Opracowanie bardziej czułego i specyficznego chromogennego podłoża agarowego do wykrywania Vibrio parahaemolyticus i innych gatunków Vibrio

Summary

Wykrywanie i izolacja klinicznie istotnych gatunków Vibrio wymaga selektywnych i zróżnicowanych pożywek hodowlanych. W badaniu tym oceniono zdolność nowej pożywki chromogennej do wykrywania i identyfikacji V. parahaemolyticus i innych pokrewnych gatunków. Okazało się, że nowe podłoże ma lepszą czułość i swoistość niż konwencjonalne podłoże.

Abstract

Infekcje przenoszone przez żywność w USA wywołane przez gatunki Vibrio wykazują tendencję wzrostową. W rodzaju Vibrio, V. parahaemolyticus jest odpowiedzialny za większość infekcji związanych z Vibrio. W związku z tym dokładne różnicowanie między Vibrio spp. i wykrywanie V. parahaemolyticus jest niezwykle ważne dla zapewnienia bezpieczeństwa naszych dostaw żywności. Chociaż techniki molekularne są coraz bardziej powszechne, metody zależne od hodowli są nadal rutynowo stosowane i w pewnych okolicznościach są uważane za metody standardowe. W związku z tym przetestowano nowatorskie chromogenne podłoże agarowe w celu zapewnienia lepszej metody izolacji i różnicowania klinicznie istotnych Vibrio spp. W protokole porównano czułość, swoistość i granicę wykrywalności dla wykrywania V. parahaemolyticus między nową pożywką chromogenną a konwencjonalną pożywką. Wykorzystano różne szczepy V. parahaemolyticus (n=22) reprezentujące różne serotypy i pochodzenie wirusa. Zostały one wcześniej zidentyfikowane przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC), a następnie zweryfikowane w naszym laboratorium za pomocą tlh-PCR. W co najmniej czterech oddzielnych próbach szczepy te inokulowano na agarze chromogenicznym i agarze tiosiarczan-cytrynian żółci-sacharoza (TCBS), który jest zalecanym podłożem do hodowli tego gatunku, a następnie inkubowano w temperaturze 35-37 °C przez 24-96 godzin. Trzy szczepy V. parahaemolyticus (13,6%) nie rosły optymalnie na TCBS, niemniej jednak wykazywały zielone kolonie, jeśli nastąpił wzrost. Dwa szczepy (9,1%) nie dały oczekiwanych kolonii cyjanu na agarze chromogennym. Szczepy inne niż V. parahaemolyticus (n=32) zostały również przetestowane w celu określenia specyficzności agaru chromogenicznego. Spośród tych szczepów 31 nie rosło lub wykazywało inne morfologie kolonii. Średni odzysk V. parahaemolyticus na agarze chromogennym wynosił ~96,4% w stosunku do tryptycznego agatora sojowego uzupełnionego 2% NaCl. Podsumowując, nowy agar chromogenny jest skutecznym podłożem do wykrywania V. parahaemolyticus i odróżniania go od innych wibrio.

Introduction

Jako przedstawiciel rodzaju Vibrio, V. parahaemolyticus jest Gram-ujemną, nietworzącą przetrwalników, zakrzywioną bakterią w kształcie pręcika. Wykazuje wysoką ruchliwość zarówno w środowisku ciekłym, jak i półstałym. Większość szczepów V. parahaemolyticus nie jest patogenna dla ludzi, jednak podtypy patogenne powodowały epidemie i pandemie, stąd gatunek ten jest uważany za ważny patogen przenoszony przez żywność w wielu krajach^1,2. Częstość występowania infekcji Vibrio w USA wykazuje tendencję wzrostową od 2000 roku³. Wśród Vibrio spp., V. parahaemolyticus jest najczęściej zgłaszanym gatunkiem powodującym choroby w USA^4,5. Inne klinicznie istotne gatunki to V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae itp. Niewielki odsetek chorób jest wywoływany przez wiele gatunków jednocześnie.

