Artykuł metodologiczny

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54511

⸱

14 września 2016

 ,  , 
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Streszczenie

Komórki eukariotyczne wyczuwają i poruszają się w kierunku gradientu chemoatraktantu, procesu komórkowego określanego jako chemotaksja. Chemotaksja odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych, takich jak embriogeneza, tworzenie wzorców neuronów, przerzuty komórek nowotworowych, rekrutacja neutrofili do miejsc zapalenia oraz rozwój organizmu modelowego Dictyostelium discoideum. Komórki eukariotyczne wykrywają chemoatraktanty za pomocą receptorów sprzężonych z białkiem G. Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Wprowadzenie

Komórki eukariotyczne wyczuwają i poruszają się w kierunku wyższego stężenia w gradiencie chemoatraktantu, procesie komórkowym zwanym chemotaksją. Chemotaksja odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych, takich jak embriogeneza1, wzorce neuronów2, przerzuty komórek nowotworowych3, rekrutacja neutrofili do miejsczapalenia4 oraz rozwój organizmu modelowego Dictyostelium discoideum5. Ogólnie rzecz biorąc, komórki eukariotyczne wyczuwają chemoatraktanty za pomocą receptorów sprzężonych z białkiem G5. Zaangażowanie chemoatraktantów w te receptory sprzyja dysocjacji heterotrimerycznych białek G Gα i Gβγ, które z kolei aktywują szlaki transdukcji sygnału, które ostatecznie regulują organizację czasoprzestrzenną cytoszkieletu aktyny w celu napędzania migracji komórek5-9.

Biolodzy komórkowi rozwijają i ulepszają testy chemotaksji, aby zbadać, w jaki sposób sygnalizacja receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) pośredniczy w ukierunkowanej migracji komórek. Test migracji z komorą Boydena lub transwell został opracowany w 1960 roku przez Boyden10. Test działa poprzez tworzenie gradientu związków chemoatraktantu między dwoma studzienkami, które są oddzielone mikroporowatą membraną. Jego prostota i łatwość użycia sprawiają, że jest to obecnie najczęściej stosowany test chemotaksji. Jednak test nie pozwala na wizualizację procesu migracji komórek. Komora Zigmonda jest pierwszym wizualnym urządzeniem mikroprzepływowym, które umożliwia wyraźne obrazowanie migracji komórek na szkiełku nakrywkowym przez wąskie zwężenie w kierunku źródła chemoatraktantu11. Dunn12 i Insall13 zmodyfikowały i poprawiły wysoką rozdzielczość i długoterminową zdolność obrazowania testu chemotaksji w komorze Zigmonda. Ze względu na wysoce przewidywalną, dominującą dyfuzję charakterystykę przepływu płynów, firma Microfluidics dostarcza rozwiązania do testów chemotaksji nowej generacji, takich jak EZ-TAXIScan (urządzenie do analizy mobilności komórek).

Przy zapewnionej stabilności gradientu, urządzenie pozwala na przeprowadzenie sześciu testów chemotaksji jednocześnie (Rysunek 1A). W przeciwieństwie do gradientów ustalanych kierunkowo generowanych w różnych testach komorowych powyżej, test igłowy lub mikropipet opracowany przez Guenthera Gerischa generuje gradient z ruchomym źródłem14. W teście chemoatraktant jest uwalniany z ruchomej mikropipety w celu wytworzenia stabilnego gradientu. Dzięki temu testowi igłowemu naukowcy odkryli, że różne komórki generują pseudopody o zasadniczo różnych cechach. Stosując mikroskopię fluorescencyjną, byliśmy w stanie zobrazować gradient, aby ułatwić jego ilościowy pomiar przez całe15 lat. W tym badaniu opisujemy szczegółowe metody przygotowania chemotaktycznych komórek HL60 (ludzkiej białaczki promielocytowej), jednocześnie monitorując wiele testów chemotaksji za pomocą urządzenia do analizy mobilności komórek oraz wizualizując czasoprzestrzenną dynamikę cząsteczek sygnałowych, takich jak kinaza białkowa D1, za pośrednictwem GPCR w pojedynczych żywych komórkach w odpowiedzi na widoczne, kontrolowane czasoprzestrzennie bodźce chemoatraktantowe. Nasze zaawansowane metody obrazowania mogą być stosowane w ogólnych badaniach chemotaksji i są szczególnie odpowiednie dla systemów komórkowych ssaków.

