Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.
Artykuł metodologiczny
Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomimo zdolności regeneracyjnej mięśni szkieletowych, trwałe deficyty funkcjonalne i/lub kosmetyczne (np. utrata objętości mięśni (VML) wynikająca z urazów, chorób i różnych wrodzonych, genetycznych i nabytych schorzeń są dość powszechne. Technologie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej mają ogromny potencjał, aby zapewnić rozwiązanie terapeutyczne. Jednak wykorzystanie biologicznie istotnych modeli zwierzęcych w połączeniu z podłużnymi ocenami odpowiednich wskaźników funkcjonalnych ma kluczowe znaczenie dla opracowania ulepszonych terapii regeneracyjnych w leczeniu urazów podobnych do VML. W związku z tym komercyjny system dźwigni mięśniowych może być używany do pomiaru parametrów długości, napięcia, siły i prędkości w mięśniach szkieletowych. Użyliśmy tego systemu, w połączeniu z dwufazowym stymulatorem o dużej mocy, do pomiaru produkcji siły in vivo w odpowiedzi na aktywację przedniego przedziału podudziowego kończyny tylnej szczura. Wcześniej używaliśmy tego sprzętu do oceny funkcjonalnego wpływu uszkodzenia VML na mięsień piszczelowy przedni (TA), a także zakresu funkcjonalnej regeneracji po leczeniu uszkodzonego mięśnia TA za pomocą naszej technologii naprawy mięśni metodą inżynierii tkankowej (TEMR). W takich badaniach lewa stopa znieczulonego szczura jest bezpiecznie zakotwiczona w płycie stopy połączonej z serwomotorem, a wspólny nerw strzałkowy jest stymulowany przez dwie przezskórne elektrody igłowe w celu wywołania skurczu mięśni i zgięcia grzbietowego stopy. Skurcz mięśni wywołany stymulacją nerwu strzałkowego jest mierzony w zakresie częstotliwości stymulacji (1-200 Hz), aby zapewnić ostateczne plateau w produkcji siły, które pozwala na dokładne określenie szczytowej siły tężcowej. Oprócz oceny zakresu uszkodzenia VML, a także stopnia odzyskania funkcji po leczeniu, metodologia ta może być łatwo zastosowana do badania różnych aspektów fizjologii i patofizjologii mięśni. Takie podejście powinno pomóc w bardziej racjonalnym opracowaniu ulepszonych terapii naprawy i regeneracji mięśni.
Wprowadzenie
Mięśnie szkieletowe mają niezwykłą wewnętrzną zdolność do naprawy w odpowiedzi na uraz lub chorobę1,2. Doświadczalnie solidność tej reakcji regeneracyjnej została dobrze udokumentowana w modelach zwierzęcych, badając na przykład przebieg w czasie uszkodzenia, naprawy i regeneracji mięśni szkieletowych po zastosowaniu miotoksyn (np. kardiotoksyny)3-7. Mówiąc dokładniej, po rozległym uszkodzeniu mięśni wywołanym przez kardiotoksynę (38-67% włókien mięśniowych8), w regeneracji pośredniczą komórki satelitarne, rezydujące komórki macierzyste, które dojrzewają, aby ostatecznie stać się funkcjonalnymi włóknami mięśniowymi4,9-13. Efektem końcowym jest zwiększona regeneracja funkcjonalna zdrowej, wytwarzającej siłę tkanki mięśniowej po uszkodzeniu14-16. Chociaż szczegóły znacznie wykraczają poza zakres tego raportu, mechanistyczne podstawy regeneracji mięśni odzwierciedlają starannie zaaranżowane zdarzenia wielu typów komórek z wielu linii wykorzystujących kanoniczne szlaki sygnałowe krytyczne zarówno dla rozwoju tkanek, jak i morfogenezy5,17-21. Co ważne, regeneracja indukowana miotoksyną jest możliwa dzięki temu, że macierz zewnątrzkomórkowa, unerwienie neuronów i perfuzja naczyń krwionośnych pozostają strukturalnie nienaruszone po uszkodzeniu mięśni wywołanym kardiotoksyną3,8,22. W przeciwieństwie do tego, te kluczowe struktury i składniki tkankowe są z definicji całkowicie nieobecne w kontekście uszkodzenia VML; gdzie jawna utrata tkanki, spowodowana różnymi przyczynami, skutkuje trwałymi deficytami funkcjonalnymi i kosmetycznymi23-25.
Niezależnie od dodatkowych wyzwań związanych z naprawą i regeneracją mięśni po urazie VML w porównaniu z uszkodzeniem mięśni wywołanym przez miotoksynę, lepsze zrozumienie mechanistycznych podstaw regeneracji i naprawy mięśni szkieletowych, w różnych kontekstach, byłoby dobrze przysłużone przez wykorzystanie biologicznie istotnych modeli zwierzęcych w połączeniu z podłużnymi ocenami odpowiednich miar funkcjonalnych. Jak omówiono w niniejszym dokumencie, badania tylnych kończyn szczura stanowią doskonały system modelowy w tym celu. Mówiąc dokładniej, mięśnie przedniego przedziału podudzia (piszczelowy przedni, prostownik palca długiego (EDL) i paluszek długi (HL)), które są odpowiedzialne za zgięcie grzbietowe stopy, są łatwe do zidentyfikowania i manipulowania. Ponadto są obsługiwane przez główne naczynia krwionośne (biodrowe i gałęzie) i są unerwione przez nerwy (kulszowe i gałęzie, w tym strzałkowe) biegnące wzdłuż nogi26-28. W związku z tym można wykorzystać model kończyn tylnych szczura do bezpośredniej oceny funkcji/patologii mięśni szkieletowych in vivo lub do oceny bardziej pośredniego wpływu zmian związanych z patologią w naczyniach krwionośnych lub nerwach na odpowiednią funkcję mięśni szkieletowych. W każdym scenariuszu nasilenie choroby, a także skuteczność leczenia można określić jako funkcję wytwarzania siły mięśniowej (momentu obrotowego) i odpowiadającego jej ruchu stopy29-34.
