Artykuł metodologiczny

Szybka i swoista ocena aktywności peroksydazy halogenującej w próbkach krwi wzbogaconej w leukocyty

DOI:

10.3791/54484

⸱

28 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje szybkie wzbogacanie leukocytów z małych próbek krwi w celu późniejszego specyficznego określenia aktywności halogenującej peroksydazy w komórkach. Metoda może być stosowana do materiału ludzkiego i innego niż ludzki i może przyczynić się do oceny nowych markerów stanu zapalnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisany jest protokół szybkiego i standaryzowanego wzbogacania leukocytów z małych próbek krwi pełnej. Procedura ta opiera się na hipotonicznej lizie erytrocytów i może być stosowana do próbek ludzkich, a także do krwi pochodzenia innego niż ludzki. Mała początkowa objętość próbki wynosząca około 50 do 100 μl sprawia, że metoda ta ma zastosowanie do powtarzających się próbek krwi od małych zwierząt laboratoryjnych. Co więcej, wzbogacenie leukocytów osiąga się w ciągu kilku minut i przy niewielkim wysiłku materiałowym związanym z chemikaliami i oprzyrządowaniem, dzięki czemu metoda ta ma zastosowanie w wielu środowiskach laboratoryjnych.

Standaryzowane oczyszczanie leukocytów jest połączone z wysoce selektywną metodą barwienia w celu oceny aktywności peroksydazy halogenującej peroksydazy hemowej, mieloperoksydazy (MPO) i peroksydazy eozynofilowej (EPO), tj. tworzenia kwasu podchlorawego i podbromowego (HOCl i HOBr). Podczas gdy MPO ulega silnej ekspresji w neutrofilach, najliczniejszym typie komórek odpornościowych w ludzkiej krwi, a także w monocytach, pokrewny enzym EPO ulega ekspresji wyłącznie w eozynofilach. Aktywność halogenująca tych enzymów jest regulowana za pomocą barwnika aminofenylofluoresceiny (APF) prawie specyficznego dla HOCl i HOBr oraz głównego substratu peroksydazy, nadtlenku wodoru. Po późniejszej analizie cytometrii przepływowej wszystkie komórki peroksydazo-dodatnie (neutrofile, monocyty, eozynofile) są rozróżnialne i można określić ilościowo ich aktywność peroksydazy halogenującej. Ponieważ barwienie APF można połączyć z zastosowaniem markerów powierzchniowych komórek, protokół ten można rozszerzyć, aby specyficznie zająć się podfrakcjami leukocytów. Metoda ma zastosowanie do wykrywania wytwarzania HOCl i HOBr zarówno w leukocytach ludzi, jak i gryzoni.

Biorąc pod uwagę szeroko i różnorodnie dyskutowaną immunologiczną rolę tych produktów enzymatycznych w przewlekłych chorobach zapalnych, ten protokół może przyczynić się do lepszego zrozumienia immunologicznego znaczenia peroksydaz hemowych pochodzących z leukocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leukocyty wielojądrzaste (PMN, zwane również granulocytami) i monocyty reprezentują ważne składniki komórkowe wrodzonego układu odpornościowegowe krwi 1,2. Przyczyniają się do podstawowej obrony przed patogenami, a także do aktywacji nabytego układu odpornościowego i zainicjowania ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej2-4. Jednak szczególnie neutrofile, najliczniejszy typ granulocytów, oraz monocyty również znacząco przyczyniają się do regulacji i zakończenia ostrych zdarzeń zapalnych5. Dlatego komórki te mogą również odgrywać ważną rolę w przewlekłych chorobach zapalnych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów6,7. W rzeczywistości astma, przewlekła choroba zapalna dróg oddechowych, charakteryzuje się upośledzoną apoptozą eozynofili, drugiego co do wielkości typu granulocytówwe krwi. Jednak apoptoza granulocytów i ich szybkie usuwanie przez makrofagi to dwa zasadnicze etapy podczas komórkowego zakończenia zapalenia9-11.