Protokół

1. Hodowla i różnicowanie ludzkich neutrofilopodobnych komórek HL60

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, która zawiera pożywkę RPMI 1640, 10 % (v/v) płodową surowicę bydlęcą (FBS), 0,1 mM pirogronianu sodu i 25 mM kwasu HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego). Ogrzać pożywkę hodowlaną RPMI 1640 do temperatury 37 °C.
  2. Za pomocą hemocytometru określ gęstość komórek HL60, aby upewnić się, że komórki są w fazie wzrostu w fazie logarytmicznej.
    UWAGA: Komórki są zwykle w fazie logarytmicznej trzeciego dnia po pasażowaniu. Gęstość komórek w fazie logarytmicznej wynosi zwykle 6-8 x 105 komórek/ml. Gęstość komórek wymagana do rozpoczęcia nowej hodowli wynosi około 1,5 x 105 komórek/ml.
    UWAGA: Na przykład, dla 10 ml nowej kultury w płaskiej kolbie T-75, jeśli gęstość komórek w fazie logarytmicznej wynosi 6 x 105 komórek/ml, wówczas 2,5 ml komórek w fazie logarytmicznej (6 x 105) rozcieńcza się do 1,5 x 105 komórek/ml w 10 ml nowej hodowli. Aby uzyskać końcową objętość 10 ml kultury, dodaje się 7,5 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640.
  3. Umieścić obliczoną objętość ciepłej pożywki hodowlanej RPMI 1640 w płaskiej kolbie. W przypadku hodowli w płaskiej kolbie T-75 całkowita objętość kultury komórkowej wynosi 10 ml.
  4. Dodać obliczoną objętość komórek HL60 rosnących w fazie logarytmicznej do płaskiej kolby, aby osiągnąć gęstość komórek 1,5 x 105 komórek/ml.
  5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2,
    UWAGA: Czas podwojenia HL60 wynosi prawie 24 godziny.
  6. Pasaż komórek za pomocą pożywki hodowlanej RPMI 1640 co 2-3 dni. Ważne jest, aby gęstość komórek HL60 nigdy nie przekraczała 1,5 x 106 komórek/ml, a pasaż komórkowy trwał nie dłużej niż 2 miesiące.
  7. Różnicować komórki HL60 5 dni przed eksperymentami.
    UWAGA: Pożywka różnicująca RPMI 1640 zawiera pożywkę RPMI 1640, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,1 mM pirogronianu sodu, 25 mM HEPES i 1,3% dimetylosulfotlenku (DMSO). Innymi słowy, jest to 1,3% DMSO w pożywce hodowlanej RPMI 1640.
    1. Aby rozróżnić komórki HL60, należy wstępnie ogrzać pożywkę hodowlaną RPMI 1640 do temperatury 37 °C. Dodać ciepłą pożywkę hodowlaną RPMI 1640 do płaskiej kolby.
    2. W celu uzyskania końcowej 10 ml kultury różnicującej HL60 należy dodać 130 ul DMSO bezpośrednio do pożywki hodowlanej RPMI 1640 w płaskiej kolbie, jednocześnie obracając kolbę, tak aby DMSO zostało szybko rozcieńczone przez pożywkę hodowlaną RPMI 1640.
    3. Dodać komórki HL60 w fazie logarytmicznej do końcowej gęstości komórek 1,5 x 105 komórek/ml w końcowej pożywce różnicującej 10 ml RPMI 1640. Hodować komórki HL60 w pożywce różnicującej RPMI 1640 w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5 % CO2 przez 5 dni.

