 26,32
      figure-protocol-3 (3)
      nuta: W równaniu 3 parametr d komórka to średnia grubość komórki, λ oznacza długość fali świetlnej światła laserowego,komórka Δφ oznacza średni kontrast fazowy, a komórka n i ośrodek n to całkowy komórkowy współczynnik załamania światła i współczynnik załamania otaczającego ośrodka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typowa konfiguracja obrazowania DHM dla cyfrowej mikroskopii holograficznej (DHM)

Aby wykonać obrazowanie w jasnym polu i ilościowe obrazowanie kontrastu fazowego DHM, zastosowaliśmy mikroskop odwrócony, jak pokazano na rysunku 1B. System został zmodyfikowany poprzez dołączenie modułu DHM, jak opisano wcześniej25. Hologramy cyfrowe wygenerowano poprze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy, że DHM zapewnia dokładną ocenę uszkodzeń histologicznych w modelach mysiego zapalenia jelita grubego i próbkach ludzkiej tkanki okrężnicy ex vivo. Co więcej, wykazaliśmy, że DHM może stale monitorować gojenie się ran nabłonkowych, jednocześnie dostarczając multimodalnych informacji o zmianach komórkowych. W DHM rekonstrukcja cyfrowo przechwyconych hologramów jest wykonywana numerycznie32. W związku z tym, w porównaniu z mikroskopią jasnego pola, mikroskopią kontrastu fazowego Zernike i mik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Faekah Gohar za korektę manuskryptu. Dziękujemy Sonji Dufentester i Elke Weber za fachową pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Azoxymethane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, NiemcyA5486
Kolba do hodowli komórkowychGreiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy658170
Costar StripetteCorning Inc., Nowy Jork, USA4488
Konsultacja siarczanu dekstranu sodu (DSS)TdB, Uppsala, SzwecjaDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - AustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, NiemcySPR3196
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, NiemcyE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgia352070
Izopentan (2-metylobutan)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, NiemcyM32631-1L
Błękit metylenowyMerck, Darmstadt, Niemcy1159430025
Mitomycyna CSigma - Aldrich, Deisenhofen, NiemcyM4287
G. Menzel, Brunszwik, NiemcyJ1800AMNZ
Związek O.C.T. Tissue Tek                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Holandia4583
Pen/Strep/Amfoterycyna BLonza, Verviers, Belgia1558
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBSLonza, Verviers, Belgia4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgia3626
Chlorek sodu 0,9%Braun, Melsungen, Niemcy5/12211095/0411
Dieta standardowaAltromin, Lage, Niemcy1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Holandia4566
Trypsyna EDTALonza, Verviers, Belgia7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, Teningen, Niemcy04-0002 
  µ-Dish 35 mm z wkładką kulturową, highibidi GmbH, Monachium, Niemcy81176
DIC Pokrywka do &mikro-naczyń, z wkładem szklanymibidi GmbH, Monachium, Niemcy80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Cyfrowy mikroskop holograficzny
ComponentModelFirma
Mikroskop odwróconyiMICTill Photonics, Graefelfing, Niemcy
Laser Compass 315MCoherent GmbH, Lubeka, Niemcy
Obiektywmikroskopu Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Getynga, Niemcy
Kamera CCDDMK 41BF02The Imaging Source, Brema, Niemcy
Szkiełka mikroskopowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144(2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317(2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976(2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017(2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210(2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2 (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009(2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912(2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar wsp czynnika za amania wiat aanaliza g sto ci tkankiobrazowanie bezbarwieniowemonitorowanie kultur kom rkowychmysi model zapalenia jelita grubegokom rki Caco 2

Powiązane artykuły