W wymienionych komórkach odpornościowych można znaleźć dwa blisko spokrewnione enzymy, a mianowicie mieloperoksydazę (MPO, neutrofile i monocyty) oraz peroksydazę eozynofilową (EPO, eozynofile)12,13. Te peroksydazy hemowe są klasycznie związane z humoralną odpowiedzią immunologiczną, ponieważ dwuelektronicznie utleniają (pseudo)halogenki do odpowiednich kwasów hipo(pseudo)halawych, które są znane ze swoich właściwości bakteriobójczych14-16. W warunkach fizjologicznych MPO tworzy głównie kwas podchlorawy (HOCl) i hipotiocyjanit (-OSCN), podczas gdy ten ostatni i kwas podbromowy (HOBr) są tworzone przez EPO17-19. Nowe wyniki sugerują, że ta aktywność enzymu (pseudo)halogenującego może również przyczyniać się do regulacji odpowiedzi zapalnych i zakończenia reakcji immunologicznych20,21. W rzeczywistości wykazano, że produkcja HOCl przez MPO i produkty pochodne hamuje adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne oparte na limfocytach T22-24.

Aby uzyskać więcej informacji na temat immunologicznej roli leukocytów z wrodzonego układu odpornościowego w przewlekłych chorobach zapalnych i określić wkład MPO i EPO w tę fizjologiczną funkcję, opracowaliśmy metodę szybkiego wzbogacania leukocytów z małych próbek krwi w celu późniejszego specyficznego określenia aktywności peroksydazy halogenującej w tych komórkach. Do zmniejszania liczby erytrocytów wybraliśmy standardową metodę, obejmującą dwa kolejne etapy lizy hipotonicznej wodą destylowaną, co prowadzi do szybkiego wzbogacenia leukocytów przy niskich kosztach materiałowych. Do późniejszego oznaczania aktywności halogenujących MPO i EPO wykorzystano barwnik specyficzny dla HOCl i HOBr, aminofenylofluoresceinę (APF)25-27. W przeciwieństwie do stosowania niespecyficznych metod barwienia peroksydazą28,29, podejście to pozwala na selektywne wykrywanie aktywności peroksydazy halogenującej, która często jest upośledzona przy ciężkim zapaleniu30,31.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki ludzkiej krwi zostały pobrane od zdrowych ochotników, a zastosowany protokół wzbogacania leukocytów jest zgodny z wytycznymi komisji etyki Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Lipsku. Eksperymenty z krwią szczurów zostały zatwierdzone przez właściwą lokalną komisję etyczną (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), zgodnie z niemieckimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.

1. Konfiguracja eksperymentalna

UWAGA: Ponieważ procedura hipotonicznej lizy w celu wyczerpania erytrocytów z próbek krwi jest procedurą krytyczną czasowo, przygotuj wcześniej cały niezbędny sprzęt (np.) dla tej części protokołu.