2. Powlekanie szklanej powierzchni pokrywy komory 4well

  1. Wyjmij butelkę z 2% roztworem bulionowym żelatyny z lodówki, wyczyść ją 70% etanolem i umieść w okapie. Weź 1 ml 2% roztworu wyjściowego żelatyny i natychmiast włóż pozostały roztwór bulionowy żelatyny do lodówki.
  2. Pozostawić roztwór żelatyny do całkowitego upłynnienia w temperaturze 37 °C i dokładnie go odpipetować. Rozcieńczyć 2% roztwór podstawowy żelatyny 9 ml wstępnie podgrzanego 1x buforu zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) do końcowego stężenia 0,2% żelatyny.
  3. Dodać 0,5 ml lub 2 ml 0,2% żelatyny w HBSS do dwóch środkowych studzienek komory 4-dołkowej lub komory 1-dołkowej ze szkłem nakrywkowym na dnie. Przechyl płytki w kilku kierunkach, tak aby płyn pokrył całą powierzchnię.
  4. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Talerze będą gotowe do użycia w ciągu 1 godziny. Można je stosować do 5 dni. Tuż przed wysiewem komórek należy usunąć roztwór żelatyny z komór 4- lub 1-dołkowych.

3. Test chemotaksji za pomocą urządzenia do analizy ruchomości komórek

  1. Przygotuj i ogrzej pożywkę głodową RPMI 1640, która jest pożywką RPMI zawierającą 0,1 mM pirogronianu sodu (opcjonalnie) i 25 mM HEPES.
  2. Przygotować 100 μl 100 nM fMLP (N-formylometylo-leucylo-fenyloalaniny) w pożywce głodowej RPMI 1640.
  3. Przygotować 3 ml 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/RPMI 1640, która zawiera 1% BSA w pożywce głodowej RPMI 1640 i 10 ml pożywki 0,1% BSA/RPMI 1640.
  4. Kwadratowe szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm i chip urządzenia do analizy ruchomości komórek o średnicy 5 μm należy pokryć świeżo przygotowanym 1% podłożem BSA/RPMI 1640 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Zamontuj uchwyt, postępując zgodnie z następującą procedurą:
    1. Ustaw podstawę uchwytu tak, aby dźwignie znajdowały się w pozycji pionowej, tak aby dźwignie mogły przechylić się w kierunku użytkownika. Nanieś 70% roztwór etanolu na powierzchnię szkła o średnicy 41 mm. Ostrożnie przetrzyj powierzchnie chusteczką, uważając, aby ich nie zarysować.
    2. Włóż szkło 41 mm do podstawy uchwytu. Umieść kwadratowe szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm z powłoką BSA na szkle o średnicy 41 mm w podstawie uchwytu.
      UWAGA: Powlekane kwadratowe szkiełko nakrywkowe między szkłem o grubości 41 mm a chipem umożliwia zachodzenie chemotaksji na podłożu powierzchni powłoki.
    3. Włóż O-ring (mały) do dolnej części obudowy płytki i zamontuj obudowę płytki w podstawie uchwytu z eliptycznym otworem z tyłu. Pociągnij wewnętrzny poziom podstawy uchwytu do przodu do pozycji poziomej, aby zablokować obudowę płytki na miejscu.
    4. Wydmuchaj kurz z wnętrza obudowy wafla za pomocą miotełki do kurzu. Dodać 4 ml 0,1% pożywki BSA/RPMI 1640 do obudowy płytki.
    5. Zamontuj chip urządzenia do analizy mobilności komórek z powłoką BSA pośrodku obudowy płytki konstrukcyjnej skierowaną w dół w kontakcie ze szkłem.
      UWAGA: Chip musi być włożony ze znacznikiem pozycjonującym (otwór w górnej części chipa) z tyłu.
    6. Przymocuj gumową uszczelkę do dolnej części zacisku wafla, dopasowując dwa występy na gumowej uszczelce do otworów.
    7. Zamontuj O-ring (duży) na górze obudowy płytki. Zamontuj zacisk waflowy z otworem czujnika z tyłu. Pociągnij zewnętrzną dźwignię podstawy obudowy do przodu do pozycji poziomej, aby zablokować płytkę clamp na miejscu.
    8. Po zmontowaniu uchwytu umieść dolną część uchwytu na kasecie oświetleniowym, aby upewnić się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza. W przypadku wykrycia pęcherzyków powietrza należy je usunąć za pomocą dołączonej plastikowej strzykawki wyposażonej w końcówkę do ładowania próbki.
