Ten protokół opisuje technikę osteosyntezy wykorzystującą gwóźdź blokujący śródszpikowy do standaryzacji osteotomii kości udowej, która może być używana do analizy prawidłowego i wadliwego gojenia kości u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Śródszpikowy gwóźdź blokujący do standaryzowanego mocowania osteotomii kości udowej w celu analizy prawidłowego i wadliwego gojenia kości u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele gojenia kości są niezbędne do opracowania nowych strategii terapeutycznych w leczeniu klinicznym złamań. Co więcej, modele mysie stają się coraz częściej wykorzystywane w badaniach nad traumą. Oferują one dużą liczbę zmutowanych szczepów i przeciwciał do analizy mechanizmów molekularnych stojących za wysoce zróżnicowanym procesem gojenia się kości. Aby kontrolować środowisko biomechaniczne, u myszy obowiązkowe są standaryzowane i dobrze scharakteryzowane techniki osteosyntezy. W tym miejscu przedstawiamy projekt i zastosowanie gwoździa śródszpikowego do stabilizacji osteotomii otwartej kości udowej u myszy. Gwóźdź, wykonany ze stali nierdzewnej klasy medycznej, zapewnia wysoką sztywność osiową i obrotową. Implant pozwala ponadto na tworzenie zdefiniowanych, stałych rozmiarów szczelin osteotomicznych od 0,00 mm do 2,00 mm. Śródszpikowa stabilizacja paznokcia blokującego osteotomię kości udowej w odstępach o rozmiarach 0,00 mm i 0,25 mm powoduje odpowiednie gojenie kości poprzez kostnienie śródchrzęstne i śródbłoniaste. Stabilizacja osteotomii kości udowej z udziałem szczeliny 2,00 mm powoduje zanikowy brak zrostu. W ten sposób gwóźdź blokujący śródszpikowy może być stosowany w modelach gojących i niegojących. Kolejną zaletą stosowania gwoździa w porównaniu z innymi otwartymi modelami gojenia kości jest możliwość odpowiedniego zamocowania substytutów kości i rusztowań w celu zbadania procesu integracji kostnej. Wadą stosowania gwoździa śródszpikowego jest bardziej inwazyjny zabieg chirurgiczny, nieodłącznie związany ze wszystkimi procedurami otwartymi w porównaniu z modelami zamkniętymi. Kolejną wadą może być indukcja pewnych uszkodzeń jamy śródszpikowej, nieodłącznie związana ze wszystkimi technikami stabilizacji śródszpikowej w porównaniu z procedurami stabilizacji pozaszpikowej.
Wprowadzenie
Biologia gojenia kości może być badana in vitro przy użyciu kultur komórkowych i sferoidalnych, ale wymaga również podejścia in vivo z wykorzystaniem badań na zwierzętach. Podczas gdy doświadczenia na dużych zwierzętach nadal odgrywają ważną rolę w badaniach przedklinicznych, badania na wczesnym etapie produktów lub hipotez zmieniły się w ciągu ostatnich 10 lat i obecnie są często przeprowadzane na modelach małych zwierząt1. Ta zmiana została wykonana z kilku powodów. Produkcja i utrzymanie myszy i szczurów są tańsze w porównaniu ze świniami i owcami. Ponadto małe zwierzęta mają krótszy czas reprodukcji i krótsze normalne okresy gojenia, co ułatwia przeprowadzanie dużych serii przewlekłych eksperymentów. Wreszcie, dostępność zwierząt ukierunkowanych na geny i specyficznych przeciwciał pozwala na analizę mechanizmów molekularnych w procesie gojenia kości. Jednakże, podczas gdy wcześniej stosowane techniki osteosyntezy w większych modelach zwierzęcych można było przełożyć z minimalnymi różnicami w stosunku do podobnych procedur stosowanych w klinicznej opiece nad ludźmi lub pacjentami weterynaryjnymi, rozwój i zastosowanie technik osteosyntezy u małych szczurów i myszy okazało się wyzwaniem.
