Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modele zakrzepicy myszy indukowanej chlorkiem żelaza

22.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54479

⸱

5 września 2016

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy udoskonaloną procedurę modeli zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza (FeCl3) na tętnicy szyjnej i krezkowej oraz żyle, scharakteryzowaną efektywnie za pomocą mikroskopii przyżyciowej do monitorowania czasu do powstania skrzeplin okluzyjnych.

Streszczenie

Zakrzepica tętnicza (zakrzepy krwi) jest częstym powikłaniem wielu chorób ogólnoustrojowych związanych z przewlekłym stanem zapalnym, w tym miażdżycy, cukrzycy, otyłości, raka i przewlekłych autoimmunologicznych zaburzeń reumatologicznych. Skrzepliny są przyczyną większości zawałów serca, udarów mózgu i utraty kończyn, co sprawia, że zakrzepica jest niezwykle ważnym problemem zdrowia publicznego. Ponieważ skrzepliny te powstają w wyniku niewłaściwej aktywacji płytek krwi i późniejszej krzepnięcia, terapeutyczne ukierunkowanie na te układy ma ważne znaczenie kliniczne dla opracowania bezpieczniejszych metod leczenia. Ze względu na złożoność układu hemostatycznego, eksperymenty in vitro nie mogą odtworzyć interakcji krew-ściana naczynia; Dlatego badania in vivo mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia patologicznych mechanizmów powstawania skrzepliny. W tym celu u myszy opracowano różne modele zakrzepicy. Wśród nich uszkodzenie naczyń wywołane chlorkiem żelaza (FeCl3) jest szeroko stosowanym modelem zakrzepicy okluzyjnej, który informuje o aktywacji i agregacji płytek krwi w kontekście aseptycznego zamkniętego układu naczyniowego. Model ten opiera się na uszkodzeniu komórek śródbłonka wywołanym przez redoks, które jest proste i wrażliwe zarówno na leki przeciwzakrzepowe, jak i przeciwpłytkowe. Czas potrzebny do rozwoju skrzepliny, która blokuje przepływ krwi, stanowi ilościową miarę uszkodzenia naczyń, aktywacji i agregacji płytek krwi, co jest istotne dla chorób zakrzepowych. Znacznie udoskonaliliśmy ten model zakrzepicy naczyniowej indukowanej FeCl3, co sprawia, że dane są wysoce powtarzalne przy minimalnej zmienności. W tym miejscu opisujemy model i przedstawiamy reprezentatywne dane z kilku konfiguracji eksperymentalnych, które pokazują przydatność tego modelu w badaniach nad zakrzepicą.

Wprowadzenie

Zakrzepica tętnicza (zakrzep krwi) jest częstym powikłaniem wielu chorób ogólnoustrojowych związanych z przewlekłym stanem zapalnym, w tym miażdżycy, cukrzycy, otyłości, raka i przewlekłych autoimmunologicznych zaburzeń reumatologicznych. Zakrzepy, które występują w krążeniu tętniczym, wynikają z nieprawidłowej aktywacji, agregacji i późniejszych mechanizmów krzepnięcia płytek krwi i są związane z zawałami serca, udarami mózgu i utratą kończyn. Ściana naczynia to złożony system, który obejmuje wiele typów komórek i jest pod wpływem wielu czynników zewnętrznych, w tym naprężeń ścinających, krążących komórek krwi, hormonów i cytokin, a także ekspresji białek przeciwutleniających w ścianie naczynia. Eksperymenty in vitro nie są w stanie odtworzyć tego złożonego środowiska, dlatego badania in vivo z wykorzystaniem modeli zwierzęcych mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia mechanizmów związanych z zaburzeniami zakrzepowymi.

