Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Białka wiążące RNA (RBP) stanowią około 10% białek S. cerevisiae ^1,2 i około 15% białek ssaków^3-5. Są zaangażowane w wiele procesów komórkowych, takich jak przetwarzanie i regulacja potranskrypcyjna mRNA, translacja, biogeneza rybosomów, aminoacylacja i modyfikacja tRNA, przebudowa chromatyny i inne. Ważną podgrupą RBP są białka wiążące mRNA (mRNP)^6,7. W trakcie dojrzewania mRNA różne RBP wiążą transkrypt i pośredniczą w jego przetwarzaniu jądrowym, eksporcie z jądra, lokalizacji komórkowej, translacji i degradacji^6-8. W ten sposób odrębny zestaw RBP związanych z określonym transkryptem w dowolnym punkcie czasowym determinuje jego przetwarzanie i ostatecznie jego los.

Identyfikacja RBP związanych z mRNA może znacznie poprawić nasze zrozumienie procesów leżących u podstaw ich regulacji potranskrypcyjnej. Do identyfikacji białek zaangażowanych w regulację mRNA wykorzystano różne metody genetyczne, mikroskopowe, biochemiczne i bioinformatyczne (przegląd w^9-11). Jednak tylko kilka z tych metod umożliwia identyfikację białek związanych z konkretnym docelowym mRNA. Na uwagę zasługuje system hybrydowy Yeast Three (Y3H), który wykorzystuje mRNA jako przynętę do badania przesiewowego biblioteki ekspresji w komórkach drożdży. Dodatnie klony są zwykle obserwowane poprzez selekcję wzrostu lub ekspresję reporterową^12-14. Kluczową zaletą tej metody jest duża liczba białek, które mogą być skanowane w środowisku komórkowym oraz możliwość pomiaru siły oddziaływania RNA-białko. Wady obejmują stosunkowo dużą liczbę wyników fałszywie dodatnich spowodowanych niespecyficznym wiązaniem oraz wysoki potencjał wyników fałszywie ujemnych, częściowo spowodowany nieprawidłowym fałdowaniem ofiary z białka fuzyjnego lub RNA przynęty.

Alternatywą dla podejścia genetycznego jest oczyszczanie RNA z powiązanymi z nim białkami. MRNA zawierające poliA można wyizolować za pomocą kolumn oligo dT, a związane z nimi białka są wykrywane za pomocą spektrometrii mas. Interakcja RNA-białko jest zachowana w kontekście komórkowym przez sieciowanie, które tworzy wiązania kowalencyjne krótkiego zasięgu. Zastosowanie kolumny oligo dT daje globalny obraz całego proteomu, który jest związany z dowolnym mRNA^3,5,15 zawierającym poli A. Nie zapewnia to jednak listy białek, które są związane z konkretnym mRNA. Dostępnych jest bardzo niewiele metod umożliwiających dokonanie takiej identyfikacji. Metoda PAIR polega na transfekcji kwasu nukleinowego z komplementarnością do docelowego mRNA^16,17. Kwas nukleinowy jest również przyłączony do peptydu, co umożliwia sieciowanie z RBP w bliskim sąsiedztwie miejsca interakcji. Po usieciowaniu kwas nukleinowy peptydowy RBP można wyizolować i poddać analizie proteomicznej. Niedawno z powodzeniem zastosowano metodologię opartą na aptamie do ekstraktów z linii komórkowych ssaków¹⁸. Opracowano aptamer RNA o zwiększonym powinowactwie do streptawidyny i połączono go z interesującą sekwencją (w tym przypadku pierwiastkiem bogatym w AU (ARE)). RNA aptamer-ARE przyłączono do kulek streptawidyny i zmieszano z lizatem komórkowym. Białka związane z sekwencją ARE oczyszczono i zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas (MS). Chociaż metoda ta wykryła asocjacje zachodzące poza ustawieniami komórkowymi (tj. in vitro), prawdopodobnie zostanie zmodyfikowana w przyszłości tak, aby wprowadzić aptamery do genomu, a tym samym umożliwić izolację białek związanych z mRNA w środowisku komórkowym (tj. in vivo). W przypadku drożdży, w przypadku których manipulacje genetyczne są dobrze ugruntowane, metoda RaPID (opracowana w laboratorium prof. Jeffa Gersta) daje wgląd w powiązania in vivo ¹⁹. RaPID łączy w sobie specyficzne i silne wiązanie białka płaszcza MS2 (MS2-CP) z sekwencją RNA MS2 oraz domeny wiążącej streptawidynę (SBP) z kulkami sprzężonymi ze streptawidyną. Umożliwia to skuteczne oczyszczanie mRNA znakowanych MS2 za pomocą kulek streptawidyny. Co więcej, ekspresja 12 kopii pętli MS2 pozwala na jednoczesne wiązanie się do sześciu MS2-CP z RNA i zwiększanie skuteczności jego izolacji. W związku z tym zaproponowano ten protokół, aby umożliwić identyfikację nowych białek związanych z mRNA po poddaniu eluowanych próbek analizie proteomicznej za pomocą spektrometrii mas.

