Artykuł metodologiczny

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

DOI:

10.3791/54466

⸱

15 października 2016

 , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinozytydy w błonie komórkowej są lipidami sygnalizacyjnymi o wielu funkcjach komórkowych. 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu (PI(4,5)P2) jest determinantem fosfoinozytolu błony komórkowej (PM) i jest niezbędny do modulowania kanałów jonowych, dynamiki aktyny, egzocytozy, endocytozy, sygnalizacji wewnątrzkomórkowej i wielu innych procesów komórkowych. Jednak organizacja przestrzenna PI(4,5)P2 w PM jest kontrowersyjna, a jej rozkład w nanoskali jest słabo poznany ze względu na ograniczenia techniczne podejść badawczych. Tutaj, wykorzystując mikroskopię lokalizacji pojedynczych cząsteczek i dwukolorowe sondy fluorescencyjne oparte na domenie Pleckstrin Homology (PH), opisujemy nowatorską metodę wizualizacji nanoskalowego rozkładu PI (4,5) P2 w PM w utrwalonych arkuszach membranowych, a także w żywych komórkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinozytydy stanowią niewielką część całkowitej warstwy lipidów błonowych, ale odgrywają kluczową rolę w różnych procesach komórkowych. Zawierają one siedem członków pochodzących z odwracalnej fosforylacji lub defosforylacji pierścieni inozytolu na3., 4. i 5. pozycji 1. 4-fosforan fosfatydyloinozytolu (PI4P) i 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu (PI(4,5)P2) to dwa główne fosfoinozytydy, które działają stosunkowo niezależnie jako lipidy determinujące błonę komórkową plazmatyczną (PM) 2,3. Fosfatydyloinozytol (3,4,5)-trifosforan (3) występuje znacznie mniej obficie niż PI4P i PI(4,5)P2, ale ma unikalne funkcje w różnych procesach komórkowych, w tym w raku4 i cukrzycy5. Lipidy te mają złożone interakcje molekularne z ich efektorami i wieloma innymi białkami. Dlatego tak ważne jest zrozumienie organizacji przestrzennej tych fosfoinozytydów w PM w skali nanometrowej.

Coraz więcej dowodów pokazuje, że kompleksy białkowe lub klastry molekuł w ograniczonych obszarach PM mogą służyć jako hotspoty sygnalizacyjne6. Na przykład syntaksyna 1a, kluczowe białko regulujące fuzję błonową7-9, wykazuje organizację klastrów w PM. W odróżnieniu od konsensusu poglądu na organizację klastrową składni 1a, przestrzenny rozkład fosfoinozytydów w PM jest kontrowersyjny. Wzorce rozmieszczenia PI(4,5)P2 wahają się od jednolitych10-12, dużych plam13,14 do gęstych klastrów14-18, w zależności od typów komórek i zastosowanych metod eksperymentalnych. Niespójna jest również organizacja przestrzenna PI(4,5)P2 w wyższej rozdzielczości. Badanie z użyciem mikroskopii wymuszonej emisji i zubożenia (STED) 19 ujawniło dużą liczbę gęstych nanoklastrów PI(4,5)P2 (o średnicy ~ 73 nm) w arkuszach PM komórek PC-12 20. Wynik ten różni się od badań wykorzystujących szybką zamrażanie mikroskopii elektronowej (EM)21,22, podejścia, które zachowuje nienaruszoną strukturę PM żywych komórek znacznie lepiej niż utrwalanie chemiczne. Ten ostatni wykazywał wyraźne pule PI(4,5)P2; stosunkowo skoncentrowany PI(4,5)P2 w kaweolach i powlekanych dołach, a także równomierny rozkład na płaskim obszarze PM. Co więcej, organizacja PI(4,5)P2 w nanoskali w arkuszach membranowych może różnić się w żywych i stałych komórkach. Nasze ostatnie prace badały ten problem zarówno w stałych, jak i żywych komórkach INS-1 przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczej cząsteczki (SMLM)23.

SMLM opiera się na stochastycznie włączaniu tylko małego podzbioru fluoroforów w danym momencie, dzięki czemu poszczególne fluorofory mogą być zlokalizowane z dużą precyzją. Wiele podejść do obrazowania superrozdzielczego zostało opracowanych przy użyciu podobnych zasad, aby przekroczyć limit dyfrakcji konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, takich jak mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji (PALM)24, mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM)25, stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)26,27 i bezpośrednia STORM (dSTORM)28. Dzięki fotoprzełączalnym lub fotoaktywowanym fluoroforom (barwnikom lub białkom fluorescencyjnym), techniki SMLM pozwalają naukowcom obrazować struktury biologiczne w rozdzielczościnanometrowej 24,29,30 z częstotliwością wideo w żywych komórkach31,32.

Używając PI(4,5)P2 jako przykładu, wprowadziliśmy podejście SMLM do badania nanoskalowego rozkładu fosfoinozytydów na PM. Domena PH PLCδ1 (fosfolipaza C δ1), która specyficznie wiąże się z PI(4,5)P2, jest dobrze ugruntowaną sondą do obrazowania dystrybucji subkomórkowej PI(4,5)P2 i dynamiki33,34 w PM. Genetycznie oznaczyliśmy tę domenę dwoma białkami fluorescencyjnymi, PAmCherry135 i iRFP36, aby wytworzyć dwukolorowe białko fuzyjne (iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1) (Figura 1A-B). PAmCherry1 służy jako fotoaktywowana sonda domeny PH dla PALM, a iRFP służy jako ogólny wskaźnik do identyfikacji transfekowanych komórek przed akwizycją PALM. Stosujemy tę dwukolorową sondę fluorescencyjną do obrazowania SMLM w stałych arkuszach membranowych. W przypadku obrazowania PALM na żywo oznaczyliśmy mEOS337 zamiast PAmCherry1 do domeny PHPLCδ1, aby wygenerować sondę mEOS3.1-PHPLCδ1 w celu uzyskania lepszej wydajności i jasności fotonów (rysunek 1C-D).