    9. Zdejmij pokrywę i umieść zespół na płytce na górze urządzenia do analizy mobilności komórek. Przymocuj blok czujnika do uchwytu.
  6. Przygotuj komórki HL60 do testu chemotaksji:
    1. Obliczyć gęstość komórek zróżnicowanych komórek HL60 za pomocą hemocytometru. Po 5 dniach różnicowania gęstość komórek wynosi około 1,0 x 106 komórek/ml.
    2. Obliczyć końcową objętość komórek HL60 przy końcowej gęstości komórek 2 x 106 komórek/ml. Na przykład, jeśli gęstość komórek zróżnicowanych komórek HL60 wynosi 1,0 x 106 komórek/ml, wówczas 10 ml zróżnicowanych komórek HL60 zostanie ponownie zawieszonych w 5 ml 0,1% pożywki BSA/RPMI 1640, aby osiągnąć 2 x 106 komórek/ml.
    3. Odwirować zróżnicowane komórki HL60 przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki o obliczonej objętości 0,1% pożywki BSA/RPMI 1640 w kroku 3.6.2) do końcowej gęstości komórek 2 x 106 komórek/ml.
  7. Uruchom urządzenie do analizy mobilności komórek i komputer w celu akwizycji obrazu. Podłącz urządzenie do komputera. Włącz urządzenie do analizy mobilności komórek. Włącz komputer.
  8. Uruchom oprogramowanie urządzenia do analizy mobilności komórek.
    1. Obserwuj 5 paneli sterowania: kamera, grzałka, fotografowanie, notatka i obrazy z kamery.
    2. Na panelu sterowania obrazem kamery użyj opcji "Linia pozioma" lub "Linia pionowa", aby dostosować pozycję uchwytu/widoku w czasie rzeczywistym, aby wyśrodkować kamerę w panelu obrazu kamery.
    3. Na panelu sterowania kamery wybierz CH1 do CH6, aby przenieść kamerę do zdefiniowanego kanału. Aby wyśrodkować pola widzenia kanału, kliknij "Przesuń L" lub "Przesuń R", aby dostosować współrzędną X kamery i wyśrodkować pozycję kamery w poziomie.
    4. Dostosuj współrzędną Y kamery, obracając pokrętło pozycji na panelu przednim urządzenia do analizy mobilności komórek, aby wyregulować obraz w pionie w celu wyśrodkowania ekranu.
    5. Na panelu sterowania grzałki ustaw "temperaturę uchwytu" na 37.0 °C, a "temperaturę płyty" na 39 °C. Kliknij "Ogrzewanie", aby rozpocząć ogrzewanie. Kliknij również "uchwyt", aby kontrolować temperaturę za pomocą czujnika termicznego podłączonego do uchwytu.
    6. Na panelu fotografowania wprowadź "15 sekund" w "Interwał" i "30 minut" w "Czas" dla interwałów i czasu trwania testu chemotaksji. Zaznacz "Grzejnik wyłącza się po zakończeniu strzelania" ze względów bezpieczeństwa. Wyznacz miejsce docelowe dla przechowywanych obrazów.
    7. Na panelu notatek wprowadź szczegóły eksperymentów, takie jak użyta linia komórkowa, czy zastosowano leczenie, czy nie, oraz stężenie zastosowanych chemoatraktantów.
    8. Potwierdź środkową pozycję wszystkich kanałów, które będą używane w eksperymentach, i w razie potrzeby powtórz regulację dla wszystkich kanałów.
  9. Wstrzyknij i wyrównaj komórki w następujący sposób:
    1. Wyjmij bufor z uchwytu i wyjmij 8 μl buforu z trzeciej studzienki od góry dla każdego kanału.
    2. Za pomocą strzykawki wstrzyknąć 2 μl komórek do drugiego dołka w tym samym kanale, jednocześnie monitorując ekran w czasie rzeczywistym, aby kontrolować liczbę komórek i przepływ podczas wstrzykiwania. Po ładnym wyrównaniu komórek natychmiast dodaj z powrotem 8 μl buforu. Powtórz tę samą procedurę dla innych kanałów (Rysunek 1B).
  10. Dodać 2 ml buforu z powrotem do uchwytu i dodać 1 μl 100 nM fMLP do trzeciego dołka od góry. Rozpocznij pobieranie obrazu i zapisz dane. Przeanalizuj dane uzyskane za pomocą oprogramowania do śledzenia obrazu9 (rysunek 2).