Powszechnie wiadomo, że środowisko biomechaniczne znacząco wpływa na proces gojenia kości2. Jak wiadomo z gojenia złamań u ludzi, różnice w stabilizacji złamań skutkują różnymi sposobami gojenia, w tym kostnieniem śródbłoniastym po sztywnym unieruchomieniu i kostnieniem śródchrzęstnym po mniej sztywnym unieruchomieniu za pomocą mikroruchów. Całkowita niestabilność osiowa lub obrotowa może opóźnić proces gojenia lub może skutkować brakiem zrostów3. W związku z tym uważamy, że konieczne jest opracowanie zaawansowanych systemów implantologicznych i technik osteosyntezy u myszy i szczurów. W ten sposób warunki biomechaniczne mogą być odpowiednio ustandaryzowane, gwarantując ważne wyniki podczas analizy procesu gojenia.
Chociaż w ciągu ostatnich kilku lat wprowadzono znaczną liczbę wysoce wyrafinowanych technik stabilizacji myszy, najczęściej używaną techniką jest nadal prosta szpilka śródszpikowa. Główną wadą tej techniki jest jednak brak stabilności obrotowej i osiowej4. Aby poprawić stabilność obrotową i osiową, wprowadzono śródszpikową do stabilizacji złamań kości udowej u myszy5. Jednak mocowanie śrubowe nie może być używane do analizy gojenia się uszkodzeń kości ze względu na potrzebę kontaktu i ściskania między fragmentami kości w celu utrzymania stabilności rotacyjnej.
Gwóźdź blokujący śródszpikowy oferuje wyższą stabilność osiową i obrotową w porównaniu do prostego kołka i śródszpikowej4. Wysoce powtarzalna osteotomia kości udowej, możliwa dzięki prowadnicy do piły Gigli i możliwości tworzenia określonych rozmiarów szczelin, pozwala na analizę zarówno prawidłowego gojenia się kości, jak i gojenia wad kostnych6. Dzięki wprowadzeniu kołków blokujących, śródszpikowy gwóźdź blokujący gwarantuje stałą wielkość szczeliny podczas całego procesu gojenia, nawet przy pełnym obciążeniu. W tym miejscu przedstawiamy konstrukcję i zastosowanie gwoździa blokującego śródszpik, a także jego zalety i wady w badaniach eksperymentalnych dotyczących prawidłowego i opóźnionego gojenia się kości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez IACUC i przestrzegały wytycznych instytucjonalnych (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, Niemcy). Analgezja i profilaktyka zakażeń powinny być zgodne z odpowiednimi wytycznymi kraju i instytucji, w której mają być wykonywane eksperymenty.
1. Przygotowanie implantów i narzędzi chirurgicznych
- Wybierz ostrze skalpela (rozmiar 15), małe nożyczki do preparacji, cienkie kleszczyki, kleszcze opatrunkowe, małe szczypce, igły o rozmiarze 24 (G) i 27 G, niewchłanialny szew 5-0 i uchwyt na igłę z pudełka z narzędziami mikrochirurgicznymi.
- Rozpakuj gwóźdź śródszpikowy, kołki blokujące, specjalne urządzenie celownicze, piłę Gigli, szablon do piły Gigli, wiertło centrujące (średnica 1 mm), wiertło (średnica 0,3 mm) i wiertarkę ręczną (rysunek 2; patrz lista materiałów).
UWAGA: Gwóźdź śródszpikowy (średnica 0,8 mm, długość 15,7 mm) to gwóźdź blokujący śródszpikowy wykonany ze stali nierdzewnej klasy medycznej do implantacji wstecznej do kości udowej. Gwóźdź ma gwint proksymalny (o długości 4 mm) i dwa otwory do włożenia kołków blokujących (średnica 0,3 mm) w celu uzyskania stabilności osiowej i obrotowej (ilustracja 1). - Wystawić implanty i wszystkie narzędzia chirurgiczne na działanie roztworu dezynfekującego (np. 96% alkoholu) przez 5 minut lub wysterylizować (sterylizacja parą, 130 °C, 25 min). Po dezynfekcji lub sterylizacji umieść narzędzia na sterylnej ściereczce operacyjnej. Umieść sterylną ściereczkę operacyjną bezpośrednio obok stołu operacyjnego dla małych zwierząt.
