Wykrywanie i izolacja klinicznie istotnych gatunków Vibrio wymaga selektywnych i zróżnicowanych pożywek hodowlanych. W badaniu tym oceniono zdolność nowej pożywki chromogennej do wykrywania i identyfikacji V. parahaemolyticus i innych pokrewnych gatunków. Okazało się, że nowe podłoże ma lepszą czułość i swoistość niż konwencjonalne podłoże.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie bardziej czułego i specyficznego chromogennego podłoża agarowego do wykrywania Vibrio parahaemolyticus i innych gatunków Vibrio
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Infekcje przenoszone przez żywność w USA wywołane przez gatunki Vibrio wykazują tendencję wzrostową. W rodzaju Vibrio, V. parahaemolyticus jest odpowiedzialny za większość infekcji związanych z Vibrio. W związku z tym dokładne różnicowanie między Vibrio spp. i wykrywanie V. parahaemolyticus jest niezwykle ważne dla zapewnienia bezpieczeństwa naszych dostaw żywności. Chociaż techniki molekularne są coraz bardziej powszechne, metody zależne od hodowli są nadal rutynowo stosowane i w pewnych okolicznościach są uważane za metody standardowe. W związku z tym przetestowano nowatorskie chromogenne podłoże agarowe w celu zapewnienia lepszej metody izolacji i różnicowania klinicznie istotnych Vibrio spp. W protokole porównano czułość, swoistość i granicę wykrywalności dla wykrywania V. parahaemolyticus między nową pożywką chromogenną a konwencjonalną pożywką. Wykorzystano różne szczepy V. parahaemolyticus (n=22) reprezentujące różne serotypy i pochodzenie wirusa. Zostały one wcześniej zidentyfikowane przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC), a następnie zweryfikowane w naszym laboratorium za pomocą tlh-PCR. W co najmniej czterech oddzielnych próbach szczepy te inokulowano na agarze chromogenicznym i agarze tiosiarczan-cytrynian żółci-sacharoza (TCBS), który jest zalecanym podłożem do hodowli tego gatunku, a następnie inkubowano w temperaturze 35-37 °C przez 24-96 godzin. Trzy szczepy V. parahaemolyticus (13,6%) nie rosły optymalnie na TCBS, niemniej jednak wykazywały zielone kolonie, jeśli nastąpił wzrost. Dwa szczepy (9,1%) nie dały oczekiwanych kolonii cyjanu na agarze chromogennym. Szczepy inne niż V. parahaemolyticus (n=32) zostały również przetestowane w celu określenia specyficzności agaru chromogenicznego. Spośród tych szczepów 31 nie rosło lub wykazywało inne morfologie kolonii. Średni odzysk V. parahaemolyticus na agarze chromogennym wynosił ~96,4% w stosunku do tryptycznego agatora sojowego uzupełnionego 2% NaCl. Podsumowując, nowy agar chromogenny jest skutecznym podłożem do wykrywania V. parahaemolyticus i odróżniania go od innych wibrio.
Wprowadzenie
Jako przedstawiciel rodzaju Vibrio, V. parahaemolyticus jest Gram-ujemną, nietworzącą przetrwalników, zakrzywioną bakterią w kształcie pręcika. Wykazuje wysoką ruchliwość zarówno w środowisku ciekłym, jak i półstałym. Większość szczepów V. parahaemolyticus nie jest patogenna dla ludzi, jednak podtypy patogenne powodowały epidemie i pandemie, stąd gatunek ten jest uważany za ważny patogen przenoszony przez żywność w wielu krajach1,2. Częstość występowania infekcji Vibrio w USA wykazuje tendencję wzrostową od 2000 roku3. Wśród Vibrio spp., V. parahaemolyticus jest najczęściej zgłaszanym gatunkiem powodującym choroby w USA4,5. Inne klinicznie istotne gatunki to V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae itp. Niewielki odsetek chorób jest wywoływany przez wiele gatunków jednocześnie.