Wykazano, że myszy mają podobne mechanizmy do ludzi pod względem zakrzepicy, miażdżycy, stanów zapalnych i cukrzycy1,2. Co więcej, można stworzyć myszy transgeniczne i z nokautem w celu przetestowania funkcji określonych produktów genowych w złożonym środowisku fizjologicznym lub patologicznym. Takie badania naśladują ludzką patologię i mogą dostarczyć ważnych informacji mechanistycznych związanych z odkrywaniem nowych szlaków i terapii, a także dostarczyć ważnych szczegółów w charakterystyce wpływu leków na zakrzepicę.

Patologiczne skrzepliny tętnicze występują z powodu uszkodzenia lub dysfunkcji warstwy śródbłonka i ekspozycji strumienia krwi na macierz podśródbłonkową3,4. Opracowano różne modele zakrzepicy w celu wywołania tego uszkodzenia śródbłonka, takiego jak uraz mechaniczny, fotoreaktywny związek Rose Bengal, uraz oksydacyjny i uraz laserowy5. W tym spektrum uszkodzenie naczyń wywołane chlorkiem żelaza (FeCl3) jest szeroko stosowanym modelem zakrzepicy. Odczynnik ten po nałożeniu na zewnętrzną powierzchnię naczyń indukuje oksydacyjne uszkodzenie komórek naczyniowych6-8, z utratą ochrony komórek śródbłonka przed krążącymi płytkami krwi i składnikami kaskady krzepnięcia. Model FeCl3 jest prosty i wrażliwy zarówno na leki przeciwzakrzepowe, jak i przeciwpłytkowe i został wykonany na tętnicach szyjnych i udowych, żyłach szyjnych oraz tętniczkach i żyłkach krezkowych i krezkowych u myszy, szczurów, świnek morskich i królików6-15.

Jednym z mierzalnych parametrów w tym modelu jest czas, jaki upłynął od urazu do całkowitego zamknięcia naczynia, mierzony jako zatrzymanie przepływu krwi za pomocą przepływomierza dopplerowskiego lub pod bezpośrednią obserwacją za pomocą mikroskopii przyżyciowej6,7,9. Zakres czasu od 5 do 30 minut został zgłoszony w różnych badaniach na myszach C57Bl67-10,16, co sugeruje, że stężenia FeCl3, rodzaje znieczulenia, techniki chirurgiczne, wiek myszy, tło genomowe, metoda pomiaru przepływu krwi i inne zmienne środowiskowe mają znaczący wpływ na ten model. Ta duża zmienność utrudnia porównywanie badań z różnych grup badawczych i może utrudniać wykrycie subtelnych różnic.

Z wizją zminimalizowania takich zmienności i ustanowienia jednolicie powtarzalnego systemu modeli in vivo, udoskonaliliśmy model tętnicy szyjnej indukowanej FeCl3, który sprawia, że dane są wysoce powtarzalne przy minimalnych zmianach6-10,16-19. W tym artykule opisujemy i dzielimy się umiejętnościami oraz przedstawiamy kilka reprezentatywnych przykładów eksperymentalnych, które mogą skorzystać z tego modelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury i manipulacje zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Kliniki w Cleveland zgodnie z Polityką Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt oraz Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowania:

  1. Barwnik fluorescencyjny do oznaczania płytek krwi
    1. Przygotować roztwór rodaminy 6G o stężeniu 0,5 mg/ml w soli fizjologicznej i wysterylizować roztwór filtrem 0,22 μm.
  2. Roztwór FeCl3
    1. Przygotować świeży roztwór podstawowy 30% FeCl3 (bezwodny, równy 1,85 M) w czystej wodzie i przefiltrować za pomocą filtra 0,45 μm. Przygotować 5 ml świeżego roztworu FeCl3 o pożądanym stężeniu [np. 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) i 12,5% (0,771 M)], rozcieńczając 30% roztwór FeCl3 wodą w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 6 cm i trzymać pokrywkę zamkniętą.
      nuta: Korzystanie z naczynia hodowlanego ułatwia pobranie bibuły filtracyjnej nasyconej roztworem FeCl3 niż pobranie jej z wąskiego pojemnika, takiego jak probówka do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. FeCl3 jest niezwykle niebezpieczny i należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych itp., środków ochrony osobistej.
  3. Bibuły filtracyjne
    1. Przyciąć bibułę filtracyjną o wymiarach 1 mm x 2 mm. Namocz wystarczającą ilość kawałków pociętej bibuły filtracyjnej w roztworze FeCl3 w tym samym naczyniu.
  4. Roztwór chlorowodorku papaweryny
    1. Przygotować roztwór chlorowodorku papaweryny (25 mg/ml) w wodzie i wysterylizować roztwór filtrem 0,22 μm.
  5. Żel agarozowy
    1. Przygotować 2% żel agarozowy w PBS lub soli fizjologicznej na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej o grubości ~ 1 cm i pokroić na półkole o średnicy ~ 3 cm.

