Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54467

⸱

30 września 2016

 , 
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology, 2Department of Biomolecular Sciences, Weizmann Institute of Science

W tym artykule

Podsumowanie

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Streszczenie

Białka wiążące RNA (RBP) odgrywają ważną rolę w każdym aspekcie metabolizmu i regulacji RNA. Ich identyfikacja jest dużym wyzwaniem we współczesnej biologii. Tylko kilka metod in vitro i in vivo umożliwia identyfikację RBP związanych z określonym docelowym mRNA. Jednak ich głównymi ograniczeniami są identyfikacja RBP w środowisku niekomórkowym (in vitro) lub niska skuteczność izolacji interesującego RNA (in vivo). Opracowano metodologię oczyszczania i identyfikacji białek wiążących RNA (RaPID), aby przezwyciężyć te ograniczenia u drożdży i umożliwić skuteczną izolację białek związanych in vivo. Aby to osiągnąć, interesujący RNA jest znakowany pętlami MS2 i ulega koekspresji z białkiem fuzyjnym białka wiążącego MS2 i białka wiążącego streptawidynę (SBP). Komórki są następnie poddawane sieciowaniu i lizie, a kompleksy są izolowane za pomocą kulek streptawidyny. Białka, które oczyszczają się jednocześnie ze znakowanym RNA, można następnie określić za pomocą spektrometrii mas. Niedawno wykorzystaliśmy ten protokół do identyfikacji nowych białek związanych z mRNA PMP1 związanym z ER. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół RaPID oraz omawiamy niektóre z jego ograniczeń i zalet.

Wprowadzenie

Białka wiążące RNA (RBP) stanowią około 10% białek S. cerevisiae 1,2 i około 15% białek ssaków3-5. Są zaangażowane w wiele procesów komórkowych, takich jak przetwarzanie i regulacja potranskrypcyjna mRNA, translacja, biogeneza rybosomów, aminoacylacja i modyfikacja tRNA, przebudowa chromatyny i inne. Ważną podgrupą RBP są białka wiążące mRNA (mRNP)6,7. W trakcie dojrzewania mRNA różne RBP wiążą transkrypt i pośredniczą w jego przetwarzaniu jądrowym, eksporcie z jądra, lokalizacji komórkowej, translacji i degradacji6-8. W ten sposób odrębny zestaw RBP związanych z określonym transkryptem w dowolnym punkcie czasowym determinuje jego przetwarzanie i ostatecznie jego los.

Identyfikacja RBP związanych z mRNA może znacznie poprawić nasze zrozumienie procesów leżących u podstaw ich regulacji potranskrypcyjnej. Do identyfikacji białek zaangażowanych w regulację mRNA wykorzystano różne metody genetyczne, mikroskopowe, biochemiczne i bioinformatyczne (przegląd w9-11). Jednak tylko kilka z tych metod umożliwia identyfikację białek związanych z konkretnym docelowym mRNA. Na uwagę zasługuje system hybrydowy Yeast Three (Y3H), który wykorzystuje mRNA jako przynętę do badania przesiewowego biblioteki ekspresji w komórkach drożdży. Dodatnie klony są zwykle obserwowane poprzez selekcję wzrostu lub ekspresję reporterową12-14. Kluczową zaletą tej metody jest duża liczba białek, które mogą być skanowane w środowisku komórkowym oraz możliwość pomiaru siły oddziaływania RNA-białko. Wady obejmują stosunkowo dużą liczbę wyników fałszywie dodatnich spowodowanych niespecyficznym wiązaniem oraz wysoki potencjał wyników fałszywie ujemnych, częściowo spowodowany nieprawidłowym fałdowaniem ofiary z białka fuzyjnego lub RNA przynęty.

