"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Fagocytoza to główna funkcja komórki, która zaczyna się od rozpoznania i związania materiału z receptorami powierzchniowymi, co następnie prowadzi do internalizacji i degradacji spożytego materiału. Podczas gdy jednokomórkowe eukarionty, takie jak pleśń Dictyostelium discoideum i ameby, wykorzystują fagocytozę do odżywiania się bakteriami, organizmy wyższe wyewoluowały z komórkami profesjonalnymi. Makrofagi lub komórki dendrytyczne są pierwszą linią obrony przed patogenami w różnych tkankach i narządach i mają kluczowe znaczenie dla aktywacji adaptacyjnego układu odpornościowego poprzez prezentację antygenu i produkcję cytokin ^1-4. W pewnych okolicznościach fagocytoza może być wykonywana przez nieprofesjonalne komórki fagocytarne, np. komórki śródbłonka i nabłonka. Proces ten jest ważny dla utrzymania homeostazy podczas rozwoju i w wieku dorosłym dla prawidłowego obrotu i przebudowy tkanek. Wreszcie, wyspecjalizowane fagocyty, takie jak komórki Sertoliego w jądrze lub komórki nabłonka barwnikowego siatkówki, są niezwykle silnymi fagocytami ⁵.

Tworzenie fagosomu, w którym następuje degradacja mikroorganizmów lub szczątków komórkowych, rozpoczyna się od zgrupowania receptorów fagocytarnych na powierzchni komórki fagocytarnej. Zdarzenia sygnalizacyjne następujące po grupowaniu receptorów opsonicznych, takich jak receptory Fc (FcR) lub receptory dopełniacza (CR), zostały dobrze scharakteryzowane. Istnieje jednak również wiele receptorów nieopsonicznych, w tym receptory Toll-podobne (TLR), lektyny, receptory mannozy i receptory padlinożerców. Receptory te rozpoznają determinanty na powierzchni cząstek, takie jak reszty mannozy lub fukozy, fosfatydyloseryna i lipopolisacharydy ^1,6-9.

Rozpoznawanie patogenów lub szczątków komórkowych polega na wiązaniu i grupowaniu kilku typów receptorów fagocytarnych, co następnie prowadzi do intensywnej i przejściowej przebudowy aktyny. Równolegle ogniskowa egzocytoza przedziałów wewnątrzkomórkowych przyczynia się do uwolnienia napięcia błonowego i jest ważna dla efektywnej fagocytozy dużych cząstek. Zdarzenia sygnalizacyjne prowadzące do polimeryzacji aktyny i deformacji błony zostały przeanalizowane w modelach eksperymentalnych, które wyzwalały pojedynczy receptor fagocytarny. Podczas fagocytozy za pośrednictwem FcR zachodzi intensywna polimeryzacja aktyny, która jest regulowana przez małe GTPazy (Rac, Cdc42). Białko zespołu Wiskotta-Aldricha (WASP) prowadzi do aktywacji kompleksu 2/3 białka związanego z aktyną (Arp2/3), który zarodkuje włókna aktynowe ^1,2,4,10. Lokalna produkcja fosfatydyloinozytolu-4, 5-bisfosforanu (PI(4,5)P₂) ma kluczowe znaczenie dla początkowej polimeryzacji aktyny, która napędza tworzenie pseudopodów. Jego konwersja do PI(3,4,5)P₃ jest wymagana do wydłużenia pseudopoda i zamknięcia fagosomu ¹¹. Do zaniku PI(4,5)P₂ przyczynia się kilka szlaków. Po pierwsze, oderwanie kinaz fosforanowych fosfatydyloinozytolu () od fagosomu zatrzymuje syntezę PI(4,5)P₂. Po drugie, może być fosforylowany i zużywany przez kinazy PI3K klasy I (PI3K) i przekształcany w PI(3,4,5)P₃ ¹². Rola fosfataz i fosfolipaz została również zasugerowana w hydrolizie PI(4,5)P₂ i usuwaniu F-aktyny podczas fagocytozy w komórkach ssaków i w Dictyostelium^13,14. Fosfolipaza C (PLC)δ hydrolizuje PI(4,5)_P2 do diacyloglicerolu i inozytolo-1,4,5-trifosforanu. Fosfataza PI(4,5)P₂ i PI(3,4,5)P₃ OCRL (zespół oczno-mózgowo-nerkowy Lowe'a) jest również zaangażowana w tworzenie fagosomów. Precyzyjne miejscowe tworzenie F-aktyny i jej depolimeryzacja jest ściśle regulowana w czasie i przestrzeni, a my wykazaliśmy, że rekrutacja przedziałów wewnątrzkomórkowych jest ważna dla lokalnego dostarczania fosfatazy OCRL, przyczyniając się w ten sposób do lokalnej depolimeryzacji aktyny u podstawy miseczki fagocytarnej ^13,15. W tym celu użyliśmy opisanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej.