V. parahaemolyticus jest naturalnym mieszkańcem wód morskich i dlatego szeroko rozpowszechnionym w wodach morskich na całym świecie, w tym w ujściach rzek. Gatunek został odkryty w 1950 roku po wybuchu zatrucia pokarmowego w Japonii. W Stanach Zjednoczonych gatunek ten został po raz pierwszy wyizolowany w wodzie morskiej, osadach i skorupiakach w regionie Puget Sound^6,7. Filtratory w siedliskach morskich, takie jak małże, mogą być siedliskiem V. parahaemolyticus jako części swojej naturalnej flory⁸. W związku z tym zakażenia V. parahaemolyticus u ludzi są często związane ze spożywaniem skażonych owoców morza, zwłaszcza surowych lub niedogotowanych skorupiaków. Rzadziej spotykana jest droga wniknięcia, gdy otwarta rana jest wystawiona na działanie wody morskiej, co prowadzi do infekcji skóry. Większość szczepów V. parahaemolyticus nie powoduje chorób u ludzi, jednak niektóre podtypy zawierające czynniki wirulencji, takie jak termostabilna bezpośrednia hemolizyna (TDH), są chorobotwórcze. Najczęstszymi objawami zakażenia V. parahaemolyticus przenoszonego przez żywność są biegunka i ból brzucha, a następnie nudności, wymioty i gorączka. Zgłaszane są również bóle głowy i dreszcze. Mediana okresu inkubacji wynosi 15 godzin, ale może wynosić do 96 godzin po spożyciu wystarczającej ilości szczepów chorobotwórczych⁹. Choroba trwa od dwóch do trzech dni. Objawy zapalenia żołądka i jelit wywołane przez V. parahaemolyticus są w dużej mierze samoograniczające się i dlatego specjalne leczenie nie jest konieczne. Łagodne przypadki zapalenia żołądka i jelit można skutecznie leczyć poprzez doustne nawadnianie. Poważniejsze choroby można leczyć antybiotykami, takimi jak tetracyklina lub cyprofloksacyna¹⁰. Śmiertelność wynosi około 2% w przypadku zapalenia żołądka i jelit, ale może wynosić nawet 29% u osób, u których rozwija się infekcja krwi lub posocznica. Każda osoba, która spożywa owoce morza lub ma otwarte rany wystawione na działanie wody morskiej, jest narażona na zakażenie V. parahaemolyticus. Cięższa forma choroby, zagrażająca życiu posocznica, występuje częściej w subpopulacji z podstawowymi schorzeniami¹¹, które obejmują alkoholizm, choroby wątroby, cukrzycę, choroby nerek, nowotwory złośliwe i inne stany prowadzące do osłabienia odpowiedzi immunologicznej. Warto zauważyć, że ta grupa osobników jest również bardziej narażona na zarażenie się ciężkimi chorobami wywoływanymi przez V. vulnificus, które można znaleźć w naturalnych siedliskach podobnych do V. parahaemolyticus.

V. parahaemolyticus jest rutynowo izolowany przy użyciu agaru tiosiarczanowo-cytrynianowo-żółciowo-sacharozowego (TCBS) jako selektywnego i różnicującego podłoża. Wzbogacenie w alkaliczną wodę peptonową może poprzedzać izolację na agarze TCBS. Przypuszczalne kolonie na TCBS są następnie dalej testowane w szeregu testów biochemicznych i/lub testów molekularnych ukierunkowanych na obecność genów specyficznych dla gatunku. Metody oparte na PCR są często stosowane w celu potwierdzenia tożsamości V. parahaemolyticus poprzez amplifikację termolabilnego genu hemolizyny, tlh¹².