4. Transfekcja z elektroporacją

  1. Różnicować komórki HL60 5 dni przed eksperymentem, jak opisano w sekcji 1. Pokryj komory 4- lub 1-dołkowe zgodnie z instrukcją w rozdziale 2.
  2. Przygotuj i podgrzej pożywkę do elektroporacji RPMI 1640, która zawiera pożywkę RPMI 1640, 20% (v/v) FBS, 0,1 mM pirogronianu sodu i 25 mM HEPES, do 37 °C.
  3. Tuż przed rozpoczęciem eksperymentu z transfekcją dodać 300 μl lub 3 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640 do dołków wstępnie pokrytych komór 4-dołkowych lub 1-dołkowych.
  4. Inkubować komory w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5 % CO2 . Użyj tych komór natychmiast lub przechowuj w inkubatorze do wykorzystania w przyszłości (dwa tygodnie).
  5. Policz gęstość komórek zróżnicowanych komórek HL60 za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Gęstość komórek często osiąga około 1,0 x 106 komórek/ml. Gęstość komórek większa niż 3,0 x 106 komórek/ml zwykle daje niepożądaną skuteczność transfekcji. Ponieważ komórki HL60 są komórkami zawiesinowymi, nie jest wymagane ponowne zawieszanie.
  6. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić 2 x 106 komórek HL60 w 100 μl odczynnika do transfekcji.
  7. Dodać 4 μg plazmidu GFP-PKD1 9 do 100 μl mieszaniny komórek i odczynników do transfekcji i delikatnie i dokładnie wymieszać. Dodaj mieszaninę do dołączonej kuwety.
  8. Wybierz wstępnie ustawiony program producenta dla linii komórek ludzkich leukocytów i wykonaj elektroporację.
    UWAGA: Więcej informacji można znaleźć na stronie producenta.
  9. Po elektroporacji natychmiast i delikatnie dodaj do ogniw wstępnie podgrzany 500 μl pożywki do elektroporacji RPMI 6140 i delikatnie przenieś ogniwa z kuwety do probówki o pojemności 1,6 ml za pomocą dostarczonych plastikowych pipet.
  10. Inkubować komórki przez 30 minut w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zasiać 100 μl lub 500 μl komórek do jednego dołka odpowiednio w komorze 4-dołkowej lub 1-dołkowej.
  11. Dodać pożywkę hodowlaną RPMI 1640 do końcowej objętości 1 ml lub 4 ml do tego samego dołka odpowiednio w komorze 4-dołkowej lub 1-dołkowej. Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5 % CO2 przez 3 godziny. Wstępnie podgrzany RPMI 1640 głodzący do 37 °C.
  12. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml delikatnie usunąć 0,8 ml lub 3 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640 z dołka odpowiednio komory 4-dołkowej lub komory 1-dołkowej. Zachowaj ostrożność i unikaj odsysania przylegających komórek HL60.
    UWAGA: Komórki HL60 rosną i różnicują się w pożywce zawiesinowej. Po różnicowaniu lub po pewnych zabiegach komórki HL60 przylegają do podłoża pokrytego polilizyną, kolagenem, żelatyną lub fibronektyną.
  13. Dodać 0,8 ml lub 3 ml pożywki głodowej RPMI 1640 do studzienki odpowiednio w komorze 4-dołkowej lub 1-dołkowej. Czekaj 1 godz.
    UWAGA: W tym momencie komórki są gotowe do eksperymentów obrazowych9.

