Poniższy raport opisuje, jak odtworzyć model gryzoni nietętniczej przedniej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego (rNAION), używając odpowiednich parametrów barwnika, soczewki kontaktowej i lasera. Ujawniamy również odpowiednie kroki do oceny zmiany rNAION in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model gryzoni nonartericznej przedniej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego (rNAION)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nienarteryczna przednia niedokrwienna neuropatia nerwu wzrokowego (NAION) to ogniskowa zmiana niedokrwienna nerwu wzrokowego, która dotyka 1/700 osób przez całe życie. NAION powoduje obrzęk nerwu wzrokowego, selektywną utratę neuronów komórek zwojowych siatkówki (RGC) i zanik nerwu wzrokowego. Opracowano model gryzoni NAION, który wyraża większość cech i następstw NAION, który ma zastosowanie zarówno u szczurów, jak i myszy. Model ten wykorzystuje zastosowanie lasera ogniskowego o długości fali 532 nm do oświetlenia fotoaktywnego barwnika, Rose Bengal (RB), w celu spowodowania uszkodzenia naczyń włosowatych i przecieku w docelowym przednim nerwie wzrokowym (obszar laminarny). Po indukcji rNAION następuje wczesne niedokrwienie nerwu wzrokowego, obrzęk nerwu wzrokowego i zapalenie wewnątrznerwowe, a następnie selektywne RGC i utrata aksonów. Ponieważ nerw wzrokowy jest drogą istoty białej OUN, model rNAION ma zastosowanie w badaniach mechanistycznych selektywnego niedokrwienia istoty białej, a także w analizach neuroprotekcyjnych oraz krótko- i długoterminowych mechanizmach glejowej i neuronalnej odpowiedzi na niedokrwienie.
Wprowadzenie
Nienarteryczna przednia niedokrwienna neuropatia nerwu wzrokowego (NAION) to ogniskowa zmiana niedokrwienna przedniej części nerwu wzrokowego (ON)1. NAION jest najczęstszą przyczyną nagłej utraty wzroku związanej z nerwem wzrokowym u osób w wieku powyżej 50 lat2. Uważa się, że mechanizm ten jest zespołem ciasnoty powięziowej, który powoduje obrzęk śródnerwowy i powoduje ucisk naczyń włosowatych zaopatrujących aksony w nerwie wzrokowym3.
Ponieważ ON jest faktycznie obwodem ośrodkowego układu nerwowego (OUN), model NAION (rNAION) gryzoni może być używany do badania mechanizmów i reakcji na izolowane uderzenia istoty białej OUN. Model rNAION może być zatem przydatny w analizie wielu problemów związanych z uszkodzeniem istoty białej związanym z udarem. Może być stosowany do oceny różnych strategii i środków neuroprotekcyjnych w udarze istoty białej.
Jedną z najbardziej atrakcyjnych cech modelu jest to, że jest to bezbolesna, nieinwazyjna procedura. Moc lasera można regulować, aby uzyskać różny stopień uszkodzenia niedokrwiennego. Inną cechą jest to, że opiera się na rodnikach ponadtlenkowych indukowanych laserem, które uszkadzają śródbłonek naczyń włosowatych, powodując postępującą dysfunkcję naczyń włosowatych. Uważa się, że to właśnie ta dysfunkcja i postępujący obrzęk są niezwykle podobne do mechanizmu, który powoduje NAION. Badania wykazały, że nie powoduje bezpośredniego krzepnięcia naczyń włosowatych, ale działa poprzez co najmniej dwa mechanizmy: śmierć wywołaną ponadtlenkiem i pozbawienie niektórych komórek śródbłonka naczyń włosowatych4 oraz NFkB (czynnik jądrowy kappa-wzmacniacz łańcucha lekkiego aktywowanych komórek B) związany z regulacją stanu zapalnego w pozostałym śródbłonku, ze zwiększonym transportem płynu przez błony komórkowe do śródmiąższu5 . Zamknięcie naczyń włosowatych nerwu wzrokowego i ucisk spowodowany gromadzeniem się płynu śródmiąższowego powoduje niedokrwienie głowy nerwu wzrokowego. Schematyczny obraz pokazano na rysunku 2. Model rNAION może być stosowany zarówno u szczurów, jak i myszy6,7 i może być zróżnicowany pod względem stopnia jego nasilenia, od łagodnego uszkodzenia do całkowitego, ale bezbolesnego zniszczenia nerwu wzrokowego i siatkówki, takiego jak niedrożność tętnicy środkowej siatkówki (CRAO).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół został zatwierdzony przez University of Maryland Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC; Baltimore, Maryland, Stany Zjednoczone)
1. Konfiguracja eksperymentalna
- Wykonaj specjalnie zaprojektowane soczewki kontaktowe z przezroczystej okrągłej soczewki optycznej z pleksiglasu o średnicy 7 mm i grubości 3 mm. Wytnij okrągłe soczewki za pomocą wiertarki. Użyj standardowego wiertła, aby wykonać krzywą wewnętrzną, a na koniec wypoleruj zewnętrzne i wewnętrzne krzywe za pomocą polerki do soczewek kontaktowych o najdrobniejszej ziarnistości (1000/3000).