Alternatywą dla podejścia genetycznego jest oczyszczanie RNA z powiązanymi z nim białkami. MRNA zawierające poliA można wyizolować za pomocą kolumn oligo dT, a związane z nimi białka są wykrywane za pomocą spektrometrii mas. Interakcja RNA-białko jest zachowana w kontekście komórkowym przez sieciowanie, które tworzy wiązania kowalencyjne krótkiego zasięgu. Zastosowanie kolumny oligo dT daje globalny obraz całego proteomu, który jest związany z dowolnym mRNA3,5,15 zawierającym poli A. Nie zapewnia to jednak listy białek, które są związane z konkretnym mRNA. Dostępnych jest bardzo niewiele metod umożliwiających dokonanie takiej identyfikacji. Metoda PAIR polega na transfekcji kwasu nukleinowego z komplementarnością do docelowego mRNA16,17. Kwas nukleinowy jest również przyłączony do peptydu, co umożliwia sieciowanie z RBP w bliskim sąsiedztwie miejsca interakcji. Po usieciowaniu kwas nukleinowy peptydowy RBP można wyizolować i poddać analizie proteomicznej. Niedawno z powodzeniem zastosowano metodologię opartą na aptamie do ekstraktów z linii komórkowych ssaków18. Opracowano aptamer RNA o zwiększonym powinowactwie do streptawidyny i połączono go z interesującą sekwencją (w tym przypadku pierwiastkiem bogatym w AU (ARE)). RNA aptamer-ARE przyłączono do kulek streptawidyny i zmieszano z lizatem komórkowym. Białka związane z sekwencją ARE oczyszczono i zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas (MS). Chociaż metoda ta wykryła asocjacje zachodzące poza ustawieniami komórkowymi (tj. in vitro), prawdopodobnie zostanie zmodyfikowana w przyszłości tak, aby wprowadzić aptamery do genomu, a tym samym umożliwić izolację białek związanych z mRNA w środowisku komórkowym (tj. in vivo). W przypadku drożdży, w przypadku których manipulacje genetyczne są dobrze ugruntowane, metoda RaPID (opracowana w laboratorium prof. Jeffa Gersta) daje wgląd w powiązania in vivo 19. RaPID łączy w sobie specyficzne i silne wiązanie białka płaszcza MS2 (MS2-CP) z sekwencją RNA MS2 oraz domeny wiążącej streptawidynę (SBP) z kulkami sprzężonymi ze streptawidyną. Umożliwia to skuteczne oczyszczanie mRNA znakowanych MS2 za pomocą kulek streptawidyny. Co więcej, ekspresja 12 kopii pętli MS2 pozwala na jednoczesne wiązanie się do sześciu MS2-CP z RNA i zwiększanie skuteczności jego izolacji. W związku z tym zaproponowano ten protokół, aby umożliwić identyfikację nowych białek związanych z mRNA po poddaniu eluowanych próbek analizie proteomicznej za pomocą spektrometrii mas.

Niedawno wykorzystaliśmy RaPID do identyfikacji nowych białek związanych z drożdżowym mRNA PMP1 20. Wcześniej wykazano, że mRNA PMP1 jest związane z błoną ER, a jego nieulegający translacji region 3' (UTR) okazał się głównym wyznacznikiem tego związku21. W związku z tym RBP, które wiążą PMP1 3' UTR, prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w jego lokalizacji. RaPID, a następnie chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas/spektrometrią mas (LC-MS/MS) doprowadziły do identyfikacji wielu nowych białek, które oddziałują z PMP120. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół metodologii RaPID, ważne kontrole, które należy wykonać, oraz wskazówki techniczne, które mogą poprawić wydajność i swoistość.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Wstaw sekwencję składającą się z 12 miejsc wiążących MS2 (pętle MS2; MS2L) do pożądanego locus genomowego, zwykle między otwartą ramką odczytu (ORF) a 3' UTR. Szczegółowy protokół tej integracji znajduje się w innym miejscu22. Sprawdzić prawidłowe wprowadzenie i ekspresję za pomocą PCR, analizy północnej lub RT-PCR20,23. Ważne jest, aby sprawdzić, czy integracja nie ingerowała w syntezę 3'UTR. Ponadto do komórek należy również wprowadzić MS2-CP z ekspresją plazmidu połączonego z SBP pod wpływem ekspresji indukowalnego promotora (zubożenie metioniny)24. Identyczny szczep, z wyłączeniem wprowadzonych pętli MS12, powinien być używany jako kontrola do wykrywania sygnałów niespecyficznych.