2. FeCl3 Indukowane uszkodzenie tętnicy szyjnej Model zakrzepicy

  1. Zabiegi chirurgiczne w modelu zakrzepicy
    1. Użyj 8-12 tygodniowych myszy C57Bl6 (lub innych szczepów w razie potrzeby). Znieczulić myszy mieszaniną ketaminy (100 mg/kg)/ksylazyny (10 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Potwierdź głębokość znieczulenia, szczypiąc palce u stóp.
      nuta: Taka ilość ketaminy/ksylazyny jest wystarczająca, aby utrzymać zwierzę w stabilnym znieczuleniu i bez bólu (reakcja na szczypanie palca) przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Usuń sierść na szyi i górnej części klatki piersiowej za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia małych zwierząt. Krem do depilacji nie jest konieczny. Nałóż neutralną maść naftową na oczy na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    3. Zamocuj mysz w pozycji leżącej na pokrywie 15-centymetrowej płytki do hodowli tkankowej. Użyj jednej długiej taśmy (~ 10 cm) do zabezpieczenia kończyn tylnych i dolnej części ciała oraz dwóch kawałków małej taśmy (2 cm x 0,5 cm) do zabezpieczenia kończyn przednich. Użyj szwu 4-0, aby owinąć wokół siekaczy, przyklej dwa końce szwu do pokrywy, aby szyja myszy była prosta (ryc. 2).
    4. Umieść płytkę z głową myszy w kierunku operatora pod chirurgicznym źródłem światła.
    5. Wysterylizuj miejsce operowane wacikiem nasączonym alkoholem. Użyj kleszczyków Micro-Adson, aby przytrzymać skórę i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać małe nacięcie (2 - 3 mm).
    6. Przytrzymaj skórę nacięcia kleszczami i włóż nożyczki chirurgiczne ze szczękami zamkniętymi w nacięciu. Popchnij nożyczki podskórnie w kierunku manubry lub podbródka, a następnie otwórz nożyczki, aby uwolnić skórę z warstwy podskórnej.
    7. Przetnij skórę nożyczkami chirurgicznymi, aby wykonać nacięcie w linii środkowej od manubrium do poziomu kości gnykowej (ryc. 3A i 3B). Tępo rozetnij cienką powięź (linia przerywana, na rycinie 3B) między gruczołami podszczękowymi za pomocą cienkiego hemostatu i kleszczyków Graefe (ryc. 3B i 3C; niebieskie strzałki).
      nuta: Manubrium (strzałka na rysunku 3C) i tchawica (T na rysunku 3C) będą widoczne po tym kroku.
    8. Przytrzymaj tkankę miękką i skórę widoczną po prawej stronie manubrium za pomocą kleszczy Graefe, włóż hemostat pod powięź w kierunku pozycji godziny 2 (żółta przerywana linia na rysunku 3C), otwórz szczęki hemostatu, aby uwolnić żyłę szyjną od otaczającej tkanki.
    9. Przeciąć powięź, tkankę miękką i skórę w kierunku pozycji godziny 2 (ryc. 3C) nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić prawą żyłę szyjną (ryc. 3D, strzałka).
    10. Pobrać około 200 - 300 μl roztworu rodaminy 6G za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 22 G, a następnie zmienić ją na igłę 30 G.