Niedawno wykorzystaliśmy RaPID do identyfikacji nowych białek związanych z drożdżowym mRNA PMP1 ²⁰. Wcześniej wykazano, że mRNA PMP1 jest związane z błoną ER, a jego nieulegający translacji region 3' (UTR) okazał się głównym wyznacznikiem tego związku²¹. W związku z tym RBP, które wiążą PMP1 3' UTR, prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w jego lokalizacji. RaPID, a następnie chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas/spektrometrią mas (LC-MS/MS) doprowadziły do identyfikacji wielu nowych białek, które oddziałują z PMP1²⁰. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół metodologii RaPID, ważne kontrole, które należy wykonać, oraz wskazówki techniczne, które mogą poprawić wydajność i swoistość.

Uwaga: Wstaw sekwencję składającą się z 12 miejsc wiążących MS2 (pętle MS2; MS2L) do pożądanego locus genomowego, zwykle między otwartą ramką odczytu (ORF) a 3' UTR. Szczegółowy protokół tej integracji znajduje się w innym miejscu²². Sprawdzić prawidłowe wprowadzenie i ekspresję za pomocą PCR, analizy północnej lub RT-PCR^20,23. Ważne jest, aby sprawdzić, czy integracja nie ingerowała w syntezę 3'UTR. Ponadto do komórek należy również wprowadzić MS2-CP z ekspresją plazmidu połączonego z SBP pod wpływem ekspresji indukowalnego promotora (zubożenie metioniny)²⁴. Identyczny szczep, z wyłączeniem wprowadzonych pętli MS12, powinien być używany jako kontrola do wykrywania sygnałów niespecyficznych.