Idealnie, pomiarom siły towarzyszą badania histologiczne i analizy ekspresji genów, aby bardziej rygorystycznie ocenić stan strukturalny i molekularny mięśni szkieletowych. Na przykład podstawowa histologia i immunohistochemia są w stanie odpowiedzieć na pytania dotyczące wielkości mięśni, ułożenia włókien mięśniowych, składu macierzy zewnątrzkomórkowej, lokalizacji jąder, liczby komórek i lokalizacji białek. Analiza ekspresji genów jest z kolei niezbędna do identyfikacji mechanizmów molekularnych, które mogą wpływać/modulować dojrzałość włókien mięśniowych, stany chorobowe i aktywność metaboliczną. Chociaż metody te dostarczają kluczowych informacji, na ogół reprezentują końcowe punkty końcowe, a co najważniejsze, nie odnoszą się bezpośrednio do zdolności funkcjonalnej mięśni szkieletowych, a zatem są raczej korelacyjne niż przyczynowe. Jednak, gdy badania histologiczne i analizy ekspresji genów są oceniane w połączeniu ze środkami funkcjonalnymi, można najdokładniej zidentyfikować mechanizmy wytwarzania siły i funkcjonalnej regeneracji.
W związku z tym, zdolność mięśnia do wytwarzania siły może być mierzona in vitro, in situ lub in vivo. Wszystkie trzy podejścia mają zarówno zalety, jak i ograniczenia. Na przykład w eksperymencie in vitro mięsień jest całkowicie izolowany i usuwany z ciała zwierzęcia. Usuwając wpływy naczyń krwionośnych i nerwów, które zaopatrują mięśnie, można określić zdolność kurczliwą tkanki w ściśle kontrolowanym środowisku zewnętrznym35. Badanie mięśni in situ pozwala na wyizolowanie mięśnia, podobnie jak w przypadku preparatów in vitro, jednak unerwienie i dopływ krwi pozostają nienaruszone. Zaletą modelu eksperymentalnego in situ jest to, że pozwala on na badanie pojedynczego mięśnia, podczas gdy unerwienie i dopływ krwi są minimalnie zaburzone36. Zarówno w doświadczeniach in vitro, jak i in situ, leczenie farmakologiczne może być stosowane bardziej bezpośrednio, bez konieczności uwzględniania wpływu jakichkolwiek otaczających tkanek lub wpływu układu krążenia na mierzone reakcje skurczowe37. Jednak testy funkcjonalne in vivo, jak opisano w niniejszym dokumencie, są najmniej inwazyjną techniką oceny funkcji mięśni w ich naturalnym środowisku38 i mogą być wykonywane wielokrotnie w czasie (tj. podłużnie). W związku z tym będzie to centralny punkt poniższej dyskusji.
W tym względzie, przezskórne elektrody umieszczone w pobliżu interesującego mięśnia, lub nerwu ruchowego, który go obsługuje, dostarczają sygnał elektryczny do mięśnia. Następnie przetwornik mierzy wynikową długość lub zmiany siły w aktywowanym mięśniu zgodnie z wcześniej ustalonym, dostosowanym protokołem oprogramowania. Na podstawie tych danych można określić właściwości fizyczne mięśnia. Należą do nich siła-częstotliwość, maksymalny tężec, siła-prędkość, sztywność, długość, napięcie i zmęczenie. Długość lub siła mięśnia może być również utrzymywana na stałym poziomie, tak aby mięsień kurczył się izometrycznie lub izotonicznie. Co ważne, te protokoły eksperymentalne mogą być szybko wykonywane, łatwo powtarzane i dostosowywane - a wszystko to podczas znieczulenia zwierzęcia i z okresem rekonwalescencji trwającym od kilku godzin do dni. Pojedyncze zwierzę może być wielokrotnie poddawane testom siłowym in vivo, co umożliwia badania podłużne modeli chorób lub ocenę platform/technologii terapeutycznych.
Jak opisano tutaj, komercyjny system dźwigni mięśniowych w połączeniu z dwufazowym stymulatorem o dużej mocy jest używany do przeprowadzania in vivo testów funkcji mięśni w celu oceny wkładu mięśnia piszczelowego przedniego kończyny grzbietowej szczura w zgięcie grzbietowe stopy poprzez stymulację nerwu strzałkowego. Opracowaliśmy protokół, który został specjalnie zaprojektowany do oceny technologii medycyny regeneracyjnej/inżynierii tkankowej w celu naprawy mięśni po urazowym urazie VML mięśnia TA szczura. Należy zauważyć; EDL i HL muszą zostać wycięte z przedniego przedziału podudzi w celu specyficznej oceny mięśnia TA (stanowią one około 15-20% całkowitego momentu obrotowego piszczelowego przedniego mierzonego po stymulacji nerwu strzałkowego (Corona i wsp., 2013)). Ponieważ podejście to zapewnia kompleksową analizę podłużną fizjologii/funkcji mięśni, może rzucić ważne informacje mechanistyczne na wiele innych rodzajów badań fizjologicznych, a także na różne obszary chorobowe lub terapeutyczne39. Na przykład badania funkcji mięśni in vivo mają zastosowanie do badań nad fizjologią wysiłku fizycznego, badaniami nad niedokrwieniem/reperfuzją, miopatią, uszkodzeniem nerwów/neuropatią i waskulopatią, sarkopenią i dystrofiami mięśniowymi40.
Protokół
Wszystkie zwierzęta były traktowane humanitarnie, a wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Wirginii.
