Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54486

⸱

5 września 2016

 ,  ,  ,  , 
1Virus-Cell Interactions Laboratory, Lady Davis Institute for Medical Research, 2Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 3Department of Medicine, McGill University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Streszczenie

Terapie małymi RNA ukierunkowane na etapy postintegracyjne w cyklu replikacji HIV-1 są jednymi z głównych kandydatów do terapii genowej i mają potencjał do wykorzystania jako terapie lekowe w przypadku zakażenia HIV-1. Inhibitory pointegracyjne obejmują rybozymy, krótkie RNA spinki do włosów (sh), małe interferujące RNA (si), RNA interferencji U1 (U1i) i aptamery RNA. Wiele z nich zostało zidentyfikowanych za pomocą przejściowych testów kotransfekcji z plazmidem ekspresji HIV-1, a niektóre przeszły do badań klinicznych. Oprócz miar skuteczności, małe RNA zostały ocenione pod kątem ich potencjału do wpływania na ekspresję ludzkiego RNA, zmiany wzrostu i/lub różnicowania komórek oraz wywoływania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych. W opisanych tutaj protokołach opisano zestaw testów transfekcji przejściowej zaprojektowanych do oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy po integracji w cyklu replikacji HIV-1. Wykorzystaliśmy te testy do identyfikacji nowych rybozymów i optymalizacji formatu shRNA i siRNA ukierunkowanych na RNA HIV-1. Metody te zapewniają szybki zestaw testów, które są przydatne do badań przesiewowych nowych RNA anty-HIV-1 i mogą być dostosowane do badań przesiewowych innych inhibitorów replikacji HIV-1 po integracji.

Wprowadzenie

Ograniczeniem obecnych metod leczenia HIV-1 jest to, że muszą być one podawane przewlekle, aby zapobiec postępowi choroby. Przeszczepienie limfocytów T opornych na HIV-1 lub hematopoetycznych komórek macierzystych może zapewnić długoterminową kontrolę replikacji wirusa HIV-1 w przypadku braku terapii farmakologicznej1,2 i może być również skutecznym podejściem do uzyskania wyleczenia z HIV-13. Jednym ze sposobów uodparnienia komórek na replikację wirusa HIV-1 jest wstawienie jednego lub więcej genów kodujących RNA lub peptydy anty-HIV-1 do komórek zakażonej osoby podczas przeszczepu autologicznego4. Zaprojektowano kilka potencjalnych genów anty-HIV-1, a niektóre z nich weszły w badania kliniczne w kombinacjach dwóch, 5 lub trzech6, aby zapobiec rozwojowi oporności HIV-1 na którykolwiek pojedynczy gen.

RNA anty-HIV-1 są jednymi z najlepszych kandydatów do skojarzonej terapii genowej ze względu na ich niski potencjał do wywołania odpowiedzi immunologicznej oraz dlatego, że są transkrybowane z bardzo krótkich sekwencji genów. Niektóre RNA anty-HIV-1 zostały zaprojektowane tak, aby celować w wnikanie i integrację wirusa. Jednak większość RNA anty-HIV-1 jest ukierunkowana na etapy po integracji w cyklu życiowym wirusa (Figura 1). Inhibitory po integracji obejmują RNA wabiki, ukierunkowane na białka regulatorowe HIV-1 Tat lub Rev1, oraz RNA oparte na antysensie, ukierunkowane na różne miejsca w RNA HIV-1, takie jak rybozymy7, shRNA8 i RNA U1i9. Metody, które zostały wykorzystane do porównania skuteczności RNA anty-HIV-1, obejmują monitorowanie replikacji wirusa w komórkach transdukowanych genami kodującymi kandydujące RNA i pomiar produkcji wirusa w komórkach przejściowo transfekowanych plazmidami eksprymującymi kandydujące RNA i plazmidem ekspresji HIV-110-13. Wcześniej stosowaliśmy test produkcji HIV-1 do badania przesiewowego RNA HIV-1 pod kątem nowych miejsc docelowych rybozymu13-15. Od tego czasu metody te zostały udoskonalone w celu optymalizacji formatu cząsteczki interferencyjnej RNA wyrażonej z plazmidowego DNA jako shRNA lub dostarczonej jako syntetyczne siRNA16. Test mierzy produkcję dojrzałych wirusów z ludzkich embrionalnych komórek 293T nerki (HEK) i może być wykorzystany do porównania działania inhibitorów, które są ukierunkowane na etapy po integracji w cyklu replikacji HIV-1 (ryc. 1). W przypadku inhibitorów, które są ukierunkowane na etapy wstępnej integracji, potrzebne są alternatywne testy, takie jak test zakaźności komórek TZM-bl17 w celu oceny skuteczności przeciwwirusowej.