Obrazowanie SMLM za pomocą tych nowatorskich sond w PM komórek INS-1 wydzielających insulinę38 odkryło jednorodne znakowanie PI(4,5)P2 w większości regionów PM, jak również skoncentrowane mikrodomeny PI(4,5)P2, które są słabo wymieszane w płaskim PM i niektóre struktury podobne do filopodiów23. Nanoskalowy rozkład PI(4,5)P2 stanowi strukturalną podstawę do ponownego przemyślenia jego funkcjonowania w żywych komórkach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i utrwalenie arkusza membrany

  1. Przygotowanie arkuszy membranowych oznaczonych za pomocą iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1
    1. Przygotuj plazmid DNA kodujący iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ123 przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej.
    2. Hodowla komórek INS-1 na #1,5 18 mm okrągłych szkiełkach nakrywkowych wstępnie pokrytych 30 μg/ml fibronektyny do 50-70% konfluencji zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych INS-138,39. Transfekcja komórek dzień po osiągnięciu 50 do 70% konfluencji.
    3. Transfekcja komórek za pomocą iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1 przy użyciu odczynnika do transfekcji liposomów zgodnie z protokołami producenta. Po transfekcji pozwól komórkom rosnąć przez 48 godzin.
    4. W dniu eksperymentu posmarować szkiełka nakrywkowe (jednostronnie) ~0,5 - 1 ml 500 μg/ml Poli-D-Lizyny (PDL; rozcieńczonej wdH2O) przez 1-2 godziny. Następnie odsączyć PDL, umieszczając bibułę na krawędzi szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełka nakrywkowe na wstępnie schłodzonej (4 °C) metalowej płytce do późniejszego użycia.
    5. Wstępnie transfekowane komórki INS-1 rosnące na szkiełkach nakrywkowych przemyć ~0,5 - 1 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1 mM EGTA. Powtórz pranie trzy razy i odcedź PBS.
    6. Umieść szkiełka nakrywkowe z hodowanymi komórkami (stroną z komórkami skierowaną w dół) na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL na wstępnie schłodzonej metalowej płytce za pomocą pęsety. Pozostaw płytkę w lodówce (4 °C) na 7 - 10 minut, aby komórki mogły przymocować się do szkiełek nakrywkowych pokrytych PDL (Rysunek 2).
      UWAGA: Czas inkubacji powinien mieścić się w zakresie 7 - 10 minut, aby lepiej przymocować komórki do powierzchni pokrytej PDL. Środowisko lodówki jest suche, a inkubacja nie powinna być zbyt długa.
    7. Wyjmij metalową płytkę z lodówki. Delikatnie odklej szkiełko nakrywkowe zawierające wstępnie transfekowane komórki za pomocą pęsety. W ten sposób powstaje cienka warstwa arkusza błony komórkowej na szkiełku nakrywkowym pokrytym PDL. Delikatnie umyj arkusze membrany ~0,5 - 1 ml lodowatego PBS, a następnie utrwal ~0,5 - 1 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA) + 0,2% aldehydu glutarowego (GA) w PBS przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Paraformaldehyd i aldehyd glutarowy są toksyczne. Przechowuj je pod wyciągiem z ochroną skóry i oczu.
    8. Po utrwaleniu należy natychmiast zobrazować arkusze membrany (patrz punkt 3) lub przechowywać w ~0,5 - 1 ml PBS w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Po zamocowaniu arkusza membrany nie będzie równowagowego wiązania sond pH z cytozolu do PI(4,5)P2. Związane sondy pH będą stopniowo oddzielać się od arkusza membrany i dyfundować do roztworu (chociaż może to potrwać od kilku dni do tygodni). Dlatego zaleca się obrazowanie utrwalonych próbek zaraz po ich przygotowaniu.
  2. Przygotować arkusze membrany do znakowania przeciwciał specyficznych dla PI(4,5)P2
    1. Hodowla komórek INS-1 na #1,5, 18 mm okrągłych szkiełkach nakrywkowych wstępnie pokrytych 30 μg/ml fibronektyny do 50%-70% konfluencji. Komórki transfekcyjne z plazmidem DNA następnego dnia, jak opisano w kroku 1.1.3.
    2. Powtórz kroki od 1.1.4 do 1.1.7 zgodnie z powyższym opisem.
      UWAGA: Wykonaj następujące procedury w temperaturze 4 °C.
    3. Umyć szkiełka nakrywkowe zawierające stałe arkusze PM trzykrotnie ~0,5 - 1 ml lodowatego PBS zawierającego 50 mM NH4Cl. Zgasić arkusze ~0,5 - 1 ml 0,1% borowodorku sodu w PBS przez 7 minut i przemyć ~0,5 - 1 ml PBS (bez 50 mM NH4Cl).
    4. Zablokować próbki ~0,5 - 1 ml roztworu blokującego (roztwór PBS zawierający 5% (v/v) normalnej surowicy koziej, 5% (v/v) albuminy surowicy bydlęcej i 50 mM NH4Cl) przez 45 min. Następnie inkubować z ~0,5 - 1 ml pierwszorzędowego przeciwciała PI(4,5)P2 (rozcieńczenie 1:300) w roztworze blokującym przez 1 godzinę. Przemyć trzy razy (za każdym razem 10 min) ~0,5 - 1 ml PBS zawierającym 50 mM NH4Cl.
    5. Inkubować próbki z ~0,5 - 1 ml wtórnego przeciwciała F(ab')2-koziego anty-myszy sprzężonego z fluoroforami (1:300) w buforze blokującym przez 1 godzinę. Przemyć trzykrotnie ~0,5 - 1 ml PBS.
    6. Próbki po utrwaleniu należy pobrać z 4% PFA + 0,2% GA przez 15 minut, a następnie przemyć próbki trzykrotnie PBS (za każdym razem 7 minut). Przejdź do sekcji 3 w celu obrazowania lub przechowuj w ~0,5 ~ 1 ml PBS w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.
      UWAGA: Przygotować próbki w temperaturze 4 °C. Użyj utrwalacza 4% PFA + 0,2% GA, aby zachować fizjologiczny rozkład fosfoinozytydów w PM. Przygotowanie RT lub utrwalenie samym 4% PFA może spowodować znaczne artefakty (Rysunek 4).