1. Oczyszczanie RaPID

1. Wyhoduj 500 ml komórek drożdży (użyj 250-1,000 ml komórek drożdży w zależności od poziomu ekspresji interesującego genu) eksprymujących mRNA²⁰ znakowane MS2 i białko fuzyjne MS2-CP-GFP-SBP²⁴ do OD₆₀₀ 0,8 - 1,0 w temperaturze 30 ^oC w odpowiednim pożywce wzrostowej (np. Pożywka selektywna syntetycznej dekstrozy (SD)).
2. Odwirować komórki przy 3 000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
3. Umyć komórki w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), odwirować jak poprzednio (krok 1.2), ponownie zawiesić w równej objętości (krok 1.1) SD bez metioniny i inkubować przez 45 - 60 minut w temperaturze 30 ^oC w celu wywołania ekspresji białka fuzyjnego MS2-CP-GFP-SBP.
   Uwaga: Dłuższy czas indukcji może spowodować agregację GFP.
4. Odłożyć na bok 10 ml komórek i wyekstrahować RNA z tej próbki przy użyciu prostej metody "gorącego fenolu"²⁵. Uwaga: Fenol jest wysoce toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa.
   Uwaga: Ten RNA jest dobrym odniesieniem dla jakości izolowanego RNA (Figura 1A).
5. W przypadku komórek o objętości 500 ml dodaj 1,35 ml 37% formaldehydu do końcowego stężenia 0,1%, aby usieciować kompleksy RNA-białko. Kontynuować inkubację w temperaturze 30 ^oC przez 10 minut. Uwaga: Formaldehyd jest wysoce toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa.
6. Dodać 26,5 ml 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 0,125 M i inkubować przez 3 minuty, aby zatrzymać sieciowanie. Od tego kroku umieść wszystko na lodzie, aby zminimalizować degradację RNA.
7. Odwirować komórki w temperaturze 3.000 x g przez 4 minuty w temperaturze 4^oC i przemyć 45 ml zimnego 1x PBS.
8. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy RaPID na 100 ml początkowej hodowli komórkowej.
9. Podzielić na porcje po 500 μl w zakręcanych probówkach do mikrofuge i dodać ~ 400 mg schłodzonych szklanych kulek do każdej podwielokrotności (około 0,2 ml probówki PCR).
10. Lizuj komórki w ubijaku do kulek przez 3 minuty. Natychmiast umieść lizat na lodzie.
    Uwaga: Liza komórek uwalnia komórkowe RNazy, które są główną przyczyną degradacji RNA. Bufor RaPID Lysis zawiera wysokie stężenie inhibitorów RNazy, takich jak niespecyficzny inhibitor RNazy heparyna i swoiste inhibitory. Zalecana jest również szybka praca i utrzymywanie wszystkiego w niskiej temperaturze.
11. Przenieś lizat do nowych probówek. Przebij mały otwór w dnie każdej probówki do mikrofuge gorącą igłą (0,8 mm x 40 mm) i umieść probówki do mikrofuge na wierzchu probówek o pojemności 15 ml. Użyj główki strzykawki o pojemności 5 ml jako łącznika między probówkami do mikrofug a probówkami o pojemności 15 ml. Odwirować zespół probówek o masie 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 ^oC.
12. Przenieść przepływ z probówki o pojemności 15 ml do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 ^oC w celu usunięcia resztek komórek.
13. Zebrać supernatanty ze wszystkich probówek o pojemności 1,5 ml w jednej probówce o pojemności 15 ml i odłożyć 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka.
    Uwaga: Będą one służyć jako próbki wejściowe do późniejszej analizy (rysunek 1).
14. Dodać 300 μg awidyny na 500 ml początkowej kultury drożdży i inkubować przez 30 minut (można to skrócić do 10 minut) w temperaturze 4 ^oC przy stałym walcowaniu (10 obr./min).
    Uwaga: Awidyna blokuje wiązanie biotyny i biotynylowanych białek z kulkami streptawidyny.
15. Wstępnie umyj kulki streptawidyny przed inkubacją z lizatem komórkowym.
    1. Przenieść około 300 μl zawiesiny kulek streptawidyny do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i usunąć górny supernatant. W ten sposób uzyskasz 250 μl kulek. Umyj kulki dwukrotnie 1 ml buforu do lizy RaPID. Odwirować kulki streptawidyny w temperaturze 660 x g przez 2 minuty w temperaturze 4^otemperaturze C między każdym etapem.
    2. Zablokuj kulki przez inkubację przez 1 godzinę z 0,5 ml buforu do lizy RaPID, 0,5 ml 10 mg/ml BSA i 10 μl 10 mg/ml tRNA drożdży. Koraliki można pozostawić O/N w roztworze blokującym w temperaturze 4^oC z obrotem, jeśli to konieczne.
    3. Przemyć dwukrotnie 1 ml buforu RaPID Lysis.
       Uwaga: Koraliki magnetyczne mogą być również używane do skrócenia czasu i tła. Te jednak mają mniejszą pojemność niż koraliki sefarozy.
16. Dodać 250 μl wstępnie umytych kulek streptawidyny do lizatu zawierającego awidynę (od kroku 1.14) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją (10 obr./min).
    Uwaga: Ten czas inkubacji jest kompromisem między zapewnieniem wystarczającego czasu wiązania a zminimalizowaniem szans na degradację RNA.
17. Wirować przy 660 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 ^otemperaturze C w celu usunięcia kulek streptawidyny i przeniesienia supernatantu do nowej probówki o pojemności 15 ml. Odłożyć na bok 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka.
    Uwaga: Będą to próbki "niepowiązane".
18. Umyj kulki 1 ml buforu do lizy RaPID, delikatnie wstrząśnij, przenieś do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj jak w kroku 1.17. Powtórz ten krok trzy razy.
19. Umyj koraliki 1 ml buforu RaPID Wash i tym razem obracaj (10 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórz ten krok dwukrotnie.
20. Umyj koraliki 1 ml 1x PBS i odwiruj jak powyżej.
21. Ponownie umyj koraliki 120 μl 1x PBS. Odwirować jak powyżej i pobrać cały supernatant do ekstrakcji RNA i białka jako próbkę "Wash".
    Uwaga: Ta ostatnia próbka do płukania będzie wskazywać na rygorystyczność płukania i powinna mieć taką samą objętość jak próbka wymująca. Uprości to przetwarzanie i załadunek w kolejnych testach.
22. Aby wymyć RNA i białka związane z RNA z kolumny, dodaj 120 μl 6 mM biotyny w 1x PBS i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją (10 obr./min).
23. Odwirować kulki jak powyżej i przenieść eluowany materiał do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Ponownie odwirować eluowaną próbkę i przenieść górną fazę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, aby upewnić się, że nie ma przenoszenia kulek.
24. Pobieranie próbek do ekstrakcji RNA lub białka.
    Uwaga: Pobrana objętość powinna zależeć od następującego testu i poziomu ekspresji RNA lub białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jako wskazówkę, w przypadku analizy północnej²⁶ należy pobrać 80% próbki, w przypadku Western blot^23,27 lub RT-PCR²⁸ należy pobrać 20%, a w przypadku spektrometrii mas²⁹ w celu odkrycia nowych białek należy pobrać całą próbkę.