1. Oczyszczanie RaPID

  1. Wyhoduj 500 ml komórek drożdży (użyj 250-1,000 ml komórek drożdży w zależności od poziomu ekspresji interesującego genu) eksprymujących mRNA20 znakowane MS2 i białko fuzyjne MS2-CP-GFP-SBP24 do OD600 0,8 - 1,0 w temperaturze 30 oC w odpowiednim pożywce wzrostowej (np. Pożywka selektywna syntetycznej dekstrozy (SD)).
  2. Odwirować komórki przy 3 000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  3. Umyć komórki w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), odwirować jak poprzednio (krok 1.2), ponownie zawiesić w równej objętości (krok 1.1) SD bez metioniny i inkubować przez 45 - 60 minut w temperaturze 30 oC w celu wywołania ekspresji białka fuzyjnego MS2-CP-GFP-SBP.
    Uwaga: Dłuższy czas indukcji może spowodować agregację GFP.
  4. Odłożyć na bok 10 ml komórek i wyekstrahować RNA z tej próbki przy użyciu prostej metody "gorącego fenolu"25. Uwaga: Fenol jest wysoce toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa.
    Uwaga: Ten RNA jest dobrym odniesieniem dla jakości izolowanego RNA (Figura 1A).
  5. W przypadku komórek o objętości 500 ml dodaj 1,35 ml 37% formaldehydu do końcowego stężenia 0,1%, aby usieciować kompleksy RNA-białko. Kontynuować inkubację w temperaturze 30 oC przez 10 minut. Uwaga: Formaldehyd jest wysoce toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa.
  6. Dodać 26,5 ml 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 0,125 M i inkubować przez 3 minuty, aby zatrzymać sieciowanie. Od tego kroku umieść wszystko na lodzie, aby zminimalizować degradację RNA.
  7. Odwirować komórki w temperaturze 3.000 x g przez 4 minuty w temperaturze 4oC i przemyć 45 ml zimnego 1x PBS.
  8. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy RaPID na 100 ml początkowej hodowli komórkowej.
  9. Podzielić na porcje po 500 μl w zakręcanych probówkach do mikrofuge i dodać ~ 400 mg schłodzonych szklanych kulek do każdej podwielokrotności (około 0,2 ml probówki PCR).
  10. Lizuj komórki w ubijaku do kulek przez 3 minuty. Natychmiast umieść lizat na lodzie.
    Uwaga: Liza komórek uwalnia komórkowe RNazy, które są główną przyczyną degradacji RNA. Bufor RaPID Lysis zawiera wysokie stężenie inhibitorów RNazy, takich jak niespecyficzny inhibitor RNazy heparyna i swoiste inhibitory. Zalecana jest również szybka praca i utrzymywanie wszystkiego w niskiej temperaturze.
  11. Przenieś lizat do nowych probówek. Przebij mały otwór w dnie każdej probówki do mikrofuge gorącą igłą (0,8 mm x 40 mm) i umieść probówki do mikrofuge na wierzchu probówek o pojemności 15 ml. Użyj główki strzykawki o pojemności 5 ml jako łącznika między probówkami do mikrofug a probówkami o pojemności 15 ml. Odwirować zespół probówek o masie 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 oC.
  12. Przenieść przepływ z probówki o pojemności 15 ml do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 oC w celu usunięcia resztek komórek.
  13. Zebrać supernatanty ze wszystkich probówek o pojemności 1,5 ml w jednej probówce o pojemności 15 ml i odłożyć 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka.
    Uwaga: Będą one służyć jako próbki wejściowe do późniejszej analizy (rysunek 1).
  14. Dodać 300 μg awidyny na 500 ml początkowej kultury drożdży i inkubować przez 30 minut (można to skrócić do 10 minut) w temperaturze 4 oC przy stałym walcowaniu (10 obr./min).
    Uwaga: Awidyna blokuje wiązanie biotyny i biotynylowanych białek z kulkami streptawidyny.
  15. Wstępnie umyj kulki streptawidyny przed inkubacją z lizatem komórkowym.
    1. Przenieść około 300 μl zawiesiny kulek streptawidyny do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i usunąć górny supernatant. W ten sposób uzyskasz 250 μl kulek. Umyj kulki dwukrotnie 1 ml buforu do lizy RaPID. Odwirować kulki streptawidyny w temperaturze 660 x g przez 2 minuty w temperaturze 4otemperaturze C między każdym etapem.
    2. Zablokuj kulki przez inkubację przez 1 godzinę z 0,5 ml buforu do lizy RaPID, 0,5 ml 10 mg/ml BSA i 10 μl 10 mg/ml tRNA drożdży. Koraliki można pozostawić O/N w roztworze blokującym w temperaturze 4oC z obrotem, jeśli to konieczne.
    3. Przemyć dwukrotnie 1 ml buforu RaPID Lysis.
      Uwaga: Koraliki magnetyczne mogą być również używane do skrócenia czasu i tła. Te jednak mają mniejszą pojemność niż koraliki sefarozy.
  16. Dodać 250 μl wstępnie umytych kulek streptawidyny do lizatu zawierającego awidynę (od kroku 1.14) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją (10 obr./min).
    Uwaga: Ten czas inkubacji jest kompromisem między zapewnieniem wystarczającego czasu wiązania a zminimalizowaniem szans na degradację RNA.
  17. Wirować przy 660 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 otemperaturze C w celu usunięcia kulek streptawidyny i przeniesienia supernatantu do nowej probówki o pojemności 15 ml. Odłożyć na bok 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka.
    Uwaga: Będą to próbki "niepowiązane".
  18. Umyj kulki 1 ml buforu do lizy RaPID, delikatnie wstrząśnij, przenieś do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj jak w kroku 1.17. Powtórz ten krok trzy razy.
  19. Umyj koraliki 1 ml buforu RaPID Wash i tym razem obracaj (10 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  20. Umyj koraliki 1 ml 1x PBS i odwiruj jak powyżej.
  21. Ponownie umyj koraliki 120 μl 1x PBS. Odwirować jak powyżej i pobrać cały supernatant do ekstrakcji RNA i białka jako próbkę "Wash".
    Uwaga: Ta ostatnia próbka do płukania będzie wskazywać na rygorystyczność płukania i powinna mieć taką samą objętość jak próbka wymująca. Uprości to przetwarzanie i załadunek w kolejnych testach.
  22. Aby wymyć RNA i białka związane z RNA z kolumny, dodaj 120 μl 6 mM biotyny w 1x PBS i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją (10 obr./min).
  23. Odwirować kulki jak powyżej i przenieść eluowany materiał do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Ponownie odwirować eluowaną próbkę i przenieść górną fazę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, aby upewnić się, że nie ma przenoszenia kulek.
  24. Pobieranie próbek do ekstrakcji RNA lub białka.
    Uwaga: Pobrana objętość powinna zależeć od następującego testu i poziomu ekspresji RNA lub białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jako wskazówkę, w przypadku analizy północnej26 należy pobrać 80% próbki, w przypadku Western blot23,27 lub RT-PCR28 należy pobrać 20%, a w przypadku spektrometrii mas29 w celu odkrycia nowych białek należy pobrać całą próbkę.