2. Zwierzęta, znieczulenie i analgezja
- Wybierz szczep, wiek i płeć myszy zgodnie z potrzebami badania i pytania, na które należy odpowiedzieć.
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano 12- do 14-tygodniowych samców myszy CD-1. Do implantacji paznokci idealna masa ciała zwierząt wynosi 25 - 35 g. - Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym 15 mg/kg ksylazyny i 75 mg/kg ketaminy. Potwierdź znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi. Nałóż smar do oczu, aby chronić oczy zwierząt przed wysuszeniem podczas znieczulenia. Po indukcji znieczulenia umieść mysz pod lampą grzewczą, aby utrzymać stałą temperaturę ciała.
- Chlorowodorek tramadolu należy stosować w wodzie do picia (2,5 mg/100 ml) w celu złagodzenia bólu od 1 dnia przed zabiegiem do 3 dnia po zabiegu.
3. Zabieg chirurgiczny i implantacja paznokci
- Przed zabiegiem należy ogolić całą prawą tylną nogę i nałożyć krem do depilacji. Po 5 minutach usuń krem i umyj nogę wodą. Wystaw implanty i wszystkie narzędzia chirurgiczne na działanie roztworu dezynfekującego (np. 96% alkoholu) lub wysterylizuj je (sterylizacja parowa, 130 °C, 25 min).
- W warunkach aseptycznych umieść mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym dla małych zwierząt. Zegnij prawe kolano, aby umożliwić dostęp do przodu do kłykci kolana. Wykonaj przyśrodkowe nacięcie przyrzepkowe o średnicy 5 mm w prawym kolanie za pomocą ostrza skalpela.
- Podnieś więzadło rzepki za pomocą cienkich kleszczy i ostrożnie zmobilizuj więzadło za pomocą ostrza skalpela. Następnie przesuń rzepkę na boki za pomocą ostrza skalpela, aby odsłonić wcięcie międzykłykciowe kości udowej.
- Otwórz wcięcie międzykłykciowe, wiercąc, aż do osiągnięcia jamy śródszpikowej.
- Rozpocznij wiercenie z przesunięciem o 45º do osi kości udowej za pomocą wiertła centrującego 1 mm. Powoli zmieniaj kierunek wiertła podczas wiercenia, aż będzie równoległe do osi kostnej kości udowej. Przerwij wiercenie, jeśli dojdziesz do jamy śródszpikowej.
- Po otwarciu kości w miejscu wcięcia międzykłykciowego należy wprowadzić igłę 24 G do jamy śródszpikowej na całej długości kości udowej. Rozwiercić jamę śródszpikową kości udowej ręcznie za pomocą ruchów obrotowych igły 24 G. Wyjąć igłę 24 G i wprowadzić cieńszą igłę 27 G do jamy śródszpikowej. Popchnij igłę do przodu, aby przebić kość korową kości udowej proksymalnie na krętarzu większym.
- Usunąć igłę 27 G z kości udowej. Za pomocą wiertarki ręcznej wszczepić gwóźdź śródszpikowy przez wcięcie międzykłykciowe pod ciągłym obrotem i naciskiem osiowym, aż dystalny koniec gwoździa osiągnie poziom kłykci.
UWAGA: Dystalny koniec paznokcia można zidentyfikować za pomocą małego znaku. - Umieść mysz w lewej pozycji bocznej. Wykonaj podłużne nacięcie skóry za pomocą ostrza skalpela wzdłuż części trzonowej bocznej kości udowej od stawu kolanowego do stawu biodrowego w celu chirurgicznego odsłonięcia środkowej części kości udowej.
