Artykuł metodologiczny

Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

14.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54497

⸱

28 września 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie do ilościowego pomiaru szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego. Omówiono również metody stosowane do analizy próbek i interpretacji danych.

Streszczenie

Serce ssaków jest głównym konsumentem ATP i wymaga stałego dostarczania substratów energetycznych do skurczu. Nic dziwnego, że zmiany w metabolizmie mięśnia sercowego zostały powiązane z rozwojem dysfunkcji skurczu i niewydolności serca. Dlatego odkrycie związku między metabolizmem a skurczem powinno rzucić światło na niektóre mechanizmy rządzące adaptacją lub nieprzystosowaniem serca w stanach chorobowych. Wyizolowany preparat działający na serce szczura może być używany do jednoczesnego i w czasie rzeczywistym śledzenia funkcji skurczowej serca i strumienia energii dostarczającej substraty do oksydacyjnych szlaków metabolicznych. Niniejszy protokół ma na celu dostarczenie szczegółowego opisu metod stosowanych w przygotowaniu i wykorzystaniu do ilościowego pomiaru szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych, głównych substratów energetycznych serca. Omówiono również metody stosowane do analizy próbek i interpretacji danych. Krótko mówiąc, technika opiera się na dostarczaniu 14C- znakowanej radioaktywnie glukozy i 3H- znakowanego radioizotopem długołańcuchowego kwasu tłuszczowego do bijącego ex vivo serca poprzez normotermiczną perfuzję krystaloidową. 14CO2 i 3H2O, końcowe produkty uboczne reakcji enzymatycznych biorących udział w wykorzystaniu tych substratów dostarczających energię, są następnie ilościowo odzyskiwane ze ścieków wieńcowych. Posiadając wiedzę na temat specyficznej aktywności zastosowanych substratów znakowanych radioizotopem, możliwe jest indywidualne określenie ilościowe strumienia glukozy i kwasów tłuszczowych w szlakach utleniania. Funkcja skurczowa izolowanego serca może być określana równolegle z odpowiednim sprzętem rejestrującym i bezpośrednio skorelowana z wartościami strumienia metabolicznego. Technika ta jest niezwykle przydatna do badania zależności metabolizm/skurcz w odpowiedzi na różne warunki stresowe, takie jak zmiany przed i po obciążeniu i niedokrwieniu, leku lub czynnika krążącego, lub po zmianie ekspresji produktu genu.

Wprowadzenie

Znaczenie kliniczne

W sercu ssaków istnieje silna pozytywna zależność między przepływem substratów przez oksydacyjne szlaki metaboliczne, wytwarzaniem ATP i pracą serca1. W ciągu ostatnich dwóch dekad badania nad skomplikowanym związkiem między metabolizmem a funkcją serca doprowadziły do uznania, że zmiany w metabolizmie serca są przyczyną dysfunkcji skurczu i prawdopodobnie patologicznej przebudowy strukturalnej w otoczeniu różnych typów chorób serca2-4. W związku z tym oczekuje się, że nasze zrozumienie mechanizmów rządzących przebudową metaboliczną zestresowanego serca doprowadzi do identyfikacji celów terapeutycznych w zapobieganiu lub leczeniu niewydolności serca5-7. Niedawna publikacja oświadczenia naukowego American Heart Association na temat "Oceny metabolizmu serca" podkreśla rosnące zainteresowanie środowiska naukowego tą dziedziną badań8. Ale podczas gdy postęp technologiczny w obrazowaniu serca pozwala obecnie na szybką i dokładną ocenę morfologii i funkcji serca, badanie in vivo metabolizmu serca pozostaje ograniczone i uciążliwe: spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) mogą być wykorzystywane do śledzenia wysokoenergetycznego metabolizmu fosforanów w sercu i aktywności cyklu Krebsa. Techniki te są jednak nękane wysokimi kosztami operacyjnymi i niemożnością określenia udziału różnych substratów w metabolizmie oksydacyjnym w warunkach stanu ustalonego9. Do tej pory preparat pracujący na serce ex vivo stanowi jedyną i unikalną dostępną technikę do badania, jednocześnie i w czasie rzeczywistym, funkcji skurczu i przepływu substratów do oksydacyjnych szlaków metabolicznych7,9. Poniższy protokół ma na celu dostarczenie wytycznych dotyczących przygotowania i wykorzystania odczynników stosowanych do określenia wskaźników wykorzystania substratów w izolowanym pracującym sercu szczura.

Izolowany działający aparat serca gryzoni

Chociaż technika ta ma już prawie pół wieku, izolowana działająca preparatura serca szczura pozostaje metodą wyboru w badaniach sercowo-naczyniowych. Podobnie jak w przypadku preparatu na serce Langendorffa, działające serce gryzoni oferuje stosunkowo prosty, niezawodny i niedrogi sposób pomiaru szerokiego zakresu parametrów serca niezależnie od zakłócającego działania innych narządów, czynników neurohormonalnych i innych czynników krążących. Jednak w przeciwieństwie do serca z perfuzją Langendorffa, pracujące serce nadal wykonuje niemal fizjologiczną pracę serca, co jest warunkiem wstępnym do generowania oksydacyjnego strumienia metabolicznego do poziomów, które są istotne dla warunków in vivo. Osiąga się to poprzez dostarczenie buforu perfuzyjnego do lewej komory (LV) przez kaniulę podłączoną do lewego przedsionka, a gdy LV wypełnia się i kurczy, bufor jest wyrzucany przez linię aorty przy określonym obciążeniu następczym, ciśnienie hydrostatyczne. Konstrukcja aparatu perfuzyjnego pierwotnie opisana przez Neely'egoi współpracowników została następnie ulepszona przez Taegtmeyera, Hemsa i Krebsa11, ale od tego czasu niewiele się zmieniła. Jak opisano w oryginalnym urządzeniu, funkcję skurczową można ocenić poprzez określenie rzutu serca, przy użyciu nie więcej niż cylindrów z podziałką i stopera do pomiaru przepływów aortalnych i wieńcowych10,11. Kilku dostawców oferuje obecnie kompletne działające systemy perfuzji serca gryzoni. Te dostępne na rynku aparaty można nabyć z sondami przepływowymi, przetwornikami ciśnienia, cewnikiem ciśnieniowo-objętościowym i całym sprzętem niezbędnym do gromadzenia i analizy danych czynnościowych serca. Dostawcy udostępniają obszerną dokumentację i sesje szkoleniowe, aby zapoznać nowego użytkownika ze swoim sprzętem. Kilka artykułów przeglądowych szczegółowo opisuje również protokoły dotyczące pracującego oprzyrządowania serca i stosowania cewników do pomiaru czynności serca u gryzoniw wieku 12-15 lat. Z tego powodu wspomnimy tylko pokrótce o ustawieniu aparatu perfuzyjnego i sprzętu rejestrującego. Niniejszy protokół ma raczej na celu uzupełnienie już dostępnych informacji o opis metod, które można zastosować do jednoczesnego pomiaru szybkości utleniania glukozy i długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, dwóch głównych substratów dostarczających energii w normalnym sercu. Opisujemy tutaj wszystkie etapy związane z wykorzystaniem znakowanych radioaktywnie substratów energetycznych do oceny metabolizmu oksydacyjnego mięśnia sercowego, od przygotowania odczynników i, przez odzyskiwanie i przetwarzanie próbek, po analizę danych.