2. Przygotowanie hodowli komórkowych do obrazowania żywych komórek za pomocą mEOS3.1-PHPLCδ1

  1. Przygotuj plazmid DNA kodujący mEOS3.1-PHPLCδ1, jak opisano wcześniej 23.
  2. Hodowla komórek INS-1 na #1,5 18 mm okrągłych szkiełkach nakrywkowych wstępnie pokrytych 30 μg / ml fibronektyny, aż osiągną 50%-70% konfluencji zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórek INS-138,39.
  3. Następnego dnia transfekować komórki INS-1 plazmidem DNA mEOS3.1-PHPLCδ1 za pomocą odczynnika do transfekcji liposomów zgodnie z protokołem produkcyjnym. Inkubować przez 48 godzin przed obrazowaniem.

3. Akwizycja obrazu PALM arkuszy membranowych i żywych komórek

  1. Akwizycja obrazu PALM arkuszy membranowych
    UWAGA: W tym przypadku do akwizycji wszystkich obrazów używany jest system SMLM oparty na mikroskopie z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRF) (olej 100X, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 .
    1. Przed obrazowaniem rozcieńczyć 1 μl roztworu kulek fluorescencyjnych w 10 ml PBS + 50 mM MgCl2. Dodać 200 μl rozcieńczonego roztworu do komory obrazowania zawierającej próbki komórek (z etapów 1.1.8/1.2.6) na 10 minut. Następnie trzykrotnie umyj PBS.
    2. Uruchom system obrazowania PALM. W powiązanym oprogramowaniu do obrazowania wybierz przycisk "Kanał iRFP" (wzbudzenie laserem 642 nm, emisja 700/75 nm). Znajdź sondy pH eksprymujące błonę komórkową w kanale iRFP.
      UWAGA: Arkusz membrany powinien mieć w pobliżu koralik fluorescencyjny. Jest to wymagane do późniejszej korekty dryftu.
    3. Użyj przycisku "Przechwyć", aby zebrać konwencjonalny obraz TIRF błony komórkowej w kanale iRFP jako odniesienie do przyszłej rekonstrukcji obrazu. Ustaw normalny kąt TIRF (tj. po osiągnięciu kąta krytycznego obróć o kolejne 1,5 stopnia), wpisując 2140 w ustawieniu kąta TIRF dla obrazowania. Użyj tego ustawienia kąta dla wszystkich kroków, chyba że zaznaczono inaczej.
      UWAGA: W opisanym tutaj systemie TIRF 3,500 to kąt pionowy w górę, 2,200 to kąt krytyczny TIRF, a 2140 to normalny kąt TIRF, który jest o 1,5 stopnia większy po kącie krytycznym TIRF. Wąski kąt TIRF wspomniany poniżej w 3.2.3 wynosi 2120, co po osiągnięciu kąta krytycznego TIRF wynosi kolejne 2 stopnie.
    4. Przełącz się na kanał PAmCherry1, klikając przycisk kanału RFP (wzbudzenie 561 nm, filtr emisji 600/50 nm). Przesuń pasek przewijania w padzie "AOTF" maksymalnie w prawo, aby uzyskać pełne oświetlenie lasera 561 nm przez 10-20 sekund, aby wybielić fluorescencję membrany tła.
    5. Ustaw optymalne ustawienie kamery (binning 2x2) w zakładce "Format" i protokół szybkiej akwizycji w zakładce "Akwizycja sekwencji ND" (zwykle 10 000-40 000 zdjęć przy 20 Hz).
    6. Akwizycję obrazów PAmCherry1 (laser 561 nm przy pełnej mocy, 50 ms/klatkę) z jednoczesną aktywacją lasera 405 nm na niskim poziomie (0,1% - 1%) należy rozpocząć od kliknięcia przycisku "Uruchom teraz". Dostosuj intensywność lasera 405 nm tak, aby przestrzennie izolowane poszczególne punkty w każdej klatce były łatwe do zidentyfikowania.
      UWAGA: Liczba aktywowanych cząsteczek PAmCherry1 zmniejsza się stopniowo podczas akwizycji. Natężenie lasera 405 nm powinno być stopniowo zwiększane, aby utrzymać optymalną gęstość sygnałów poszczególnych cząsteczek w każdej klatce.
    7. Kontynuuj pozyskiwanie obrazów, aż nie zostanie aktywowany żaden sygnał pojedynczej cząsteczki PAmCherry1.
  2. Obrazowanie metodą PALM w żywych komórkach
    1. Przed obrazowaniem należy rozcieńczyć kulki fluorescencyjne w komorze obrazowania na 10 minut, jak opisano w kroku 3.1.1. Następnie rozpocznij obrazowanie PALM, otwierając powiązane oprogramowanie do obrazowania.
      UWAGA: Użyj magnetycznej komory obrazowania z szybkozłączką do obrazowania żywych komórek. Utrzymuj środek pola obrazowania na poziomie 35 °C za pomocą regulatora temperatury pod stałą perfuzją z buforem zewnątrzkomórkowym (roztwór zewnątrzkomórkowy: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 3 mM glukozy i 20 mM HEPES; pH = 7,3).
    2. Wybierz przycisk kanału GFP (emisja 525/50 nm). Zidentyfikuj sondy fluorescencyjne z ekspresją błony komórkowej na podstawie zielonej fluorescencji z mEOS3 pod wzbudzeniem laserowym 488 nm. Upewnij się, że pobliskie koraliki fluorescencyjne są również uwzględnione podczas obrazowania, ponieważ jest to później wymagane do korekcji dryfu offline.
    3. Kliknij przycisk "Przechwyć", aby zebrać obraz TIRF błony komórkowej w kanale mEOS3 (zielony) jako obraz referencyjny. Użyj płytkiego oświetlenia wzbudzenia falą ulotną (po osiągnięciu kąta krytycznego obróć o kolejne 2 stopnie), wpisując 2120 w ustawieniu kąta TIRF dla obrazowania żywych komórek.
      UWAGA: Minimalizuje to fluorescencję z niezwiązanego mEos3-PH w cytozolu przylegającym do błony plazmatycznej.
    4. Przełącz na przycisk "Kanał RFP" (wzbudzenie 561 nm, emisja 600/50 nm). Użyj lasera o pełnej mocy 561 nm, aby wybielić fluorescencję tła arkuszy membrany przez 10 ~ 20 sekund za pomocą paska przewijania w "Padzie AOTF" (patrz 3.1.4).
    5. Akwizycję obrazu należy rozpocząć od kliknięcia przycisku "Uruchom teraz" w kanale czerwonym (pełna moc 561 nm, ustawiona na 10 ms/klatkę w zakładce ustawień "kamera") z jednoczesną aktywacją lasera 405 nm. Dostosuj intensywność lasera 405 nm, aby aktywować przestrzennie oddzielone punkty w każdej klatce.
      UWAGA: W miarę postępu akwizycji liczba cząsteczek δ1 nieprzekształconych mEOS3.1-PHPLC powoli maleje. Stopniowo zwiększaj moc lasera 405 nm, aby zoptymalizować sygnał pojedynczej cząsteczki. Długość akwizycji obrazowania zależy od celu eksperymentalnego. Rejestruj obrazy w sposób ciągły przez 5 minut w normalnych warunkach. Jeśli wymagane jest dłuższe pobieranie, zbierz wiele stosów obrazów zamiast jednego, dużego stosu obrazów. Rozmiar pliku każdego stosu obrazów nie powinien przekraczać 4 GB, w przeciwnym razie wpłynie to na późniejszą analizę oprogramowania.