5. Monitorowanie translokacji błonowej PKD1 za pośrednictwem GPCR za pomocą wielokanałowej mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Przygotuj świeżą mieszaninę 100 nM fMLP i 1 μg/ml Alexa 594 w pożywce głodowej RPMI 1640 jako bodźce.
    UWAGA: Mieszanina fMLP i Alexa 594 musi być świeżo przygotowana, aby zapewnić maksymalną skuteczność.
  2. Zamontuj jedną 4-dołkową komorę wysianą komórkami na 40-krotnej soczewce olejowej.
  3. Ustaw mikroskop fluorescencyjny w konfiguracji wielokanałowej w następujący sposób:
    1. Ustaw zielony kanał emisji (500-530 nm) dla PKD1 oznaczony GFP, czerwony kanał emisji (580-620 nm) dla chemoatraktantu fMLP (Alexa 594) i kanał światła przechodzącego do identyfikacji przylegających komórek HL60.
    2. Rozpocznij akwizycję "na żywo" i zoptymalizuj warunki akwizycji w trzech kanałach:
    3. Dostosuj intensywność i moc lasera dla wszystkich trzech kanałów, aby zminimalizować fotowybielacz przez dłuższy czas obrazowania.
    4. W razie potrzeby uśredniaj co 2 do 4 klatek, aby zmniejszyć współczynnik szumów tła i uzyskać lepszą jakość obrazów. Użyj interwału 1 sekundy.
  4. Szukaj przylegających komórek, które wyrażają silny PKD1-GFP w widoku kanału GFP i DIC (kontrast interferencji różnicowej). Przylegające komórki są morfologicznie płaskie i nie poruszają się szybko.
  5. Po zidentyfikowaniu przylegających komórek HL60, które wykazują wysoką ekspresję GFP-PKD1, zoptymalizuj warunki akwizycji, obniżając moc lasera, jednocześnie zwiększając wzmocnienie detektora dla każdego kanału, aby zmniejszyć fotowybielacz do długoterminowego obrazowania (Figura 3A).
  6. Pobrać 100 μl roztworu fMLP/Alexa 594 za pomocą pipetera o pojemności 200 μl i odstawić. Wybierz "akwizycję poklatkową" i ustaw interwały na 2 sekundy, a liczbę klatek do uzyskania na 100.
    UWAGA: interwały i liczba klatek do uzyskania zależą od celu eksperymentów. Interwały 1-2 sekundowe i 100 klatek są często używane do eksperymentów obrazowych, jak na rysunku 3. W przypadku wolno migrujących komórek konieczne są dłuższe odstępy czasu w celu długotrwałego obrazowania. W przeciwieństwie do tego, w przypadku szybko migrujących komórek, krótsze odstępy czasu są wymagane do obserwacji ciągłych szczegółów migracji komórek.
  7. Ostrożnie zdejmij pokrywę komory 4-dołkowej, aby położenie komory nie uległo zmianie. Rozpocznij akwizycję natychmiast i uzyskaj 3-5 obrazów niestymulowanych komórek, umieszczając pipeter o pojemności 200 μl bezpośrednio nad komórkami, używając plamki światła laserowego jako przewodnika.
  8. Pipetować mieszaninę fMLP/Alexa 594 na obrazowane komórki z szybkim i równomiernym przepływem i zakończyć cały zestaw akwizycji poklatkowej. Nazwij i zapisz dane, które będą poddawane dalszej analizie danych.

6. Obrazowanie komórek chemotaksujących w widocznych i kontrolowanych bodźcach chemoatraktantowych

  1. Używając mikropipetera o pojemności 10 μl i końcówek iniekcyjnych, wypełnij mikropipetę 30 μl świeżo przygotowaną mieszaniną fMLP i Alexa594.
  2. Przymocuj mikropipetę do uchwytu na mikropipety zamontowanego na stoliku mikroskopu i podłącz rurkę do jednostki zasilania ciśnieniem, urządzenia, które zapewnia stałe ciśnienie w celu uwolnienia roztworu fMLP/Alexa594 z mikropipety w celu wytworzenia stałego gradientu.
  3. Włączyć dopływ ciśnienia i ustawić ciśnienie kompensacyjne (Pc) na 70 hPa.
  4. Zamontuj 1-dołkowe szkiełko nakrywkowe z komórkami HL60 wyrażającymi PKD1-GFP na 40-krotnej soczewce olejowej pod mikroskopem konfokalnym lub jego odpowiednikiem mikroskopem fluorescencyjnym.
  5. Ustaw akwizycję w trybie kanału w następującej konfiguracji: kanał zielony (500-530 nm) dla PKD1 oznaczonego GFP; kanał czerwony (580-620 nm) dla chemoatraktantu fMLP (Alexa594); oraz kanał światła przechodzącego do identyfikacji przylegających komórek HL60.
  6. Rozpocznij akwizycję "na żywo" i zoptymalizuj warunki akwizycji dla trzech kanałów: dostosuj intensywność każdego kanału do ilościowej analizy danych obrazowych; dostosuj intensywność i moc lasera dla wszystkich trzech kanałów, aby uzyskać obrazy o najlepszej jakości i zminimalizować fotowybielacz. W razie potrzeby uśredniaj co 2 do 4 klatek, aby uzyskać lepszą jakość obrazu. Zwykle używamy interwału 1 sekundy.
  7. Rozpocznij akwizycję "na żywo" i szukaj przylegających komórek, które wyrażają silny PKD1-GFP w widoku GFP i kanałów światła przechodzącego. Korzystając z optyki jasnego pola, wyśrodkuj mikropipetę w środkowym polu view (Rysunek 4A), aby uwidocznić gradient fMLP i przylegające do nich komórki HL60 wykazujące ekspresję PKD1-GFP.
  8. Wybierz akwizycję poklatkową i ustaw interwały na interwały 2 sekundy, a liczbę klatek do uzyskania na 100.
    UWAGA: Po zebraniu każdej serii poklatkowej nazwij i zapisz dane, które będą poddawane dalszej analizie danych.