Zasady metody

Kardiomiocyty generują większość swojej energii na skurcz z oksydacyjnej fosforylacji kwasów tłuszczowych (głównie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych) i węglowodanów (glukozy i mleczanu). Serce ma bardzo ograniczone rezerwy energetyczne i jest uzależnione od stałego dostarczania tej energii dostarczającej substraty z krążenia. Katabolizm glukozy poprzez szlak glikolityczny daje pirogronian, który jest następnie dekarboksylowany przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej wewnętrznej błony mitochondrialnej. Długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, ekstrahowane z krążących albumin lub triglicerydów lipoprotein, są najpierw aktywowane do cząsteczek acylo-CoA w cytozolu, a następnie transportowane do wnętrza macierzy mitochondrialnej przez transport karnityny, aby wejść na szlak beta-oksydacji. Cząsteczki acetylo-CoA wytwarzane przez katabolizm glukozy i kwasów tłuszczowych napędzają cykl Krebsa w celu wytworzenia równoważników redukujących (NADH i FADH2), które są wykorzystywane przez łańcuch transportu elektronów do budowy siły napędowej protonów w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej i generowania ATP poprzez aktywność syntazy ATP. Woda i dwutlenek węgla są końcowymi produktami ubocznymi reakcji enzymatycznych zachodzących w cyklu Krebsa. Dostarczenie 14substratów znakowanych radioizotopowo C i 3H (takich jak 14C-radioznakowanej glukozy i 3H-radioizotopowany kwas oleinowy) do izolowanego serca roboczego doprowadzi w konsekwencji do wytworzenia 14CO2 i 3H2O, które można ilościowo odzyskać ze ścieków wieńcowych. Zbieranie 14CO2 odbywa się poprzez przetrzymywanie izolowanego perfuzji serca w szczelnej komorze i natychmiastowe odzyskiwanie ścieków wieńcowych, gdy opuszczają serce. Mała kolumna anionowymienna służy do oddzielenia i odzyskania 3H2O ze ścieków wieńcowych. Promieniotwórczość z przetworzonych próbek mierzy się za pomocą licznika scyntylacyjnego cieczy, a posiadając wiedzę na temat specyficznej aktywności użytych substratów znakowanych radioaktywnie, możliwe jest indywidualne określenie ilościowe strumienia glukozy i kwasów tłuszczowych w szlakach utleniania16,17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały wykonane zgodnie z polityką NIH Public Health Service w zakresie opieki nad ludźmi i wykorzystania zwierząt oraz zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Mississippi. Wszystkie procedury obejmujące wykorzystanie radioizotopów zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z wytycznymi określonymi przez biuro bezpieczeństwa radiologicznego Uniwersytetu Medycznego w Mississippi.