4. Przetwarzanie i rekonstrukcja obrazu SMLM

  1. Prześlij pliki obrazów (.tif stosy obrazów) do stacji analizy obrazu. Uruchom program do rekonstrukcji obrazu (napisany na zamówienie) w Matlabie zgodnie z wcześniejszym opisem37 i załaduj stos obrazów, klikając zakładkę "Plik" w menu głównym, następnie "otwórz", a następnie "nowy plik".
  2. Identyfikuj i lokalizuj poszczególne zdarzenia molekularne z każdej klatki. Ustaw próg intensywności filtrowania z numerem progowym (1-10) w "falce". Przed rekonstrukcją należy zweryfikować optymalne ustawienia parametrów do wizualnego wykrywania punktów. Następnie przejdź do zakładki "PALM" i kliknij "proces jednoetapowy", aby rozpocząć rekonstrukcję obrazu.
    UWAGA: Próg intensywności wykrywania punktów jest arbitralny i zależy od osobistego doświadczenia. Może być wymaganych kilka prób w celu wygenerowania optymalnego progu wykrywania, który ani nie wychwytuje zbyt wielu niekwalifikowanych (przyciemnionych) punktów, ani nie odfiltrowuje zbyt wielu kwalifikowanych (jasnych) punktów. Dostosuj inne parametry, aby zoptymalizować analizę danych. W tym przypadku odległość sąsiedztwa (punkty fluorescencji w sąsiednich ramkach w obrębie odległości są łączone) jest ustawiona na 65 nm (1/2 szerokości piksela) i dopasowana jako pojedyncza cząsteczka. Ramki przerwy (pojedyncze zdarzenia cząsteczkowe, które wystąpiły w tych ramkach i odległości sąsiedztwa, zostały połączone i dopasowane jako zdarzenie pojedynczej cząsteczki) jest ustawione na 26 ramek (1,3 s) dla obrazowania PAmCherry140. Dostosuj ten parametr do właściwości sond jednocząsteczkowych i szybkości akwizycji, aby uniknąć nadmiernego zliczania40 w SMLM. Zastosuj korekcję dryfu za pomocą koralików fluorescencyjnych podczas rekonstrukcji.
    1. W przypadku obrazowania stałych arkuszy membranowych oznaczonych przez iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1, zrekonstruuj całe stosy obrazów z tego samego arkusza membrany w jeden obraz o wysokiej rozdzielczości37.
    2. W przypadku próbek żywych komórek oznaczonych przez mEOS3.1-PHPLCδ1 należy rozdzielić cały stos obrazów na kilka mniejszych stosów po 1,000 klatek, tak aby stos 1,000 kolejnych klatek był rekonstruowany jako pojedynczy obraz o wysokiej rozdzielczości, który ma rozdzielczość czasową 10 sekund. Na koniec połącz wszystkie obrazy szeregów czasowych w końcowy stos szeregów czasowych23,
      UWAGA: W obrazowaniu PALM z żywymi komórkami niewielka liczba aktywowanych sond może przesunąć się lub oddzielić od PI(4,5)P2 w PM przed wybielaniem. Aby uwzględnić nadpróbkowanie sond, należy połączyć sygnały pojedynczych cząsteczek w sąsiednich ramkach w promieniu 130 nm (zamiast 65 nm) w jedno zdarzenie emisyjne podczas analizy obrazu.
  3. Po uzyskaniu zrekonstruowanych obrazów przeprowadź dalszą analizę obrazu za pomocą specjalnie napisanego programu w Matlabie, aby określić ilościowo gęstość cząsteczek, gęstość/rozmiar mikrodomeny oraz analizę skupień z korelacją par41.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niepewność lokalizacji (σ) naszego systemu superrozdzielczości wynosi 14,73 nm23. Bezpośrednie porównania obrazów TIRF i PALM wykazały znaczną poprawę rozdzielczości przestrzennej. Rysunek 3A-B przedstawia reprezentatywne obrazy PI(4,5)P2 TIRF znakowane przeciwciałem PI(4,5)P2 i iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1 w typowych arkuszach membranowych i żywych komórkach. Obrazy za pomocą konwencjonalnej mikroskopii TIRF w arkuszach membranowych są niezwykle podobne do tych w nienaruszonych żywych komórkach znakowanych domenami PH znakowanymi ulepszonym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP) (EGFP-PHPLCδ1) (Figura 3C). Wszystkie próbki wykazały równomierny rozkład sond. Natomiast nieoptymalne utrwalenie próbek skutkowało ostrymi, gęstymi klastrami PI(4,5)P2 i spadkiem intensywności sygnału (ryc. 4). W optymalnych warunkach fiksacji, obrazy PI(4,5)P2 w stałej rozdzielczości (ryc. 5) ujawniły jednorodny rozkład sond w znacznej części PM z ograniczonymi gradientami stężeń. Niektóre plastry błonowe wzbogacone sondami PI(4,5)P2 były słabo rozmieszczone i miały różne rozmiary. Obrazy PALM z żywych komórek mają podobny rozkład przestrzenny jak komórki stałe (ryc. 6). Szczegółowa analiza sygnałów PI(4,5)P2 w czasie pozwala na uzyskanie szybkiej dynamiki na obszarach lokalnych, bez istotnych zmian ich liczebności na szerokich obszarach.