  1. Oznaczyć jedną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml do lizy hipotonicznej i jedną probówkę o pojemności 1,5 ml do późniejszego barwienia aminofenylofluoresceiną (APF) na próbkę krwi.
    1. Jeśli wzbogacanie leukocytów będzie wykonywane w sterylnych warunkach, należy wykonać to znakowanie w skrzynce przepływowej.
  2. Przygotować około 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 10 mM) na próbkę. W zależności od tego, czy leukocyty mają być izolowane w warunkach sterylnych, czy nie, PBS należy przygotować przy użyciu sterylnego roztworu dostarczonego przez dostawcę lub przez rozpuszczenie tabletek PBS w wodzie destylowanej. Sprawdź wartość pH i, jeśli to konieczne, dostosuj do pH 7,4, używając niewielkich ilości 0,1 M roztworów HCl i NaOH.
    1. Rozpuścić tabletki PBS (patrz tabela materiałów) w 200 ml wody destylowanej, aby otrzymać niesterylny roztwór buforowy wystarczający na około 16 próbek. W razie potrzeby wysterylizuj ten roztwór przez sterylną filtrację.
  3. Przygotować około 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego o Ca2+ na próbkę.
    1. Rozpuścić 970 mg soli HBSS w 100 ml (objętość końcowa) podwójnie destylowanej wody. Przed napełnieniem do końcowej objętości sprawdź wartość pH i dostosuj ją do pH 7,4. Ze względu na małą pojemność buforową, bufor ten należy przygotowywać na świeżo każdego dnia i przeprowadzać regulację pH ze szczególną ostrożnością, używając niewielkich ilości 0,1 M roztworów HCl i NaOH.
      UWAGA: Można użyć sterylnego roztworu, w zależności od eksperymentu. Roztwór może być sterylizowany przez sterylną filtrację.
  4. Oprócz dwóch, należy wcześniej oznaczyć i przygotować probówkę (np. 50 ml probówkę wirówkową) lub kolbę (np. miarkę o pojemności 250 ml) z podwójnie destylowaną wodą do procedury lizy hipotonicznej. Przygotować około 10 ml wody na próbkę.
  5. Przygotuj pojemnik z pokruszonym lodem do barwienia APF (sekcja 3), które odbywa się na lodzie.
  6. Przygotować porcje APF z wyprzedzeniem, aby umożliwić szybkie przygotowanie roztworów roboczych używanych podczas barwienia (etap 3.2) i uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania roztworu APF.
    UWAGA: APF jest powszechnie otrzymywany w postaci roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml (11,81 mM) w octanie metylu.
    1. Zamrozić podwielokrotności 10-100 μl w probówkach o pojemności 0,5 ml. Do barwienia APF stosuje się końcowe stężenie barwnika 10 μM (krok 3.8).

2. Hipotoniczna liza erytrocytów

UWAGA: Wykonaj etapy lizy hipotonicznej (z wyjątkiem etapów wirowania) pod stołem do przepływu laminarnego, aby uniknąć zanieczyszczenia. Całą procedurę wykonaj w temperaturze pokojowej. Ponieważ liza hipotoniczna jest procesem krytycznym pod względem czasu, należy wcześniej wyregulować pipety do dodawania wody (2 ml) i PBS (5 ml) oraz otworzyć kolby z wodą i PBS przed rozpoczęciem procedury. Przed użyciem należy przechowywać roztwór PBS i wodę destylowaną w temperaturze pokojowej.