1. Przygotowanie roztworów buforów zapasowych i odczynników

  1. Roztwory zapasowe buforu Krebsa-Henseleita (KH)
    1. Przygotować 2 L 20-krotnie stężonego roztworu zapasowego soli zawierającego (w mol/L) 2,37 NaCl, 0,0948 KCl, 0,0236 KH2PO4 oraz 0,0236 MgSO4*7H2O. Przefiltrować przez jednostkę filtracyjną o rozmiarze porów 0,45 µm i przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca.
    2. Przygotować 2 L 20-krotnie stężonego (0,5 mol/L) roztworu NaHCO3. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez nieokreślony czas.
    3. Przygotować 250 ml 1 mol/L roztworu zapasowego CaCl2. Przefiltrować przez jednostkę filtracyjną o rozmiarze porów 0,45 µm i przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca.
  2. Konwersja żywicy wymiany anionowej z formy chlorkowej na formę wodorotlenkową
    1. Przepłukać żywicę wymiany anionowej, resuspendując ją w 1 L wody ultrapure. Pozostawić żywicę do osadzenia i odlać nadmiar wody. Powtórzyć ten krok jeszcze 4 razy.
    2. Wsypać żywicę do szklanego próżniowego uchwytu filtrującego do mikroanalizy zamontowanego na kolbie filtracyjnej.
    3. Przekształcić żywicę w formę wodorotlenkową, powoli przepuszczając przez nią 22 objętości 1 N NaOH. Okresowo mieszać zawiesinę za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej.
    4. Przemywać żywicę wodą ultrapure, aż pH spadnie poniżej 9,0. Regularnie sprawdzać pH, zanurzając pasek testowy pH w pobliżu powierzchni zawiesiny żywicy. Przykryć i przechowywać żywicę z wodą ultrapure w butelce z borokrzemianowego szkła, chroniąc przed światłem. Nie dopuszczać do wyschnięcia żywicy przed użyciem.
      UWAGA: Przy właściwym przechowywaniu żywica zachowuje trwałość przez co najmniej 3 miesiące.
  3. 8-krotnie stężony roztwór zapasowy kwasu oleinowego z albuminą
    1. W kolbie Erlenmeyera o pojemności 4 L wymieszać 200 ml 20-krotnie stężonego roztworu zapasowego soli i 200 ml 20-krotnie stężonego roztworu NaHCO3 z 3,6 L wody ultrapure.
    2. Używając rurki do dyspersji gazu z cylinderem spiekanym, napowietrzać roztwór przez 15 min mieszaniną 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu w celu stabilizacji pH.
    3. Nalać 470 ml buforu do szklanego zlewki o pojemności 1 L. Dodać 8,75 ml 1 mol/L roztworu zapasowego CaCl2 do pozostałych 3530 ml buforu w kolbie Erlenmeyera o pojemności 4 L i odstawić.
    4. Dodać 40 g BSA wolnej od kwasów tłuszczowych do zlewki o pojemności 1 L i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego do całkowitego rozpuszczenia.
    5. W probówce stożkowej o pojemności 15 ml przygotować 4 ml 50% (v:v) roztworu etanolu w wodzie ultrapure. Dodać 487 mg oleinianu sodu i wortexować do całkowitego rozpuszczenia proszku.
      UWAGA: Niektórzy badacze zamiast kwasu oleinowego stosują kwas palmitynowy w buforze perfuzyjnym. Roztwór zapasowy kwasu palmitynowego z albuminą można przygotować według tej samej procedury. Zaleca się jednak podgrzanie roztworu do 70 ºC w celu całkowitego rozpuszczenia palmitynianu sodu.
    6. Dodawać roztwór oleinianu kroplami do roztworu BSA wolnej od kwasów tłuszczowych przy ciągłym mieszaniu i odczekać kolejne 10 min na utworzenie kompleksu kwas oleinowy-BSA.
      UWAGA: Roztwór powinien mieć jasnocżółty kolor i być wolny od widocznych cząstek. Obecność osadu lub nierozpuszczalnych cząstek może wskazywać na niepełną konjugację kwasu tłuszczowego z BSA. W takim przypadku roztwór należy wyrzucić i rozpocząć proces od nowa.
      UWAGA: Palmitynian może wytrącić się, jeśli pozostanie w pipecie, co uniemożliwi dodawanie kroplowe. Mieszany roztwór BSA można podgrzać do 37 ºC, aby ułatwić wiązanie kwasu palmitynowego. Nie przegrzewać, ponieważ może to spowodować denaturację i agregację BSA.
      OSTRZEŻENIE: Kolejne kroki tego protokołu obejmują pracę z materiałami radioaktywnymi. Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej i przestrzegać przepisów dotyczących bezpieczeństwa i utylizacji odpadów ustalonych przez biuro ochrony radiologicznej instytucji.
    7. Dodać 160 µl (0,8 mCi) kwasu [9,10-3H]oleinowego do mieszanego roztworu kwas oleinowy-BSA i mieszać przez kolejne 10 min.
    8. Dodać 2,5 ml 1 mol/L roztworu zapasowego CaCl2 do mieszanego roztworu kwas oleinowy-BSA.
    9. Odciąć około 1,2 m membrany dializacyjnej i przepłukać ją wewnątrz i na zewnątrz wodą z kranu. Intensywnie szorować membranę dializacyjną pod bieżącą wodą przez 10 do 15 min, aby usunąć powłokę glicerynową. Alternatywnie powłokę można usunąć, mocząc membranę w ciepłej wodzie przez 1 h przed użyciem. Na koniec przepłukać membranę dializacyjną wodą ultrapure.
    10. Mocno zawiązać jeden koniec membrany dializacyjnej. Napełnić roztworem kwas oleinowy-BSA i zawiązać drugi koniec membrany.
    11. Umieścić napełnioną membranę dializacyjną w kolbie Erlenmeyera o pojemności 4 L z buforem KH i pozostawić do dializy przez noc w temperaturze 4 ºC przy delikatnym mieszaniu za pomocą mieszadła magnetycznego.
    12. Następnego dnia wyjąć 8-krotnie stężony roztwór kwas oleinowy-BSA z membrany dializacyjnej. Użyć roztworu kwas oleinowy-BSA natychmiast do perfuzji lub podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 ºC. Zamrożone alikwoty są stabilne przez co najmniej 2 miesiące. Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ może to pogorszyć rozpuszczalność kompleksu kwas oleinowy-BSA.
      UWAGA: Do przygotowania odczynników i buforów stosowanych do perfuzji serca należy używać wyłącznie wody ultrapure (oporność 18,2 MΩ.cm w 25 ºC, całkowity węgiel organiczny <10 ppb, mikroorganizmy ≤ 1 CFU/ml, cząstki o rozmiarze powyżej 0,22 µm ≤1/ml). Konwersję żywicy wymiany anionowej z formy chlorkowej na formę wodorotlenkową można pominąć, kupując bezpośrednio formę wodorotlenkową za dodatkową opłatą (patrz Tabela materiałów). Oprócz oleinianu lub palmitynianu można stosować każdy inny rodzaj naturalnie występującego kwasu tłuszczowego, o ile dostępna jest jego wersja trytowana w celu śledzenia utleniania.

2. Przygotowanie buforu perfuzyjnego

  1. W kolbie Erlenmeyera o pojemności 4 L zmieszać 200 ml 20-krotnie stężonego roztworu soli oraz 200 ml 20-krotnie stężonego roztworu NaHCO3 z 3,6 L wody ultrapurej. Napowietrzać roztwór przez 15 min mieszaniną 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu, a następnie dodać 10 ml 1 mol/L roztworu stokowego CaCl2, aby ustalić stężenie wolnego Ca2+ na poziomie 2,5 mmol/L.
    UWAGA: Następne kroki obejmują manipulacje z materiałem promieniotwórczym. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i przestrzegać przepisów dotyczących bezpieczeństwa oraz utylizacji odpadów określonych przez biuro ochrony radiologicznej instytucji.
  2. Przenieść 1,750 L buforu KH do butelki z borokrzemowego szkła o pojemności 2 L. Dodać 250 ml 8-krotnie stężonego roztworu kwasu oleinowego-BSA, 1,802 g D-glukozy, 400 µl insuliny w stężeniu 0,4 U/ml oraz 200 µl (0,2 mCi) [U-14C]glukozy. Odwrócić butelkę, aby wymieszać składniki. W ten sposób otrzymamy 2 L kompletnego buforu perfuzyjnego zawierającego kwas oleinowy (0,4 mmol/L), D-glukozę (5 mmol/L) i insulinę (40 µU/ml).
    UWAGA: Objętość 2 L jest wystarczająca do perfuzji serca dorosłego szczura w warunkach bez recyrkulacji przez co najmniej 60 min.
  3. Wykorzystać część niepromieniotwórczego buforu KH do napełnienia dwóch naczyń sekcyjnych i umieścić je na lodzie w celu schłodzenia.