      nuta: Chroni to igłę 30 G przed uszkodzeniem jej cienkiej końcówki. Bezpośrednie pobieranie roztworu rodaminy 6G za pomocą igły 30 G nie spowoduje uszkodzenia końcówki; Jednak przypadkowe dotknięcie ścianki pojemnika spowoduje uszkodzenie, co może utrudnić wstrzyknięcie.
    11. Przepłukać igłę 30 G, powoli wypychając roztwór rodaminy 6G, upewniając się, że w strzykawce lub igle nie pozostały pęcherzyki powietrza. Zachowaj 100 μl roztworu rodaminy 6G do wstrzykiwań.
    12. Zegnij końcówkę igły o średnicy 2 - 3 mm pod kątem 90° za pomocą uchwytu igły, co zapobiegnie zbyt głębokiemu wprowadzeniu igły do żyły szyjnej i ułatwi kontrolę wstrzyknięcia (ryc. 3D).
    13. Wstrzyknąć roztwór rodaminy 6G do prawej żyły szyjnej w celu oznaczenia płytek krwi. Aby ustabilizować strzykawkę i utrzymać igłę na miejscu, podczas wstrzyknięcia należy trzymać strzykawkę jedną ręką, a igłę kleszczami Graefe drugą ręką. Po wstrzyknięciu należy zacisnąć miejsce wstrzyknięcia za pomocą kleszczyków Graefe, aby uniknąć krwawienia.
    14. Otwórz szczęki hemostatu i włóż go pod kleszcze Graefe, aby zacisnąć ścianę naczynia w miejscu wstrzyknięcia, a następnie podwiązać miejsce wstrzyknięcia szwem 6-0.
      nuta: Alternatywnie w kroku 2.1.15 uciskanie palcem w miejscu wstrzyknięcia przez 2 minuty spowoduje zatrzymanie krwawienia; Jednak ta metoda wiąże się z ryzykiem spowodowania dalszego krwawienia, jeśli skrzep w miejscu wstrzyknięcia zostanie przypadkowo usunięty.
    15. Tępo wypreparuj tkankę miękką i powięź wokół lewego gruczołu podszczękowego za pomocą hemostatu i kleszczy Graefe, a następnie pociągnij gruczoł w kierunku pozycji godziny 7 (ryc. 3E), aby odsłonić lewy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy (niebieska strzałka na rycinie 3E).
    16. Tępo rozwiń powięź (ryc. 3E, linia przerywana) między lewym mięśniem mostkowo-obojczykowo-sutkowym a mięśniem omohyoidalnym lub mięśniem mostkowo-gnykowym (ryc. 3E, zielona strzałka) znajdującym się w lewym miejscu tchawicy z hemostatem.
    17. Przełóż igłę z jedwabnym szwem 6-0 (o długości około 15 cm) pod środkiem mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego (niebieska strzałka na rysunku 3E), połącz oba końce szwu i pociągnij szew bocznie w kierunku pozycji godziny 10.
      nuta: Zabieg ten należy wykonać ostrożnie, aby uniknąć urazu lewej żyły szyjnej, która znajduje się na zewnątrz mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.
    18. Tępo oddziel cienki mięsień mostkowo-gnykowy i/lub mięsień omohyoidalny, aby odsłonić tętnicę szyjną (CA) (strzałka ryc. 3F) po odciągnięciu mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego. W razie potrzeby przeciąć mięsień mostkowo-gnykowy i/lub mięsień omohyoidalny. Użyj hemostatu, aby oddzielić tkankę miękką od CA bez dotykania CA.
      nuta: CA towarzyszy nerw błędny, biała struktura widoczna na rycinie 3G (zielona strzałka), aw większości przypadków znajduje się pod cienkim mięśniem mostkowo-gnykowym i/lub mięśniem omohyoidalnym (między żółtymi przerywanymi liniami na rycinie 3F).