1. Przygotowanie sprzętu
- Upewnij się, że wszystkie maszyny są prawidłowo podłączone.
- Włącz komputer, a następnie dwufazowy stymulator o dużej mocy i system dźwigni dwutrybowych.
- W tym czasie umieść zwierzę w komorze anestezjologicznej zaopatrzonej w 2% izofluran i włącz element grzejny tak, aby platforma została podgrzana do 37 °C.
- Umieść elektrody w 70% etanolu, tak aby końcówki pokryte politetrafluoroetylenem (PTFE) były zanurzone i zostały zdezynfekowane podczas konfiguracji urządzenia i oprogramowania.
- Zlokalizuj i otwórz oprogramowanie sterujące systemem dźwigni na pulpicie.
UWAGA: Będzie to oprogramowanie potrzebne do przeprowadzenia testów funkcjonalnych.
2. Konfiguracja oprogramowania
- Po otwarciu programu (Rysunek 1A) zmień parametry Instant Stim w menu Setup na żądane wartości.
UWAGA: W tym protokole wszystkie parametry pozostają na wstępnie ustawionych poziomach, z wyjątkiem "Czas pracy (s)", który jest zmieniany na 180 sekund (Rysunek 1B). - Utwórz folder Autozapis w menu Ustawienia.
- Znajdź okno do pisania oznaczone jako "Baza automatycznego zapisywania". Wprowadź nazwę próbki, na przykład "Rat1-date-timepoint". Bezpośrednio po lewej stronie okna "Podstawa autozapisu" kliknij pole "Włącz autozapis ".
- U góry ekranu sterowania wybierz "Sekwencer". Otworzy się nowe okno. U dołu nowego okna wybierz "Otwórz sekwencję". Otworzy się nowe okno. Wybierz gotową sekwencję i kliknij przycisk OK. Lista protokołów z parametrami sekwencji, w tym częstotliwością, czasem trwania bodźców i czasem odpoczynku, zostanie opracowana w oknie o nazwie: Edytor sekwencji (Rysunek 1C). Kliknij "Załaduj sekwencję" -> "Zamknij okno".
- Aby zobaczyć prąd i stymulację w czasie rzeczywistym, wybierz "Plik" - > "Monitor danych na żywo". Otworzy się nowe okno.
- W nowymoknie Aktywne dane sformatuj ekran do testowania przy użyciu funkcji automatycznego skalowania lub ręcznie wprowadź maksymalne i minimalne wartości y wyświetlane na ekranie.
3. Ustawienie zwierząt
UWAGA: Wszystkie pomiary siły są tymi samymi dla 11-tygodniowego szczura Lewisa. Istnieje liniowa korelacja między masą mięśniową a produkcją siły (w niutonach). Dlatego wraz ze wzrostem wieku szczura wartości siły wytwarzanej przez nogę również powinny wzrosnąć.
- Upewnij się, że zwierzę znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia przed wyjęciem go z komory anestezjologicznej. Całkowicie usuń wszystkie włosy po bocznej stronie między kostką a miednicą eksperymentalnej nogi za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia włosów.
UWAGA: Właściwa płaszczyzna znieczulenia jest osiągana, gdy zwierzę nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi. Konieczne jest przestrzeganie wytycznych określonych przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w każdej instytucji. - Ułóż zwierzę w pozycji leżącej, upewniając się, że nos zwierzęcia jest bezpiecznie w stożku nosowym znieczulenia, tak aby pozostał na wystarczającej głębokości znieczulenia.
- Reguluj położenie aparatu pedałowego za pomocą trzech niezależnych pokręteł (Rysunek 2). Za pomocą pokręteł (A i B) do regulacji pedału nożnego ustaw pedał odpowiednio w skrajnym lewym i najniższym położeniu. Umożliwi to prawidłowe ułożenie stopy zwierzęcia, pozostawiając jednocześnie miejsce na późniejsze manipulacje. W tej pozycji użyj pokrętła po lewej stronie toru, aby przesunąć aparaturę w kierunku lub dalej od eksperymentatora, tak aby noga zwierzęcia leżała w prostej płaszczyźnie.
- Oczyść nogę trzema przemianami jodu i alkoholu. Jod powinien pozostać na nodze przez 30 sekund.
- Wyreguluj zwierzę lub platformę (Rysunek 2A, D) tak, aby przedłużona noga zapewniała pełny kontakt między podeszwą stopy a pedałem nożnym.
- Za pomocą taśmy medycznej przymocuj stopę zwierzęcia do płyty stopy (Rysunek 2D). Bardzo ważne jest, aby pięta przylegała równo do dolnej części pedału, a cała stopa była płaska i nie odrywała się od płytki podczas testowania.
- Zlokalizuj mechanizm zaciskowy, aby ustabilizować nogę. Wciśnij kołek stabilizujący na tyle daleko, aby zmniejszyć ruch nogi i zablokuj ją na miejscu, obracając klucz imbusowy.
- W tej pozycji użyj pokrętła C, aby przesunąć aparat w kierunku lub od eksperymentatora, tak aby kostka, kość piszczelowa i kość udowa leżały w linii prostej (rysunek 2C). Upewnij się, że noga jest równoległa do pedału nożnego. Dokonaj regulacji kursu i drobnych pokręteł znajdujących się z tyłu aparatu, aby powoli przesuwać kostkę tak, aby stopa i piszczel znajdowały się w pozycji 90°.
- Kontynuuj poruszanie nogą tak, aby kość udowa i piszczel znajdowały się pod kątem prostopadłym 90 stopni (ryc. 2B). W tym momencie zwierzę jest gotowe na elektrody.
4. Rozmieszczenie elektrod
- Aktywuj "Instant Stim", klikając pomarańczowy przycisk oznaczony "Instant Stim".