Niezależnie od wyboru metod potwierdzania, ważne jest, aby w pierwszej kolejności dysponować skutecznym podłożem do izolowania i odróżniania V. parahaemolyticus od innych morskich vibrio. TCBS jest rutynowo stosowany do różnicowania gatunków z rodzaju Vibrio według ich zdolności do fermentacji sacharozy¹². Pozytywnej reakcji fermentacji towarzyszy zmiana koloru wskaźnika pH błękitu bromotymolowego. Kolonie V. parahaemolyticus są dość charakterystyczne na TCBS, wykazując kolor od niebieskiego do zielonego. Jednak to podłoże nie może łatwo odróżnić V. alginolyticus i V. cholerae. Fermentujące sacharozę gatunki Proteus mogą wytwarzać żółte kolonie przypominające V. cholerae lub V. alginolyticus¹³. Po początkowej izolacji na TCBS, V. parahaemolyticus może być również błędnie zidentyfikowany jako Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides i Pseudomonas spp¹⁴. Szczepy z opóźnioną fermentacją sacharozy mogą być mylone z innymi niefermentującymi sacharozami Vibrio¹³, do których zalicza się V. parahaemolyticus. Stwierdzono, że TCBS nie jest wrażliwy m.in. na Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens. Kilka innych gatunków daje kolonie od zielonych do szarych, które mogą być mylone z V. parahaemolyticus lub V. vulnificus¹⁵. W związku z tym pożądane jest opracowanie alternatywnych pożywek hodowlanych o większej czułości i swoistości w wykrywaniu i izolowaniu V. parahaemolyticus i innych blisko spokrewnionych gatunków.

Ostatnio opracowano kilka alternatywnych mediów. Oprócz włączenia środków selektywnych, większość z nich zawiera substraty chromogenne w celu różnicowania gatunków na podstawie ich zróżnicowanej aktywności enzymatycznej. Na przykład indoksylo-β-glukozyd i indoksylo-β-galaktozyd zostały użyte jako podłoża chromogenne do odróżnienia kolonii V. parahaemolyticus (które wydają się niebieskawo-zielone) od kolonii V. cholerae (fioletowy) ze względu na ich zróżnicowane zdolności do wytwarzania β-glukozydazy i β-galaktozydazy¹⁶. Oceniano różne preparaty agaru chromogennego opracowane przez kilka grup i stwierdzono, że działają porównywalnie lub lepiej niż TCBS^17,18,19. Zaletą stosowania pożywki chromogenicznej jest to, że zabarwienie otaczającej pożywki jest minimalne, co ułatwia izolację poszczególnych kolonii. W tym badaniu oceniliśmy zdolność nowo opracowanej pożywki chromogennej do wykrywania i izolowania V. cholerae, V. parahaemolyticus i V. vulnificus; ze szczególnym naciskiem na jego zdolność do odróżniania V. parahaemolyticus od innych gatunków.

Protocol

1. Pożywki i hodowla szczepów drobnoustrojów

UWAGA: Używaj technik aseptycznych we wszystkich eksperymentach. Używaj sterylnych materiałów. Wysterylizuj wszystkie pojemniki, narzędzia i odczynnik przed użyciem. Wszystkie odpady należy sterylizować w autoklawie przed utylizacją, ponieważ są one uważane za niebezpieczne biologicznie. Kombinacja temperatury i czasu w autoklawie wynosi ≥121 °C x ≥15 min dla wszystkich poniższych procedur.