Wyniki

Symultaniczne obrazowanie chemotaksji wielu komórek HL60 przy użyciu urządzenia do analizy mobilności komórkowej

W oparciu o zasadę mikroprzepływów16, producent dostarczył symulowane profile gradientów: gradient jest generowany w ciągu 1 min, stabilizowany w ciągu 5 min i utrzymywany przez 2 hr. Wysoko przewidywalne profile stabilnych gradientów generowanych przez mikroprzepływy pozwalają na jednoczesne przeprowadzanie wielu testów chemotaksji. W niniejszym badaniu zaobserwowano trzy równoległe testy chemotaksji (Rysunek 2A i Film 1). Stwierdzono, że komórki HL60 zaczęły wykaziwać chemotaksję natychmiast po wstrzyknięciu chemoatraktanta do studni z chemoatraktantem i kontynuowały ruch po linii prostej przez kolejne 60 min, co jest zgodne z wynikami symulacji stabilności gradientu. Śledzenie ścieżki ruchu i morfologii komórek umożliwia pomiary ilościowe i późniejsze porównanie zachowań chemotaktycznych przy użyciu indeksu chemotaksji, który obejmuje całkowitą długość ścieżki, prędkość, kierunkowość oraz okrągłość komórek (Rysunek 2B). Całkowita długość ścieżki jest sumą długości odcinków linii łączących centroidy ścieżki. Prędkość uzyskuje się poprzez podzielenie całkowitej długości ścieżki przez czas. Kierunkowość jest mierzona w górę i zdefiniowana jako: (współrzędna Y końca ścieżki minus współrzędna Y początku) podzielona przez całkowitą długość ścieżki. Dla obiektu poruszającego się bezpośrednio w górę wartość ta wynosi 1,0. Okrągłość komórki jest miarą (wyrażoną w procentach), w jakim dany obwód efektywnie zamyka powierzchnię. Koło posiada największą powierzchnię przy dowolnym danym obwodzie i ma parametr okrągłości wynoszący 100%. Linia prosta nie zamyka żadnej powierzchni i ma parametr okrągłości wynoszący 0%. Przedstawiamy ilościowo zmierzone zachowanie chemotaktyczne opisane za pomocą wybranych parametrów chemotaksji (Rysunek 2C).

Monitorowanie subkomórkowej lokalizacji PKD w komórkach HL60 pod wpływem spatiotempuralnie widzialnego i kontrolowanego bodźca fMLP

Zastosowanie kontrolowanej stymulacji chemoatraktantem znakowanym fluorescencyjnie w systemie eksperymentalnym stanowi istotny postęp techniczny. Historycznie, w celu obserwacji odpowiedzi i zachowań komórek, stosowano stymulację jednorodną (zwaną również równomierną) lub stymulację gradientową. Jednakże stymulacja „ślepa” nie tylko nie dostarcza informacji czasoprzestrzennych na temat tego, w jaki sposób bodziec dociera do komórek, ale także budzi wątpliwości w przypadku wszelkich „nietypowych” obserwacji odpowiedzi komórkowej na stymulację, po prostu dlatego, że nie widzimy bodźca. Wykazaliśmy wcześniej, że barwnik fluorescencyjny (Alexa594) może być stosowany wraz z chemoatraktantem w celu ustanowienia liniowej zależności między stężeniem chemoatraktanta a monitorowaną intensywnością barwnika fluorescencyjnego15. Dzięki konfiguracji akwizycji obejmującej zielone białko fluorescencyjne (GFP), czerwoną emisję barwnika fluorescencyjnego (Alexa594) oraz światło przechodzące, jesteśmy w stanie monitorować przylegające komórki, aplikację bodźca oraz odpowiedź komórkową na ten bodziec (Ryc. 3A). Kinaza białkowa D to rodzina kinaz seryna/treoninowych, które odgrywają kluczową rolę w kierunkowej migracji komórek9,17. W odpowiedzi na równomierną stymulację fMLP (czerwony), komórki HL60 wykazują silną translokację błonową znakowanej GFP kinazy białkowej D1 (zielony) (Ryc. 3B oraz Film 2). W gradiencie fMLP (czerwony) (Ryc. 4A), komórki HL60 aktywnie rekrutują PKD1 do krawędzi prowadzącej (Ryc. 4B oraz Film 3). Szczegółowe porównanie subkomórkowej lokalizacji GFP w wypustce krawędzi prowadzącej wskazuje, że PKD1 lokalizuje się w tylnej części krawędzi prowadzącej (Ryc. 4C).