- Za pomocą małych nożyczek przygotowawczych rozetnij powięź i rozłóż mięśnie w kierunku osi kości udowej od strony bocznej. Rozłóż mięśnie, aż część kłosowa kości udowej zostanie odsłonięta. Zachowaj nerw kulszowy.
- Przygotuj cały obwód kości udowej, podkopując kość kleszczami opatrunkowymi. Następnie cofnij mięśnie, rozkładając kleszcze opatrunkowe i odsłaniając kość udową.
- Zamontuj przyrząd celowniczy do dystalnego końca gwoździa. Przesuń urządzenie, aż zamocuje się do kołnierza adaptera gwoździa i obróć przyrząd celowniczy w pozycji przednio-bocznej do kości udowej.
- Zablokuj gwóźdź za pomocą bliższego i dystalnego kołka blokującego.
- Zacznij od bliższego kołka blokującego.
- Włóż wiertło centrujące (o średnicy 1 mm) do wiertarki ręcznej. Pogłębić kość w miejscu proksymalnego otworu blokującego.
UWAGA: Przez pogłębianie tworzy się mały wgłębień w licowej kości korowej bez wiercenia w kości. Wnęka ta pozwala na lepsze centrowanie i prowadzenie cieńszego wiertła (o średnicy 0,3 mm), używanego później. - Włóż wiertło (o średnicy 0.3 mm) do wiertarki ręcznej. Za pomocą przyrządu celowniczego wywierć otwór zarówno przez licówkę, jak i odwróconą kość korową (bikortykalną). Włóż pierwszy kołek blokujący przez urządzenie celownicze. Wał napędowy sworznia blokującego odcina się, gdy tylko zostanie osiągnięty moment blokujący.
- Powtórz tę procedurę dla dystalnego kołka blokującego.
- Wykonaj osteotomię trzonu.
- Przymocuj prowadnicę piły do przyrządu celowniczego po bocznej stronie między dwoma kołkami blokującymi. Następnie zobaczyłem kość za pomocą piły Gigli pod ciągłym nawadnianiem solą fizjologiczną. Po zakończeniu osteotomii przeciąć piłę na jednym końcu, blisko kości. Ostrożnie wyjmij piłę, aby uniknąć uszkodzenia tkanek miękkich.
- Zdejmij przyrząd celowniczy i za pomocą małych szczypiec odetnij pozostały trzon gwoździa śródszpikowego na zaznaczonej linii.
- Zamknij warstwy mięśniowe w bocznym miejscu kości udowej i wykonaj zamknięcie skóry za pomocą pojedynczych szwów. W przedniej części kolana zmień położenie rzepki i przymocuj ścięgno rzepki do mięśni za pomocą jednego szwu. Użyj pojedynczych szwów, aby zamknąć również tę ranę.
- Trzymaj zwierzęta pod lampą grzewczą, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą brzusznie. Umieść zwierzęta z powrotem w pojedynczych klatkach w obiekcie dla zwierząt.