3. Przygotowanie aparatu perfuzyjnego

UWAGA: Badacz może zdecydować się na użycie autorskiego zestawu do perfuzji, takiego jak ten opisany przez Taegtmeyera, Hemsa i Krebsa11, lub jednego z dostępnych komercyjnie systemów. Systemy perfuzyjne składają się zazwyczaj z elementów przedstawionych na poniższej Rysunku 1. Poza przewodami i szkłem laboratoryjnym, reszta sprzętu pomiarowego jest opcjonalna, a jego wykorzystanie zależy od potrzeb badacza w odniesieniu do stawianego pytania badawczego. Niemniej jednak zalecamy stosowanie mikroelektrod tlenowych w celu oznaczenia stężenia O2 w buforze wchodzącym do krążenia wieńcowego i z niego wypływającym (Rysunek 1). Pozwoli to badaczowi kontrolować, czy serce jest dostarczane odpowiednią ilością tlenu oraz czy podaż tlenu nie różni się między poszczególnymi eksperymentami. Ponadto oznaczenie różnicy tlenowej „tętniczo-żylnej” może zostać wykorzystane do obliczenia zużycia tlenu przez mięsień sercowy oraz wydajności serca16,18.

  1. Włącz cyrkulacyjną łaźnię wodną i ustaw temperaturę 37 ºC, aby rozgrzać aparat perfuzyjny.
  2. Włącz komputer oraz system akwizycji danych, który zostanie wykorzystany do pomiaru funkcji serca.
  3. Podłącz urządzenia rejestrujące (cewnik ciśnienia, cewnik ciśnienie-objętość, mikroelektrody tlenowe, przepływomierze, itp.) do systemu akwizycji danych i przeprowadź kalibrację instrumentów zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Napełnij zbiornik buforu wodą ultrapure. Włącz pompę perystaltyczną i przepłucz cały układ, przepuszczając wodę przez wszystkie przewody i szkło. Wyłącz pompę perystaltyczną i upewnij się, że w przewodach i/lub szkle nie pozostała woda, ponieważ może to wpłynąć na stężenie buforu perfuzyjnego i preparat serca.
  5. Podłącz do systemu nowy filtr z włókna szklanego o rozmiarze 1,0 µm. Podłącz butlę z mieszaniną 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu do komory natleniającej.
    OSTROŻNIE: Następne kroki obejmują manipulację materiałem radioaktywnym. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej oraz przestrzegać przepisów dotyczących bezpieczeństwa i utylizacji odpadów ustalonych przez biuro ochrony radiologicznej instytucji.
  6. Napełnij zbiornik buforem perfuzyjnym. Włącz pompę i upewnij się, że wszystkie przewody i szkło są wypełnione buforem perfuzyjnym. Przepuść bufor perfuzyjny przez aparat perfuzyjny w trybie recyrkulacji i natleniaj przez co najmniej 30 min przed użyciem.
  7. Mocno przymocuj końcówkę strzykawki 20 ml pod komorą serca, aby odzyskiwać effluent wieńcowy. Podłącz końcówkę strzykawki do góry kurka trójdrożnego. Podłącz ramię boczne do strzykawki 3 ml. Podłącz ramię dolne za pomocą przewodu do pojemnika na płynne odpady radioaktywne.
    UWAGA: Przy stosowaniu kompleksu kwas tłuszczowy-BSA natlenianie buforu perfuzyjnego nie może być wykonywane poprzez bezpośrednie bąbelkowanie rurką dyspersyjną gazu, ponieważ spowoduje to nadmierne pienienie się roztworu. W tym celu należy użyć natleniacza membranowego (Rysunek 1) lub komory natleniającej z przepływem warstwowym. Zaleca się sprawdzenie, czy osiągnięto odpowiedni poziom natlenienia, umieszczając mikroelektrodę tlenową w obiegu perfuzyjnym ( Rysunek 1).