Mechanizm i czynniki molekularne niezbędne do zamknięcia fagosomu i rozszczepienia błony pozostają słabo zdefiniowane z powodu trudności w wizualizacji i monitorowaniu miejsca zamknięcia fagosomu. Do niedawna fagocytozę obserwowano na stałych lub żywych komórkach, które internalizują cząstki na swojej powierzchni grzbietowej lub po bokach, co utrudnia terminową wizualizację miejsca zamknięcia fagosomu. Ponadto metody mocowania mogą powodować cofanie się błon i zniekształcać wyniki dotyczące wydłużania i zamykania pseudopodiów. W przeciwieństwie do tego, test, który skonfigurowaliśmy i opisaliśmy tutaj, pozwala nam uwidocznić wydłużenie pseudopoda i etap zamykania fagocytozy w żywych komórkach ¹³, w oparciu o całkowitą mikroskopię wewnętrznego odbicia (TIRFM) ¹⁶. Ta technika optyczna wykorzystuje falę ulotną do wzbudzenia fluoroforów w cienkim obszarze na granicy między przezroczystym ciałem stałym (szkiełko nakrywkowe) a cieczą (pożywką do hodowli komórkowych). Grubość głębokości wzbudzenia wynosi około 100 nm od powierzchni ciała stałego, co pozwala na wizualizację zdarzeń molekularnych w pobliżu błony plazmatycznej. TIRFM pozwala na wysoki stosunek sygnału do tła i ogranicza zebraną fluorescencję nieostrą oraz cytotoksyczność spowodowaną oświetleniem komórek.

Korzystając z TIRFM, opracowaliśmy "test zamykania fagosomu", w którym szkiełka nakrywkowe są aktywowane polilizyną, a następnie pokrywane IgG-opsonizowanymi czerwonymi krwinkami (IgG-SRBC). Makrofagi wykazujące ekspresję przejściowo znakowanych fluorescencyjnie białek będących przedmiotem zainteresowania mogą następnie pochłonąć IgG-SRBC. Podczas gdy komórki odrywają cząstki docelowe, które są niekowalencyjnie związane z powierzchnią szkła, końcówki pseudopodów można obserwować i rejestrować w trybie TIRF. Akwizycje TIRF łączy się z akwizycjami w trybie epifluorescencji, po przesunięciu stopnia o 3 μm powyżej, co pozwala na wizualizację podstawy miseczki fagocytarnej. Możliwe jest również dodanie leków farmakologicznych, takich jak leki hamujące aktynę lub dynaminę podczas procesu, w celu dalszej analizy procesu na poziomie molekularnym.

Protokół opisany tutaj szczegółowo dotyczy mysiej linii komórkowej makrofagów RAW264.7 i opsonizowanych cząstek, ale praktycznie można go dostosować do dowolnej innej komórki fagocytarnej i z innymi celami, takimi jak koraliki. Metoda ta pozwoli na lepsze scharakteryzowanie regulacji w czasie i przestrzeni graczy molekularnych zaangażowanych w wydłużanie pseudopodów i zamykanie fagosomów podczas różnych procesów fagocytarnych.

Uwaga: Plazmid użyty Lifeact-mCherry jest miłym darem od dr Guillaume'a Montagnaca z Instytutu Curie w Paryżu, wygenerowanym po ¹⁷ roku.