figure-results-1
Rysunek 1. Schemat sond fluorescencyjnych użytych w tym badaniu. (A-B) Sonda iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1 używana w eksperymentach z blachą membranową o stałej nośności. Podczas konwencjonalnego obrazowania TIRF (A) do wzbudzenia iRFP używany jest laser o długości fali 640 nm (Ex: 692 nm; Em: 713 nm). Obraz TIRF wykonany w tym stanie służy jako obraz referencyjny TIRF dla obrazowania w superrozdzielczości uzyskanego za pomocą obrazowania PALM (B). Laser o długości fali 405 nm służy do fotoaktywacji fluoroforu PAmCherry1, a laser o długości fali 561 nm służy do wzbudzania PAmCherry1 (np. 564 nm; Em: 595 nm) do obrazowania metodą PALM. (C-D) Sonda mEos3.1-PHPLCδ1 używana w eksperymentach z żywymi komórkami. (C) Podczas konwencjonalnego obrazowania TIRF do wzbudzenia mEOS3.1 używa się lasera o długości fali 488 nm (np. 506 nm; Em: 519 nm). (D) Po fotokonwersji przez laser o długości fali 405 nm, mEos3.1 przechodzi w postać czerwoną (np. 573 nm; Em: 584 nm), a laser 561 nm jest używany do akwizycji PALM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Schemat przygotowania arkusza membranowego z ogniw INS-1. (A) Umieścić szkiełko nakrywkowe z hodowanymi komórkami skierowanymi w dół na szkiełku nakrywkowym pokrytym PDL i odczekać 7 ~ 10 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić przyłączenie komórek do szkiełka nakrywkowego pokrytego PDL. (B) Odklej górne szkiełko nakrywkowe pęsetą i przymocuj arkusz membrany przymocowany do wstępnie powlekanego szkiełka nakrywkowego PDL. (C) Zobrazuj próbki za pomocą TIRFM i PALM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Organizacja przestrzenna PI(4,5)P2 jest podobna między arkuszami błony a nienaruszonymi żywymi komórkami pod konwencjonalnym mikroskopem TIRF. (A) Typowy obraz TIRF arkuszy membranowych utrwalonych w temperaturze 4 °C z 4% PFA i 0,2% GA. PI(4,5)P2 znakowano przeciwciałem specyficznym dla PI(4,5)P2. (B) Arkusz membrany z komórki INS-1 wyrażający iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1. (C) Obraz TIRF dwóch nienaruszonych żywych komórek wykazujących ekspresję EGFP-PHPLCδ1 na różnych poziomach. Podziałka skali: (A): 3 μm; (B) i (C): 5 μm. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Organizacja przestrzenna PI(4,5)P2 w arkuszach membranowych jest wrażliwa na typowe warunki mocowania. (A) Arkusze membrany utrwalone w temperaturze 37 °C z 4% samym PFA i znakowane przeciwciałem specyficznym dla PI(4,5)P2 (jak na rysunku 3A). (B) Arkusz membrany utrwalony w temperaturze pokojowej z samym PFA i znakowany przeciwciałem specyficznym dla PI(4,5)P2. Należy zauważyć, że gęste skupiska sond PI(4,5)P2 są wyraźnie widoczne pod mikroskopem TIRF, w przeciwieństwie do znacznie bardziej równomiernych obrazów fluorescencyjnych pokazanych na rysunku 3A. Podziałka skali: A-B: 3 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Obrazowanie sond PI(4,5)P2 metodą PALM ujawnia ich rozkład w skali nanometrowej w komórce PM INS-1. (A) Obraz iRFP TIRF arkusza membrany z komórki INS-1 eksprymującej iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1. (B) Odpowiedni obraz PALM PM w tym samym regionie na podstawie rekonstrukcji sygnału PAmCherry1. Zwróć uwagę na jednorodny rozkład przestrzenny PI(4,5)P2 w głównych regionach PM i kilku mikrodomenach PI(4,5)P2. (C) Powiększony widok obszaru ramkowego w (B). Strzałki wskazują słabo rozmieszczone mikrodomeny PM wzbogacone o sondy PI(4,5)P2. Podziałki liniowe: A i B: 3 μm; C: 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Obrazowanie PALM w żywych komórkach INS-1. (A) Obraz TIRF PI(4,5)P2 w żywej komórce INS-1 eksprymującej mEos3.1-PHPLCδ1. Obraz został szybko uzyskany w kanale zielonym przed akwizycją PALM (35 °C). (B) Sekwencyjne obrazy PALM z żywych komórek w odstępach 10 sekund. Wstawki pokazują profile intensywności lokalnej gęstości PI(4,5)P2 wzdłuż tej samej pozycji linii prostej 1 w różnych momentach w (B) i (C). Zwróć uwagę na ich duże miejscowe zmiany intensywności w ciągu 10 sek. (D) Przebieg w czasie średnich zmian intensywności PI(4,5)P2 na dużym obszarze (box2, 3x3 μm) i małych okręgach (3, 4 i 5, 5 nm średnicy) w (B) podczas 5 min obrazowania PALM (klatka/10 sek.). Zwróć uwagę na gwałtowne fluktuacje intensywności lokalnych sond PI(4,5)P2 (okrąg 3, 4 i 5) w porównaniu z bardzo małymi zmianami na dużym obszarze (ramka 2). (E) Powiększone obrazy PALM obszaru box2 w (B) we wskazanych momentach. Strzałki wskazują plastry błony wzbogaconej PI(4,5)P2 w warunkach fizjologicznych. Podziałka skali: C: 3 μm; E: 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu rozwiązywania problemów należy zwrócić szczególną uwagę na dwa procesy: produkcję arkuszy membranowych i utrwalanie próbek. Jak opisano w protokole, czas inkubacji szkiełek nakrywkowych w kroku 1.1.6 jest ważny dla produkcji arkuszy membranowych. Optymalny czas inkubacji w naszych warunkach eksperymentalnych wynosi 7-10 minut (ryc. 2). Inkubacja dłuższa niż 10 minut spowoduje powstanie nienaruszonych komórek zamiast arkuszy membrany na szkiełkach nakrywkowych PDL, a krótsza inkubacja doprowadzi do zmniejszenia liczby arkuszy membrany lub ich braku na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL. Jak opisano w protokole, utrwalacze i temperatura podczas utrwalania mają kluczowe znaczenie dla utrzymania rozkładu PI(4,5)P2 w PM. Utrwalenie w RT lub użycie samego 4%-PFA może zniekształcić normalny rozkład lipidów w PM.