Główne obawy dotyczące bezpieczeństwa dostarczania RNA anty-HIV-1 w klinice obejmują potencjalne niezamierzone skutki dla ludzkich RNA lub białek oraz aktywację wrodzonych czujników odpornościowych. Aby ocenić toksyczność siRNA anty-HIV-1, użyliśmy testu żywotności komórek w różnych liniach komórkowych16. Zmierzyliśmy również aktywację dwuniciowych czujników immunologicznych RNA, kinazy białkowej R aktywowanej RNA (PKR) i receptora Toll podobnego 3 (TLR3), a także ekspresję genu stymulowanego interferonem, ADAR1 p150. Testy te można wykorzystać do potwierdzenia, że skuteczność RNA anty-HIV-1 nie wynika z pośredniego wpływu na żywotność komórek lub aktywację czujnika immunologicznego. Są one również przydatne w wykluczaniu potencjalnych RNA o potencjalnej toksyczności z dalszego rozwoju.

W poniższych protokołach opisane są procedury identyfikacji nowych terapeutycznych RNA i optymalizacji formatu istniejących. Metody te są przydatne do badań przesiewowych inhibitorów replikacji HIV-1 opartych na RNA i mogą być dostosowane do badań przesiewowych innych inhibitorów po integracji, takich jak małe cząsteczki ukierunkowane na eksport wirusowego RNA18 za pośrednictwem Rev lub systemy CRISPR/Cas zaprojektowane do celowania w zintegrowane DNAHIV-1 19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Komórki i transfekcje

  1. Hodowla komórek HEK 293T w zmodyfikowanym pożywce orła (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną. Przygotować zawiesinę 2 x 105 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowych. Dodać 500, 100 i 1,000 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 24-dołkowych, 96-dołkowych i 12-dołkowych płytek, odpowiednio do testów produkcji wirusa, żywotności komórek i aktywacji immunologicznej (ryc. 2A).
  2. Delikatnie zawirować płytki i inkubować je w temperaturze O/N w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Hoduj komórki do 50-70% zbieżności.
  3. Zgodnie z planem transfekcji przygotuj rozcieńczenia testowych RNA i ich kontroli w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml (przykład, rysunek 2B).
    1. Do oznaczania produkcji wirusa należy przygotować rozcieńczenie plazmidu ekspresji HIV-1 o stężeniu 10 ng/μl i dodać 10 μl do każdej probówki. Następnie należy przygotować 5 μM rozcieńczenia testowanych RNA i RNA kontroli ujemnej. Dodać 2,5 lub 10 μl każdego badanego RNA i rozcieńczenia kontroli ujemnej do odpowiednich probówek dla końcowych stężeń 25 lub 100 nM.
    2. Do oznaczania żywotności komórek należy przygotować 5 μM rozcieńczeń badanych RNA i 10 mg/ml rozcieńczenia RNA kontroli dodatniej, Poly I:C. Dodać 2 μl rozcieńczeń badanego RNA lub RNA kontroli dodatniej do odpowiednich probówek dla końcowych stężeń 100 nM lub 200 μg/ml, odpowiednio.
    3. Do testu aktywacji immunologicznej dodać 20 μl rozcieńczonego RNA testowego lub RNA kontroli dodatniej przygotowanych w kroku 1.3.2. do odpowiednich probówek dla odpowiednich stężeń końcowych odpowiednio 100 nM lub 200 μg/ml.
      Uwaga: Do badania plazmidów ekspresji RNA należy przygotować rozcieńczenia 10 ng/μl zamiast 5 μM rozcieńczeń badanych RNA, podając końcowe ilości 25 i 100 ng dla kroku 1.3.1. i 100 ng dla kroków 1.3.2. oraz 1.3.3.
  4. Dodać 50, 25 lub 75 μl DMEM do każdej probówki do transfekcji w celu przeprowadzenia testów produkcji wirusa, żywotności komórek i aktywacji immunologicznej. W przypadku testów produkcji wirusa przed kolejnym krokiem należy przynieść komórki i przygotowane probówki do transfekcji do laboratorium na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3).
  5. Dodać kolejno 2 μl odczynnika do transfekcji do probówek do transfekcji i inkubować przez 15 do 20 minut, aby umożliwić utworzenie się kompleksów. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnym odczynnikiem do transfekcji, który ma być użyty.
  6. Dodać kroplami całą mieszaninę transfekcji z każdej mikroprobówki do odpowiednich pozycji na płytkach do hodowli komórkowych. Delikatnie obracać i inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  7. Zmierz produkcję HIV-1 (sekcja 2), żywotność komórek (sekcja 3) i aktywację immunologiczną (sekcja 4) na płytkach do hodowli komórkowych (ryc. 2C).