- Umieść obie elektrody powierzchownie na bliższym końcu kości piszczelowej przedniej i przesuwaj końcówki elektrod, aż na monitorze na żywo pojawią się skoki. Idealnie, kolce powinny wynosić około 0,4 N.
UWAGA: Elektrody powinny być umieszczone obok i prostopadle do płaszczyzny nerwu strzałkowego, która z kolei biegnie bocznie od kolana i prostopadle do kości piszczelowej. - Wbij jedną igłę wystarczająco głęboko, aby przebić skórę właściwą i ledwo w warstwę mięśniową. Przesuwaj drugą elektrodę, aż na monitorze na żywo pojawią się skoki około 0,6 N. Włóż igły i zaciśnij je na miejscu za pomocą hobbystycznego zacisku lub taśmy medycznej.
- Dostosuj regulację zgrubną i precyzyjną, aby znaleźć maksymalną siłę wyjściową.
- Na stymulatorze dwufazowym o dużej mocy pośrodku będą znajdować się dwa pokrętła. Jeden jest oznaczony jako "ZAKRES", a drugi "DOSTOSUJ". Przekręć pokrętło "RANGE" na żądane maksimum amperage.
UWAGA: Szczyty będą powoli zwiększać swoją wielkość, a maksymalne natężenie prądu jest określane jako poziom, przy którym trzy kolejne stymulacje powodują identyczne reakcje skurczowe. Oprzyj się obracaniu natężenia prądu wyżej niż to konieczne; Maksymalne natężenie prądu pobudzi cały mięsień do skurczu, ale każdy wyższy prąd spowoduje rekrutację sąsiednich mięśni i potencjalnie również antagonistów. - Obróć pokrętło "ADJUST", aby ustawić procent "ZAKRESU", który będzie używany do stymulacji mięśnia. W tym momencie siła powinna wskazywać około 1,0 N. Może to wymagać zwiększenia lub zmniejszenia prądu.
- Sprawdź ponownie elektrody, aby upewnić się, że są dobrze zamocowane. Zatrzymaj natychmiastowy stymulant.
- W oknie "Dane na żywo" kliknij "Rozpocznij sekwencję".
- Kontynuuj monitorowanie krzywych, wracając do ekranu sterowania i klikając przycisk "Analiza" znajdujący się nad pomarańczowym przyciskiem "Natychmiastowy stymulant". Krzywa tężcowa powinna zacząć kształtować się w okolicach stymulacji 60 Hz.
5. Zakończenie stymulacji i sprzątanie
- Po zakończeniu sekwencji wyjmij elektrody i wytrzyj do czysta 70% alkoholem. Umieść elektrody w osłonach.
- Odpiąć zacisk kolanowy i wyłączyć znieczulenie. Wyjmij zwierzę z gazu znieczulającego i ułóż zwierzę w pozycji leżącej, nadal na poduszce grzewczej. Utrzymuj szczura na poziomie 100%O2 przez kilka minut po wyłączeniu gazowego izofluranu, aby utrzymać szczura w stanie natlenionym. Zwierzę może początkowo się poruszać, ale nie należy wracać z powrotem do klatki, dopóki zwierzę nie odzyska przytomności. Jeśli po powrocie do zdrowia zauważy się bolesność mięśni, należy podać dawkę NLPZ zgodnie z zaleceniami komisji ds. opieki nad zwierzętami.
- Wyłącz wszystkie urządzenia wymienione w kroku 1.2, zamknij oprogramowanie i kontynuuj analizę danych.
- Wytrzyj platformę i pedał nożny.
6. Analiza danych
UWAGA: Analiza danych jest wykonywana tak, aby pasowała do sekwencji zaprojektowanej przez to laboratorium i zgodnie z protokołami laboratoryjnymi. Wartości analizy, ważne punkty danych i inne aspekty procedury będą się zmieniać w zależności od intencji użytkownika.
- Otwórz oprogramowanie do analizy danych.
- Kliknij menu Wysoka przepustowość, aby włączyć analizę wielu plików danych (próbek) jednocześnie. Wybierz analizę "Częstotliwość siły".
- Kliknij przycisk "Wybierz pliki" i otwórz tyle zapisanych plików danych, ile chcesz.
- Wybierz "Ręcznie" w polu Metoda umieszczania kursora.
UWAGA: Umożliwi to użytkownikowi przeanalizowanie wszystkich danych w żądanym znaczniku czasu, w przeciwieństwie do automatycznego wyboru lokalizacji analizy przez program. - Zmień wartość sygnatury czasowej kursora końcowego na 2. Kliknij przycisk "Analizuj" (Rysunek 1D).
- Aby zapisać tabelę i przeanalizować dane za pomocą arkusza kalkulacyjnego, kliknij przycisk "Zapisz tabelę w ACSII". Spowoduje to zapisanie pliku i można go otworzyć za pomocą arkusza kalkulacyjnego w późniejszym czasie.
- Otwórz zapisany plik danych w arkuszu kalkulacyjnym.
- Utwórz dodatkową kolumnę o nazwie "Bezwzględne maksimum" i określ różnicę między wartościami bazowymi a maksymalnymi dla każdej próbki. Zapewni to całkowitą maksymalną siłę wytwarzaną przy każdej częstotliwości.
- Aby określić moment obrotowy, pomnóż każdą wartość siły przez długość ramienia dźwigni.
UWAGA: W tym przypadku będzie to reprezentowane przez długość stopy zwierzęcia. W protokole tym wykorzystuje się średnią wartość wyznaczoną doświadczalnie wynoszącą 30 mm. Użytkownik określił teraz wartości maksymalnego momentu obrotowego wytwarzanego przy każdej częstotliwości. - Wykres tych wartości jako krzywą częstotliwości momentu obrotowego lub maksymalny moment obrotowy wytwarzany przez zwierzę we wszystkich częstotliwościach stymulacji.