Stosując mikroskopię PALM do badań lipidów błonowych, jesteśmy w stanie zaobserwować rozkład PI(4,5)P2 w skali nanometrowej, kluczowego fosfoinozytydu, który pośredniczy w wielu podstawowych czynnościach komórkowych. Ten przestrzenny rozkład PI(4,5)P2 z ograniczonymi gradientami stężeń w komórkach INS-1 zapewnia ramy do ponownego przemyślenia interakcji lipidowo-białkowych i lokalnych zdarzeń sygnalizacyjnych PI(4,5)P2 w tych komórkach. Co więcej, metody opracowane w tej pracy mogą być również zastosowane do innych badań fosfolipidów błonowych za pomocą odpowiednich sond, oferując tym samym nowe narzędzia do badania fosfoinozytydów w procesach biologicznych.

Zastosowanie arkuszy membranowych w tej pracy omija dwa główne problemy w badaniach morfologicznych fosfolipidów: obróbkę detergentem i potencjalne zanieczyszczenie sygnału z cytozolu. Detergenty często powodują grupowanie się i znaczną utratę sygnału fosfolipidowego PM. Zanieczyszczenie sygnału cytozolowego jest szczególnie problematyczne w przypadku fosfoinozytydów o niskiej liczebności na PM23, takich jak PI(3,4,5)P3 i PI(3,4)P2. Próbki arkuszy membranowych są w stanie obejść te problemy bez znaczącego zakłócania struktur związanych z błoną plazmatyczną, takich jak korowa siatka aktynowa i wgłębienia pokryte klatryną42,43. Względny jednorodny rozkład PI(4,5)P2 w PM jest dobrze zgodny z innymi badaniami szybkiego zamrażania EM przy użyciu sond GST-PHPLCδ1 w błonie fibroblastów44.

Należy pamiętać, że niewłaściwe warunki przetwarzania próbki mogą generować mylące wyniki. Po pierwsze, bardzo ważne jest, aby wykonać etapy mocowania w niższej temperaturze (4 °C) i użyć utrwalacza GA do produkcji arkuszy membranowych. Jak pokazano na rysunku 3, ciepła temperatura i wiązanie PFA bez GA nie są wystarczające do wiązania fosfoinozytydów w komórce PM. Może to zniekształcić nienaruszoną dystrybucję PI(4,5)P2 i generować ostre skupiska, których nie obserwuje się w żywych komórkach w warunkach fizjologicznych. Po drugie, zastosowanie PAmCherry1 jako sondy SMLM, a nie innych sond, ma kluczowe znaczenie dla ilościowego obrazowania PALM. Zaletą aplikacji PAmCherry1 są dobrze scharakteryzowane jednocząsteczkowe właściwości fotofizyczne35,40,45, takie jak jasność, wysoka wydajność fotoaktywacji, a przede wszystkim bardzo ograniczone mruganie zdjęcia. Właściwości te pozwalają nam wyeliminować potencjalne artefakty klastrowe z mrugania zdjęć i ilościowo analizować gęstość cząsteczkową błony PI(4,5)P2.