V. parahaemolyticus jest naturalnym mieszkańcem wód morskich i dlatego szeroko rozpowszechnionym w wodach morskich na całym świecie, w tym w ujściach rzek. Gatunek został odkryty w 1950 roku po wybuchu zatrucia pokarmowego w Japonii. W Stanach Zjednoczonych gatunek ten został po raz pierwszy wyizolowany w wodzie morskiej, osadach i skorupiakach w regionie Puget Sound6,7. Filtratory w siedliskach morskich, takie jak małże, mogą być siedliskiem V. parahaemolyticus jako części swojej naturalnej flory8. W związku z tym zakażenia V. parahaemolyticus u ludzi są często związane ze spożywaniem skażonych owoców morza, zwłaszcza surowych lub niedogotowanych skorupiaków. Rzadziej spotykana jest droga wniknięcia, gdy otwarta rana jest wystawiona na działanie wody morskiej, co prowadzi do infekcji skóry. Większość szczepów V. parahaemolyticus nie powoduje chorób u ludzi, jednak niektóre podtypy zawierające czynniki wirulencji, takie jak termostabilna bezpośrednia hemolizyna (TDH), są chorobotwórcze. Najczęstszymi objawami zakażenia V. parahaemolyticus przenoszonego przez żywność są biegunka i ból brzucha, a następnie nudności, wymioty i gorączka. Zgłaszane są również bóle głowy i dreszcze. Mediana okresu inkubacji wynosi 15 godzin, ale może wynosić do 96 godzin po spożyciu wystarczającej ilości szczepów chorobotwórczych9. Choroba trwa od dwóch do trzech dni. Objawy zapalenia żołądka i jelit wywołane przez V. parahaemolyticus są w dużej mierze samoograniczające się i dlatego specjalne leczenie nie jest konieczne. Łagodne przypadki zapalenia żołądka i jelit można skutecznie leczyć poprzez doustne nawadnianie. Poważniejsze choroby można leczyć antybiotykami, takimi jak tetracyklina lub cyprofloksacyna10. Śmiertelność wynosi około 2% w przypadku zapalenia żołądka i jelit, ale może wynosić nawet 29% u osób, u których rozwija się infekcja krwi lub posocznica. Każda osoba, która spożywa owoce morza lub ma otwarte rany wystawione na działanie wody morskiej, jest narażona na zakażenie V. parahaemolyticus. Cięższa forma choroby, zagrażająca życiu posocznica, występuje częściej w subpopulacji z podstawowymi schorzeniami11, które obejmują alkoholizm, choroby wątroby, cukrzycę, choroby nerek, nowotwory złośliwe i inne stany prowadzące do osłabienia odpowiedzi immunologicznej. Warto zauważyć, że ta grupa osobników jest również bardziej narażona na zarażenie się ciężkimi chorobami wywoływanymi przez V. vulnificus, które można znaleźć w naturalnych siedliskach podobnych do V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus jest rutynowo izolowany przy użyciu agaru tiosiarczanowo-cytrynianowo-żółciowo-sacharozowego (TCBS) jako selektywnego i różnicującego podłoża. Wzbogacenie w alkaliczną wodę peptonową może poprzedzać izolację na agarze TCBS. Przypuszczalne kolonie na TCBS są następnie dalej testowane w szeregu testów biochemicznych i/lub testów molekularnych ukierunkowanych na obecność genów specyficznych dla gatunku. Metody oparte na PCR są często stosowane w celu potwierdzenia tożsamości V. parahaemolyticus poprzez amplifikację termolabilnego genu hemolizyny, tlh12.
Niezależnie od wyboru metod potwierdzania, ważne jest, aby w pierwszej kolejności dysponować skutecznym podłożem do izolowania i odróżniania V. parahaemolyticus od innych morskich vibrio. TCBS jest rutynowo stosowany do różnicowania gatunków z rodzaju Vibrio według ich zdolności do fermentacji sacharozy12. Pozytywnej reakcji fermentacji towarzyszy zmiana koloru wskaźnika pH błękitu bromotymolowego. Kolonie V. parahaemolyticus są dość charakterystyczne na TCBS, wykazując kolor od niebieskiego do zielonego. Jednak to podłoże nie może łatwo odróżnić V. alginolyticus i V. cholerae. Fermentujące sacharozę gatunki Proteus mogą wytwarzać żółte kolonie przypominające V. cholerae lub V. alginolyticus13. Po początkowej izolacji na TCBS, V. parahaemolyticus może być również błędnie zidentyfikowany jako Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides i Pseudomonas spp14. Szczepy z opóźnioną fermentacją sacharozy mogą być mylone z innymi niefermentującymi sacharozami Vibrio13, do których zalicza się V. parahaemolyticus. Stwierdzono, że TCBS nie jest wrażliwy m.in. na Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens. Kilka innych gatunków daje kolonie od zielonych do szarych, które mogą być mylone z V. parahaemolyticus lub V. vulnificus15. W związku z tym pożądane jest opracowanie alternatywnych pożywek hodowlanych o większej czułości i swoistości w wykrywaniu i izolowaniu V. parahaemolyticus i innych blisko spokrewnionych gatunków.