2. Test produkcji wirusa

  1. Wyjmij 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z inkubatora i delikatnie zakręć płytkami wewnątrz kaptura do hodowli komórkowych BSL3. Przenieść 150 μl supernatantu z każdej studzienki do odpowiadającej jej studzienki w 96-dołkowej płaskiej płytce dennej, która zostanie wykorzystana do ilościowego określenia produkcji HIV-1.
    Uwaga: Typowe testy ilościowe wirusa obejmują pomiar ekspresji białka kapsydu HIV-1 (p24) za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)20, ilościowe oznaczanie wirusowego RNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)21 oraz pomiar aktywności enzymu RT HIV-1. Kroki od 2.2 do 2.5 wyjaśniają metody ilościowego określania aktywności RT HIV-113,15,16.
  2. Przenieść 5 μl supernatantu do odpowiednich studzienek na 96-dołkowej płytce, zawierającej 25 μl koktajlu wirusowego15 (Tabela 1). Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść płytkę do stacji roboczej radioaktywności.
    Uwaga: Krok 2.2. jest konieczne tylko wtedy, gdy stacja robocza do promieniotwórczości nie jest dostępna w laboratorium BSL3. Jeśli płytki nie muszą być usuwane z laboratorium BSL3, przejdź do kroku 2.3. i dodać 50 μl koktajlu radioaktywnego/wirusowego (tabela 1) w miejsce 25 μl koktajlu radioaktywnego.
  3. Przygotować radioaktywny koktajl15 (Tabela 1) i dodać 25 μl do każdej studzienki supernatantu wirusowego i koktajlu zakłócającego. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  4. Umieścić 5 μl mieszaniny reakcyjnej na odpowiednich kwadratach w bibule z maty filtracyjnej z włókna szklanego Di Ethyl Amino Ethyl (DEAE) i pozostawić plamy do wyschnięcia na 10 minut. Mieszaninę reakcyjną należy rozmieścić na co drugim kwadracie, tak aby żadne dwie próbki nie stykały się bezpośrednio ze sobą. Pomaga to uniknąć krzyżowania się między próbkami podczas określania liczby na minutę (cpm) w kroku 2.6.
  5. Umyj papiery 5x przez 5 minut 2x buforem z soli fizjologicznej (SSC) (Tabela 1), a następnie dwa 1-minutowe płukanie 95% etanolem. Pozostaw papiery do wyschnięcia i zamknij je w workach na próbki.
  6. Włożyć worki na próbki zawierające bibułę z matą filtracyjną do kasety i włożyć kasetę do licznika scyntylacyjnego mikropłytek. Ustaw licznik tak, aby odczytywał cpm dla 32P z datą odniesienia podaną dla partii [32P]dTTP użytej w eksperymencie. Wybierz próbki do odczytu, korzystając z mapy płyt i uruchom licznik.
  7. W przypadku dowolnej metody oznaczania ilościowego wirusa należy podzielić wartości uzyskane dla każdego badanego RNA przez sąsiednią kontrolę ujemną i pomnożyć tę wartość przez 100, aby uzyskać procentowe zahamowanie produkcji HIV-1 dla każdej kontrpróby testowanych RNA. Przykład wyników porównujących różne badane RNA w różnych stężeniach przedstawiono na rysunku 3.