1. Komórki i transfekcja

Uwaga: Makrofagi RAW264.7 są hodowane do subkonfluencji w kompletnym pożywce (pożywka RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy i 10% FCS (surowica cielęca płodu)) na płytce o średnicy 100 mm. Są one transfekowane plazmidami kodującymi fluorescencyjnie znakowane białka za pomocą elektroporacji. Rutynowo około 5 - 6 x 10⁶ komórek jest transfekowanych 20 μg lub 10 μg plazmidu odpowiednio dla każdej transfekcji lub kotransfekcji. Należy pamiętać, że inne metody transfekcji oparte na elektroporacji lub lipofekcji mogą być stosowane jako alternatywne podejścia.

1. Zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek i ponownie zawiesić je w 10 ml pożywki hodowlanej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
2. Odwirować zawiesinę komórek 300 x g, 5 min przy RT w wirniku o kącie wychylnym.
3. Rozgrzać 10 ml kompletnego podłoża uzupełnionego 10 μg/ml gentamycyny w temperaturze 37 °C.
4. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml "buforu płuczącego A" z zestawu do elektroporacji.
5. Zawiesinę komórek odwirować 300 x g, 5 min w temperaturze pokojowej w wirniku o kącie wychylnym.
6. W międzyczasie przygotuj mieszankę DNA w temperaturze pokojowej: 120 μl 2x bufor B, 20 μg plazmidowego DNA kodującego interesujące nas białko, q.s.p. 240 μl H₂O.
7. Po odwirowaniu wyrzucić cały supernatant.
8. Ponownie zawiesić osad komórkowy w mieszance DNA i przenieść do kuwet do elektroporacji o średnicy 4 mm.
9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
10. Elektroporacja przy 250 V, 900 μF.
11. Natychmiast ponownie zawiesić komórki w podgrzanym (37 °C) kompletnym podłożu uzupełnionym gentamycyną i umieścić je w naczyniu o średnicy 100 mm.
12. Inkubować transfekowane komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
13. Następnego ranka zastąp całe podłoże 10 ml pożywki mikroskopowej bez surowicy (RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy).

2. Opsonizacja czerwonych krwinek

Uwaga: Jako model docelowych cząstek dla makrofagów stosuje się owcze krwinki czerwone (SRBC). Zwykle stosuje się około 7 x 10⁶ SRBC na naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.

1. Przepłukać SRBC 100 μl 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)/0,1% BSA (albumina surowicy bydlęcej) i odwirować (600 x g, 4 min).
2. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić SRBC w 100 μl 1x PBS/0,1% BSA i odwirować (600 x g, 4 min).
3. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić SRBC w 1x PBS/0,1% BSA z króliczymi IgG anty-SRBC w stężeniu subaglutynacyjnym. Użyć 500 μl roztworu zawierającego przeciwciała/5 μl SRBCs.
   Uwaga: Stężenie subaglutynacyjne przeciwciał odpowiada najniższemu stężeniu, które nie wywołało aglutynacji wykrytej jako tworzenie sieci. Ogólnie rzecz biorąc, stężenie subaglutynacyjne wynosi 8,2 μg/ml.
   1. Określić stężenie IgG anty-SRBC wymagane do opsonizacji SRBC za pomocą testu hemaglutynacji. Stopniowo rozcieńczyć IgG anty-SRBC (zapas w stężeniu 13,1 mg/ml) w proporcjach 1/50 - 1/25 600 na mikropłytce. Dodaj 2 x 10⁶ SRBC do każdej studzienki. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut z powolną rotacją.
5. Po dwóch płukaniach w 1x PBS/0,1% BSA, jak opisano powyżej, ponownie zawiesić IgG-opsonizowane SRBC (IgG-SRBCs) we wstępnie podgrzanym pożywce mikroskopowej bez surowicy (2 ml / naczynie).

3. Powłoka polilizynowa szkiełek nakrywkowych

1. W międzyczasie potraktuj naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm 2 ml 0,01% poli-L-lizyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
2. Umyj naczynia dwa razy 2 ml 1x PBS.