Ostatnio opracowano kilka alternatywnych mediów. Oprócz włączenia środków selektywnych, większość z nich zawiera substraty chromogenne w celu różnicowania gatunków na podstawie ich zróżnicowanej aktywności enzymatycznej. Na przykład indoksylo-β-glukozyd i indoksylo-β-galaktozyd zostały użyte jako podłoża chromogenne do odróżnienia kolonii V. parahaemolyticus (które wydają się niebieskawo-zielone) od kolonii V. cholerae (fioletowy) ze względu na ich zróżnicowane zdolności do wytwarzania β-glukozydazy i β-galaktozydazy16. Oceniano różne preparaty agaru chromogennego opracowane przez kilka grup i stwierdzono, że działają porównywalnie lub lepiej niż TCBS17,18,19. Zaletą stosowania pożywki chromogenicznej jest to, że zabarwienie otaczającej pożywki jest minimalne, co ułatwia izolację poszczególnych kolonii. W tym badaniu oceniliśmy zdolność nowo opracowanej pożywki chromogennej do wykrywania i izolowania V. cholerae, V. parahaemolyticus i V. vulnificus; ze szczególnym naciskiem na jego zdolność do odróżniania V. parahaemolyticus od innych gatunków.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pożywki i hodowla szczepów drobnoustrojów
UWAGA: We wszystkich eksperymentach należy stosować techniki aseptyczne. Należy używać sterylnych materiałów. Wszystkie pojemniki, narzędzia i odczynniki należy wysterylizować przed użyciem. Wszystkie odpady należy poddać autoklawowaniu przed utylizacją, ponieważ są one uznawane za materiały biologicznie niebezpieczne. Kombinacja temperatury i czasu autoklawowania dla wszystkich poniższych procedur wynosi ≥121 °C x ≥15 min.
- Aby przygotować ok. 1 l agaru z soi i tryptony (TSA), najpierw wlać 1 l wody dejonizowanej do kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l zawierającej mieszadło magnetyczne. Należy użyć kolby, której pojemność jest co najmniej dwukrotnie większa od objętości końcowej. Do kolby dodać 30 g proszku pożywki z soi i tryptony oraz 20 g granulek agaru.
UWAGA: Aby ograniczyć rozprzestrzenianie się (swarming) niektórych szczepów, należy zastosować agar o stężeniu 2% zamiast 1,5%. Vibrio spp.- Wymieszaj dokładnie, włączając mieszadło. Podczas mieszania włącz ogrzewanie, aby doprowadzić mieszaninę do wrzenia. Zdejmij kolbę z grzałki natychmiast po tym, jak mieszanina zacznie wrzeć. Luźno przykryj kolbę folią aluminiową. Przed autoklawowaniem przymocuj folię do kolby za pomocą taśmy.
- Aby przygotować bulion sojowo-kazeinowy (TSB), należy pominąć agar w recepturze opisanej w kroku 1.1.
UWAGA: Zamiast kolby Erlenmeyera można użyć butelek. - Aby przygotować agar sojowy z tryptonem uzupełniony o 2% chlorku sodu lub NaCl (TSAS), należy dodać 20 g NaCl do mieszaniny przed mieszaniem i podgrzewaniem. Aby przygotować bulion sojowy z tryptonem uzupełniony o 2% NaCl (TSBS), należy pominąć agar i dodać 20 g NaCl do mieszaniny przed mieszaniem i podgrzewaniem.
- Aby przygotować agar BHI (brain heart infusion), zawiesić 37 g proszku BHI i 15 g granulek agaru w 1 L wody oczyszczonej. Podgrzewać przy częstym mieszaniu do czasu rozpuszczenia proszku. Sterylizować w autoklawie. Aby przygotować bulion BHI, pominąć dodanie agaru.