    19. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby podnieść powięź boczną wokół CA, unikając nerwu błędnego i CA. Użyj innych kleszczyków z cienką końcówką, aby wybić otwór w powięzi między CA a nerwem błędnym.
    20. Przełóż haczyk przez otwór i delikatnie podnieś CA, a następnie umieść kleszczyki z cienką końcówką pod CA. Przesuń haczyk i kleszcze w przeciwnych kierunkach wzdłuż CA, aby usunąć tkankę miękką przybyszową. Uwolnić co najmniej ~ 5 mm długości CA (ryc. 3H, niebieska strzałka) z otaczającej tkanki.
    21. Aby zablokować fluorescencję tła, dociśnij koniec czarnego plastikowego mieszadełka do kawy do płasko, przetnij mieszadło do kawy na kawałek o średnicy 3 mm, a następnie przetnij wzdłuż krawędzi zagięcia, aby uzyskać dwa kawałki plastiku w kształcie litery "U" (Rysunek 3H, zielona strzałka).
    22. Opłucz jeden kawałek tego plastiku w kształcie litery "U" solą fizjologiczną i przytrzymaj go kleszczami i umieść pod CA, delikatnie podnosząc CA za pomocą haka (Rysunek 3H, zielona strzałka). Natychmiast nałóż 2-3 krople soli fizjologicznej, aby uniknąć wysuszenia CA.
  2. Nagrywanie wideo w czasie rzeczywistym
    1. Przenieś mysz i pokrywkę płytki razem do stolika mikroskopowego i umieść w odpowiedniej pozycji pod soczewką wodną 10X. Wypełnij przestrzeń między obiektywem 10X a CA solą fizjologiczną.
    2. Uruchom aplikację do cyfrowego nagrywania wideo, uruchom nowy plik i nazwij go odpowiednio. Nagraj normalne obrazy naczynia i zapisz numer klatki, gdy nagrywanie wideo zostanie zatrzymane.
      nuta: Zapoznaj się z oprogramowaniem do nagrywania wideo w komputerze w celu nagrywania. Używamy oprogramowania do cyfrowego nagrywania wideo, a poniższe opisy są oparte na tej aplikacji.
      nuta: Ponieważ uraz mechaniczny może uszkodzić śródbłonek i doprowadzić do powstania skrzepliny20, konieczne jest potwierdzenie, że przed urazem FeCl3 nie doszło do chirurgicznego uszkodzenia ściany naczynia. Konieczne jest również potwierdzenie, że wokół CA nie ma pozostałej tkanki, która może tworzyć barierę i łagodzić efekt uszkodzenia wywołanego przez FeCl3. Zapisanie numeru klatki zapisów ułatwi późniejszą analizę filmów według czasu, który upłynął.
    3. Wyjmij mysz z pokrywą płytki z obiektywu 10X. Złóż róg ręcznika papierowego, aby zrobić cienką i cienką końcówkę i użyj go do ostrożnego osuszenia soli fizjologicznej wokół CA (unikaj dotykania CA), a także w innych miejscach w polu operacyjnym. Jest to ważne, aby uniknąć rozcieńczenia zastosowanego roztworu FeCl3.
    4. Użyj kleszczyków z cienką końcówką i podnieś kawałek bibuły filtracyjnej nasyconej roztworem FeCl3 i umieść go bezpośrednio na CA i trzymaj na miejscu przez 1 min.
      nuta: Aby ułatwić wizualizację krwiobiegu i zebrać dokładne dane, umieść bibułę filtracyjną blisko dystalnego końca odsłoniętego CA (ryc. 3I) i pozostaw krótki segment w miejscu proksymalnym (zielona strzałka na rycinie 3I) w celu obserwacji przepływu krwi w późnej fazie (patrz poniżej).