1. Aby zrobić ~1-litrowy agar sojowy tryptyczny (TSA), najpierw dodaj 1 l wody dejonizowanej do 2-litrowej kolby Erlenmeyera zawierającej mieszadło magnetyczne. Użyj kolby, która jest co najmniej dwa razy większa niż ostateczna objętość. Do kolby dodać 30 g bulionu sojowego tryptycznego w proszku i 20 g granulatu agarowego.
   UWAGA: Użyj 2% agaru zamiast 1,5%, aby ograniczyć rój niektórych Vibrio spp.
   1. Dokładnie wymieszaj, włączając mieszadło. Mieszając, włącz ogień, aby zagotować mieszaninę. Wyjąć kolbę z grzałki, gdy tylko mieszanina zacznie wrzeć. Luźno przykryj kolbę folią aluminiową. Przyklej folię taśmą, aby przymocować ją do kolby przed autoklawem.
   2. Aby zrobić tryptyczny bulion sojowy (TSB), pomiń agar w przepisie w kroku 1.1.
      UWAGA: Można używać butelek zamiast kolby Erlenmeyera.
   3. Aby przygotować tryptyczny agar sojowy uzupełniony 2% chlorkiem sodu lub NaCl (TSAS), dodaj 20 g NaCl do mieszaniny przed wymieszaniem i podgrzaniem. Aby przygotować tryptyczny bulion sojowy uzupełniony 2% NaCl (TSBS), pomiń agar, dodaj 20 g NaCl do mieszaniny przed wymieszaniem i podgrzaniem.
2. Aby przygotować agar do infuzji z serca mózgu (BHI), zawiesić 37 g proszku BHI i 15 g granulek agaru w 1 l oczyszczonej wody. Podgrzewać z częstym mieszaniem, aby rozpuścić proszek. Autoklaw. Pomiń agar, aby zrobić bulion BHI.
3. Aby przygotować agar TCBS, zawiesić 89 g proszku TCBS w 1 litrze oczyszczonej wody. Podgrzewać z częstym mieszaniem i gotować przez 1 minutę, aby całkowicie rozpuścić proszek. Nie sterylizować w autoklawie.
4. W przypadku wszystkich pożywek agarowych gorący agar należy schłodzić do temperatury 45-50 °C w łaźni wodnej. Ułóż puste szalki Petriego w stosy po pięć do sześciu płytek. Zaczynając od dołu stosu, wlej stopiony agar do każdej płytki Petriego, aby osiągnąć około połowy wypełnienia. Zamknij pokrywę płytki Petriego po nalaniu wody. Pozwól agarowi zastygnąć, pozostawiając płytki w temperaturze pokojowej.
   1. Płytki agarowe należy zużyć następnego dnia lub po 12 godzinach. Niewykorzystane płytki należy przechowywać w lodówce do dwóch tygodni. Przed użyciem wyjmij talerze z lodówki i zrównoważ je w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut.
      UWAGA: Jednolitrowy agar tworzy ~45 płytek agarowych. Pozostawić płytki agarowe do wystarczającego wyschnięcia w dniu przygotowania i wyrównać je do temperatury pokojowej po przechowywaniu w chłodni, aby skutecznie ograniczyć rozprzestrzenianie się kolonii.
5. Zaopatrz się w czekoladowe i chromogenne płytki agarowe i zrównoważ je w temperaturze pokojowej przed każdym eksperymentem.
6. Subkultura wszystkich 54 szczepów drobnoustrojów przedstawionych w tabeli 1 co kilka dni.
   1. Użyj sterylnej pętli zaszczepiającej, aby przenieść kultury z zamrożonego bulionu lub poprzedniej partii do nieselektywnych pożywek, takich jak BHI, TSB/TSA lub agar czekoladowy. Uprawiaj halofilne Vibrio spp. na TSBS/TSAS.
   2. Aby sprawdzić czystość kultury, należy rozprowadzić wszystkie szczepy we wzorze, który pozwoliłby na obserwację izolowanych kolonii. Na przykład użyj trójfazowego wzoru smug, aby rozcieńczyć dużą ilość bakterii do mniejszej ilości, ostatecznie uzyskując izolowane kolonie.
7. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 35-37 °C przez maksymalnie 48 godzin. W przypadku Campylobacter spp. inkubować probówki lub płytki w słoiku z zamkniętą pokrywką zawierającym woreczek z gazem, aby wytworzyć środowisko mikroaerofilne. Obserwuj morfologię kolonii po inkubacji. Czyste kultury powinny dawać kolonie, które wykazują podobną morfologię kolonii.
   UWAGA: Inkubuj wszystkie płytki do góry nogami, aby zapobiec spadaniu na kolonie skondensowanych kropelek wody utworzonych na spodniej stronie pokrywy.