4. Niekowalencyjne utrwalanie SRBC na naczyniach ze szklanym dnem

1. Wlać 2 ml zawiesiny SRBC na szklane naczynie o dnie 35 mm.
2. Wirować z wirnikiem wahliwym o sile 500 x g przez 2 minuty na naczyniach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
3. Usunąć sklarowany osad i przemyć go raz 2 ml 1x PBS/10% BSA.
4. Inkubować cząstki przez 30 minut z 2 ml 1x PBS/10% BSA na naczynie.
5. Umyj naczynia trzy razy 2 ml 1x PBS.
6. Zastąp 1x PBS 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża mikroskopowego bez surowicy.

5. Fagocytoza wizualizowana przez TIRFM

1. Mikroskop
   Uwaga: TIRFM przeprowadzono przy użyciu mikroskopu wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy w oleju (N 100X, NA1.49), komorę grzewczą z CO₂ oraz dwie kamery do wykrywania pojedynczych fotonów EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) sprzężone z soczewką 1,5X.
   1. Dzień przed sesją mikroskopową TIRF włączyć komorę grzewczą na 37 ºC, aby umożliwić jednorodne podgrzanie stolika mikroskopowego.
2. Wyznaczanie kąta krytycznego
   Uwaga: Oprogramowanie ImageJ Color Profiler służy do przetwarzania strumieni obrazów TIRF.
   1. Umieścić pod mikroskopem naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierające opsonizowane SRBC z pożywką mikroskopową bez surowicy.
   2. Zeskrobać komórki i ponownie zawiesić je w pożywce przed dodaniem ich (100 - 500 μl) do naczynia.
   3. Użyj oprogramowania "Live Acquisition" do sterowania mikroskopem i przeprowadzenia wzbudzenia za pomocą lasera 491 nm i/lub 561 nm w celu identyfikacji komórek wykazujących ekspresję fluorescencyjnie znakowanych białek.
   4. Zidentyfikuj komórkę, która wyraża fluorescencyjnie znakowane białka.
   5. Umieść go na środku pola i uzyskaj 500 obrazów na jednej długości fali wzbudzenia, pod różnymi kątami od 0º do 5º, z krokiem 0,01º (rysunek 2A). Kąty są automatycznie zmieniane przez system mikroskopu.
   6. Określ kąt krytyczny, aby padające światło zostało całkowicie odbite na granicy szkła / medium i wygeneruj falę ulotną. Za pomocą oprogramowania ImageJ Color Profiler otwórz sekwencję obrazów, klikając "Plik", "Otwórz" i wybierz plik.
   7. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) za pomocą prostokątnego narzędzia w komórce o jednolitej fluorescencji (Rysunek 2B żółty 1).
   8. Wykreśl "Profil osi Z" średnią intensywność fluorescencji mierzoną w ROI z funkcją kątów na osi x, klikając zakładkę "Obraz", "Stosy" w menu rozwijanym i "Wykres profilu osi Z" (rysunek 2B czerwony 2).
      Uwaga: Kąt krytyczny to kąt prowadzący do maksymalnej fluorescencji przed gwałtownym spadkiem fluorescencji.
   9. Użyj dowolnej wartości kąta na osi x większej niż kąt krytyczny podczas sesji mikroskopowej, aby uzyskać sygnał TIRF, jak w przykładzie 2.00 (Rysunek 2C).
3. Przejęcia
   1. Korzystając z oprogramowania Live Acquisition, ustaw parametry akwizycji za pomocą modułu "Edytor protokołów" (Rysunek 3A).
      1. Stwórz protokół z "pętlą" obejmującą akwizycję "Multi Channels" w celu uzyskania sygnału fluorescencyjnego z białek będących przedmiotem zainteresowania w regionie TIRF. Wprowadź kąt TIRF (na przykład 2,00), czas naświetlania (na przykład 50 ms) i intensywność lasera (na przykład 50%) (Rysunek 3B 1).
      2. Wprowadź ruch "Z" celu 3 μm powyżej obszaru TIRF, aby uzyskać akwizycję sygnału w epifluorescencji za pomocą narzędzia "Multi Channels". Wprowadź kąt poniżej kąta krytycznego (jak w przykładzie 1.00), czasu naświetlania (50 ms) i natężenia lasera (50%) (rysunek 3B, 2 i 3).
      3. Następnie dodaj ruch "z" celu 3 μm poniżej, aby powrócić do obszaru TIRF (Rysunek 3B 4). Dodaj "migawkę" ogniwa w jasnym świetle LED (dioda elektroluminescencyjna) (Rysunek 3B 5).
   2. Znajdź interesującą komórkę o umiarkowanym poziomie fluorescencyjnie znakowanej ekspresji białka, która inicjuje fagocytozę SRBC poprzez rozszerzenie błony plazmatycznej wokół cząsteczki.
   3. Umieść go na środku pola.
   4. Rozpocznij akwizycję strumieniową od 500 do 1 000 klatek. W zakładce "liczba pętli" wpisz "750 klatek" (Rysunek 3B 1).
      Uwaga: Oprogramowanie ImageJ Color Profiler służy do przetwarzania strumieni obrazów TIRF.
   5. Otwórz obrazy sekwencji w oprogramowaniu Image J, klikając "Plik", "Otwórz" i wybierając plik.
   6. Oddziel kanały, klikając zakładkę "Obraz", menu rozwijane "Hyperstacks" i funkcję "Stos do hiperstosu". Wypełnij wyświetlone okno: Zamówienie: xyctz; Kanał (c): liczba kanałów (np. "2", jeśli masz dwa fluorochromy); Plasterki (z): liczba wycinków na osi z (np. "1", jeśli nie ma ruchu w osi z); Klatki (t): liczba obrazów podzielona na liczbę kanałów; Tryb wyświetlania: Skala szarości.
      Uwaga: Generowane są dwie oddzielne sekwencje obrazów, odpowiadające dwóm różnym kanałom.