    5. Usuń bibułę filtracyjną (ten punkt czasowy jest zdefiniowany jako początek "po urazie") i spłucz CA solą fizjologiczną (co najmniej 2 ml).
    6. Umieść mysz z pokrywką płytki z powrotem na obiektywie 10X; obserwuj naczynie i zacznij nagrywać obrazy wideo. Zapisz numer klatki filmu na końcu pierwszej minuty nagrywania.
      nuta: Powstawanie skrzepliny jest identyfikowane na podstawie akumulacji fluorescencyjnych płytek krwi, co obserwuje się na obrazach wideo w czasie rzeczywistym na ekranie komputera lub pod mikroskopem. Nagrywaj obrazy wideo natychmiast po ponownym umieszczeniu myszy pod mikroskopem. Kontynuuj nagrywanie do końca pierwszej minuty po wyjęciu bibuły filtracyjnej. Obserwuj całe naczynie od dystalnego do bliższego miejsca, aby uzyskać informacje o urazie, a następnie skup się na obszarze zainteresowania (zwykle jest to środek uszkodzonego obszaru) w celu dalszego obrazowania.
    7. Nagrywaj obrazy wideo przez 10 sekund co minutę przez pierwsze 10 minut (np. od 2:55 do 3:05), a następnie co 10 sekund co drugą minutę do końca eksperymentu. Zapisz numery klatek, gdy każde nagrywanie zostanie zatrzymane.
      nuta: Punkty końcowe modelu to: 1) gdy przepływ krwi ustanie na > 30 sekund; lub 2) jeśli okluzja nie jest widoczna w ciągu 30 minut po urazie. W takim przypadku wykorzystaj 30 minut na analizę statystyczną. Ustaw czas ekspozycji nagrania wideo na 10 ms na początku, aby łatwo było zaobserwować przepływ krwi przez skrzepliny. Kiedy skrzepliny stają się duże, a fluorescencja nasyca matrycę aparatu, trudno jest zidentyfikować przepływ krwi przez skrzepliny. Aby rozwiązać ten problem, należy przenieść centrum obrazowania do bliższego miejsca nieuszkodzonego (ryc. 3I, zielona strzałka), gdzie nadal można wyraźnie zaobserwować przepływ krwi. Wydłużamy również czas ekspozycji do 15 lub 20 ms, gdy skupiamy się na bliższym miejscu, w którym nie ma urazu, dzięki czemu można wyraźniej zaobserwować przepływ krwi. Kiedy przepływ krwi ustanie, liczne większe komórki (leukocyty) zaczynają toczyć się po ścianie naczynia w bliższym miejscu skrzepliny. Przepływ zwykle zatrzymuje się w ciągu 2 - 3 minut po pojawieniu się dużych komórek. Zapisz czas ekspozycji na arkuszu nagrywania, jeśli zostanie zmieniony. Zwykle trwa to około 30 minut od znieczulenia do końca eksperymentu, jeśli użyto normalnych myszy C57Bl6 typu dzikiego.
      UWAGA UWAGA: Nie należy używać białego, zagregowanego skrzepu płytek krwi jako oznaki ustania przepływu krwi, który nie da dokładnych danych i ma na to wpływ czas ekspozycji. Biały skrzep pokrył światło naczynia nie oznacza, że przepływ krwi ustał (patrz reprezentatywny film 1).
    8. Pod koniec eksperymentu należy poddać myszy eutanazji za pomocą przedawkowania ketaminy/ksylazyny (200/20 mg/kg), a następnie zwichnąć szyjkę macicy po potwierdzeniu braku oddechu i bicia serca.