2. Ekstrakcja RNA

  1. Dodać równą objętość 2x sieciującego buforu odwracalnego i inkubować przez 45 minut w temperaturze 65 °C. Kontynuować bezpośrednio w celu ekstrakcji RNA.
    Uwaga: Bufor odwracający sieciowanie zawiera kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), który znacznie poprawia ekstrakcję RNA20.
  2. Użyć standardowej metody fenol:chloroform26 w celu ekstrakcji RNA z próbek "wejściowych" i "niezwiązanych" (etapy 1.13 i 1.17).
    Uwaga: Próbki te zawierają dużą ilość heparyny, inhibitora RNazy, która może hamować późniejsze testy z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy (RT) (np. RT-PCR), dlatego zaleca się jej usunięcie LiCl precipitation30. Próbki "wash" i "elucion" (kroki 1.21 i 1.24) zawierają niewielkie ilości RNA i są wytrącane w następujących etapach.
  3. Dodać równą objętość 8M guanidynium-HCl (GuHCl) i dwie objętości 100% etanolu do próbek "wash" i "elucion". Inkubować w temperaturze -80 °C przez co najmniej 2 godziny.
    Uwaga: Guanidynium skutecznie denaturuje białka, a tym samym hamuje RNazy i proteazy w próbce.
  4. Odwirować w temperaturze 20 000 x g, 4 °C przez 30 minut i odrzucić supernatant. Umyć granulat zimnym 80% etanolem i ponownie odwirować przy 20 000 x g, 4 °C przez 15 minut.
  5. Rozpuść osad RNA w 400 μl wody wolnej od RNaz i ponownie wytrąc, aby usunąć wszelkie resztki GuHCl lub inne zanieczyszczenia. Dodać 40 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 800 μl 100% etanolu, inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  6. Odwirować i umyć jak w kroku 2.4 i usunąć cały etanol za pomocą końcówki o pojemności 10 μl. Zawiesić osad RNA w 10 μl wody wolnej od RNazy. Zachowaj szczególną ostrożność, ponieważ osadek RNA zwykle nie jest widoczny.
    Uwaga: Próbki można wykorzystać do analizy północnej, jak opisano w23 (rysunek 1).