2. Oznaczanie gatunków metodą PCR

1. Przeprowadzić tlh-PCR, aby potwierdzić tożsamość szczepów V. parahaemolyticus. Użyj starterów tlh-F (5' AAA, GCG, GAT, TAT, GCA, GAA, GCA, CTG, 3') i tlh-R (5' GCT, ACT, TTC, TAG, CAT, TTT, CTC, TGC, 3'), aby amplifikować 450-bp fragment termolabilnego genu hemolizyny²⁰.
   1. Użyj sterylnej pętli zaszczepiającej, aby przenieść kilka izolowanych kolonii każdego szczepu V. parahaemolyticus z TSAS do 5 ml TSBS. Inkubować w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 godziny.
   2. Odwirować kultury przy 14 000 x g przez 1 minutę. Usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć osad solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Gotować zawiesinę przez 3 minuty, aby uzyskać lizat komórkowy.
      UWAGA: V. parahaemolyticus łatwo ulega lizie. Dlatego odczynnik do lizy nie jest wymagany. Możliwe jest również użycie odrobiny kolonii bezpośrednio jako szablonu.
   3. Wykonaj PCR w objętości reakcyjnej 25 μl. Przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą końcowe stężenie 1x buforu PCR, 1,5 mM MgCl₂, 100 μM każdego dNTP, 1 μM każdego startera, 1 U polimerazy Taq i 1 μl lizatu komórkowego. Po wstępnej inkubacji w temperaturze 94 °C przez 5 minut należy wykonać 35 cykli amplifikacji w temperaturze 94 °C przez 30 sekund, 58 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 60 sekund²¹.
   4. Załaduj porcje amplikonu 5 μl w 1,5% żelach agarozowych. Włącz zasilanie, aby rozpocząć elektroforezę. Wizualizacja obecności lub braku amplikonów w świetle UV po barwieniu bromkiem etydyny.

3. Wzrost na podłożach selektywnych i różnicowych

1. Dwa do czterech dni przed eksperymentem należy przeszukać wszystkie szczepy drobnoustrojów przedstawione w Tabeli 1 na nieselektywnym podłożu (TSAS, BHI lub agar czekoladowy) w celu izolacji kolonii. Inkubować płytki w temperaturze 35-37 °C przez 48 godzin. Sprawdź czystość kultur, obserwując morfologię kolonii po inkubacji. Czyste kultury powinny dawać kolonie, które wykazują podobną morfologię kolonii.
2. Przenieść kilka izolowanych kolonii z kroku 3.1 do 5 ml bulionu. Inkubować probówki w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 godz.
   UWAGA: We wszystkich eksperymentach należy używać młodych kolonii, które mają mniej niż cztery dni, do przygotowania kultur na noc.
3. Umieść pętlę nocnych kultur na pożywkach selektywnych i różnicowych (TCBS i agar chromogenny) w celu izolacji kolonii. Inkubować płytki w temperaturze 35-37 °C przez maksymalnie 96 godzin.
4. Rejestruj ogólny wzrost wszystkich szczepów, badając zarówno gęstość kultur na płytce, jak i wielkość izolowanych kolonii. Zapisz kolor kolonii w świetle otoczenia i/lub UV. Zwróć uwagę na inne cechy izolowanej kolonii, takie jak wysokość, margines i forma.

4. Test odzyskiwania

1. Należy wybrać reprezentatywny podzbiór szczepów V. parahaemolyticus (n=14), które obejmują różne serotypy i pochodzenie izolacji²². Zaszczepić młode kultury z płytek w 5 ml TSBS. Inkubować probówki w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 godziny.
2. Przeprowadzić standardową metodę liczenia płytek w posiewach nocnych, jak opisano poniżej.
   1. Wiruj, aby dobrze wymieszać kultury z nocy. Wykonać 10-krotne lub ^10-1 rozcieńczenie, przenosząc 100 μl nocnej hodowli do probówki zawierającej 900 μl PBS. Wiruj, aby dobrze wymieszać.
   2. Za pomocą nowej końcówki pipety przenieść 100 μl z probówki do rozcieńczania ^10-1 do innej probówki zawierającej 900 μl PBS. Wiruj, aby dobrze wymieszać. Stanowi to rozcieńczenie ^10-2. Powtórz proces sekwencyjnie, aby uzyskać rozcieńczenie ^10-7.
   3. Używając probówek do rozcieńczania od ^10-4 do ^10-7, rozłóż po 100 μl każda na płytkach agarowych chromogennych, TCBS i TSAS.
      UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia (df) na płytce wynosi odpowiednio ^10-5 do ^10-8.
   4. Rozprowadź porcje równomiernie na powierzchni agaru.
      UWAGA: Dobrze jest używać tego samego rozsiewacza na szczep na tym samym podłożu, o ile najpierw rozprowadzi się najbardziej rozcieńczoną podwielokrotność (tj. od ^10-8 do ^10-5). Nie używaj tego samego rozsiewacza do różnych mediów.
   5. Inkubować płytki w temperaturze 35-37 °C przez okres do 96 godzin. Policz kolonie na płytkach. Zignoruj płytki zawierające kolonie, które są zbyt liczne, aby je policzyć (tntc) lub mniejsze niż 25. Oblicz jtk jtk/ml zgodnie z następującymi zasadami:
      