3. FeCl3 Indukowany model zakrzepicy tętniczej/żyły krezkowej

  1. Znieczulić 8 − 12-tygodniowe myszy C57Bl6, jak wspomniano w sekcji 2.1.1. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Roztwór papaweryny (łącznie 0,4 mg/mysz) należy wstrzykiwać dootrzewnowo w celu zahamowania perystaltyki jelit.
  3. Usuń sierść na szyi i brzuchu za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia zwierząt. Krem do depilacji nie jest konieczny.
  4. Zamocuj mysz w pozycji leżącej na pokrywie 15-centymetrowej płytki do hodowli tkankowej. Użyj czterech kawałków małej taśmy (2 cm x 0,5 cm), aby zabezpieczyć wszystkie nogi. Użyj szwu 4 -0, aby owinąć siekacze, przyklej dwa końce szwu do pokrywy, aby szyja była prosta (ryc. 2).
  5. Postępuj zgodnie z procedurami 2.1.4 - 2.1.15, aby odsłonić żyłę szyjną do wstrzyknięcia rodaminy 6G w celu znakowania płytek krwi.
  6. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry od mieczykowatego mieczyka do podbrzusza za pomocą nożyczek chirurgicznych (ryc. 4A). Podnieś środkową otrzewną (zwaną również linea alba, ryc. 4A, strzałka) za pomocą kleszczy Graefe, która jest przezroczysta i nie ma naczyń krwionośnych, podnieś na wysokość około 2-3 mm, upewnij się, że pod linią cięcia nie ma jelita i przeciąć otrzewną wzdłuż cienkimi nożyczkami (ryc. 4B).
  7. Ponownie zabezpiecz myszy w prawej pozycji bocznej. Umieść półokrągły żel agarozowy blisko brzucha, delikatnie zewnętrznij jelita i rozprowadź go na wierzchu żelu za pomocą kleszczyków Graefe (ryc. 4C). Użyj drugich gałęzi do eksperymentu z zakrzepicą (Rysunek 4C, strzałka).
    nuta: Użyj kleszczyków do hemostatu lub Micro-Adson, aby pomóc w eksterioryzacji jelit. Unikaj zranienia jelit i naczynia.
  8. Umieść 5-6 kropli soli fizjologicznej, aby utrzymać wilgotność jelit i naczynia. Przenieś mysz z pokrywką płytki razem do stolika mikroskopu i umieść w odpowiedniej pozycji pod suchą soczewką 10X.
    nuta: Użyj suchej soczewki, ponieważ błona jelita czczego nie może pomieścić roztworu soli fizjologicznej. Pamiętaj, aby upuścić roztwór soli fizjologicznej na odsłonięte tkanki, aby były wilgotne.
  9. Osusz sól fizjologiczną wokół tętnicy krezkowej i żyły przed zabiegiem.
  10. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką podnieś kawałek bibuły filtracyjnej nasyconej 12,5% roztworem FeCl3 i umieść go bezpośrednio na tętnicy krezkowej i żyle na 1 minutę (ryc. 4D). Usuń bibułę filtracyjną (ten punkt czasowy definiuje się jako początek "po urazie") i przepłucz uszkodzoną tętnicę krezkową i żyłę solą fizjologiczną (co najmniej 2 ml).
  11. Umieść mysz z pokrywką płytki z powrotem pod suchą soczewką 10X; obserwuj naczynia i zacznij nagrywać obrazy wideo, jak wspomniano w 2.2).
    nuta: Punkty końcowe tego eksperymentu to: 1) gdy przepływ krwi ustanie na > 30 sekund; lub 2) jeśli okluzja nie jest widoczna w ciągu 30 minut po urazie, w takim przypadku użyj 30 minut na analizę statystyczną.
  12. Pod koniec eksperymentu należy poddać myszy eutanazji za pomocą przedawkowania ketaminy/ksylazyny (200/20 mg/kg), a następnie zwichnięcie szyjki macicy po potwierdzeniu braku oddechu i bicia serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Model zakrzepicy tętnicy szyjnej