UWAGA: Można go zidentyfikować i wykorzystać jako pojedynczy punkt porównania między próbkami.
Wyniki
Krzywa tetaniczna może być wykorzystana do odróżnienia wyników optymalnych od nieoptymalnych. Krzywa ta zazwyczaj zaczyna się formować przy częstotliwości 60 Hz. Kluczowym czynnikiem w uzyskaniu dobrych wyników jest zdolność do stymulacji mięśnia w taki sposób, aby wytworzył on maksymalną siłę i utrzymał ją podczas tetanizacji. Idealna krzywa powinna charakteryzować się nieprzerwanym, gwałtownym, pionowym wzrostem w momencie stymulacji, po którym następuje płaska faza plateau z minimalnymi oscylacjami oraz nieprzerwany, gwałtowny okres pionowego spadku po zakończeniu stymulacji (Rysunek 4). Odchylenia od idealnej krzywej wskazują na zmęczenie mięśnia (Rysunek 5D) lub na niewłaściwą stymulację mięśnia, uniemożliwiającą wytworzenie maksymalnej siły (Rysunek 5B-C). To drugie zazwyczaj wynika z nieprawidłowego rozmieszczenia elektrod, co prowadzi do braku maksymalnej rekrutacji włókien mięśniowych podczas stymulacji. Cechą wyróżniającą, która pozwala badaczowi określić, czy nieidealna krzywa jest wynikiem błędnego rozmieszczenia elektrod czy zmian patologicznych w mięśniu, jest to, czy krzywa tetaniczna jest pełna (stopiona), czy niepełna (niestopiona). Niestopiona, niepełna krzywa tetaniczna wskazuje na niewłaściwe rozmieszczenie elektrod, w wyniku czego mięsień nie osiąga maksymalnego skurczu. Przykładem zmiany patologicznej w mięśniu może być zmniejszony skurcz maksymalny w porównaniu z grupą kontrolną lub reakcja skurczowa, która szybciej ulega zmęczeniu.
Trzy różne rodzaje szczytów uzyskane w trakcie tej procedury reprezentują różne pozycje elektrod i kończyn, co przedstawiono na Rysunku 3. Pierwsze szczyty pojawią się w okolicy 0,4N i występują, gdy prawidłowe rozmieszczenie elektrod zostanie określone powierzchownie na skórze (Rysunek 3A). Druga grupa szczytów ma wyższą amplitudę, zazwyczaj około 0,5-0,6N (Rysunek 3B) i pojawia się, gdy elektrody przebijają skórę właściwą. Po ich uzyskaniu koryguje się ułożenie nogi i stopy w celu maksymalizacji generowanej siły, co zostaje osiągnięte, gdy amplituda szczytu wzrośnie do około 1N lub więcej (Rysunek 3C). W tym momencie można wyłączyć funkcję Instant Stim i rozpocząć sekwencję. Wytyczne te zapewniają dokładne i powtarzalne wyniki i stanowią kluczowe punkty kontrolne w całym protokole.
Ostateczne wyniki można przedstawić na różne sposoby, w zależności od informacji, które użytkownik wyekstrahował z testu siły oraz od projektu doświadczenia. W niniejszym protokole mierzona jest maksymalna siła dla wszystkich częstotliwości stymulacji, jednak inne punkty danych mogą być istotne dla konkretnego badacza lub zastosowania. Przykładem jest częstotliwość stymulacji, przy której zaczyna kształtować się krzywa tetaniczna. Dane można porównać z innymi wynikami uzyskanymi w wcześniejszym lub późniejszym eksperymencie na tym samym zwierzęciu lub służyć do porównań między różnymi grupami badawczymi. Wytwarzaną siłę można znormalizować względem masy ciała, aby obliczyć siłę izometryczną i uzyskać bardziej obiektywną ocenę wpływu wieku na obserwowany maksymalny skurcz. Chociaż zwierzęta o różnej masie ciała i wieku będą generować różne siły maksymalne, kształt krzywej tetanicznej powinien być spójny we wszystkich grupach, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.