  1. Z każdej próbki krwi przenieść 100 μl do odpowiedniej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: W naszych eksperymentach próbki krwi zwykle zawierają 10 j./ml heparyny, aby uniknąć krzepnięcia. Jednak ze względu na różne źródła materiału próbki, charakter i stężenie antykoagulantu mogą się różnić. Jego wpływ na barwienie APF należy zbadać poprzez porównanie wyników z wynikami uzyskanymi z próbek krwi uzupełnionych innymi typami lub stężeniami antykoagulantu.
  2. Dodać 2 ml wody destylowanej i wymieszać próbki za pomocą mieszalnika wirowego ustawionego na średni poziom. Inkubować próbki przez 60 sekund, następnie dodać 5 ml PBS na próbkę i wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego.
    UWAGA: Równolegle można przygotować do około 5 próbek. Kolejność próbek powinna być taka sama dla dodawania wody i PBS, aby osiągnąć porównywalne czasy inkubacji.
  3. Po regeneracji warunków izotonicznych przez dodanie PBS (etap 2.2), pozostałe nienaruszone komórki we wszystkich próbkach należy osadzać przez wirowanie przez 6 minut w temperaturze pokojowej i 450 x g.
  4. Usunąć supernatant, wlewając go do stołowego kosza na śmieci. Usuń jak najwięcej płynu, odwracając probówkę wirówkową i stukając otworem w ręcznik papierowy. Upewnij się, że osad komórkowy jest tak suchy, jak to możliwe.
  5. Powtórzyć procedurę lizy hipotonicznej, jak opisano wcześniej (krok 2.2).
    UWAGA: Zasadniczo ta procedura lizy hipotonicznej (kroki od 2.3 do 2.5) może być powtarzana więcej niż jeden raz, w zależności od czystości mieszanej frakcji leukocytów, która ma zostać uzyskana. Po dwóch etapach lizy udział pozostałych erytrocytów w uzyskanej frakcji mieszanej komórek wynosi około 25%.
  6. Pozostałe nienaruszone komórki osadzać przez odwirowywanie przez 6 minut w temperaturze pokojowej i 450 x g. Usunąć supernatant (patrz krok 2.4). Dodać 500 μl HBSS do osadu i delikatnie rozpuścić go aż do uzyskania jednorodnego roztworu. Przenieść każdą próbkę do odpowiednio oznakowanej probówki z próbką o pojemności 1,5 ml.
  7. W zależności od doświadczenia bezpośrednio analizować otrzymane próbki (np. za pomocą cytometrii przepływowej)25, barwić przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie (w celu identyfikacji pojedynczych typów komórek)32, inkubować z bodźcami komórkowymi (w przypadku eksperymentów z aktywacją komórek)33 lub przechowywać na lodzie i używać później. W zależności od celu badania należy natychmiast wykonować kolejne eksperymenty na mieszanej frakcji leukocytów, ponieważ granulocyty mają dość krótki okres półtrwania wynoszący około 20 godzin.
    UWAGA: Dotyczy to również barwienia aktywnością peroksydazy opisanego poniżej.

3. Barwienie aktywności peroksydazy halogenującej

UWAGA: Produkcja HOCl i HOBr przez krwiopochodne peroksydazy hemowe MPO i EPO jest oznaczana ilościowo za pomocą APF, który jest utleniany do fluoresceiny przez wymienione kwasy podhalowe. Dlatego, jeśli znakowanie komórek przeciwciałami znakowanymi fluorescencją odbywa się w połączeniu z barwieniem APF, należy unikać fluoroforów, które zakłócają sygnał emisyjny fluoresceiny.