- Przygotować wcześniej 2,5 mM Rose Bengal (RB) w buforze fosforanowym o pH 7,4 soli fizjologicznej (PBS), przefiltrować, wysterylizować filtrem strzykawkowym o średnicy 0,45 mikrona i przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20 °C w światłoszczelnym pojemniku przez okres do 6 miesięcy.
UWAGA: Wykorzystanie samców albinosów niekrewniaczych, takich jak Sprague Dawley, minimalizuje różnice w odpowiedzi zależnej od szczepu, umożliwia większą łatwość indukcji i zmniejsza zmienność, która może wystąpić w przypadku samicy jeżdżącej na rowerze.
- Ustaw okulistyczny laser medyczny z granatu neodymowo-itrowo-aluminiowego o podwojonej częstotliwości (Fd-YAG), który generuje światło laserowe o długości 532 nm. Zamontuj laser na okulistycznej lampie szczelinowej Haag-Streit za pomocą standardowego adaptera lasera okulistycznego. To dostępne na rynku urządzenie umożliwia jednoczesną wizualizację oka zwierzęcia i aplikację plamki laserowej. Laser medyczny posiada również wiązkę celowniczą do prawidłowego ustawiania ostrości i centrowania przy użyciu tej samej wielkości plamki, co indukcja laserowa. Parametry mocy lasera są następujące:
- Do indukcji rNAION szczura: użyj rozmiaru plamki 500 μm/mocy lasera 50 mW/czasu trwania 1,000 ms/interwału 1,000 ms.
- W przypadku indukcji rNAION u myszy: zmień rozmiar plamki na 300 μm dla mniejszej tarczy nerwu wzrokowego i pozostaw inne parametry takie same, jak ustawienie szczura.
- Rutynowo używaj miernika mocy lasera, aby zapewnić moc wyjściową lasera.
2. Procedura eksperymentalna
- Włącz moc lasera i ustaw odpowiedni parametr lasera. Przed użyciem rozgrzej laser przez co najmniej pięć minut.
- Zważyć zwierzę, aby określić odpowiednią dawkę ketaminy/ksylazyny i barwnika RB. Znieczulić zwierzę przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny 80 mg/ml ketaminy i 4 mg/ml ksylazyny.
- Pozostaw zwierzę w ogrzewanej klatce do czasu całkowitego znieczulenia. Sprawdź, czy nie ma reakcji na bodźce awersyjne (szczypanie ogona lub palców). Sprawdzaj zwierzęta pod kątem głębokości znieczulenia co 10 minut.
- Rozszerz źrenice zwierzęcia 1% tropikamidem i znieczul powierzchnię oka 0,5% proparakainą. W przypadku stosowania pigmentowanych zwierząt, takich jak Long Evans, 2,5% krople do oczu z neosynefryny zwiększą rozszerzenie źrenic.
- Użyj nożyczek, aby przyciąć wąsy blisko kufy po stronie, która ma być wywołana, aby uniknąć zasłaniania widoku.
- Umieść kroplę 1% metylocelulozy lub innej okulistycznej kropli sprzęgającej do wnętrza wykonanej na zamówienie soczewki kontaktowej, a następnie nałóż soczewkę na oko szczura.
- Umieść zwierzę na platformie dostosowanej do wysokości lampy szczelinowej. Ustaw głowę zwierzęcia pod kątem 45° tak, aby oko było prostopadłe do lampy szczelinowej i wiązki laserowej.
- Wizualizuj oko przez okulistyczną lampę szczelinową. Upewnij się, że wiązka celownicza ma odpowiedni rozmiar, a także jest skupiona i wyśrodkowana bezpośrednio na uwidocznionym nerwie wzrokowym. Sfotografuj dno siatkówki za pomocą aparatu cyfrowego o wysokiej prędkości ASA (1,200 - 2,000) zamontowanego na jednym z okularów lampy szczelinowej za pomocą specjalnie wykonanego adaptera.