- Aby przygotować agar TCBS, zawiesić 89 g proszku TCBS w 1 l oczyszczonej wody. Podgrzewać przy częstym mieszaniu i gotować przez 1 min, aby całkowicie rozpuścić proszek. Nie autoklawować.
- W przypadku wszystkich pożywek agarowych schłodzić gorący agar do 45-50 °C w łaźni wodnej. Puste szalki Petriego ułożyć w stosach po pięć do sześciu sztuk. Zaczynając od dołu stosu, wlewać roztopioną agar do każdej szalki Petriego, aż zostanie wypełniona mniej więcej do połowy. Po wlaniu zamknąć pokrywę szalki Petriego. Pozostawić szalki w temperaturze pokojowej do czasu stężenia agaru.
- Użyj szalek z agarem następnego dnia lub po 12 godzinach. Niewykorzystane szalki przechowuj w lodówce do dwóch tygodni. Przed użyciem wyjmij szalki z lodówki i pozostaw je w temperaturze pokojowej na co najmniej 15 minut w celu wyrównania temperatury.
UWAGA: Z jednego litra agaru można przygotować około 45 płytek. W dniu przygotowania należy pozostawić płytki z agarem do wystarczającego wyschnięcia, a po przechowywaniu w niskiej temperaturze doprowadzić je do temperatury pokojowej, aby skutecznie ograniczyć rozprzestrzenianie się kolonii.
- Użyj szalek z agarem następnego dnia lub po 12 godzinach. Niewykorzystane szalki przechowuj w lodówce do dwóch tygodni. Przed użyciem wyjmij szalki z lodówki i pozostaw je w temperaturze pokojowej na co najmniej 15 minut w celu wyrównania temperatury.
- Należy przygotować agar czekoladowy oraz agar chromogenny, a następnie przed każdym eksperymentem doprowadzić je do temperatury pokojowej.
- Przeprowadź pasaż wszystkich 54 szczepów drobnoustrojów przedstawionych w Tabela 1 co kilka dni.
- Za pomocą sterylnej pętli do szczepienia przenieś kultury z zamrożonego banku lub poprzedniej partii na podłoża nieselektywne, takie jak BHI, TSB/TSA lub agar czekoladowy. Hoduj halofiliczne Vibrio spp. na podłożach TSBS/TSAS.
- Aby sprawdzić czystość hodowli, należy wykonać posiew wszystkich szczepów w sposób umożliwiający obserwację kolonii izolowanych. Na przykład można zastosować metodę posiewu w trzech fazach, aby rozcieńczyć dużą ilość bakterii do mniejszej ilości, co w końcowym etapie pozwoli na uzyskanie kolonii izolowanych.
- Inkubować płytki odwrócone do góry dnem w temperaturze 35-37 °C przez maksymalnie 48 h. Dla Campylobacter spp., inkubować probówki lub płytki w słoiku z zamkniętą pokrywką zawierającym saszetkę z gazem w celu wytworzenia środowiska mikroaerofilnego. Po inkubacji należy ocenić morfologię kolonii. Kultury czyste powinny dawać kolonie o podobnej morfologii.
UWAGA: Wszystkie płytki należy inkubować odwrócone do góry dnem, aby zapobiec spadaniu skroplonej wody z wewnętrznej strony pokrywki na kolonie.
2. Identyfikacja gatunków metodą PCR
- Przeprowadź PCR genu tlh, aby potwierdzić tożsamość szczepów V. parahaemolyticus. Do amplifikacji fragmentu genu termolabilnej hemolizyny o długości 450 bp użyj starterów tlh-F (5' AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') oraz tlh-R (5' GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3')20.
- Za pomocą sterylnej pętli szczepiącej przenieś kilka wyizolowanych kolonii każdego szczepu V. parahaemolyticus z podłoża TSAS do 5 ml bulionu TSBS. Inkubuj w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 hr.
- Odwiruj kultury przy 14,000 x g przez 1 min. Usuń nadsącz i dwukrotnie przemyj osad fosforanowym buforem solnym (PBS). Gotuj zawiesinę przez 3 min, aby uzyskać lizat komórkowy.