3. Test żywotności komórek

  1. Wyjąć 96-dołkowe płytki z inkubatora i dodać 20 μl 5 mg/ml MTT (bromek 3-[4,5-dimetylo-2-tiazolylo]-2,5-difenylo-2H-tetrazoliowy) rozcieńczonego w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco do każdego dołka. Inkubować płytki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Dodać 150 μl zakwaszonego izopropanolu z detergentem (1% NP-40, 4 mM HCl w izopropanolu) do każdego dołka i inkubować płytki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Oznaczyć absorbancję przy długości fali 570 nm w spektrofotometrze mikropłytkowym.
  4. Obliczyć względny metabolizm MTT dla każdej kontroli dodatniej i badać RNA, dzieląc wartość uzyskaną dla każdej próbki przez przylegającą do niej kontrolę transfekcji. Przykład wyników porównujących różne testowane RNA i kontrolę pozytywną przedstawiono na rysunku 4.

4. Test aktywacji immunologicznej

  1. Wyjąć 12-dołkowe płytki z inkubatora i odessać pożywkę hodowlaną. Delikatnie przemyć komórki dwukrotnie DPBS i dodać 70 μl buforu do lizy zimnej22 (w tym inhibitory proteazy i fosfatazy, Tabela 1) do każdej studzienki. Inkubować płytki przez 10 minut na lodzie.
  2. Przenieś lizaty komórkowe do mikroprobówek i szybko je zamroź, zanurzając probówki w ciekłym azocie. Pozostawić próbki do rozmrożenia i powtórzyć te czynności przez kolejne 2 cykle zamrażania i rozmrażania, w sumie 3.
  3. Odwirowywać lizaty przez 15 minut w temperaturze 4 °C, 15 700 x g, w celu rozdrobnienia resztek komórek. Przenieść supernatant do nowych mikroprobówek i oznaczyć stężenie białka metodą błękitu Coomassie (Bradford)23,24.
  4. Rozpuść 75 μg białka z każdej próbki w 10% denaturującym żelu poliakrylamidowym i przenieś do membrany nitrocelulozowej, jak opisano wcześniej25,26.
  5. Po elektroforezie i przeniesieniu do membrany należy odsłonić prążki białkowe poprzez inkubację błony w Pąsie S (Tabela 1) przez 1 minutę, a następnie przemycie w wodzie podwójnie destylowanej. Użyj taśm i drabinki białkowej jako prowadnicy, aby przeciąć membranę przy 80 i 55 kDa.
    Uwaga: W kroku 4.4 próbki można badać na żelach o wymiarach 16 x 18 cm2 o natężeniu do 34 kDa, dzięki czemu łatwo jest przeciąć membranę w określonych pozycjach i nie przecinać interesujących nas pasm. Alternatywnie, można uruchomić kilka żeli z tymi samymi próbkami, aby uniknąć przecięcia membrany.
  6. Zmyj barwnik Ponceau S solą fizjologiczną buforowaną Tris zawierającą 0,05% Tween 20 (TBST, Tabela 1). Dodaj TBST z 5% beztłuszczowym mlekiem, aby całkowicie pokryć błony. Inkubować błony w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 1 godzinę.
  7. Inkubować błony O/N w TBST z 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i przeciwciałami rozcieńczonymi do 1 na 1000 przeciwko ADAR1 (110 i 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa) i fosfo-IRF3 (47 kDa), odpowiednio dla górnej, środkowej i dolnej części błony.
  8. Przemyć membrany 5x przez 5 minut TBST i inkubować w TBST z 5% mlekiem beztłuszczowym i kozimi przeciwciałami drugorzędowymi przeciwko królikom znakowanymi peroksydazą (rozcieńczonymi do 1 na 5 000) przez 1 godzinę.
  9. Przemyj membrany 5x przez 5 minut za pomocą TBST i nałóż roztwór elektrochemiluminescencji (ECL), aby uwidocznić pasma na foliach zgodnie z instrukcjami producenta.
  10. Po uwidocznieniu prążków białkowych na foliach, przemyj środkową i dolną część membrany przez 10 minut roztworem do usuwania przeciwciał. Inkubować błony O/N w TBST z 3% BSA i przeciwciałami przeciwko całkowitemu PKR (w stężeniu 1 na 500) i IRF3 (w stężeniu 1 na 1 000), odpowiednio dla części środkowej i dolnej. Powtórz kroki 4.8. oraz 4.9. przy użyciu znakowanego peroksydazą koziego przeciwciała anty-mysiego zamiast przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi dla błony PKR (środek).
  11. Przemyć dolną część membrany 5x przez 5 minut TBST i inkubować membranę w TBST z 3% BSA przez 1 godzinę z przeciwciałem przeciwko aktynie (rozcieńczonym do 1 na 5 000). Powtórz kroki 4.8. oraz 4.9. przy użyciu znakowanego peroksydazą koziego przeciwciała anty-mysiego zamiast przeciwciała wtórnego anty-królika. Przykład wyników porównujących różne testowe RNA i kontrolę pozytywną przedstawiono na rysunku 5. Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi przeciwciałami, które należy zastosować.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat procedur przedstawiono na Rysunku 2, natomiast przykładowy plan transfekcji dla trzech badanych RNA oraz RNA kontrolnego zamieszczono na Rysunku 2B>. W przypadku produkcji wirusa i testów żywotności komórek, wynik dla każdej badanej konstrukcji jest normalizowany względem kontroli negatywnej. Powtórzenia są transfekowane w zestawach, tak aby każde badane RNA było normalizowane względem przypisanej mu kontroli negatywnej. Postępowanie to ma ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany test produkcji HIV-1 został przeprowadzony przy użyciu komórek HEK293T (ryc. 2) i jest podobny do testów stosowanych do badań przesiewowych RNA HIV-1 pod kątem skutecznych miejsc docelowych rybozymu13, shRNA10,29, siRNA30 i U1i RNA11,31 . Stosując różne metody ilościowego określania produkcji HIV-1, w większości badań mierzono produkcję wirusa 48 godzin po jednoczesnej transfekcji plazmidu ekspresji HIV-1 z kandydującymi RNA. Po wytworzeniu HIV-1 niedoj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca przedstawiona tutaj była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) (granty DCB-120266, PPP-133377 i HBF-348967 dla A.G.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicylina/Streptomycyna GibcoThermo Fisher15140-122