UWAGA: Zdolność widzenia naczyń naczyniówkowych ujawnia przezroczystość siatkówki. Jest to ważny znak, aby móc wykryć późniejsze niedokrwienie siatkówki, które może zakłócić interpretację, jeśli wystąpi. rNAION to niedokrwienie nerwu wzrokowego, które powoduje izolowaną utratę RGC, podczas gdy niedokrwienie siatkówki powoduje uszkodzenie siatkówki wpływające na wszystkie komórki wewnętrznych warstw siatkówki. - Opcjonalnie należy dodatkowo zobrazować siatkówkę i nerw wzrokowy za pomocą tomografu koherentnego spektralnego (SD-OCT8) w celu oceny oka nieindukowanego. Skan en face (ryc. 3B), a także 7 skanów przekrojowych przez siatkówkę (ryc. 3C). Obrazowanie SD-OCT wykorzystuje tę samą soczewkę kontaktową, która jest używana do indukcji laserowej.
- Wstrzyknąć dożylnie 1 ml/kg RB przez żyłę ogonową i odczekać 30 sekund, a następnie aktywować moc lasera. To opóźnienie czasowe umożliwia RB równomierne rozprowadzenie w całym krążeniu. Używamy impulsu laserowego o mocy 50 mW przy jednej sekundzie/impuls. Większe energie (≥ 60 mW) mogą uszkodzić siatkówkę lub spowodować niedokrwienie naczyń siatkówki.
ostrożność: Upewnij się, że każdy ma parę okularów z filtrem laserowym o odpowiedniej długości fali blokującej, aby zapobiec przedostawaniu się rozproszonego światła laserowego do oka badacza.
UWAGA: Podanie laserem musi być podane szybko po wstrzyknięciu dożylnym RB, ponieważ barwnik jest szybko eliminowany z krążenia. Im dłuższa indukcja laserowa, tym poważniejsze jest niedokrwienie nerwu wzrokowego. Ogólnie rzecz biorąc, zwierzętom podaje się impulsy trwające od 7 do 12 sekund w krótkim odstępie czasu. Kontakt światła laserowego z krążącym barwnikiem nadaje naczyniom nerwu wzrokowego piękną złotą poświatę, którą można zobaczyć przez lampę szczelinową (ryc. 4B). Dowodzi to, że barwnik został wstrzyknięty ogólnoustrojowo i rozprowadzony do krwiobiegu. Jeśli blask jest słaby lub nie ma go wcale (ryc. 4A), barwnik nie został wstrzyknięty dożylnie. W takim przypadku nie należy natychmiast wykonywać drugiego wstrzyknięcia, ponieważ zwierzę będzie musiało dojść do siebie przez co najmniej dwa dni przed ponownym wstrzyknięciem. - Natychmiast po indukcji należy zdjąć soczewkę kontaktową. Pokryć oba oczy maścią z potrójnym antybiotykiem okulistycznym (Neosporin/polimyksyna/bacytracyna) z deksametazonem i umieścić zwierzę na podkładce rozgrzewającej o temperaturze 37 °C w pojedynczej klatce pod ścisłą obserwacją aż do całkowitego wyzdrowienia.
- Wyczyść soczewkę kontaktową wodą destylowaną i wytrzyj do sucha nierysującą ściereczką do czyszczenia do wykorzystania w przyszłości.
- Dwa dni po indukcji oceń obrzęk nerwu wzrokowego zarówno za pomocą kolorowej fotografii dna oka, jak i analizy SD-OCT8,
UWAGA: Porównanie stopnia obrzęku nerwu wzrokowego pozwala oszacować nasilenie niedokrwienia nerwu wzrokowego. Po dwóch dniach brzeg tarczy nerwu wzrokowego jest niewyraźny, a żyły siatkówki są lekko rozszerzone w porównaniu z okiem przeciwległym (nieindukowanym). Wykonaj elektroretinografię (ERG) i wizualny potencjał wywołany (VEP11) po dwóch i czterech tygodniach od indukcji w celu analizy elektrofizjologicznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Soczewka kontaktowa umożliwiła wizualizację centralnej części siatkówki (Rycina 1). Ogniskowa plamka lasera oświetla tarczę nerwu wzrokowego w tylnej części siatkówki (Rycina 2). Prawidłowa, nieindukowana siatkówka została zobrazowana za pomocą biomikroskopu z lampą szczelinową (Rycina 3A) oraz SD-OCT (Rycina 3B i 3C). Podczas indukcji laserowej, gdy w krążeniu nie ma barwnika, światło lasera nie powoduje fluorescencji na...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż istnieje wiele modeli uszkodzenia nerwu wzrokowego (zmiażdżenie nerwu wzrokowego12, przecięcie nerwu wzrokowego13 i PION14), model rNAION jest humanitarny, można go dostosować zarówno do szczurów, jak i myszy. Bardziej przypomina on stan kliniczny NAION u ludzi. Stan ten obejmuje postępujący obrzęk przedniego nerwu wzrokowego, zespół przedniego nerwu wzrokowego, ogniskowe niedokrwienie aksonów, izolowane uszkodzenie aksonów komórek zwojowych siatkówki i utratę w dłuższym czasie. B...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy wielu studentom i stypendystom, którzy pracowali nad tym modelem, aby poprawić jego skuteczność i zrozumieć jego mechanizmy. Szczególne podziękowania należą się dr Mary Johnson (University of Maryland-Baltimore), Nitzie Goldenberg-Cohen (Schneiderman Childrens Hospital, Petah-Tikva, Izrael), Charlesowi Zhangowi (Einstein Medical College, Bronx, NY) i Valerie Touitou (Hopital Salpetrie, Paryż, Francja). Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez RO1 EY015304 SLB.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Laser 50 mW 532 nm | Iridex | Standardowy laser okulistyczny | |