UWAGA: V. parahaemolyticus ulega łatwej lizie, dlatego odczynnik do lizy nie jest wymagany. Można również użyć niewielkiej ilości kolonii bezpośrednio jako matrycy. - Przeprowadź PCR w objętości reakcyjnej 25-µl. Przygotuj mieszaninę reakcyjną o końcowym stężeniu: 1x bufor PCR, 1.5 mM MgCl2, 100 µM każdego dNTP, 1 µM każdego startera, 1 U polimerazy Taq oraz 1 µl lizatu komórkowego. Po wstępnej inkubacji w 94 °C przez 5 min przeprowadź 35 cykli amplifikacji: 94 °C przez 30 sec, 58 °C przez 30 sec oraz 72 °C przez 60 sec21.
- Naniesienie aliquoty 5-µl amplikonu na żele agarozy 1.5%. Włącz zasilacz, aby rozpocząć elektroforezę. Obecność lub brak amplikonów zwizualizuj w świetle UV po barwieniu bromkiem etydyny.
3. Wzrost na pożywkach selektywnych i różnicujących
- Na dwa do czterech dni przed eksperymentem wysiać wszystkie szczepy drobnoustrojów przedstawione w Tabeli 1 na podłożu nieselektywnym (agar TSAS, BHI lub czekoladowy) w celu izolacji kolonii. Inkubować płytki w temperaturze 35-37 °C przez 48 hr. Sprawdzić czystość kultur poprzez obserwację morfologii kolonii po inkubacji. Czyste kultury powinny dawać kolonie o podobnej morfologii.
- Przenieść kilka wyizolowanych kolonii z kroku 3.1 do 5 ml bulionu. Inkubować probówki w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 hr.
UWAGA: Do przygotowania kultur nocnych we wszystkich eksperymentach należy używać młodych kolonii, których wiek nie przekracza czterech dni. - Wysiać pętlą kultur nocnych na podłożach selektywnych i różnicujących (agar TCBS oraz agar chromogenny) w celu izolacji kolonii. Inkubować płytki w temperaturze 35-37 °C do 96 hr.
- Odnotować ogólny wzrost wszystkich szczepów, oceniając zarówno gęstość kultury na płytce, jak i wielkość wyizolowanych kolonii. Zapisać kolor kolonii w świetle widzialnym i/lub UV. Odnotować inne cechy wyizolowanych kolonii, takie jak wypukłość, brzeg i kształt.
4. Test odzysku
- Wybrać reprezentatywny podzbiór szczepów V. parahaemolyticus (n=14), obejmujący różne serotypy i miejsca izolacji22. Zaszczepić młode kultury z płytek do 5 ml TSBS. Inkubować probówki w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 h.
- Przeprowadzić metodę standardowego przeliczenia płytek dla kultur nocnych zgodnie z opisem poniżej.
- Wymieszać kultury nocne za pomocą vortexa. Przygotować rozcieńczenie 10-krotne lub 10-1, przenosząc 100 µl kultury nocnej do probówki zawierającej 900 µl PBS. Wymieszać za pomocą vortexa.
- Używając nowej końcówki do pipety, przenieść 100 µl z probówki z rozcieńczeniem 10-1 do kolejnej probówki zawierającej 900 µl PBS. Wymieszać za pomocą vortexa. Stanowi to rozcieńczenie 10-2. Powtórzyć proces sekwencyjnie, aby uzyskać rozcieńczenie 10-7.
- Z probówek z rozcieńczeniami od 10-4 do 10-7 wysiać po 100 µl na chromogenne płytki agarowe, płytki TCBS oraz TSAS.
UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia (df) na płytce wynosi odpowiednio od 10-5 do 10-8. - Równomiernie rozprowadzić aliquoty na powierzchni agaru.