      Gdzie
      N = liczba komórek w nierozcieńczonej probówce, wyrażona jako jtk/ml lub jtk/g
      C = całkowita liczba rodzin zliczonych na tabliczkach, na których znajduje się 25-300 kolonii
      N₁ = liczba płytek, na których zliczone kolonie pochodzą z dolnego DF
      N₂ = liczba płytek, na których znajdują się zliczone kolonie z późniejszego 10-krotnego rozcieńczenia
      df = dolny współczynnik rozcieńczenia (tj. bardziej skoncentrowane rozcieńczenie)
3. Porównaj jtk/ml między różnymi mediami. Użyj jtk/ml na TSAS jako 100%, oblicz % odzysku V. parahaemolyticus wyhodowanego na agarze chromogennym i TCBS.

5. Test konkurencji

1. Wybierz podzbiór szczepów, które wykazują różną morfologię kolonii na agarze chromogennym i TCBS.
   UWAGA: W ten sposób możliwe będzie liczenie kolonii pochodzących tylko od V. parahaemolyticus, pomimo obecności innych gatunków w inokulum.
   1. Wybierz szczep V. parahaemolyticus, który daje oczekiwane turkusowe i cyjanowe kolonie odpowiednio na TCBS i agarze chromogennym.
   2. Wybierz gatunki inne niż V. parahaemolyticus i inne niż Vibrio, które nie rosną na żadnym z tych pożywek lub wykazują inny kolor kolonii.
      UWAGA: Na przykład V. metschnikovii rośnie bardzo słabo na TCBS i nie rośnie na agarze chromogennym. Shigella sonnei nie rośnie na TCBS, ale daje kolonie magenta na agarze chromogenicznym.
2. Po wybraniu powyższych szczepów przygotuj nocne kultury bulionowe, używając izolowanych kolonii wyhodowanych na nieselektywnych podłożach.
   1. Wykonaj nocne hodowle V. parahaemolyticus i V. metschnikovii, przenosząc kilka izolowanych kolonii z TSAS do 5 ml TSBS. Inkubować w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 godziny.
   2. Zrób nocne kultury Shigella sonnei, przenosząc kilka izolowanych kolonii z agaru BHI do 5 ml bulionu BHI. Inkubować w temperaturze 35-37 °C przez 16-24 godziny.
3. Dla każdego szczepu należy wykonać serię rozcieńczeń podobną do kroków 4.2.1 i 4.2.2. Umieścić odpowiednie rozcieńczenia na TSAS lub BHI w celu oznaczenia jtk/ml nocnej hodowli, stosując równanie pokazane w kroku 4.2.5.
   UWAGA: Zazwyczaj 100 μl z probówek rozcieńczających ^10-5 do ^10-7 działa dla większości kultur. Użyj wartości CFU/ml, aby obliczyć dokładną liczbę komórek użytych w następnym kroku. Obliczone wartości jtk/ml uzyskuje się po inkubacji, chociaż poniższe kroki są wykonywane w tym samym dniu, co krok 5.3.
4. Korzystając z nocnych kultur i probówek rozcieńczających w krokach 5.2 i 5.3, wymieszać różne ilości szczepu V. parahaemolyticus i gatunku innego niż V. parahaemolyticus. Na przykład zmieszać 500 μl probówki z ^10-5 rozcieńczeniami V. parahaemolyticus z 500 μl nocnych kultur V. metschnikovii.
   UWAGA: Ta mieszanina symuluje wysokie tło mikroflory. Aby zasymulować tło o niskiej zawartości mikroflory, zmieszaj po 500 μl każdej z probówki do rozcieńczania ^10-5 z obu gatunków.
5. Rozprowadzić po 100 μl mieszaniny na płytkach agarowych chromogennych, TCBS i TSAS.
6. Po inkubacji w temperaturze 35–37 °C przez okres do 96 godzin, należy policzyć kolonie gatunków V. parahaemolyticus i innych niż V. parahaemolyticus na podstawie różnicy we wzroście i morfologii kolonii na agarze chromogennym i TCBS.
   UWAGA: Na przykład, jeśli gatunek inny niż V. parahaemolyticus nie rośnie na agarze chromogennym i TCBS, wszystkie kolonie będą należeć do V. parahaemolyticus. Jeśli gatunek inny niż V. parahaemolyticus rośnie na obu podłożach, tylko turkusowe kolonie na TCBS i cyjanowe kolonie na chromogennym agarze będą należeć do V. parahaemolyticus. Gatunki inne niż V. parahaemolyticus mogą, ale nie muszą, wykazywać podobną morfologię kolonii do V. parahaemolyticus na TSAS.
   1. Jeśli gatunek inny niż V. parahaemolyticus rośnie podobnie do V. parahaemolyticus na tej nieselektywnej pożywce, podziel liczbę kolonii przez dwa, aby uzyskać liczby tylko dla V. parahaemolyticus. Porównaj rzeczywistą liczbę kolonii z oczekiwaną liczbą wynikającą z kroku 5.3.