Płytki do hodowli komórkowych, 96 dołków, 24 dołki, 6 dołków.Corning353075, 353047, 353043
Mikrorurki AxygenCorning311-08-051
Niskocząsteczkowy Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01odczynnik do transfekcji do syntetycznych RNA
TransIT-LT1MirusMIR 2300odczynnik do transfekcji plazmidów
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
matryca poli(A) RNA Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 Starter DNAThermo Fisher18418-012
Papier do maty filtracyjnej DEAE Perkin Elmer1450-522
Licznik scyntylacyjny mikropłytekPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Spektrofotometr mikropłytkowyBio-rad1706930
Tabletki buforowe do lizyRoche4693159001, 4906837001inhibitory proteaz i fosfataz
MikrowirówkaEppendorf5415R
Odczynnik BradfordBio-rad500-0006
Żelowa komora biegowaHoeferSE600
Półsucha komórka transferowaBio-rad1703940
Drabinka białkowa EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Membrana nitrocelulozowaBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Roztwór do usuwania przeciwciałMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher 
Przeciwciałood dr B.L. Bassa
Przeciwciało fosfo-T446-PKRAbcamab32036
fosfo-S396-IRF3Sygnalizacja komórkowaPrzeciwciało
PKRod dr A. Hovanessian
MilliporeMAB1501
Koza znakowana peroksydazą anty-królikKPL474-1506
Koza znakowana peroksydazą anty-mysieKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5
ekspresji RNAPI32106 ADAR1 Przeciwciało 4947 Przeciwciało IRF3 Sygnalizacja komórkowa 11904 Przeciwciało aktynowe

Bibliografia

  1. Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).
  2. Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50(2015).
  3. Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
  4. DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
  5. Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236(2015).
  6. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43(2010).
  7. Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
  8. Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
  9. Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
  10. McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55(2009).
  11. Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
  12. Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
  13. Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178(2014).
  14. Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
  15. Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
  16. Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
  17. Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
  18. Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
  19. Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22(2015).
  20. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  21. Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
  22. Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96(2013).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  25. Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
  26. Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
  27. Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
  28. Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
  29. ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
  30. Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80(2007).
  31. Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
  32. Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
  33. Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
  34. Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
  35. Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
  36. Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).
  37. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
  38. Riss, T. L., et al. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
  39. Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
  40. Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Celowanie w RNA HIV 1test skuteczno ci RNAprzesiew toksyczno ci RNAtest przej ciowej transfekcjitest produkcji wirusatest ywotno ci kom rektest aktywacji odporno ciowejoptymalizacja rybozym wprojektowanie shRNA i siRNAprotok laboratorium BSL 3
Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.