UWAGA: Można używać tego samego rozpylacza dla jednego szczepu na tym samym podłożu, pod warunkiem, że w pierwszej kolejności rozprowadza się najbardziej rozcieńczony aliquot (tzn. od 10-8 do 10-5). Nie należy używać tego samego rozpylacza do różnych podłoży. - Inkubować płytki w temperaturze 35-37 °C do 96 h. Policzyć kolonie na płytkach. Pominąć płytki, na których kolonie są zbyt liczne, by można je było policzyć (tntc), lub których liczba jest mniejsza niż 25. Obliczyć CFU/ml zgodnie z poniższym wzorem:
![Równanie dla pojemności kolumny, \(N=C/[(1 \times n_1)+(0.1 \times n_2)] \times df\); analiza chromatograficzna.](/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg "figure-protocol-1")
Gdzie
N = liczba komórek w nierozcieńczonej probówce, wyrażona jako CFU/ml lub CFU/g
C = całkowita liczba kolonii policzonych na płytkach zawierających od 25 do 300 kolonii
n1 = liczba płytek, na których policzone kolonie pochodzą z niższego df
n2 = liczba płytek, na których policzone kolonie pochodzą z kolejnego rozcieńczenia 10-krotnego
df = niższy współczynnik rozcieńczenia (tzn. bardziej stężone rozcieńczenie)
- Porównać CFU/ml dla różnych podłoży. Przyjmując CFU/ml na TSAS jako 100%, obliczyć procent odzysku V. parahaemolyticus wyhodowanych na agarze chromogennym i TCBS.
5. Test konkurencyjny
- Wybierz podzbiór szczepów wykazujących różną morfologię kolonii na podłożu chromogenicznym oraz agarze TCBS.
UWAGA: W ten sposób możliwe będzie zliczenie wyłącznie kolonii pochodzących od V. parahaemolyticus, mimo obecności innych gatunków w inokulum.- Wybierz szczep V. parahaemolyticus, który daje oczekiwane kolonie turkusowe na TCBS i cyjanowe na agarze chromogenicznym.
- Wybierz gatunek niebędący V. parahaemolyticus oraz gatunek niebędący z rodzaju Vibrio, które nie rosną na żadnym z tych podłoży lub wykazują inny kolor kolonii.
UWAGA: Na przykład V. metschnikovii rośnie bardzo słabo na TCBS i nie rósł na agarze chromogenicznym. Shigella sonnei nie rośnie na TCBS, ale daje kolonie magenta na agarze chromogenicznym.
- Po wybraniu powyższych szczepów przygotuj nocne kultury w bulionie, wykorzystując izolowane kolonie wyhodowane na podłożach nieselektywnych.
- Przygotuj nocne kultury V. parahaemolyticus oraz V. metschnikovii, przenosząc kilka izolowanych kolonii z TSAS do 5 ml TSBS. Inkubuj w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 hr.
- Przygotuj nocne kultury Shigella sonnei, przenosząc kilka izolowanych kolonii z agaru BHI do 5 ml bulionu BHI. Inkubuj w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 hr.
- Dla każdego szczepu wykonaj serię rozcieńczeń analogicznie do kroków 4.2.1 i 4.2.2. Wysiej odpowiednie rozcieńczenia na TSAS lub BHI, aby określić CFU/ml kultury nocnej, korzystając z równania przedstawionego w kroku 4.2.5.
UWAGA: Zazwyczaj dla większości kultur sprawdza się 100 µl z probótek z rozcieńczeniami od 10-5 do 10-7. Wykorzystaj wartości CFU/ml do obliczenia dokładnej liczby komórek użytych w następnym kroku. Obliczone wartości CFU/ml uzyskuje się po inkubacji, mimo że kolejne kroki są wykonywane w tym samym dniu co krok 5.3. - Wykorzystując kultury nocne i probótki z rozcieńczeniami z kroków 5.2 i 5.3, zmieszaj różne ilości szczepu V. parahaemolyticus i gatunku niebędącego V. parahaemolyticus. Na przykład zmieszaj 500 µl z probótki z rozcieńczeniem 10-5 V. parahaemolyticus z 500 µl kultury nocnej V. metschnikovii.
UWAGA: Mieszanina ta symuluje wysokie tło mikroflory. Aby zasymulować niskie tło mikroflory, zmieszaj po 500 µl z probótek z rozcieńczeniem 10-5 dla obu gatunków. - Rozsiej 100 µl mieszaniny na płytkach z agarem chromogenicznym, TCBS oraz TSAS.
- Po inkubacji w temperaturze 35-37 °C przez maksymalnie 96 hr, zlicz kolonie V. parahaemolyticus oraz gatunku niebędącego V. parahaemolyticus na podstawie różnic w ich wzroście i morfologii kolonii na agarze chromogenicznym i TCBS.