Takie podejście ma też swoje ograniczenia. Po pierwsze, metoda arkusza błonowego zastosowana w tym badaniu może nie naśladować w pełni fizjologicznego rozkładu PI(4,5)P2 , ponieważ komórka jest zakłócona przed obrazowaniem. Jednak nasze obrazowanie PALM na żywo pokazuje podobny, stosunkowo jednorodny rozkład PI(4,5)P2, co potwierdza wyniki zaobserwowane w próbkach arkuszy membranowych. Po drugie, jak omówiliśmy w naszej poprzedniej pracy23, SMLM wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie obrazowania i dodatkowej uwagi, aby uniknąć artefaktów obrazowania, które mogą powstać w wyniku różnych procesów, w tym używanych sond, przygotowania i utrwalania próbek, próbkowania i rekonstrukcji obrazu. Wreszcie, chociaż sondy i przeciwciała oparte na domenie PH były szeroko stosowane w badaniach fosfoinozytydu46,47 , możliwe jest, że nie wszystkie PI(4,5)P2 w błonie można wykryć za pomocą tego podejścia. Na przykład PI(4,5)P2 związany przez inne endogenne białka może nie być dostępny dla sond PH lub przeciwciał, a to może powodować niedoszacowanie PI(4,5)P2 ze względu na przeszkodę przestrzenną samej sondy. Alternatywnym sposobem oznaczania PI(4,5)P2 byłoby użycie Top-Fluor PI(4,5)P248, wstępnie znakowanego analogu PI(4,5)P2 z modyfikacją na końcu oryginalnego PI(4,5)P2. Jednak może być szybko przekształcany w inne podtypy fosfoinozytolu przez szybki metabolizm żywych komórek, ponieważ jego pierścień inozytolowy jest taki sam jak endogenny PI(4,5)P2. Rodzi to obawy, czy ten wstępnie znakowany analog PI(4,5)P2 w żywych komórkach może wiernie reprezentować PI(4,5)P2 , a nie jego produkty metaboliczne. Dlatego, pomimo pewnych ograniczeń, sondy oparte na domenie PH są nadal jednymi z najlepszych sond, które są szeroko stosowane do monitorowania dystrybucji PI(4,5)P2 i dynamiki PM komórek.