3. Przygotowanie białka do analizy metodą Western Blot lub spektrometrii mas

  1. Dodać 1/3 objętości 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) do próbek białek i inkubować 45 minut w 65 °C, aby odwrócić sieciowanie RNA i białek.
    Uwaga: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
  2. Uruchom białka na żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE)31. Dostosuj zawartość procentową żelu do wielkości białek, które mają być analizowane.
    Uwaga: 10% żel akrylamidowy daje szeroki zakres separacji i jest dobry jako pierwsze przybliżenie.
  3. Przenieś białka do błony, jak w standardowej analizie immunoblot27 w celu kontroli skuteczności izolacji (ryc. 1C). Zabarwić barwą Coomassie Blue R250 lub srebrem przed analizą spektrometrii mas.
    Uwaga: Srebrna plama jest preferowanym wyborem, ponieważ jest bardziej czuła i umożliwia lepsze wykrywanie (Rysunek 1B). Barwienie można wykonać za pomocą ręcznie przygotowanych roztworów lub zestawów komercyjnych. Czas inkubacji żelu w końcowym roztworze barwnika należy określić doświadczalnie. Długa inkubacja może ujawnić niską obfitość białek, ale może spowodować, że białka o wysokiej ekspresji, takie jak MS2-CP-SBP-GFP, będą nadmiernie wybarwione i mogą maskować otaczające białka w ich pobliżu. Dodatkowo może wystąpić wysokie tło. Uważnie śledź reakcję i dodaj roztwór zatrzymujący w odpowiednim czasie.
  4. Wytnij pasma z żelu i przenieś je do tubek o pojemności 1,5 ml. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C lub wyślij do ekstrakcji białka i trawienia trypsyny, a następnie do analizy LC-MS/MS 32.
  5. Jako alternatywne podejście proteomiczne w celu wykluczenia etapu separacji żelu, trawić eluowany materiał z kroku 1.24 w roztworze przy użyciu trypsyny i poddawać analizie LC-MS/MS33.
    Uwaga: Pominięcie separacji SDS-PAGE upraszcza protokół i zwiększa wydajność. Jednak próbki mogą zawierać śladowe ilości detergentu NP-40, który hamuje analizę spektrometrii mas. Aby rozwiązać ten problem, wykonaj następujące czynności:
    1. Uruchom białko na SDS-PAGE31 przez 10 - 15 minut.
    2. Wytnij całą część pasa (tj. miejsce, w którym znajdują się białka).
      Uwaga: Próbka białka może zawierać znaczną ilość białka MS2-CP-SBP, które może przesłaniać sygnały białek o niskiej obfitości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metoda RaPID umożliwia izolację specyficznego docelowego RNA wraz z powiązanymi z nim białkami. Kluczowym czynnikiem sukcesu jest utrzymanie RNA w jak najmniej zdegradowanym stanie, co pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości białek. W celu określenia wydajności izolacji oraz jakości RNA przeprowadza się analizę northern (Ryc. 1A). Analiza northern ma tę zaletę, że bezpośrednio informuje o wydajności i jakości procesu RaPID. Dzięki temu w jednym przebiegu można określić...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Różne metody wykorzystują izolację określonych mRNA do identyfikacji powiązanych z nimi białek11,34 35. Metody te mają zastosowanie w strategiach in vitro i in vivo do badania interakcji RNA-białko. Metody in vitro inkubują egzogennie transkrybowane RNA z lizatem komórkowym w celu wychwycenia RBP i wyizolowania kompleksów RNP36,37. Niedawno zaprezentowano skuteczne podejście tego typu, które umożliwiło identyfikację nowych białek wiążących regulatorowy motyw RNA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Prof. Jeffowi Gerstowi i Borisowi Slobodinowi za ich pomocne rady w konfiguracji protokołu RaPID i dostarczeniu niezbędnych plazmidów. Dziękujemy również dr Avigail Atir-Lande za pomoc w ustaleniu tego protokołu oraz dr Tamar Ziv z Centrum Proteomiki Smoler za pomoc w analizie LC-MS/MS. Dziękujemy prof. T.G. Kinzy (Rutgers) za przeciwciało YEF3. Prace te były wspierane przez 2011013 grantowe z Binational Science Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TrissigmaT1503
SDSbio-lab1981232300
DTTsigmaD9779
Kwaśny fenol (pH 4,3)sigmaP4682
Kwaśny fenol: Chloroform (5:1, pH 4,3)sigmaP1944
Chloroformbio-lab3080521
FormaldehydFrutarom5551820
GlycinesigmaG7126
NP-40Calbiochem492016
HeparinSigmaH3393
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)SigmaP7626
LeupeptinSigmaL2884
AprotininSigmaA1153
Inhibitor trypsyny sojowejSigmaT9003
PepstatynaSigmaP5318
DNaza IPromegaM610A
Rybonukleaza  InhibitorTakara2313A
Koraliki szklaneSartoriusBBI-8541701średnica 0,4-0,6 mm 
Mini BeadBeaterBioSpecMini BeadBeater 16
GuanidiniumSigmaG4505
AvidinSigmaA9275