4. Izolacja i kaniulacja serca szczura​

  1. Zważ szczura na wadze.
  2. Przygotuj strzykawkę z dawką anestetyku 150 mg/kg wodnego hydratu soli sodowej tiobutabarbitalu oraz strzykawkę tuberkulinową z 200 jednostek USP heparyny.
  3. Wstrzyknij tiobutabarbital drogą I.P. i poczekaj, aż zwierzę straci przytomność. Można stosować inne środki indukcyjne, o ile nie będą one kolidować z celem eksperymentu (patrz Wybór anestetyku w poniższej sekcji Dyskusja Section ).
  4. Sprawdź odpowiedni poziom znieczulenia, potwierdzając brak odruchu na uciśnięcie palca u nogi. Należy zadbać o utrzymanie właściwej głębokości znieczulenia, aby mieć pewność, że zwierzę nie odczuwa bólu podczas procedury.
  5. Gdy szczur będzie całkowicie nieprzytomny i nie będzie reagował na uciśnięcie palca, połóż go na plecach na stole operacyjnym i unieruchom kończyny za pomocą taśmy lub pinsetów.
  6. Wygol brzuch z włosów i wykonaj cięcie pośrodkowe brzucha. Na tym etapie nie otwieraj jeszcze klatki piersiowej. Odsuń żołądek i jelita, aby odsłonić żyłę główną dolną. Wstrzyknij heparynę bezpośrednio do żyły głównej dolnej i odczekaj od 5 do 10 s przed kontynuacją.
  7. Za pomocą nożyczek przetnij przeponę oraz boki klatki piersiowej, aby odsłonić zawartość jamy klatki piersiowej.
  8. Delikatnie chwyć serce kciukiem, palcem wskazującym i środkowym, a następnie wyciśnij razem serce i płuca. Przetnij w miejscu aorty zstępującej, uważając, aby w tym procesie nie uszkodzić łuku aorty i aorty wstępującej. Natychmiast przenieś serce i płuca do jednej z szalek sekcyjnych wypełnionych lodowatym buforem KH.
  9. Po ustaniu bicia serca przenieś je do drugiej szalki sekcyjnej i odetnij wszelkie duże fragmenty tkanki płucnej, utrzymując serce zanurzone w lodowatym buforze KH. Przetnij aortę zstępującą tuż nad łukiem aorty.
    UWAGA: Następne kroki wiążą się z manipulacją materiałem radioaktywnym. Należy stosować odpowiednie Środki Ochrony Indywidualnej i przestrzegać przepisów dotyczących bezpieczeństwa i utylizacji odpadów ustanowionych przez biuro bezpieczeństwa radiologicznego instytucji.
  10. Przepłucz linię aortalną aparatury perfuzyjnej, aby wypełnić kaniulę aortalną ciepłym buforem i usunąć wszelką wodę lub powietrze, które mogą wciąż znajdować się w przewodach. Pozwól buforowi perfuzyjnemu kapać z kaniuli aortalnej, aby zminimalizować ryzyko wystąpienia zatorów powietrznych w momencie podłączenia serca do kaniuli.
  11. Używając dwóch mikro-pincet sekcyjnych, ostrożnie otwórz aortę i nasuń serce na kaniulę aortalną. Zabezpiecz aortę na kaniuli za pomocą mikro-klipsa i rozpocznij perfuzję serca w układzie Langendorffa. Obserwuj ponowne rozpoczęcie bicia serca i usuń całą krew pozostałą w naczyniach wieńcowych w sekundach następujących po rozpoczęciu perfuzji.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wykonać kroki od 4.6 do 4.10 tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec nieodwracalnym uszkodzeniom niedokrwiennym serca. Z doświadczeniem cała procedura powinna zająć od 1 do 2 min. Podczas nasuwania aorty na kaniulę należy uważać, aby nie przekroczyć pierścienia aorty, gdyż może to doprowadzić do hipoperfuzji mięśnia sercowego i uszkodzenia zastawki aorty.
  12. Przywiąż aortę do kaniuli aortalnej szwem jedwabnym 3-0 i usuń mikro-klips. Zlokalizuj żyłę płucną. Może być konieczne przycięcie tkanek pozasercowych w celu jej odnalezienia, ale nie należy wycinać zbyt wiele tkanek pozasercowych, ponieważ posłużą one do przywiązania lewego przedsionka do kaniuli.
  13. Przepłucz linię lewego przedsionka aparatury perfuzyjnej, aby wypełnić kaniulę przedsionkową ciepłym buforem i usunąć wszelką wodę lub powietrze, które mogą wciąż znajdować się w przewodach. Należy zachować szczególną ostrożność przy usuwaniu pęcherzyków powietrza z aparatury, aby zminimalizować ryzyko wystąpienia zatorów powietrznych w momencie podłączenia serca do kaniuli.
  14. Używając dwóch mikro-pincet sekcyjnych, delikatnie chwyć otwór żyły płucnej i nasuń serce na kaniulę przedsionkową. W celu wykonania tego kroku może być konieczne repozycjonowanie serca poprzez delikatne obracanie kaniuli przedsionkowej i/lub aortalnej. W każdym przypadku należy upewnić się, że procedura nie wywiera nadmiernego nacisku na serce i nie powoduje zagięcia aorty. Przywiąż lewy przedsionek do kaniuli przedsionkowej szwem jedwabnym 3-0.
  15. Otwórz linię przedsionkową i jednocześnie przełącz linię aortalną z trybu Langendorffa na tryb roboczy. Jeśli z lewego przedsionka wycieka bufor, zamknij linię przedsionkową, przełącz linię aortalną z powrotem na perfuzję w układzie Langendorffa i użyj kolejnego szwu jedwabnego 3-0, aby mocniej przywiązać lewy przedsionek do kaniuli.

5. Pomiar funkcji serca i pobieranie próbek​

UWAGA: Wyznaczenie strumieni metabolicznych będzie wymagało znajomości przepływu wieńcowego (CF). Jak opisano poniżej, wartości przepływu wieńcowego można uzyskać za pomocą zwykłego stoperka. Dodatkowo pomiar przepływu aorty (AF) tą samą metodą pozwoli na wyznaczenie rzutu serca (CO = CF + AF), który można następnie wykorzystać do obliczenia mocy serca (CP) jako ogólnej miary funkcji serca, stosując wzór CP = CO (m3/s) * Afterload (Pa). Inna dostępna metoda oceny funkcji serca opiera się na pomiarze ciśnienia tętna w czasie rzeczywistym za pomocą przetwornika ciśnienia (Rysunki 3 i 4). Choć jest to opcjonalne, najdokładniejsze i najbardziej szczegółowe pomiary funkcji skurczowej serca i hemodynamiczne, w tym wyznaczenie funkcji skurczowej i rozkurczowej lewej komory, zostaną osiągnięte dzięki zastosowaniu cewnika do pomiaru przewodności ciśnienie-objętość (PV). W tej sekcji krótko opisano cewnikowanie izolowanego serca. Dodatkowe informacje dotyczące kalibracji cewników PV oraz analizy danych z pomocą oprogramowania statystycznego można znaleźć w literaturze14,15.
OSTRZEŻENIE: Następujące kroki obejmują manipulację materiałem promieniotwórczym. Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE) i przestrzegać przepisów dotyczących bezpieczeństwa oraz utylizacji odpadów określonych przez biuro ochrony radiologicznej danej instytucji.