Przyszłe zastosowanie tej metodologii może zostać rozszerzone na inne badania fosfoinozytylu, takie jak PI(3,4,5)P3 i PI(3,4)P2. Podsumowując, nowatorskie podejście SMLM zastosowane w tym projekcie otwiera nowe możliwości badania fosfoinozytolu w komórkach. Na przykładzie PI(4,5)P2 pokazujemy unikalne właściwości obrazowania PALM w badaniu morfologicznym i ilościowym cząsteczek błony komórkowej, a także jego wady. Podejście to można dostosować do innych interesujących nas cząsteczek i będzie miało szerokie zastosowanie w biologii komórki.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. jest częściowo wspierany przez American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, dla C.J.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MikroskopNikonTi-U
sCMOScamera AndorNeo
Wirujący dyskYokogawaCSU X-1, 10 000 obr./min 
Monolityczny łącznik laserowy dużej mocy SP z laserami 405, 488, 561 i 642 nm.AgilentMLC400na końcu światłowodu)
405  nm: 15 mW & 13  Mw;
488  nm: 45 mW i 42  Mw;
561  nm: 45 mW i 40  Mw;
640  nm: 35 mW i 16  Mw.
Obiektyw 100XNikonAPO 100X Olej, NA 1.49, WD 0.12  mm
Oprogramowanie do akwizycji i analizy Nikon (NIS Element)Nikon
MatlabMathWorks
Szkiełko nakrywkoweWarner64-0714Round 18  mm szkiełko nakrywkowe, #1.5
FibronectinMilliporeFC010-5MG
Lipofectamin 3000 (odczynnik do transfekcji)InvitrogenL3000-008
Mikroskopia elektronowaaldehydu glutarowegoNauka#16120
PI(4,5)P2 1st przeciwciałoSanta Cruzsc-53412
przeciwciało wtórne  F(ab')2-kozioł anty-myszy Alexa Fluor 647InvitrogenA-21237
Koraliki TetraspeckInvitrogenT7279
szybkozłączką Regulator temperatury Warner InstrumentsCat#641994
Warner InstrumentsTC-344C
Poly-D-LysineSigmaP6407
Bufor fosforanowy soli fizjologicznejSigmaP4417-100TAB
EGTASigma3780
NH4ClSigmaA0171
Kozia surowicaSigmaG9023
albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906
NaClSigmaS5886
KClSigmaP5405
CaCl2• 2H2OSigma223506
MgCl2• 6H2OSigmaM9272
GlukozaSigmaG7021
HEPESSigmaH4034
ParaformaldyhydeSigmaP6148
Oryginalne moce i moce lasera Magnetyczna komora obrazowania z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, 651-657 (2006).
  2. Hammond, G. R. V., et al. PI4P And PI(4,5)P(2) Are Essential But Independent Lipid Determinants Of Membrane Identity. Science. 337, New York, N.Y. 727-730 (2012).
  3. Nakatsu, F., et al. PtdIns4P synthesis by PI4KIIIalpha at the plasma membrane and its impact on plasma membrane identity. J Cell Biol. 199, 1003-1016 (2012).
  4. Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science. 296, 1655-1657 (2002).
  5. Czech, M. P. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol. 65, 791-815 (2003).
  6. Spira, F., et al. Patchwork organization of the yeast plasma membrane into numerous coexisting domains. Nat Cell Biol. 14, 640-648 (2012).
  7. Barg, S., Knowles, M. K., Chen, X., Midorikawa, M., Almers, W. Syntaxin clusters assemble reversibly at sites of secretory granules in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20804-20809 (2010).
  8. Sieber, J. J., et al. Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science. 317, 1072-1076 (2007).
  9. Knowles, M. K., et al. Single secretory granules of live cells recruit syntaxin-1 and synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) in large copy numbers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20810-20815 (2010).
  10. Milosevic, I., et al. Plasmalemmal phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate level regulates the releasable vesicle pool size in chromaffin cells. J Neurosci. 25, 2557-2565 (2005).
  11. van Rheenen, J., Jalink, K. Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale. Mol Biol Cell. 13 (2), 3257-3267 (2002).
  12. Hammond, G., Schiavo, G., Irvine, R. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinct cellular pools of PtdIns4P and PtdIns (4, 5) P2. Biochem J. 422, 23-35 (2009).
  13. Huang, S., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-rich plasma membrane patches organize active zones of endocytosis and ruffling in cultured adipocytes. Mol Cell Biol. 24, 9102-9123 (2004).
  14. James, D. J., Khodthong, C., Kowalchyk, J. A., Martin, T. F. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates SNARE-dependent membrane fusion. J Cell Biol. 182, 355-366 (2008).
  15. Laux, T., et al. GAP43, MARCKS, CAP23 modulate PI(4,5)P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 149, 1455-1472 (2000).
  16. Aoyagi, K., et al. The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdomains at syntaxin clusters. J Biol Chem. 280, 17346-17352 (2005).
  17. Kabachinski, G., Yamaga, M., Kielar-Grevstad, D. M., Bruinsma, S., Martin, T. F. CAPS and Munc13 utilize distinct PIP2-linked mechanisms to promote vesicle exocytosis. Mol Biol Cell. 25, 508-521 (2014).
  18. Wang, J., Richards, D. A. Segregation of PIP2 and PIP3 into distinct nanoscale regions within the plasma membrane. Biol Open. 1, 857-862 (2012).
  19. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
  20. van den Bogaart, G., et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions. Nature. 479, 552-555 (2011).
  21. van Rheenen, J., Achame, E. M., Janssen, H., Calafat, J., Jalink, K. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. Embo J. 24, 1664-1673 (2005).
  22. Sato, K., et al. Differential requirements for clathrin in receptor-mediated endocytosis and maintenance of synaptic vesicle pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1139-1144 (2009).
  23. Ji, C., Zhang, Y., Xu, P., Xu, T., Lou, X. Nanoscale Landscape of Phosphoinositides Revealed by Specific Pleckstrin Homology (PH) Domains Using Single-molecule Superresolution Imaging in the Plasma Membrane. J of Biol Chem. 290, 26978-26993 (2015).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  27. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339, 452-456 (2013).
  28. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat Methods. 7, 717-719 (2010).
  29. Szymborska, A., et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  30. Pertsinidis, A., et al. Ultrahigh-resolution imaging reveals formation of neuronal SNARE/Munc18 complexes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 2812-2820 (2013).
  31. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc Natl Acad Sci. 109, 13978-13983 (2012).
  32. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  33. Balla, T., Várnai, P. Visualization of Cellular Phosphoinositide Pools with GFP-Fused Protein-Domains. Curr Protoc Cell Biol. 24, 24(2009).
  34. Xu, C., Watras, J., Loew, L. M. Kinetic analysis of receptor-activated phosphoinositide turnover. J Cell Biol. 161, 779-791 (2003).
  35. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 6, 153-159 (2009).
  36. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging. Nature Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  37. Zhang, M., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 727-729 (2012).
  38. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  39. Dyachok, O., Isakov, Y., Sågetorp, J., Tengholm, A. Oscillations of cyclic AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells. Nature. 439, 349-352 (2006).
  40. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 18519-18524 (2013).
  41. Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
  42. Morone, N., et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J Cell Biol. 174, 851-862 (2006).
  43. Peters, K. R., Carley, W. W., Palade, G. E. Endothelial plasmalemmal vesicles have a characteristic striped bipolar surface structure. J Cell Biol. 101, 2233-2238 (1985).
  44. Fujita, A., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Takenawa, T., Fujimoto, T. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9256-9261 (2009).
  45. Durisic, N., Laparra-Cuervo, L., Sandoval-Álvarez, Á, Borbely, J. S., Lakadamyali, M. Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nat Methods. 11, 156-162 (2014).
  46. Thomas, C. L., Steel, J., Prestwich, G. D., Schiavo, G. Generation of phosphatidylinositol-specific antibodies and their characterization. Biochem Soc Trans. 27, 648-652 (1999).
  47. Várnai, P., Balla, T. Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains. Methods. 46, 167-176 (2008).
  48. Honigmann, A., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate clusters act as molecular beacons for vesicle recruitment. Nature Struct Mol Biol. 20, 679-686 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie PI 45 P2lokalizacja pojedynczych cz steczekarkusze b ony plazmatycznejmikroskopia TIRFznakowanie fosfoinozytold wfiksacja b onydystrybucja w skali nanoobrazowanie ywych kom rek

Powiązane artykuły