Koraliki StreptawidinGE Healthcare 17-5113-01
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7906
Drożdże tRNASigmaR8508
BiotynaSigmaB4501
Ekstrakt drożdżowyBacto288620
peptonBacto211677
GlukozaSigmaG8270
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
0,2 M NaOH
4x Laemmli Bufor do próbek (LSB)0,2 M Tris-HCl pH 6,8, 8% SDS, 0,4 M DTT, 40% glicerol, 0,04% błękit bromofenolowy.
do lizy gorących fenoli10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% SDS 
3 M octan sodu pH 5,2
100% i 70% Etanol
RNaz woda bez
g/ml Leupeptyna, 10 i mikro; g/ml Aprotynina, 10 i mikro; g/ml Inhibitor trypsyny sojowej, 10 &mikro; g/ml Pepstatyna, 20 U/ml DNazy I, 100 U/ml Rybonukleaza  Inhibitor.
2x Sieciowany bufor100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
płuczący RaPID20 mM Tris-HCl pH 7,5,  300 mM NaCl, 0,5% NP-40
0,5 M EDTA pH 8
Zestaw Silver Stain PlusBio-Rad 161-0449Do wykrywania białek w żelach poliakrylamidowych
SD selektywne podłoże 1,7 g/l Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów i siarczanu amonu, 5 g/l Siarczan amonu, 2% glukozy, 350 mg/l Treonina, 40 mg/l Metionina, 40 mg/l adenina, 50 mg/l Lizyna, 50 mg/l Tryptofan, 20 mg/l Histydyna, 80 mg/l Leucyna, 30 mg/l Tyrozyna, 40 mg/l Arginina
Anty-eEF3 (EF3A, YEF3)Prezent od Kinzy TG. (UMDNJ Szkoła Medyczna im. Roberta Wooda Johnsona)1:5,000
Przeciwciało anty GFPSanta Cruzsc-83341:3,000
Przeciwciało anty królicze IgG-HRP sprzężoneSIGMAA91691:10,000
Bufor (EtOH) RaPID bufor do lizy 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl, 0,5% NP-40, 5 mg/ml Heparyna, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), 10 i mikro; odwracalny Bufor

Bibliografia

  1. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255(2008).
  2. Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
  3. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
  4. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
  5. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
  6. Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
  7. Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
  8. Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
  9. Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
  10. Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
  11. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203(2014).
  12. Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  13. SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
  14. Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
  16. Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
  17. Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
  18. Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13(2014).
  19. Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
  20. Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17(2015).
  21. Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
  22. Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
  23. Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
  24. Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
  25. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
  26. Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
  27. Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
  28. Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
  29. Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
  30. Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
  31. Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
  32. Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25(2009).
  33. Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
  34. Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
  35. Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
  36. Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
  37. Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
  38. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
  39. Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
  40. Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
  41. Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14(2004).
  42. Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572(2015).
  43. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
  44. Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
  45. de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

RNA z tagiem MS2kulki z streptawidynprotok sieciowanializy kom rek dro d yizolacja bia ekspektrometria masekstrakcja RNAelucja biotyny
Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.