  1. Jeśli eksperyment obejmuje bezpośredni pomiar funkcji LV za pomocą cewnika, należy nakłuć wierzchołek LV igłą 26 G i wprowadzić cewnik przez miejsce nakłucia.
  2. Przy użyciu cewnika ciśnieniowo-objętościowego należy ostrożnie ustawić cewnik tak, aby jego trzon był wyrównany z osią podłużną LV, z elektrodą dystalną bezpośrednio pod zastawką aortalną i przylegającą do brzegu endokardium oraz elektrodą proksymalną tuż przy ścianie komory.
  3. Serce należy zamknąć w komorze serca z płaszczem wodnym i monitorować parametry czynnościowe serca za pomocą oprogramowania do akwizycji danych. Rejestrację rozpoczyna się po tym, jak bazowe parametry czynnościowe serca pozostawały stabilne przez ponad 5 min.
  4. Przepływ wieńcowy należy określić, mierząc czas potrzebny do napełnienia rurki strzykawki o pojemności 20 ml przymocowanej pod komorą serca. Po pomiarze należy otworzyć kran trójdrożny, aby opróżnić effluent wieńcowy do pojemnika na radioaktywne odpady ciekłe.
    UWAGA: Pomiary przepływu można również przeprowadzić przy użyciu przepływomierza i sond przepływowych.
  5. Należy użyć strzykawki 3 ml przymocowanej do ramienia bocznego kranu trójdrożnego, aby odzyskać ~2 ml effluentu wieńcowego w momencie jego opuszczania serca. 0,5 ml effluentu wieńcowego należy przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml bez zakrętki i niezwłocznie przystąpić do oznaczenia szybkości utleniania glukozy (Sekcja 6 poniżej).
  6. Pozostałą część próbki effluentu wieńcowego (~1,5 ml) należy przenieść do odpowiednio oznakowanej probówki do mikrocentryfugi i przechowywać w lodzie.
  7. Kroki 5.4 do 5.6 należy powtarzać w regularnych odstępach czasu (np. co 5 lub 10 min) aż do zakończenia eksperymentu perfuzyjnego.
  8. W przypadku stosowania cewnika ciśnieniowo-objętościowego, przed zakończeniem eksperymentu należy wstrzyknąć bolus 10 µl soli hipertonicznej (15%) do linii przedsionkowej, tuż przed kaniulą przedsionkową. Wstrzyknięcie bolusa służy do obliczenia przewodności równoległej (Vp), co jest kluczowe dla dokładnego oznaczenia objętości serca15.
  9. Należy otworzyć komorę serca i usunąć cewnik z LV, jeśli był on stosowany w eksperymencie. Serce należy odzyskać za pomocą jednej z poniższych opcji:
    1. Jeśli nie ma potrzeby izolowania konkretnych obszarów serca do dalszych analiz i jeśli aparat perfuzyjny na to pozwala, należy zamknąć linie przedsionkową i aortalną i natychmiast zamrozić serce na kaniulach, używając kleszczy Wollenbergera schłodzonych wcześniej w ciekłym azocie.
    2. Alternatywnie, należy odciąć serce od kaniul i wrzucić je do lodowatego buforu KH. Serce należy szybko osuszyć ręcznikiem papierowym i zmierzyć jego masę mokrą. Następnie serce można wypreparować i pobrać próbki tkanek do konkretnych pomiarów. Pozostałą tkankę należy zamrozić za pomocą kleszczy Wollenbergera schłodzonych wcześniej w ciekłym azocie.
  10. Zamrożoną tkankę serca należy przechowywać w temperaturze -80 ºC do czasu oznaczenia masy suchej (patrz sekcja 8. Obliczenia).

6. Wyznaczanie szybkości utleniania glukozy w mięśniu sercowym

UWAGA: Metoda polega na ilościowym odzyskiwaniu 14CO2 z odcieku wieńcowego przy użyciu roztworu pułapki z hydroksydem hyaminu. 14CO2 rozpuszczony jako H14CO3- jest odzyskiwany po zakwaszeniu buforu kwasem nadchlorowym. Próbki należy przetwarzać niezwłocznie po ich pobraniu, ponieważ pasywna dyfuzja gazu między powietrzem a próbką spowoduje z czasem utratę 14CO2. Fiolki do scyntylacji powinny być szczelnie zamknięte gumowymi korkami z tulejką, aby zapobiec utracie 14CO2 po dodaniu kwasu nadchlorowego. W razie potrzeby do zabezpieczenia gumowych korków z tulejką w fiolkach można użyć parafilmu (Rysunek 2).

  1. Do szklanych fiolek scyntylacyjnych dodać 1 ml 10-krotnie stężonego wodorotlenku hyaminy (jedna fiolka na próbkę + dwie dodatkowe fiolki do oznaczenia tła).
    OSTROŻNIE: Wodorotlenek hyaminy jest silnie toksyczny i powoduje ciężkie oparzenia. W celu zapoznania się z odpowiednimi zasadami obchodzenia się z produktem i jego przechowywania należy zapoznać się z kartą charakterystyki (MSDS).
  2. Za pomocą pęsety delikatnie przenieść probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml bez zakrętki, zawierającą 0,5 ml próbki odcieku wieńcowego, do fiolki uprzednio napełnionej wodorotlenkiem hyaminy. Do oznaczenia tła należy użyć 0,5 ml buforu perfuzyjnego.
  3. Zamknąć fiolkę gumowym korkiem z mankietem. Do uszczelnienia fiolki można użyć Parafilmu. Za pomocą strzykawki 1 ml i długiej igły 23 G wstrzyknąć 200 µl kwasu nadchlorowego (60% m/m) przez gumowy korek bezpośrednio do probówki 2 ml bez zakrętki.
    UWAGA: Odciek wieńcowy powinien stać się biały z powodu wytrącenia BSA.
  4. Pozostawić fiolki na noc.
    ​OSTROŻNIE: Kwas nadchlorowy jest silnie żrący, może działać jako utleniacz i/lub stwarzać ryzyko wybuchu. W celu zapoznania się z odpowiednimi zasadami obchodzenia się z produktem i jego przechowywania należy zapoznać się z kartą charakterystyki (MSDS).
  5. Następnego dnia usunąć gumowe korki. Ostrożnie wyciągnąć każdą probówkę 2 ml bez zakrętki za pomocą pęsety i wypłukać dno probówki nad otwartą fiolką za pomocą 1 ml koktajlu scyntylacyjnego, aby odzyskać cały wodorotlenek hyaminy. Probówkę bez zakrętki należy wyrzucić do odpowiednio oznakowanego pojemnika na odpady radioaktywne.
  6. Do każdej fiolki dodać kolejne 9 ml koktajlu scyntylacyjnego. Do dwóch fiolek wypełnionych 10 ml płynnego koktajlu scyntylacyjnego dodać bezpośrednio 0,5 ml buforu perfuzyjnego w celu oznaczenia aktywności właściwej. Energicznie wstrząsnąć fiolkami ręcznie i odczekać co najmniej 6 hr do czasu zniknięcia pęcherzyków powietrza przed pomiarem w liczniku scyntylacyjnym do cieczy, odpowiednio skonfigurowanym do eksperymentów z podwójnym znakowaniem.
    UWAGA: Należy używać przezroczystych szklanych fiolek, aby widzieć igłę podczas przebijania gumowych korków. Nie wolno wlewać kwasu nadchlorowego bezpośrednio do wodorotlenku hyaminy, ponieważ zniszczy to reakcję. Dodanie kwasu nadchlorowego uwalnia 14CO2 z odcieku wieńcowego do powietrza. Chociaż fiolki powinny być szczelnie zamknięte, a cały 14CO2 powinien zostać uwięziony w wodorotlenku hyaminy, zaleca się przeprowadzanie tego testu w dygestorium chemicznym.