System eksperymentalny opisany w tym manuskrypcie jest schematycznie przedstawiony na rysunku 1. Transfekowane makrofagi RAW264.7 wyrażające interesujące białka połączone ze znacznikiem fluorescencyjnym są umieszczane w kontakcie z IgG-opsonizowanymi krwinkami czerwonymi owiec (SRBC), które zostały niekowalencyjnie utrwalone na szkiełku nakrywkowym. Makrofagi mogą oderwać SRBC od szkiełka nakrywkowego, aby je pochłonąć. Zastosowany mikroskop TIRF pozwala na jednoczesne pozyskiwanie sygnałów z obszaru TIRF odpowiadających końcówkom pseudopodów oraz sygnałów w trybie epifluorescencji po przesunięciu Z o 3 μm powyżej.

Istotne jest określenie kąta krytycznego dla całkowitej wewnętrznej fluorescencji odbicia, jak opisano na rysunku 2. Zapewnia to czysty sygnał TIRF z obszaru 100 nm poniżej błony plazmatycznej. Rysunek 3 przedstawia opracowywanie parametrów akwizycji za pomocą modułu o nazwie "Edytor protokołu" zawartego w oprogramowaniu Live Acquisition. Moduł ten pozwala użytkownikom tworzyć i zarządzać przepływami pracy przed wysłaniem ich do mikroskopu, który wykona proces. Na końcu pozyskiwania użytkownik pobiera strumień TIFF.

Rysunek 4 pokazuje, reprezentatywny film TIRFM z żywych komórek "testu zamykania fagosomu" w makrofagach RAW264.7 transfekowanych plazmidem (np. Lifeact-mCherry, uprzejmy dar dr Guillaume'a Montagnaca, Institut Curie, Paryż, wygenerowany po 17) w celu śledzenia polimeryzacji aktyny. Makrofagom przejściowo eksprymującym plazmid pozwolono pochłonąć IgG-SRBC związane ze szkiełkiem nakrywkowym. Gdy końcówki pseudopodów zostały przyłożone do szklanego szkiełka nakrywkowego wokół jednego SRBC, wykryto pierścień F-aktyny w obszarze TIRF (górny panel), który stopniowo zwężał się, aż się zamknął. Równolegle niewyraźny sygnał F-aktyny wykryty przez epifluorescencję po przesunięciu stopnia o 3 μm powyżej (dolny panel) odpowiadał depolimeryzacji u podstawy miseczki fagocytarnej. Po 3 minutach od akwizycji SRBC został całkowicie zinternalizowany, co zostało potwierdzone światłem przechodzącym (panel po prawej).