2. Ekstrakcja RNA

1. Dodać równą objętość 2x sieciującego buforu odwracalnego i inkubować przez 45 minut w temperaturze 65 °C. Kontynuować bezpośrednio w celu ekstrakcji RNA.
   Uwaga: Bufor odwracający sieciowanie zawiera kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), który znacznie poprawia ekstrakcję RNA²⁰.
2. Użyć standardowej metody fenol:chloroform²⁶ w celu ekstrakcji RNA z próbek "wejściowych" i "niezwiązanych" (etapy 1.13 i 1.17).
   Uwaga: Próbki te zawierają dużą ilość heparyny, inhibitora RNazy, która może hamować późniejsze testy z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy (RT) (np. RT-PCR), dlatego zaleca się jej usunięcie LiCl precipitation³⁰. Próbki "wash" i "elucion" (kroki 1.21 i 1.24) zawierają niewielkie ilości RNA i są wytrącane w następujących etapach.
3. Dodać równą objętość 8M guanidynium-HCl (GuHCl) i dwie objętości 100% etanolu do próbek "wash" i "elucion". Inkubować w temperaturze -80 °C przez co najmniej 2 godziny.
   Uwaga: Guanidynium skutecznie denaturuje białka, a tym samym hamuje RNazy i proteazy w próbce.
4. Odwirować w temperaturze 20 000 x g, 4 °C przez 30 minut i odrzucić supernatant. Umyć granulat zimnym 80% etanolem i ponownie odwirować przy 20 000 x g, 4 °C przez 15 minut.
5. Rozpuść osad RNA w 400 μl wody wolnej od RNaz i ponownie wytrąc, aby usunąć wszelkie resztki GuHCl lub inne zanieczyszczenia. Dodać 40 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 800 μl 100% etanolu, inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
6. Odwirować i umyć jak w kroku 2.4 i usunąć cały etanol za pomocą końcówki o pojemności 10 μl. Zawiesić osad RNA w 10 μl wody wolnej od RNazy. Zachowaj szczególną ostrożność, ponieważ osadek RNA zwykle nie jest widoczny.
   Uwaga: Próbki można wykorzystać do analizy północnej, jak opisano w²³ (rysunek 1).

3. Przygotowanie białka do analizy metodą Western Blot lub spektrometrii mas

1. Dodać 1/3 objętości 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) do próbek białek i inkubować 45 minut w 65 °C, aby odwrócić sieciowanie RNA i białek.
   Uwaga: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
2. Uruchom białka na żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE)³¹. Dostosuj zawartość procentową żelu do wielkości białek, które mają być analizowane.
   Uwaga: 10% żel akrylamidowy daje szeroki zakres separacji i jest dobry jako pierwsze przybliżenie.
3. Przenieś białka do błony, jak w standardowej analizie immunoblot²⁷ w celu kontroli skuteczności izolacji (ryc. 1C). Zabarwić barwą Coomassie Blue R250 lub srebrem przed analizą spektrometrii mas.
   Uwaga: Srebrna plama jest preferowanym wyborem, ponieważ jest bardziej czuła i umożliwia lepsze wykrywanie (Rysunek 1B). Barwienie można wykonać za pomocą ręcznie przygotowanych roztworów lub zestawów komercyjnych. Czas inkubacji żelu w końcowym roztworze barwnika należy określić doświadczalnie. Długa inkubacja może ujawnić niską obfitość białek, ale może spowodować, że białka o wysokiej ekspresji, takie jak MS2-CP-SBP-GFP, będą nadmiernie wybarwione i mogą maskować otaczające białka w ich pobliżu. Dodatkowo może wystąpić wysokie tło. Uważnie śledź reakcję i dodaj roztwór zatrzymujący w odpowiednim czasie.
4. Wytnij pasma z żelu i przenieś je do tubek o pojemności 1,5 ml. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C lub wyślij do ekstrakcji białka i trawienia trypsyny, a następnie do analizy LC-MS/^{MS 32}.
5. Jako alternatywne podejście proteomiczne w celu wykluczenia etapu separacji żelu, trawić eluowany materiał z kroku 1.24 w roztworze przy użyciu trypsyny i poddawać analizie LC-MS/MS³³.
   Uwaga: Pominięcie separacji SDS-PAGE upraszcza protokół i zwiększa wydajność. Jednak próbki mogą zawierać śladowe ilości detergentu NP-40, który hamuje analizę spektrometrii mas. Aby rozwiązać ten problem, wykonaj następujące czynności:
   1. Uruchom białko na SDS-PAGE³¹ przez 10 - 15 minut.
   2. Wytnij całą część pasa (tj. miejsce, w którym znajdują się białka).
      Uwaga: Próbka białka może zawierać znaczną ilość białka MS2-CP-SBP, które może przesłaniać sygnały białek o niskiej obfitości.