W przypadku myszy o linii C57BL6 zalecamy zastosowanie 7,5% FeCl3 do traktowania naczynia przez 1 min jako punkt wyjścia. Przy zastosowaniu 7,5% FeCl3 granice obszaru uszkodzonego oraz prawidłowa ściana naczynia są łatwo identyfikowalne pod mikroskopem (patrz film online 1), co sugeruje znaczne uszkodzenie warstwy śródbłonka. Zakrzepy tworzą się natychmiast po traktowaniu FeCl3 i są obs...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Model indukowany FeCl3 jest jednym z najczęściej stosowanych modeli zakrzepicy, który może nie tylko dostarczyć cennych informacji na temat modyfikacji genetycznych funkcji płytek krwi i zakrzepicy7,8,16,19,31-33, ale może być również cennym narzędziem do oceny związków terapeutycznych i strategii leczenia i zapobiegania chorobom miażdżycowym11,17,34-37. Tutaj pokazaliśmy nasze modyfikacje i udoskonalenia tego modelu oraz pokazaliśmy dodatkowe dowody na użyteczność tej techniki, która jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) of the National Institutes of Health pod numerami nagród R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) i R01 HL098217 (PI: Nieman). Wyłączną odpowiedzialność za treść tej publikacji ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nożyczki chirurgiczne - narzędzia naukowe z węglika wolframu 14502-14do cięcia i przytrzymywania skóry
- ząbkowane/proste/12 cmFine Science Tools 11018-12cięcia i przytrzymywania skóry
- węglik wolframu/zakrzywiony/tępo-/14,5 cmFine Science Tools Numer katalogowy: 14519-14   do preparowania i oddzielania tkanek miękkich
Ultra Fine Hemostat - Gładki/Zakrzywiony/12,5 cmFine Science Tools 13021-12do preparowania i oddzielania tkanek miękkich
Kleszcze Graefe - ząbkowane/proste/10 cmFine Science Tools 11050-10do preparowania i oddzielania tkanek miękkich
Dumont #5 Cienkie kleszcze - Wskazówki biologiczne/Proste/Inox/11 cmFine Science Tools Numer katalogowy: 11254-20 Odizolować naczynie od otaczającej tkanki
Kleszcze Dumont #5XL - Końcówki standardowe/Proste/Inox/15 cmFine Science Tools 11253-10Izoluj naczynie od otaczającej tkanki
haczyk - 12 cm/0,3 mm Średnica końcówkiFine Science Tools 10062-12Izoluj naczynie od otaczającej tkanki
Mikroigłowniki CastroviejoFine Science Tools 12061-02Uchwyty do igieł
Nici do szwów 4-0Fine Science Tools 18020-40Do mocowania siekaczy do płytki
Nici do szwów 6-0Fine Science Tools 18020-60Do wszystkich operacji i podwiązań
Igły do szwów KaltFine Science Tools 12050-03
rodamina 6G Sigma83697-1GDo lebel płytek
krwi FeCl3 (Bezwodny)Sigma12321Aby wywołać uszkodzenie naczynia
Chlorowodorek papawerynySigmaP3510Aby zahamować perystaltykę jelit.
Medline Instrument chirurgiczny Sterylizacja Taśmy do autoklawu parowegoMedline111625Aby przymocować mysz do płyty
Fisherbrand™   Filtry strzykawkowe - sterylne 0,22 i mikro; mFisher09-720-004Do sterylizacji roztworów wstrzykiwanych myszom
Fisherbrand™   Filtry strzykawkowe - sterylne 0,45 i mikro; mFisher09-719DDo filtrowania roztworu FeCl3
Sterylna podkładka do przygotowywania alkoholuFisher06-669-62Do sterylizacji miejsca operowanego
Agaroza BioExpressE-3120-500Do produkcji stolika żelowego
Mikroskop fluorescencyjny Leica DMLFSMikroskop przyżyciowyLeica
Platforma GIBRALTAR i system stolików XY z dołączoną płytą grzewczą.npi electronic GmbHhttp://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
oprogramowanie Streampix w wersji 3.17.2NorPixhttps://www.norpix.com/
Kleszczyki Micro-Adson Nożyczki Metzenbaum Fino do

Bibliografia

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zakrzepica indukowana chlorkiem elaza IIImodel t tnicy szyjnejmikroskopia wewn trzoperacyjnaaktywacja p ytek krwitworzenie zakrzepuuszkodzenie naczynioweleki przeciwkrzepliweleki przeciwp ytkoweznakowanie rhodamin 6Gprzeciwcia o PAR4
Modele zakrzepicy myszy indukowanej chlorkiem żelaza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.