| 0 - 100 mW Laser 532 nm | Technologie | Substytut iridex | |
| Adapter lampy szczelinowej laserowej | Iridex | SMA do wyjścia laserowego | |
| Koherentny miernik laserowy Fieldmate z czujnikiem termoelektrycznym | Spójne | inne również odpowiednie | |
| Badanie okulistyczne Biomikroskop z lampą szczelinową | Różne | Haag-Streit jest najlepszy; tańsze wersje dostępne w serwisie eBay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Środek fotoindukujący |
| dno oka Soczewka kontaktowa lub szkiełko nakrywkowe | na zamówienie / Cantor i Nissel (Wielka Brytania) | Specjalnie zaprojektowana planoconvex plastikowa soczewka do badania wzroku i indukcji | |
| Tropicamid 1% | |||
| Pasta polerska Tamiya | Tamiya, INC | 87068 | polerowanie soczewek kontaktowych |
| 2,5% Hypromeloza (goniovisc)/1% Metyloceluloza | HUB Pharmaceuticals | środek sprzęgający soczewki kontaktowe | |
| 2,5% Neosynefryna Krople okulistyczne | Alcon labs | rozszerzający źrenice | |
| Tropikamid 1% | Alcon labs | środek rozszerzający źrenice | |
| 0,5% Proparakaina | Alcon labs miejscowo | znieczulająca | |
| strzykawka insulinowa 30 G z topioną igłą | Różne | Różne | do dożylnego wstrzykiwania róży bengalskiej |
| Ophthamic Maść antybiotykowa z dodatkiem deksametazonu (maść z potrójnym antybiotykiem) | Różne | Różne | Stosować po indukcji, aby zminimalizować bliznowacenie rogówki |
| Heidelberg Corporation Domena spektralna - Optyczna koherentna tomografia | Heidelberg Corporation | For Optical Coherence measurements baseline i post-indukcja; nie jest niezbędna do indukcji |
Bibliografia
- Banik, R. Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy: An Update on Demographics, Clinical Presentation, Pathophysiology, Animal Models, Prognosis, and Treatment. J. Clin. Experimental Ophthalmol. 10, 1-5 (2013).
- IONDT study group. Characteristics of patients with nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy eligible for the Ischemic Optic Neuropathy Decompression Trial. Arch Ophthalmol. 114, 1366-1374 (1996).
- Tesser, R. A., Niendorf, E. R., Levin, L. A. The morphology of an infarct in nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Ophthalmology. 110, 2031-2035 (2003).
- Bernstein, S. L., Johnson, M. A., Miller, N. R. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) and its experimental models. Prog Retin Eye Res. 30, 167-187 (2011).
- Nicholson, J. D., et al. PGJ2 Provides Prolonged CNS Stroke Protection by Reducing White Matter Edema. PLoS One. 7 (12), (2012).
- Goldenberg-Cohen, N., et al. Oligodendrocyte Dysfunction Following Induction of Experimental Anterior Optic Nerve Ischemia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 2716-2725 (2005).
- Bernstein, S. L., Guo, Y., Kelman, S. E., Flower, R. W., Johnson, M. A. Functional and cellular responses in a novel rodent model of anterior ischemic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 4153-4162 (2003).
- Berger, A., et al. Spectral-Domain Optical Coherence Tomography of the Rodent Eye: Highlighting Layers of the Outer Retina Using Signal Averaging and Comparison with Histology. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Huang, T. L., et al. Protective effects of systemic treatment with methylprednisolone in a rodent model of non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION). Exp Eye Res. 131, 69-76 (2015).
- Mantopoulos, D., et al. An Experimental Model of Optic Nerve Head Injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, 6222(2014).
- You, Y., et al. Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination. J. Vis. Exp. (101), e52934(2015).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System. J Vis Exp. (51), e2241(2011).
- Wang, Y., et al. A Novel Rodent Model of Posterior Ischemic Optic Neuropathy. JAMA Ophthalmol. 131 (2), 194-204 (2013).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Chang, S. W., Lin, K. H., Tsai, R. K. Efficacy of Intravitreal Injections of Antivascular Endothelial Growth Factor Agents in a Rat Model of Anterior Ischemic Optic Neuropathy. IOVS. 56, 2290-2296 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