6. Efekty homogenatów ostryg

1. Zważyć ≥50 g mięsa ostryg ze skorupiaków ≥12, w tym mięsa i likieru.
   1. Dodaj równą ilość PBS do mięsa ostryg i likieru. Miksuj mieszaninę na wysokich obrotach przez 90 sekund. Stanowi to rozcieńczony w ^2-1 homogenat ostryg.
   2. Dodać 100 g ^2-1 rozcieńczonego homogenatu ostryg do 400 g PBS. Użyj wagi, aby zmierzyć wagę, a nie objętość. Miksuj mieszaninę na wysokich obrotach przez 1 minutę. Autoklaw homogenatu ostryg.
      UWAGA: Będzie to homogenat ostryg używany do przyprawiania.
2. Powtórzyć test odzysku (etap 4) w obecności homogenatu ostryg.
   1. Po ostygnięciu 500 g homogenatu ostryg dodaj do niego 100 μl nocnych kultur V. parahaemolyticus wyhodowanych w TSBS. Określić rzeczywistą ilość komórek V. parahaemolyticus w inokulum, przeprowadzając procedury standardowego liczenia płytek opisane w kroku 4.2.
3. Powtórzyć test konkurencji (etap 5) w obecności homogenatu ostryg.
   1. Po ostygnięciu 500 g homogenatu ostryg dodać do niego po 100 μl każdej z nocnych kultur V. parahaemolyticus i non-V. parahaemolyticus. Określ rzeczywistą ilość komórek bakteryjnych w inokulum, przeprowadzając procedury standardowego liczenia płytek opisane w kroku 4.2
4. Dobrze wymieszaj komórki bakteryjne z homogenatem ostryg za pomocą homogenizatora.
   UWAGA: Po wymieszaniu homogenat ostryg zawierający celowo dodane komórki nazywa się homogenatem ostryg z kolcami.
5. Rozcieńczyć homogenat ostryg z kolcami w celu uzyskania ^10-1 do ^10-3 probówek rozcieńczających zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 4.2.2. Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczenia na agarze chromogenicznym, TCBS i TSAS. Inkubować płytki w temperaturze 35-37 °C przez maksymalnie 96 godzin.
6. Porównaj rzeczywistą liczbę kolonii na agarze chromogennym i TCBS z oczekiwaną liczbą kolonii wydedukowaną z kroków 6.2.1 i 6.3.1.
   UWAGA: Na przykład, jeśli probówka nocnej hodowli V. parahaemolyticus zawiera 10⁸ jtk/ml, inokulum 100 μl oznacza, że do 500 g homogenatu ostryg dodaje się 10-7 komórek, co daje 5 x 10⁴ komórek/g. Po rozcieńczeniu i posianiu płytka o df = ^10-2 powinna dać 500 kolonii; podczas gdy to, że DF = ^10-3 powinno dać 50 kolonii. Są to oczekiwane liczby kolonii.