- Uważnie monitoruj zwierzęta każdego dnia. Utrzymuj analgezję pooperacyjną przez pierwsze trzy dni. Kontynuuj analgezję, jeśli w 4 dniu po operacji zwierzęta nadal wykazują oznaki bólu, na co wskazuje wokalizacja, niepokój, brak mobilności, brak pielęgnacji, nieprawidłowa postawa i brak normalnego zainteresowania otoczeniem. Zakończ analgezję, gdy zwierzęta są wolne od bólu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Całkowity czas trwania procedury chirurgicznej wynosił około 30 min od nacięcia skóry do zamknięcia rany. Przy użyciu dostarczonych implantów chirurgicznych operację można przeprowadzić bez użycia stereomikroskopu. Po zabiegu zwierzęta monitorowano codziennie. Analgezję pooperacyjną zakończono po 3 dniach, ponieważ po tym czasie u żadnego ze zwierząt nie stwierdzono objawów bólu (wokalizacji, niepokoju, braku mobilności, zaniedbania pielęgnacji, nieprawidłowej postawy ciała lub braku norm...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najważniejszymi etapami techniki chirurgicznej są prawidłowe ustawienie gwoździa, urządzenia celowniczego i kołków. Gwóźdź musi być wbity całkowicie do zaznaczonego wgłębienia na dystalnym końcu gwoździa, ponieważ występ gwoździa w stawie kolanowym na poziomie kłykci może ograniczać ruch kolana (ryc. 3 A). W związku z tym należy wziąć pod uwagę wielkość kości udowej, a tym samym masę ciała zwierząt. Chirurg powinien również zwrócić szczególną uwagę na końcowe położenie przyrządu celowniczego mocującego k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Romano Matthys jest pracownikiem firmy RISystem AG z siedzibą w Davos w Szwajcarii, która produkuje implanty i instrumenty specyficzne dla implantów. Pozostali autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez RISystem AG, Davos, Szwajcaria.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MouseNail | RISystem AG | 221,122 | |
| Przyrząd do celowania MouseNail | RISystem AG | 221,201 | |
| Trzpień blokujący MouseNail | RISystem AG | 221,121 | |
| Frez | centrujący RISystem AG | 592,205 | |
| Wiertło | RISystem AG | 590,200 | |
| Piła linowa Gigli | RISystem AG | 590,100 | |
| Szew (5-0 Prolen) | Kleszcze Ethicon | 8614H | |
| Braun | Aesculap AG & CoKG | BD520R | |
| Kleszczyki opatrunkowe | Braun Aesculap AG & CoKG | BJ009R | |
| Nożyczki | Braun Aesculap AG & CoKG | BC100R | |
| Uchwyt na igłę | Braun Aesculap AG & CoKG | BM024R | |
| Igła 24 G | BD Mircolance 3 | 304100 | |
| Igła 27 G | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Ostrze skalpela rozmiar 15 | Braun Aesculap AG & CoKG | ||
| Szczypce | Knipex | 7932125 | |
| Grzejnik | Sanitas | 605.25 | |
| Krem do depilacji | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Smar do oczu | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Ketamine | Serumwerke Bernburg | ||
| Tramadol | Grü nenthal GmbH | 2256241 | |
| Roztwór do dezynfekcji (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| Myszy CD-1 | Charles River | 22 |
Bibliografia
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Claes, L., Augat, P., Suger, G., Wilke, H. J. Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing. J Orthop Res. 15 (4), 577-584 (1997).
- Histing, T., et al. Characterization of the healing process in non-stabilized and stabilized femur fractures in mice. Arch Orthop Trauma Surg. 136 (2), 203-211 (2016).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. J Orthop Res. 27 (9), 1152-1156 (2009).
- Holstein, J. H., et al. Development of a stable closed femoral fracture model in mice. J Surg Res. 153 (1), 71-75 (2009).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail-a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J Surg Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Cheung, K. M., Kaluarachi, K., Andrew, G., Lu, W., Chan, D., Cheah, K. S. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. J Biomech. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. J Orthop Res. 28 (3), 397-402 (2010).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11 (2), 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18 (10), 687-695 (2004).
- Lovati, A. B., et al. Diabetic mouse model of orthopaedic implant-related Staphylococcus aureus infection. PLoS One. 8 (6), e67628(2013).
- Slade Shantz, J. A., Yu, Y. Y., Andres, W., Miclau, T. 3rd, Marcucio, R. Modulation of macrophage activity during fracture repair has differential effects in young adult and elderly mice. J Orthop Trauma. 28, 10-14 (2014).
- Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. 355 (Suppl), 132-147 (1998).
- Gröngröft, I., et al. Fixation compliance in a mouse osteotomy model induces two different processes of bone healing but does not lead to delayed union. J Biomech. 18 (13), 2089-2096 (2009).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. J Vis Exp. (9), e51558(2014).
- Manassero, M., et al. A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes. Tissue Eng Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