Rycina 1: Przegląd oprogramowania do sterowania i analizy danych systemu Lever służącego do analizy. (A) Przegląd oprogramowania sterującego po uruchomieniu programu. (B) Parametry dla „Instant Stim.” (C) Przykładowa sekwencja stymulacji siła-częstotliwość. (D) Reprezentatywne dane z wysokoprzepustowej analizy częstotliwości siły w oprogramowaniu analitycznym. Należy zauważyć, że przykładowa sekwencja i procedura analizy danych są specyficzne dla niniejszego protokołu i nie reprezentują pełnego zakresu sekwencji oraz wyników dostarczanych przez to oprogramowanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 2: Kluczowe aspekty pozycjonowania szczura i umieszczenia stopy w aparaturze. (A) Szczur znajduje się w pozycji grzbietnej, a lewa stopa jest bezpiecznie przymocowana do płytki stopowej. Okręgiono kąty proste tworzone przez stopę, podudzie i udo. (B) Podkreślono kąt prosty utworzony przez kostkę. (CNoga powinna być ustawiona w jednej linii, od stopy do ciała.DElektrody umieszczono równolegle i prostopadle do płaszczyzny nerwu strzałkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Reprezentatywne piki wykazujące znaczenie prawidłowego rozmieszczenia elektrod dla maksymalnej generacji siły. (A) Bazowe piki odpowiedzi tetanicznej obserwowane przy zbyt powierzchownym umieszczeniu elektrod. (B) Większe piki przy elektrodach umieszczonych w prawidłowym miejscu. (C) Przejście od większych pików sygnalizujących prawidłowe rozmieszczenie elektrod do optymalnej amplitudy piku przedsekwencyjnego w miarę optymalnego dostosowania pozycji nogi i stopy. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Optymalna krzywa tetaniczna przy 10 Hz. Krzywa ta gwałtownie rośnie i spada, a następnie przechodzi w płaską fazę plateau. Niniejszy przykład wskazuje na prawidłowe rozmieszczenie elektrod oraz stymulację siłą maksymalną. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 5: Reprezentatywne przykłady Nieoptymalne krzywe tetaniczne uzyskane przy 10 Hz. (A) Po rozluźnieniu krzywa ta opada poniżej linii bazowej. Świadczy to o stymulacji antagonistów. (B-DWykresy te są wynikiem niewłaściwego rozmieszczenia elektrod i nierównomiernej rekrutacji włókien mięśniowych. Fazy plateau wykazują duże oscylacje (B), nachylenie w górę (C), lub nachylenie w dół (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Protokół ten demonstruje stosunkowo prostą metodę wykonywania testów funkcji mięśni in vivo na przednim przedziale podudziowym kończyny tylnej szczura. Inne formy testowania funkcji mięśni, w tym protokoły ex vivo i in situ, mogą również dostarczyć ważnych informacji na temat fizjologii mięśni. Znaczenie badań funkcjonalnych in vivo polega jednak na ich nieinwazyjnym charakterze oraz na tym, że najdokładniej odwzorowują endogenne mechanizmy stymulacji mięśni. Zarówno w badaniach ex vivo, jak i in situ, ścięgno i/lub mięsień są odsłonięte i dlatego muszą być utrzymywane w stanie wilgotnym lub zanurzonym 41,42. Badania in vivo usuwają zmienne zakłócające związane z urazami i stanami zapalnymi, które mogą być spowodowane procedurami chirurgicznymi wymaganymi do badania funkcji mięśni in situ; Jest to szczególnie ważne, jeśli celem eksperymentu jest zbadanie procesów zapalnych i komórkowych43. Co więcej, badania in vivo wymagają niewielkich umiejętności chirurgicznych, ponieważ mięsień nie jest odizolowany od otoczenia i nie wymaga precyzyjnych węzłów w celu zmniejszenia poślizgu mięśni/ścięgien (jak ma to miejsce w przypadku badań in situ lub ex vivo)41. Ponadto, przy odpowiedniej wprawie, szybkość prawidłowego umieszczenia elektrod i zdolność do szybkiego dokonywania regulacji w celu osiągnięcia maksymalnej siły wytwarzanej przez mięsień zapewnią, że wypełnianie protokołu będzie szybkie i powtarzalne – zarówno u zwierząt, jak i u różnych użytkowników tego samego sprzętu39. Korzystne jest rozpoczęcie od oceny całego przedniego komponentu podudzi, jak pokazano na ilustracji, przed wycięciem mniej dostępnych mięśni synergistycznych (EDL i HL) w celu bardziej bezpośredniego zbadania mięśnia TA. Stosując takie podejście, można dość szybko osiągnąć mistrzostwo w technice. Podczas gdy procedura opisana w niniejszym dokumencie demonstruje i podkreśla użyteczność protokołu częstotliwości siły do wywoływania tężca i określania maksymalnej siły wytwarzanej przez mięsień, użytkownicy powinni określić rodzaj (y) testów funkcjonalnych, które najlepiej informowałyby o ich konkretnych eksperymentach i celach badawczych.
Istnieje kilka krytycznych kroków, które należy dokładnie wykonać, aby zapewnić optymalne i powtarzalne wyniki eksperymentalne, czyli stałą maksymalną produkcję siły przez mięsień do różnych parametrów stymulacji. Kilka kluczowych funkcji przedstawiono na rysunku 2. Jednak właściwe umieszczenie i stabilność elektrody stymulacyjnej jest absolutnym warunkiem wstępnym powtarzalnej maksymalnej stymulacji nerwu strzałkowego. W związku z tym elektrody należy umieszczać powierzchownie. Oznacza to, że jeśli umieszczenie elektrody jest zbyt głębokie, istnieje ryzyko bezpośredniej stymulacji elektrycznej mięśni antagonistycznych, zmniejszając w ten sposób wielkość obserwowanej odpowiedzi skurczowej przedniego przedziału podudziowego. Ponadto obie elektrody powinny być umieszczone tak blisko siebie, jak to możliwe, aby zmniejszyć opór elektryczny otaczającej skóry i tkanki łącznej. Ogólnie rzecz biorąc, umieszczenie elektrody blisko kolana i przyśrodkowo do nogi, bezpośrednio śledząc krawędź kości piszczelowej do przodu do miejsca, w którym styka się z mięśniem brzuchatym łydki, często zapewnia odpowiednią produkcję siły. Zapewnia to również, że elektrody są umieszczone obok i prostopadle do płaszczyzny nerwu strzałkowego, który z kolei biegnie prostopadle do kości piszczelowej i bocznie w dół nogi od kolana. Jednak naturalna zmienność anatomii zwierząt wymaga stałej czujności, aby zapewnić, że rozmieszczenie elektrod jest zoptymalizowane w każdym indywidualnym przypadku. W związku z tym istnieje pewien poziom prób i błędów związany z umieszczeniem elektrody, który jest znacznie zmniejszany przez doświadczenie użytkownika. Liczba przebić skórę przez elektrody powinna być zminimalizowana, aby zmniejszyć obrzęk i stan zapalny, co zmniejsza produkcję mierzonej siły. Zależy to od tego, gdzie igły są początkowo umieszczone, ale zaleca się przesuwanie igieł dwa razy lub mniej, szczególnie w obszarze wokół rzepki. Wreszcie, po umieszczeniu elektrod w nodze zwierzęcia, można dokonać drobnych korekt w ustawieniu nogi i prądzie dostarczanym przez elektrody. Należy to zrobić przy jednoczesnym monitorowaniu siły wytwarzanej przez pojedyncze drganie. Oprócz umieszczenia elektrod można również dostosować napięcie dostarczane przez elektrody. Jednak w opisanej tutaj konfiguracji ważne jest, aby zachować ostrożność podczas zwiększania napięcia jako sposobu na zwiększenie siły wyjściowej, ponieważ zwiększone napięcie będzie stymulować nerwy, które unerwiają mięśnie antagonistyczne.