UWAGA: Na przykład, jeśli gatunek niebędący V. parahaemolyticus nie rośnie na agarze chromogenicznym i TCBS, wszystkie kolonie będą należeć do V. parahaemolyticus. Jeśli gatunek niebędący V. parahaemolyticus rośnie na obu podłożach, tylko kolonie turkusowe na TCBS i cyjanowe na agarze chromogenicznym będą należeć do V. parahaemolyticus. Gatunek niebędący V. parahaemolyticus może lub nie może wykazywać morfologię kolonii podobną do V. parahaemolyticus na TSAS.- Jeśli gatunek niebędący V. parahaemolyticus rośnie na tym podłożu nieselektywnym podobnie do V. parahaemolyticus , podziel liczbę kolonii przez dwa, aby uzyskać liczbę samych V. parahaemolyticus. Porównaj rzeczywistą liczbę kolonii z liczbą oczekiwaną wynikającą z kroku 5.3.
6. Efekty homogenatów ostryg
- Odważ ≥50 g mięsa ostryg z ≥12 mięczaków, wliczając mięso i płyn ustrojowy.
- Do mięsa i płynu z ostryg należy dodać równą ilość PBS. Mieszaninę blendować z dużą prędkością przez 90 s. Otrzymany roztwór stanowi próbkę 2-1 rozcieńczony homogenat ostryg.
- Dodać 100 g 2-1 rozcieńczony homogenat ostryg do 400 g PBS. Do pomiaru należy użyć wagi, a nie miarki objętościowej. Mieszaninę blendować z dużą prędkością przez 1 min. Homogenat ostryg poddać autoklawowaniu.
UWAGA: Będzie to homogenat ostryg wykorzystany do wzbogacania prób.
- Powtórzyć test odzysku (krok 4) w obecności homogenatu ostrygi.
- Po ostygnięciu 500 g homogenatu z ostryg należy dodać 100 µl z V. parahaemolyticus do hodowli nocnych w TSBS. Określić rzeczywistą ilość V. parahaemolyticus liczbę komórek w inokulum, przeprowadzając procedury standardowego przeliczania kolonii na płytkach opisane w kroku 4.2.
- Powtórzyć analizę konkurencyjną (Krok 5) w obecności homogenatu ostrygi.
- Po ochłodzeniu 500 g homogenatu z ostryg, dodać 100 µl każda z nocnych kultur V. parahaemolyticus i nie-V. parahaemolyticus do niego. Wyznaczyć rzeczywistą ilość bakterii liczbę komórek w inokulum, przeprowadzając procedury standardowego przeliczenia płytek (Standard Plate Count) opisane w kroku 4.2
- Dokładnie wymieszaj komórki bakteryjne z homogenatem ostrygi za pomocą homogenizatora.
UWAGA: Po wymieszaniu homogenat ostrygi zawierający celowo dodane komórki nazywany jest wzbogaconym homogenatem ostrygi. - Przygotować rozcieńczenia wzbogaconego homogenatu ostryg, aby uzyskać 10-1 do 10-3 probówki do rozcieńczeń zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 4.2.2. Rozprowadź 100 µl każdego rozcieńczenia na chromogeniczne agar, agar TCBS oraz agar TSAS. Inkubować płytki w temperaturze 35-37 °C do 96 h.
- Porównaj rzeczywistą liczbę kolonii na agarze chromogenicznym i TCBS z oczekiwaną liczbą kolonii wynikającą z kroków 6.2.1 i 6.3.1.
UWAGA: Na przykład, jeśli probówka zawierająca V. parahaemolyticus kultura nocna zawiera 108 CFU/ml, inokulum o stężeniu 100 μl oznacza 107 komórki dodaje się do 500 g homogenatu ostrygi, otrzymując 5 x 104 komórek/g. Po rozcieńczeniu i wysianiu, płytka posiadająca df = 10-2 powinno dać 500 kolonii; podczas gdy ta posiadająca df = 10-3 powinno przynieść 50 kolonii. Są to oczekiwane liczby kolonii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym badaniu zgromadzono 54 szczepy drobnoustrojów, w tym 22 szczepy gatunku V. parahaemolyticus, 19 innych gatunków z rodzaju Vibrio oraz 13 gatunków spoza rodzaju Vibrio (Tabela 1). Większość szczepów V. parahaemolyticus otrzymano z FDA, CDC lub innych stanowych wydziałów zdrowia. Reprezentują one różne serotypy i źródła izolacji. Szczepy te zostały wcześniej zidentyfikowane przez agencje regulacyjne. Tożsamość tych szczepów <...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsze badanie koncentruje się na opracowywaniu i ocenie pożywek kulturowych. Konwencjonalnie TCBS jest selektywnym i różnicowym podłożem stosowanym do izolowania i wykrywania V. parahaemolyticus, V. cholerae i V. vulnificus12. Odnotowano jednak ograniczenia dotyczące tego podłoża, takie jak niemożność odróżnienia V. cholerae od innych gatunków Vibrio . Sacharoza i wskaźnik pH są czynnikami różnicującymi TCBS. Tak więc produkcja kwasu przez fermentor sacharozy powoduje zm...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Niektóre media zostały hojnie dostarczone przez Hardy Diagnostics z Santa Maria w Kalifornii. Thorsen przeprowadził to badanie podczas studiów na Politechnice Kalifornijskiej. Obecnie jest pracownikiem firmy Hardy Diagnostics.