RaPID umożliwia izolację określonego docelowego RNA wraz z powiązanymi z nim białkami. Kluczowe znaczenie dla jego sukcesu ma utrzymanie RNA w stanie nienaruszonym w jak największym stopniu, a tym samym uzyskanie wystarczającej ilości białek. Aby określić skuteczność izolacji i jakość RNA, przeprowadza się analizę północną (ryc. 1A). Analiza Northern ma tę zaletę, że bezpośrednio raportuje wydajność i jakość RaPID. W ten sposób można określić względne ilości produktów pełnej długości i degradacji w jednym przebiegu. Rybosomalne RNA (rRNA) są łatwo wykrywane w barwieniu bromkiem etydyny, a brak rRNA w próbce elucyjnej wskazuje na rygorystyczność oczyszczania. O rygorystyczności i swoistości oczyszczania świadczy ponadto brak sygnału nieznakowanego mRNA w próbkach elucyjnych (dolny panel ACT1). Sygnał pozorny na torze FPR1, który nie jest wielkości ACT1, jest pozostałością po poprzedniej hybrydyzacji z sondą MS2L. Analiza północna ujawnia również, że wejściowy RNA jest nieco bardziej zdegradowany w porównaniu z RNA, które zostało oczyszczone przez protokół gorącego fenolu (panel sondy ACT1 c/o). Przypisuje się to dłuższemu i bardziej skomplikowanemu protokołowi RaPID. Niemniej jednak znaczna ilość pełnowymiarowego, znakowanego RNA jest izolowana specyficznie, co ujawnia silny sygnał we frakcji elucyjnej (sonda MS2L).

Próbki białek mogą być badane na SDS-PAGE i barwione srebrnym barwnikiem przed analizą proteomiczną (Rysunek 1B). Próbka wyizolowana z kontrolnych, nieoznakowanych komórek (-MS2L) jest pomocna w odróżnianiu asocjacji niespecyficznych od zależnych od RNA. Dlatego tylko prążki, które są silniejsze w oznakowanej próbce (+MS2L) są wycinane z żelu i pobierane do LC-MS/MS. Zaleca się również zachodnią analizę z ogólnymi RBP, aby wskazać skuteczność kooczyszczania białek (Figura 1C). W tym przypadku użyliśmy Yef3, o którym wiadomo, że wchodzi w interakcje z PMP120 lub GFP, co wskazuje na ogólną skuteczność i specyficzność izolacji. Co ciekawe, skuteczność izolacji Yef3 wydaje się różnić między PMP1 a FPR1 i jest znacznie niższa w porównaniu z GFP.

Rysunek 1. Specyficzna izolacja RNA znakowanych MS2L i identyfikacja powiązanych białek. Przedstawiono wyniki dwóch różnych RNA, które poddano działaniu RaPID (PMP1 i FPR1). (A) Analiza Northern blot próbek RNA oczyszczonych z eksperymentu RaPID. RNA prowadzono na żelu agarozowym i barwiono bromkiem etydyny (górny panel). Żel osuszono do membrany nylonowej i poddano hybrydyzacji ze wskazanymi sondami (dolnymi panelami). Analizowane próbki to: szybka liza komórek (gorący fenol [krok 1.4]), liza komórek RaPID (wejście [krok 1.13]) oraz po elucji biotyną (elucja [krok 1.24]). (B) Srebrne barwienie białek z RaPID z komórkami znakowanymi i nieznakowanymi MS2. Próbki białek z frakcji elucyjnych PMP1 znakowanej MS2 (+MS2L) lub nieznakowanej (-MS2L) kontroli przeprowadzono w SDS-PAGE i wybarwiono srebrem. Pasma o różnej intensywności (oznaczone gwiazdkami) wycięto z żelu i oznaczono za pomocą analizy spektrometrii mas. Strzałka wskazuje białko fuzyjne MS2-CP-GFP-SBP, które wykazuje równe obciążenie białka. Nieistotne aleje zostały wycięte dla przejrzystości. (C) Zachodnia analiza kontroli pozytywnych. Przeprowadzono Western blot z przeciwciałami rozpoznającymi ugrupowanie Yef3 lub GFP białka fuzyjnego MS2-CP. Nieistotne aleje zostały wycięte dla przejrzystości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.