Results

W tym badaniu zebrano 54 szczepy drobnoustrojów, w tym 22 szczepy z gatunku V. parahaemolyticus, 19 innych gatunków Vibrio i 13 gatunków innych niż Vibrio (Tabela 1). Większość szczepów V. parahaemolyticus otrzymano z FDA, CDC lub innych stanowych departamentów zdrowia. Reprezentują one różne serotypy i źródła izolacji. Szczepy te zostały wcześniej zidentyfikowane przez agencje regulacyjne. Następnie potwierdziliśmy tożsamość tych V...

Discussion

Niniejsze badanie koncentruje się na opracowywaniu i ocenie pożywek kulturowych. Konwencjonalnie TCBS jest selektywnym i różnicowym podłożem stosowanym do izolowania i wykrywania V. parahaemolyticus, V. cholerae i V. vulnificus¹². Odnotowano jednak ograniczenia dotyczące tego podłoża, takie jak niemożność odróżnienia V. cholerae od innych gatunków Vibrio . Sacharoza i wskaźnik pH są czynnikami różnicującymi TCBS. Tak więc produkcja kwasu przez fermentor sacharozy powoduje zm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik/Sprzęt
Agar	Fisher Scientific	DF0140-15-4	może używać innych marek
Autoklaw	Dowolny
proszek BHI	Fisher Scientific	DF0418-17-7	może używać innych marek
Blender	Any		do miksowania mięsa ostryg
Gaz CampyGen generator	Hardy Diagnostics	CN035A	w celu zapewnienia atmosfery mikroaerofilowej; może używać innych marek
Czekoladowe talerze agarowe	Hardy Diagnostics	E14	może używać innych marek
Popularne odczynniki PCR (dNTPs, MgCl2, Taq Polimeraza)	Dowolne		lub użyj kulek PCR (Fisher Sci 46-001-014)
Probówki hodowlane	Fisher Scientific	S50712	może używać
probówek Eppendorf	Fisher Scientific	S348903	może używać innych marek
Gel doc	Dowolne
płytki agarowe HardyChrom Vibrio	Hardy Diagnostics	G319	To badanie ocenia tę pożywkę
Inkubator	Dowolne
pętle inokulacyjne	Fisher Scientific	22-363-606	W tym badaniu użyto rozmiaru 10 mikrolitrów
NaCl Fisher	Scientific	BP358-212	może używać innych marek
Ostrygi	Dowolna
PBS	Fisher Scientific	R23701	może używać
szalki Petriego	Fisher Scientific	FB0875713	może używać innych marek
Pipety i końcówki	Dowolne		sterylizowane końcówki
		tlh	IDT
	Zamiast
rozsiewacza	Fisher Scientific	08-100-11	Koraliki
Blender	Stomacher	400	Próbki homogenizowano przy 200 obr./min przez 30 sek.  Można użyć innego homogenizatora.
Sterylne worki filtracyjne do blenderów	Fisher Scientific	01-812-5
TCBS w proszku	Hardy Diagnostics	265020	To badanie ocenia to medium
Termocykler	Dowolny
proszek TSB	Fisher Scientific	DF0370-07-5	może używać innych marek
Szafka obserwacyjna UV	Dowolna		emituje długofalowe światło UV
Kąpiel wodna	Dowolna
Nazwa	Źródła	Numer katalogowy	Komentarze
Gatunki i szczepy bakterii
Aeromonas hydrophila	ATCC
em>Candida albicans	ATCC
Campylobacter jejuni	ATCC
em>Escherichia coli	ATCC
em>Proteus mirabilis	ATCC
em>Pseudomonas aeruginosa	ATCC
em>Staphylococcus aureus	ATCC
Salmonella Choleraesuis	ATCC
em>Shigella boydii	ATCC
em>Shigella flexneri	ATCC
em>Shigella sonnei	ATCC
em>Vibrio alginolyticus	ATCC
V. cholerae (serotypy obejmują O139, O1, non O1, El Tor biowars)	FDA, ATCC
>V. damsela	FDA
em>V. fisheri	Environment
V. fluvialis	CDC
em>V. furnissii	CDC
em>V. hollisae	FDA
em>V. metschnikovii	ATCC
em>V. mimicus	FDA
em>V. parahaemolyticus (serotypy obejmują O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.)	ATCC, FDA, CDC, Środowisko
V. proteolyticus	FDA
em>V. vulnificus	FDA