Podziękowania
Dziękujemy M. Channey, E. Chau i K. Tomasowi za pomoc w projekcie. Materiały projektowe zostały częściowo sfinansowane przez Politechnikę Kalifornijską.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynnik/Sprzęt | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | może używać innych marek |
| Autoklaw | Dowolny | ||
| proszek BHI | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | może używać innych marek |
| Blender | Any | do miksowania mięsa ostryg | |
| Gaz CampyGen generator | Hardy Diagnostics | CN035A | w celu zapewnienia atmosfery mikroaerofilowej; może używać innych marek |
| Czekoladowe talerze agarowe | Hardy Diagnostics | E14 | może używać innych marek |
| Popularne odczynniki PCR (dNTPs, MgCl2, Taq Polimeraza) | Dowolne | lub użyj kulek PCR (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Probówki hodowlane | Fisher Scientific | S50712 | może używać |
| probówek Eppendorf | Fisher Scientific | S348903 | może używać innych marek |
| Gel doc | Dowolne | ||
| płytki agarowe HardyChrom Vibrio | Hardy Diagnostics | G319 | To badanie ocenia tę pożywkę |
| Inkubator | Dowolne | ||
| pętle inokulacyjne | Fisher Scientific | 22-363-606 | W tym badaniu użyto rozmiaru 10 mikrolitrów |
| NaCl Fisher | Scientific | BP358-212 | może używać innych marek |
| Ostrygi | Dowolna | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | może używać |
| szalki Petriego | Fisher Scientific | FB0875713 | może używać innych marek |
| Pipety i końcówki | Dowolne | sterylizowane końcówki | |
| tlh | IDT | ||
| Zamiast | |||
| rozsiewacza | Fisher Scientific | 08-100-11 | Koraliki |
| Blender | Stomacher | 400 | Próbki homogenizowano przy 200 obr./min przez 30 sek. Można użyć innego homogenizatora. |
| Sterylne worki filtracyjne do blenderów | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS w proszku | Hardy Diagnostics | 265020 | To badanie ocenia to medium |
| Termocykler | Dowolny | ||
| proszek TSB | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | może używać innych marek |
| Szafka obserwacyjna UV | Dowolna | emituje długofalowe światło UV | |
| Kąpiel wodna | Dowolna | | |
| Nazwa | Źródła | Numer katalogowy | Komentarze |
| Gatunki i szczepy bakterii | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| em>Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| em>Escherichia coli | ATCC | ||
| em>Proteus mirabilis | ATCC | ||
| em>Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| em>Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| em>Shigella boydii | ATCC | ||
| em>Shigella flexneri | ATCC | ||
| em>Shigella sonnei | ATCC | ||
| em>Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypy obejmują O139, O1, non O1, El Tor biowars) | FDA, ATCC | ||
| >V. damsela | FDA | ||
| em>V. fisheri | Environment | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| em>V. furnissii | CDC | ||
| em>V. hollisae | FDA | ||
| em>V. metschnikovii | ATCC | ||
| em>V. mimicus | FDA | ||
| em>V. parahaemolyticus (serotypy obejmują O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.) | ATCC, FDA, CDC, Środowisko | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| em>V. vulnificus | FDA |
Bibliografia
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008).
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , Second Edition, (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm (2005).
- Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm (2004).
- MacFaddin, J. F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
- World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