  1. Barwienie APF należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C na lodzie.
  2. W celu przygotowania roztworu roboczego APF należy rozmrozić odpowiednią porcję barwnika (np. 10 μl, 11,81 mM) i rozcieńczyć go HBSS dokładnie do 1 mM (np. dodać 108,1 μl buforu do 10 μl).
    1. Dla każdej próbki (500 μl roztworu komórkowego) należy przygotować 5 μl opisanego roztworu roboczego APF. W związku z tym należy użyć jednej 10 μl podwielokrotności APF (11,81 mM), co daje 118,1 μl roztworu roboczego APF (1 mM) do przygotowania około 20 próbek. Ze względu na straty podczas pipetowania należy przygotować około 10% więcej roztworu roboczego APF niż obliczono.
  3. W celu sprawdzenia swoistości peroksydazy barwienia APF należy przygotować próbki kontrolne z inhibitorem peroksydazy hemowej hydrazydem kwasu 4-aminobenzoesowego (4-ABAH)35.
    1. Przygotować 1 M roztwór podstawowy 4-ABAH (151,17 g/mol) w dimetylosulfotlenku (DMSO), rozcieńczając 75,6 mg 4-ABAH w 500 μl rozpuszczalnika. Dalej rozcieńczyć 4-ABAH 1/10 w HBSS.
  4. W celu przygotowania roztworu roboczegoH2O2należy oznaczyć dwie probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml odpowiednio "70 mM H2O 2" i "7 mM H2O2" .
    1. W probówce oznaczonej jako "70 mM H2O2" świeżo rozcieńczyć 10 μl 30% roztworu podstawowego (8,8 mM)H2O2przy użyciu 990 μl wody destylowanej, aby uzyskać stężenie około 88 mM. Przechowywać na lodzie i zużyć w ciągu 4 godzin
      UWAGA:H2O2 jest zwykle dostarczany przez dostawców jako 30% roztwór podstawowy. Przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C jest stabilny przez około 3 lata. Przeprowadzić rozcieńczeniaH2O2w wodzie destylowanej, aby uniknąć rozkładu. RozcieńczeniaH2O2można również przygotować w 0,1 M roztworze NaOH.
    2. W celu oznaczenia dokładnego stężeniaH2O2należy przygotować dalsze rozcieńczenie 1-10 z pierwszego roztworu podstawowegoH2O2(około 88 mM), dodając 100 μl z tego roztworu do 900 μl wody destylowanej w probówce o pojemności 1,5 ml oznaczonej "7 mM H2O2".
    3. Zarejestrować widmo w bliskim zakresie UV (np. 200-300 nm) za pomocą fotospektrometru UV-Vis i użyć absorbancji przy 240 nm (ε240 = 34 M-1 cm-1) w celu określenia rzeczywistego stężeniaH2O2w drugim roztworze podstawowymH2O234. Upewnij się, że kuweta referencyjna zawiera tylko wodę destylowaną. Do pomiaru należy użyć kuwet kwarcowych, ponieważ rejestrowane jest widmo w zakresie UV.
    4. Na podstawie tego wyniku należy obliczyć dokładne stężenia obu roztworów podstawowychH2O2. Dostosować stężenie pierwszego roztworu podstawowego w probówce z próbką "70 mMH 2O2" dokładnie do 70 mM, dodając odpowiednią ilość wody destylowanej. Otrzymany roztwór roboczy należy przechowywać na lodzie i zużyć w ciągu jednej godziny.
  5. Dodać 5 μl roztworu roboczego 4-ABAH (100 mM) do odpowiednich próbek, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze przed dodaniem APF.
  6. Dodać 5 μl roztworu roboczego APF (1 mM) do każdej próbki o objętości 500 μl, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika wynoszące 10 μM. Próbki należy delikatnie wymieszać (np. przy użyciu mieszalnika wirowego na poziomie pożywki) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Dodać 5 μl roztworu roboczego H2O2 (70 mM) do każdej próbki o objętości 500 μl, aby uzyskać końcowe stężenie 700 μM. Delikatnie wymieszać próbki i inkubować je przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Wykonać odpowiednie pomiary kontrolne równolegle.
    UWAGA: Pomiary kontrolne wykazały, że 700 μMH2O2 nie jest toksyczne dla komórek. Nie zaobserwowano również żadnych istotnych odpowiedzi komórkowych.
    UWAGA: Barwienie APF można również przeprowadzić z pominięciem dodatkuH2O2, w zależności od kwestii naukowej. W przypadku braku nadtlenku wodoru określa się tylko podstawową aktywność chlorowania, MPO i EPO, podczas gdy dodanieH2O2pozwala na wykrycie maksymalnej produkcji HOCl i HOBr przez komórki. To ostatnie oznacza znacznie wyższy sygnał fluorescencyjny.
  8. W celu granulowania komórek należy odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej i 400 x g. Dokładnie usunąć supernatant bez niszczenia osadu i dodać 250 μl HBSS w celu ponownego zawieszenia komórek.