Dlatego ta metoda może być wykorzystana do prawidłowego rozróżnienia zdarzeń molekularnych, które mają miejsce na samych końcach pseudopodów, od zdarzeń molekularnych zachodzących u podstawy miseczki fagocytarnej.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie "testu zamykania fagosomu" analizowanego przez TIRFM. Test zamykania fagosomu przeprowadza się przy użyciu makrofagów wykazujących przejściową ekspresję jednego lub dwóch fluorescencyjnie znakowanych białek. Makrofagi osadzają się na IgG-opsonizowanych SRBC niekowalencyjnie utrwalonych na szkiełkach nakrywkowych pokrytych polilizyną. Obrazy są rejestrowane w trybie TIRF w celu wykrycia miejsca zamknięcia fagosomu oraz w trybie epifluorescencji w celu wykrycia podstawy miseczki fagocytarnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wyznaczanie kąta krytycznego dla TIRFM. (A) Za pomocą "Akwizycji żywego" komórkę wykazującą ekspresję fluorescencyjnie znakowanych białek umieszcza się w środku pola (region 1 na czerwono). Dzięki opcji stosu TIRF obrazy były rejestrowane na jednej długości fali wzbudzenia, pod różnymi kątami od 0° do 5°, z krokiem 0,01° (obszar 2 na czerwono). (B) Sekwencja obrazów jest otwierana za pomocą oprogramowania ImageJ Color Profiler, a średnia intensywność fluorescencji obszaru zainteresowania (ROI) jest wykreślana z funkcją kątów na osi x za pomocą "Stosów" i "Profilu osi PlotZ" (obszar 1 na czerwono). (C) Położenie x piku fluorescencji na wykresie odpowiada kątowi krytycznemu: 1,98° (linia przerywana). Można użyć dowolnej wartości po tym kącie. Na przykład można wybrać 2,00° (czerwona linia). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Proces przepływu pracy z wykorzystaniem modułu Live Acquisition: "Edytor protokołów". (A) W oknie "Edytor protokołu" tworzone jest płótno przepływu pracy. (B) Protokół ten składa się z "pętli" czynności, które mikroskop powtórzy tyle razy, ile zdecyduje użytkownik. Na przykład: 750 (1). Jedna pętla obejmowała: akwizycję "Multi Channels" z laserowym wzbudzaniem interesujących białek fluorescencyjnych w trybie TIRF. Na przykład: Laser 491 nm intensywność 50% -kąt TIRF 2,00 (2); »ruch Z« celu 3 μm (3); Akwizycja "wielokanałowa" w trybie epifluorescencji (4); "Ruch Z" celu z powrotem do obszaru TIRF (5) i "Migawka" w świetle przechodzącym (6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. F-aktyna jest akumulowana jako punkt w miejscu zamknięcia fagosomu. Test zamykania fagosomów przeprowadzono przy użyciu makrofagów RAW264.7 wykazujących przejściową ekspresję plazmidu Lifeact-mCherry (dar dr Guillaume'a Montagnaca z Instytutu Curie w Paryżu, wygenerowany po 17 roku życia). Sygnał plazmidowy został uzyskany w obszarze TIRF (na górze) i w trybie epifluorescencji (na dole). Czerwony grot strzałki wskazuje akumulację aktyny w regionie TIRF. Prezentowany jest obraz w świetle przechodzącym po 3 minutach, wskazujący na zinternalizowane SRBC. Podziałka liniowa, 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1: F-aktyna gromadzi się w końcach pseudopodów i w miejscu zamknięcia fagosomu, podczas gdy jest usuwana z podstawy kubka fagocytarnego. Test zamknięcia fagosomu przeprowadzono przy użyciu makrofagów RAW264.7 przejściowo eksprymujących plazmid. Obrazowanie plazmidowe w obszarze TIRF (na górze) i w trybie epifluorescencji (na dole) przy użyciu TIRFM wykonywano naprzemiennie co 50 ms przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.