7. Wyznaczanie szybkości utleniania oleinianu w mięśniu sercowym

UWAGA: Metoda opiera się na ilościowym oddzieleniu i odzyskaniu 3H2O z effluentu wieńcowego przy użyciu silnie zasadowej żywicy wymiany anionowej. W przeciwieństwie do odzyskiwania 14CO2, nie występuje problem ze stabilnością próbki, a effluent wieńcowy można przechowywać w lodu lub w zamrażarce przed wykonaniem analizy.

  1. Przygotować kolumny z żywicą wymiany anionowej (jedna kolumna na próbkę + dwie dodatkowe kolumny do oznaczenia aktywności tła), wypełniając końcówkę probówek od strzykawki o pojemności 3 ml watą szklaną. Za pomocą pipety transferowej dodać zawiesinę żywicy w wodzie, aż żywica osiągnie poziom 2 ml na probówce od strzykawki.
  2. Przepłukać żywicę, przepuszczając przez kolumnę 2 ml wody ultrapure. Powtórzyć ten krok jeszcze dwa razy.
  3. Pod kolumnami umieścić otwarte fiolki scyntylacyjne i nanieść na każdą kolumnę 0,5 ml effluentu wieńcowego. W celu oznaczenia aktywności tła nanieść 0,5 ml buforu perfuzyjnego.
  4. Kolejno przepłukać kolumny 0,5, 1 i 2 ml wody ultrapure. Po zakończeniu elucji kolumny zutylizować w odpowiednio oznakowanym pojemniku na odpady radioaktywne.
  5. Do każdej fiolki scyntylacyjnej dodać 13 ml ciekłego koktajlu scyntylacyjnego. W celu oznaczenia aktywności właściwej do dwóch fiolek wypełnionych 13 ml ciekłego koktajlu scyntylacyjnego dodać bezpośrednio 0,5 ml buforu perfuzyjnego. Energicznie wstrząsnąć fiolkami i odczekać co najmniej 6 hr przed pomiarem w liczniku scyntylacyjnym odpowiednio skonfigurowanym do eksperymentów z podwójnym znakowaniem.