Istnieją trzy kluczowe problemy techniczne, które należy monitorować, aby zapewnić optymalne umieszczenie elektrody. Po pierwsze, stopa znieczulonego zwierzęcia musi być bezpiecznie zakotwiczona w aparacie pedału nożnego, który mierzy wytwarzanie siły mięśniowej (ryc. 2). Jeśli stopa nie jest bezpiecznie zakotwiczona, rzeczywista siła wytwarzana przez mięsień może nie zostać w pełni przeniesiona na przetwornik siły. Niestabilne mocowanie stopy stwarza również ryzyko utraty optymalnego ułożenia elektrod, ponieważ ruch wykraczający poza normalny skurcz mięśni (tj. odsunięcie stopy od podnóżka) może spowodować przemieszczenie elektrod z ich powierzchownej pozycji lub ich całkowite przemieszczenie. Każdy scenariusz zmniejszy zmierzoną siłę. Po drugie, ciało zwierzęcia powinno być całkowicie leżące na plecach i ustawione w płaszczyźnie prostej (ryc. 2). Prawidłowe ułożenie ciała zwierzęcia zapobiega lekkim ruchom nogi spowodowanym oddychaniem, a także minimalizuje skręcanie nogi i miednicy, umożliwiając lepsze ułożenie i ciągły kontakt elektrod stymulujących. Po trzecie, prawidłowe ułożenie i zakotwiczenie kolana ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że noga pozostaje stabilna, a tym samym pomaga ustabilizować optymalne rozmieszczenie elektrod stymulujących, aby umożliwić konsekwentną aktywację nerwu strzałkowego.
Jest kilka dodatkowych punktów, na które należy zwrócić uwagę. Po pierwsze, komercyjny system dźwigni mięśniowych jest przeznaczony do wykonywania testów na lewej nodze, jednak konfiguracja może zostać zmodyfikowana w celu przeprowadzenia testów również na prawej nodze. Po drugie, systemy dźwigni mięśniowych mogą być wybierane w zależności od wielkości zwierzęcia, więc użytkownicy powinni upewnić się, że używana platforma jest odpowiednia do pomiaru i podtrzymywania siły wytwarzanej przez wybrany model zwierzęcy. Testowane mięśnie dla platformy sprzętowej są ograniczone do tych, które indukują wyprost podeszwowy lub zgięcie grzbietowe stopy. Po trzecie, należy ponownie podkreślić, że umieszczenie elektrod może być trudne i wymaga cierpliwości i praktyki, aby opanować technikę. Elektrody również szybko matowieją przy regularnym stosowaniu, dlatego warto mieć kilka zapasowych zestawów na wypadek, gdy trudno będzie powierzchownie nakłuć skórę. Po trzecie, protokół opisany w tym raporcie wykorzystuje określone sekwencje stymulacji i procedury analizy danych. Oprogramowanie sterujące systemem dźwigni mięśniowej i oprogramowanie do analizy danych oraz dostarczane przez nie dane mogą odpowiedzieć na wiele innych pytań eksperymentalnych, a zatem jego użyteczność wykracza poza to, co opisano w niniejszym dokumencie. W związku z tym zachęca się użytkowników do eksploracji poza ograniczeniami protokołów oprogramowania przedstawionych w tym dokumencie. Pomimo tych drobnych ograniczeń, testy funkcji mięśni in vivo są skutecznym podejściem do określania zdrowia i zdolności kurczliwości mięśni szkieletowych, ponieważ są minimalnie inwazyjne i mogą być wykonywane przy wielu okazjach, w dłuższym czasie, na tym samym zwierzęciu. Krótko mówiąc, ten rodzaj użytecznego narzędzia sprawia, że system jest szczególnie biegły w testowaniu efektów nowych terapii urazów mięśni szkieletowych lub chorób kończyn tylnych szczura.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr Hannah Baker za jej rozległą pracę nad optymalizacją tej procedury.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
| Isoflurane Steamizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
| Adapter wlotowy do waporyzatora | Vet Equip | 911124 | |
| Adapter wylotowy do waporyzatora | Vet Equip | 911125 | |
| Stołowy aparat do znieczulenia | Vet Equip | 901801 | |
| Sprężony tlen gazowy | Praxair | N/A Filtr z węglem | |
| aktywnym VaporGuard | Vet Equip | 931401 | |
| T / Pump Profesjonalny podgrzewacz wody | Stryker | N/A | ustawiony na czas ciągłej terapii na 38/100 dla temperatury |
| Taśma chirurgiczna Transpore | 3M | 1527S-1 | rozerwać na pół, aby uzyskać cieńsze paski |
| A5 Złote maszynki do strzyżenia | zwierząt Oster | 078005-050-002 | |
| Aplicare | jodu powidonu | 82-227K | |
| Waciki nasączone alkoholem | |||
| 200 proof Etanol | Decon labs | rozcieńczone do 70% aplikatorami z bawełnianą końcówką wody dejonizowanej | |
| Puritan | 836-WC | ||
| Elektrody pokryte teflonem - Monopolarna elektroda igłowa | Chalgren Enterprises | 111-725-24TP | |
| serwomotor | Cambridge Technology | Model 6650LR | |
| Dwutrybowy system dźwigni | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | skontaktuj się z producentem, aby zamówić |
| Interfejs sygnałowy | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
| stymulator dużej mocy | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
| Analiza danych oprogramowanie | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 | |
| Oprogramowanie sterujące systemem dźwigni mięśniowej | Oprogramowanie Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 |
Bibliografia
- Jarvinen, T. A., Jarvinen, T. L., Kaariainen, M., Kalimo, H., Jarvinen, M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 33, 745-764 (2005).