    UWAGA: Próbki są teraz gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej25.
  9. Przechowuj próbki w ciemności do czasu analizy, aby uniknąć bielenia. Po wzbudzeniu przy 480-490 nm wykryj emisję fluoresceiny przy około 525 nm37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak informowaliśmy wcześniej, metoda opisana powyżej okazała się mieć zastosowanie zarówno do materiału ludzkiego, jak i nie-ludzkiego32. Ponadto, jak wykazano w przypadku myszy z objawami astmatycznymi, barwienie APF może być odpowiednim narzędziem do wykrywania różnic w ogólnoustrojowym stanie prozapalnym. Dlatego w kolejnym badaniu zastosowaliśmy ten protokół do wielokrotnej oceny aktywności halogenującej MPO (i EPO) u samic szczurów Dark Agouti z zapaleniem stawów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ neutrofile są najliczniejszymi leukocytami we krwi ludzkiej, izolacja komórek z dodatnim wynikiem peroksydazy często koncentruje się tylko na tych komórkach i obejmuje oddzielenie neutrofili od innych leukocytów przez wirowanie w gradiacji gęstości38. Ponieważ jednak neutrofile występują znacznie rzadziej w próbkach krwi mysiej39 , w przypadku tych ostatnich konieczne jest zastosowanie bardziej skomplikowanych metod40. Ponadto obie metody prowadzą również do usunięcia z próbek mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była możliwa dzięki finansowaniu z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (BMBF, 1315883), jak również dzięki projektowi Sächsische Aufbaubank (SAB) 100116526 z funduszy Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały/Wyposażenie
Probówki wirówkowe 15 mlVWR/Corning734-0451-1,5
ml Probówki do próbekVWR/Eppendorf211-2130DE
Pipety do objętości do 5 mlEppendorfnp. , 3120000070Używamy pipet Eppendorf Resarch plus o regulowanych objętościach w zakresie 1-10 i mikro; l, 10-100 i mikro; l, 100-1,000 i mikro; l an 500-5,000 &mikro; l
ławka z przepływem laminarnymThermo Electron CorperationMieszalnik HeraSafe-Vortex
Giętarka & Hobein AGWirówka stołowa Vortex Genie 2
laboratoryjne KendroLaborfuge 400RWirówka powinna być używana przy 450 x g
Mała wirówkaEppendorf5415DWirówka powinna być używana przy 400 x g
InkubatorHeraeuscytoperm 2Ustawienia: 37 ° C, wilgotność 95%, zawartość CO2
Spektrofotometr UV-VisVarianCary 50 bioWidmo między 200 a 300 nm musi być rejestrowane. W związku z tym należy zastosować kuwety kwarcowe
Cytometr przepływowyBecton, DickinsonBD Facs CaliburMożna użyć dowolnego cytometru przepływowego, który jest wyposażony w laser odpowiedni do wzbudzenia fluoresceiny (np. , laser argonowy 488 nm)
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)amrescoK812sterylny roztwór, gotowy do użycia
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichP4417tabletki do rozpuszczania w 200 ml miliporowej wody
Hanks zrównoważony roztwór soli (HBSS) z Ca2+Sigma-AldrichH1387970 mg/100 ml, dokładnie sprawdzić i dostosować wartość pH do 7,4
Kwas solnyMerck Millipore1.09057.10001 M roztwór
Wodorotlenek soduRiedel-deHaë n30620Granulki stałe. Dla 1 M roztworu rozpuścić 4 g/100 ml Milipore wody
Aminophenyl fluoresceinCayman101575 mg/ml roztwór (11,81 mM) w octanie metylu, podwielokrotnościach (np. 100 &mikro; l) powinien być przygotowany i przechowywany w temperaturze -20 &; C
Nadtlenek wodoruSigma-AldrichH1009Ten 30% roztwór podstawowy odpowiada stężeniu około 8,8 M. Dalsze rozcieńczenia muszą być świeżo przygotowane w wodzie destylowanej bezpośrednio przed użyciem i określone ilościowo za pomocą pomiarów absorbancji
Hydrazyd kwasu 4-aminobenzoesowego (4-ABAH)Sigma-AldrichA41909Pierwszy roztwór podstawowy 1 M należy przygotować w DMSO, drugi roztwór 100 mM w rozcieńczeniu 1:10 w chemikaliach HBSS
DMSOVWR23500.26-
Produkty

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314(2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wzbogacanie leukocyt wliza hipotonicznausuwanie erytrocyt wpomiar aktywno ci peroksydazybarwienie APFanaliza cytometrycznawykrywanie mieloperoksydazywykrywanie peroksydazy eozynofilowejsubstrat nadtlenku wodoruinhibicja peroksydazy hemowej

Powiązane artykuły