8. Obliczenia

  1. Jeśli nie zostało to jeszcze wykonane, należy określić mokrą masę całego perfundowanego serca.
    UWAGA: Nie dopuszczać do rozmrożenia mrożonej tkanki, jeżeli w pozostałej części tkanki mają być następnie przeprowadzone analizy molekularne i biochemiczne.
  2. Należy określić mokrą masę próbki tkanki z całego perfundowanego serca (użyć około 15 do 30% całego serca). Próbkę tkanki należy umieścić w suszarce ustawionej na 50 °C na noc i zmierzyć jej suchą masę. Należy wykorzystać stosunek mokrej masy do suchej masy próbki tkanki, aby określić suchą masę całego serca w gramach (g suchej masy).
  3. Dla każdego punktu czasowego x wartość przepływu wieńcowego CFx należy wyrazić w ml/min.
  4. Oznaczanie szybkości utleniania glukozy
    1. Należy wyciągnąć średnią z dwóch wartości rozpadów na minutę (d.p.m.) zmierzonych dla aktywności tła 14C, aby określić czynnik korekcyjny 14Cd.p.m.ba.
    2. Należy wyznaczyć średnią wartość aktywności właściwej 14C 14Cd.p.m.sa.
    3. Należy wyznaczyć właściwą radioaktywność glukozy w d.p.m./µmol (FGlu), stosując wzór
      Równanie dla stosunku znakowania glukozy, \(F_{Glu} = \frac{^{14}C \cdot d.p.m._{sa}}{n_{Glu}}\).
      UWAGA: Gdzie nGlu (µmol) = CGlu (µmol/L) * objętość próbki (L) = 2,5 przy zastosowaniu glukozy w stężeniu 5 mmol/L i próbce o objętości 0,5 ml.
    4. Dla każdego punktu czasowego x należy wyznaczyć szybkość produkcji 14CO2 w d.p.m./min (A), stosując wzór
      Równanie obliczeń znacznika radioaktywnego; schemat pomiaru i analizy naukowej.
      UWAGA: Gdzie Volx (ml) = 0,5
    5. Wartość A należy podzielić przez wyznaczoną wartość suchej masy serca, aby uzyskać znormalizowaną szybkość produkcji 14CO2 (ANorm) w d.p.m./min na g suchej masy.
    6. Należy zastosować wzór GO = ANorm/FGlu, aby uzyskać szybkość utleniania glukozy (GO) w µmol glukozy/min na g suchej masy.
  5. Oznaczanie szybkości utleniania oleinianu
    1. Należy wyciągnąć średnią z dwóch wartości rozpadów na minutę (d.p.m.) zmierzonych dla aktywności tła 3H, aby określić czynnik korekcyjny 3Hd.p.m.ba.
    2. Należy wyznaczyć średnią wartość aktywności właściwej 3H 3Hd.p.m.sa.
    3. Należy wyznaczyć właściwą radioaktywność oleinianu w d.p.m./µmol (FOle), stosując wzór
      Wzór na równowagę statyczną \( F_{Ole} = \frac{3H \cdot d.p.m_{sa}}{n_{Ole}} \); schemat matematyczny.
      UWAGA: Gdzie nOle (µmol) = COle (µmol/L) * objętość próbki (L) = 0,2 przy zastosowaniu oleinianu w stężeniu 0,4 mmol/L i próbce o objętości 0,5 ml.
    4. Dla każdego punktu czasowego x należy wyznaczyć szybkość produkcji 3H2O w d.p.m./min (B), stosując wzór
      Równanie obliczania stosunków wiązania biochemicznego; pokazuje wzór różnicowy dla \( B = \frac{^{3}\!H d.p.m._{x} - ^{3}\!H d.p.m._{ba}}{Vol_{x}} \cdot CF_{x} \).
      UWAGA: Gdzie Volx (ml) = 0,5
    5. Wartość B należy podzielić przez wyznaczoną wartość suchej masy serca, aby uzyskać znormalizowaną szybkość produkcji 3H2O (BNorm) w d.p.m./min na g suchej masy.
    6. Należy zastosować wzór OO = BNorm/FOle, aby uzyskać szybkość utleniania oleinianu (OO) w µmol oleinianu/min na g suchej masy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na poniższych rysunkach opisano dwa reprezentatywne eksperymenty. W obu przypadkach wyizolowano serce 16-tygodniowego samca szczura Sprague Dawley i poddano je perfuzji w trybie roboczym z użyciem buforu KH przygotowanego zgodnie z poprzednim protokołem. W każdym eksperymencie serce poddano warunkom stresowym w celu wpłynięcia na pracę serca. Funkcję kurczliwości serca oceniano poprzez ciągły zapis ciśnienia tętna po wprowadzeniu przetwornika ciśnienia do linii aorty oraz poprzez wyznacze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powyższy protokół szczegółowo opisuje metody jednoczesnego ilościowego określania strumienia substratu poprzez utlenianie glukozy i utlenianie kwasów tłuszczowych w izolowanym pracującym sercu szczura. Pomiary można następnie nałożyć na zarejestrowane parametry czynnościowe serca w celu określenia związku między metabolizmem substratów a pracą serca w warunkach wyjściowych i stresowych (zmiana obciążenia, niedokrwienie-reperfuzja itp.). Możliwa jest również ocena, w jaki sposób na zależność metabolizm/skurcz wpł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (dla R. H.), R01 HL108618 (dla J.P.G.), P01 HL051971 i P20 GM104357. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificBP358
Chlorek potasu (KCl)Fisher ScientificBP366
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Fisher ScientificP284
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4*7H2O)Fisher ScientificM63
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Fisher ScientificS233
Chlorek wapnia (CaCl2)Żywica Sigma-AldrichC5670
AG 1-X8, postać chlorkowa, 100 - 200 suchy rozmiar oczek, 500 gBio-Rad1401441Ten element można wymienić, kupując bezpośrednio formę hydrotlenku  (patrz odniesienie poniżej), ale będzie to kosztować prawie 8 razy więcej
żywicy AG 1-X8, forma wodorotlenkowa, 100 - 200 suchych oczek, 100 gBio-Rad1432445Zakup tego elementu pozwala ominąć konwersję żywicy anionowymiennej z postaci chlorkowej do postaci wodorotlenkowej (patrz sekcja 1.2 protokołu)
Szklany uchwyt filtra próżniowego do mikroanalizyFisher Scientific09-753-2
Wodorotlenek sodu (NaOH)Fisher ScientificS318. Zapoznaj się z kartą charakterystyki produktu w celu uzyskania informacji na temat prawidłowego obchodzenia się i przechowywania.
Rurka dyspersyjna gazu ze spiekanym cylindremFisher Scientific11-138B
Probumin Albumina surowicy bydlęcej Bez kwasów tłuszczowych, proszekEMD Millipore820027Zalecamy stosowanie odtłuszczonego węgla drzewnego BSA, ponieważ inne procesy oczyszczania, takie jak frakcjonowanie zimnego etanolu, mogą pozostawiać pozostałości toksyczne dla serca.
Sodium OleateSigma-AldrichO7501
Kwas oleinowy, [9,10-3H(N)]-PerkinElmerNET289005MCMateriał radioaktywny. Postępuj zgodnie z wytycznymi biura ds. bezpieczeństwa radiologicznego swojej instytucji dotyczącymi zamawiania i obsługi.
Rurka membranowa do dializy, średnica 29 mmFisher Scientific08-667E
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021
Glukoza, D-[14C(U)]-PerkinElmerNEC042B005MCMateriał radioaktywny. Postępuj zgodnie z wytycznymi biura ds. bezpieczeństwa radiologicznego swojej instytucji dotyczącymi zamawiania i obsługi.
Humulin R U-100Eli Lilly and CompanyNDC 0002-8215-01 (HI-210)
Hydrat inaktynySigma-AldrichT133Substancja kontrolowana na USDEA Harmonogram III
3-0 Jedwabny warkoczRoboz SurgicalSUT-15-3
10x Wodorotlenek hiaminyPerkinElmer6003005Wysoce toksyczny i powoduje poważne oparzenia. Zapoznaj się z kartą charakterystyki produktu w celu uzyskania informacji o prawidłowym obchodzeniu się i przechowywaniu
20 ml szklanych fiolek scyntylacyjnychFisher Scientific03-341-25EUżywaj szklanych fiolek do ilościowego odzyskiwania 14CO2
20 ml Fiolki scyntylacyjne HDPEFisher Scientific03-337-23BUżywaj fiolek HDPE do ilościowego odzyskiwania 3H2O
Czerwony Zatyczki gumoweFisher Scientific14-126DDFit 20 ml fiolki scyntylacyjne; Igła wielokrotnego użytku
BD PrecisionGlide 23G x 40 mmBD305194Służy do wstrzykiwania kwasu nadchlorowego przez gumowy korek tulei pułapki CO2
Kwas nadchlorowy, 60%Fisher ScientificA228Silnie i może działać jako utleniacz i/lub powodować zagrożenie wybuchem. Zapoznaj się z kartą charakterystyki produktu w celu uzyskania informacji na temat prawidłowego obchodzenia się i przechowywania
Ultima Gold, Koktajl scyntylacyjnyPerkinElmer6013327
Wełna szklanaFisher ScientificAC38606
Decon Dri-Clean Detergent w proszkuFisher Scientific04-355Do czyszczenia naczyń szklanych, części plastikowych i rurek
Alconox Tergazyme Detergent z aktywnymi enzymamiFisher Scientific16-000-115Do czyszczenia "trudno dostępnych" powierzchni (rurki, szkło) zanieczyszczonych pozostałościami kwasów tłuszczowych BSA

Bibliografia

  1. Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
  2. Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796(2013).
  3. Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
  4. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
  5. Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
  6. Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
  7. Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
  8. Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
  9. Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
  10. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
  11. Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
  12. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
  13. Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
  14. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
  15. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
  16. Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
  17. Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
  18. Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
  19. Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
  20. Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
  21. Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochemistry. 6, 1-5 (1967).
  22. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  23. Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
  24. Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
  25. Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit? Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
  26. Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
  27. Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
  28. Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
  29. Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
  30. Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
  31. Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
  32. Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
  33. Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model? J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
  34. Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
  35. Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect? Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
  36. Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
  37. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Utlenianie glukozyizolowane pracuj ce serceznakowane izotopami promieniotw rczymi substratyanaliza effluentu wie cowegoliczniki scyntylacyjnekurczliwo sercapomiar strumienia metabolicznegoprzygotowanie buforu perfuzyjnegotechnika znakowania radioizotopowego

Powiązane artykuły