- Ciciliot, S., Schiaffino, S. Regeneration of mammalian skeletal muscle. Basic mechanisms and clinical implications. Curr Pharm Des. 16, 906-914 (2010).
- Lin Shiau, S. Y., Huang, M. C., Lee, C. Y. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther. 196, 758-770 (1976).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3639-3646 (2011).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84, 209-238 (2004).
- Couteaux, R., Mira, J. C., d'Albis, A. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury I. Cytological aspects. Biol Cell. 62, 171-182 (1988).
- d'Albis, A., Couteaux, R., Janmot, C., Roulet, A., Mira, J. C. Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Eur J Biochem. 174, 103-110 (1988).
- Reali, M., Serafim, F. G., da Cruz-Hofling, M. A., Fontana, M. D. Neurotoxic and myotoxic actions of Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle in vitro. Toxicon. 41, 657-665 (2003).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, 628-633 (2007).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10, 504-514 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138, 3647-3656 (2011).
- Lees, S. J., Rathbone, C. R., Booth, F. W. Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C609-C615 (2006).
- Rotter, R., et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue. J Orthop Res. 26, 1618-1626 (2008).
- Rathbone, C. R., Wenke, J. C., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Importance of satellite cells in the strength recovery after eccentric contraction-induced muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, R1490-R1495 (2003).
- Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling. Annu Rev Biochem. 75, 19-37 (2006).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- von Maltzahn, J., Chang, N. C., Bentzinger, C. F., Rudnicki, M. A. Wnt signaling in myogenesis. Trends Cell Biol. 22, 602-609 (2012).
- Collu, G. M., Hidalgo-Sastre, A., Brennan, K. Wnt-Notch signalling crosstalk in development and disease. CMLS. 71, 3553-3567 (2014).
- Bjornson, C. R., et al. Notch signaling is necessary to maintain quiescence in adult muscle stem cells. Stem Cells. 30, 232-242 (2012).
- Vignaud, A., Hourde, C., Butler-Browne, G., Ferry, A. Differential recovery of neuromuscular function after nerve/muscle injury induced by crude venom from Notechis scutatus, cardiotoxin from Naja atra and bupivacaine treatments in mice. Neurosci Res. 58, 317-323 (2007).
- Grogan, B. F., Hsu, J. R. Skeletal Trauma Research, C. Volumetric muscle loss. J Am Acad Orthop Surg. 19 Suppl 1, S35-S37 (2011).
- Sicari, B. M., et al. A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement. Tissue Eng Part A. 18, 1941-1948 (2012).
- Wu, X., Corona, B. T., Chen, X., Walters, T. J. A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies. Biores Open Access. 1, 280-290 (2012).
- Armstrong, R. B., Phelps, R. O. Muscle fiber type composition of the rat hindlimb. Am J Anat. 171, 259-272 (1984).
- Yeh, L. S., Gregory, C. R., Theriault, B. R., Hou, S. M., Lecouter, R. A. A functional model for whole limb transplantation in the rat. Plast Reconstr Surg. 105, 1704-1711 (2000).
- Lin, J. B., et al. Imaging of small animal peripheral artery disease models: recent advancements and translational potential. Int J Mol Sci. 16, 11131-11177 (2015).
- Larcher, T., et al. Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PloS one. 9, e110371(2014).
- Warren, G. L., Stallone, J. L., Allen, M. R., Bloomfield, S. A. Functional recovery of the plantarflexor muscle group after hindlimb unloading in the rat. Eur J Appl Physiol. 93, 130-138 (2004).
- Muller-Delp, J. M., Spier, S. A., Ramsey, M. W., Delp, M. D. Aging impairs endothelium-dependent vasodilation in rat skeletal muscle arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1662-H1672 (2002).
- Liu, M., Bose, P., Walter, G. A., Thompson, F. J., Vandenborne, K. A longitudinal study of skeletal muscle following spinal cord injury and locomotor training. Spinal Cord. 46, 488-493 (2008).
- Yoshida, H., et al. A phosphodiesterase 3 inhibitor, K-134, improves hindlimb skeletal muscle circulation in rat models of peripheral arterial disease. Atherosclerosis. 221, 84-90 (2012).
- Regensteiner, J. G., et al. Chronic changes in skeletal muscle histology and function in peripheral arterial disease. Circulation. 87, 413-421 (1993).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. J Vis Exp. , e4198(2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. J Vis Exp. , e3167(2011).
- Grassi, B., Gladden, L. B., Samaja, M., Stary, C. M., Hogan, M. C. Faster adjustment of O2 delivery does not affect V(O2) on-kinetics in isolated in situ canine muscle. J Appl Physiol (1985). 85, 1394-1403 (1998).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskelet Disord. 12, 246(2011).
- Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Eng Part A. 20, 705-715 (2014).
- Burks, T. N., et al. Losartan restores skeletal muscle remodeling and protects against disuse atrophy in sarcopenia. Sci transl med. 3, 82ra37(2011).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488 (Pt 2), 459-469 (1995).
- Machingal, M. A., et al. A tissue-engineered muscle repair construct for functional restoration of an irrecoverable muscle injury in a murine model. Tissue Eng Part A. 17, 2291-2303 (2011).
- Pizza, F. X., Koh, T. J., McGregor, S. J., Brooks, S. V. Muscle inflammatory cells after passive stretches, isometric contractions, and lengthening contractions. J Appl Physiol (1985). 92, 1873-1878 (2002).
Przedruki i uprawnienia