figure-results-1
Rycina 1. Urządzenie do analizy mobilności komórkowej umożliwia jednoczesne przeprowadzenie do 6 testów chemotaksji. (A) Schemat przedstawia konstrukcję chipa urządzenia do analizy mobilności komórkowej przeznaczonego do jednoczesnego monitorowania 6 niezależnych testów chemotaksji. Kolor czerwony oznacza chemoatraktant dodany do studni. (B) Wprowadzanie komórek HL60 do studni z komórkami, podczas gdy chemoatraktant dyfunduje, tworząc stabilny gradient fMLP. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2. Równoczesne monitorowanie wielu testów chemotaksji z wykorzystaniem komórek HL60. (A) Montaż przedstawia obrazy z testu chemotaksji w urządzeniu do analizy mobilności komórek w celu zbadania hamujących efektów inhibitorów specyficznych dla PKD na chemotaksję w czasie 0 i 12 min po zastosowaniu gradientu. Chemotaktyczne komórki HL60 poddano wstępnej inkubacji z inhibitorem PKD 1 μM CID755673 przez 30 min. Komórkom HL60 z zastosowaniem lub bez zastosowania inhibitora PKD pozwolono na przeprowadzenie chemotaksji w gradientach medium głodzeniowego RPMI1640 lub 100 nM fMLP przez 12 min. (B) Schemat przedstawia długość ścieżki przemieszczania się oraz morfologię śledzonych komórek HL60. (C) Ilościowa analiza chemotaksji jako całkowita długość ścieżki, prędkość, kierunkowość i okrągłość. Przedstawiono średnią ± SD; n = 10, 12 lub 11 odpowiednio dla braku gradientu, gradientu fMLP bez zastosowania CID755673 oraz zastosowania fMLP z inhibitorem CID755673. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3. Silna translokacja PKD1 do błony komórkowej zależna od GPCR w odpowiedzi na jednorodnie przyłożone bodźce fMLP. (A) Wielokanałowe monitorowanie PKD1-GFP (zielony), chemoatraktanta (1 μM fMLP zmieszanego z 0,1 μg/ml barwnika fluorescencyjnego Alexa 594, czerwony) oraz obraz DIC (kontrast interferencyjny różnicowy) w celu zidentyfikowania przylegających komórek HL60 w studzience komory 4-studzienkowej powlekanej 0,2% żelatyną w medium RPMI 1640. Pasek skali = 10 μm. (B) Montaż obrazów pokazuje, że jednorodnie przyłożony fMLP (czerwony) indukuje silną translokację PKD1-GFP (zielony) do błony komórkowej. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-4
Rysunek 4. Lokalizacja PKD1 na krawędzi natarcia w chemotaktycznych komórkach HL60. (A) Konfiguracja akwizycji w trybie kanałowym ułatwia wizualizację gradientu fMLP oraz dynamiki czasoprzestrzennej PKD1. Na zdjęciach A-C komórki HL60 przejściowo ekspresowały PKD1 z tagiem GFP; aby zwizualizować gradient fMLP generowany z mikropipety (DIC), 100 nM fMLP (czerwony) zmieszano z 0,1 μg/ml barwnika fluorescencyjnego Alexa 594. (B) Wzmocniona lokalizacja PKD1 na krawędzi natarcia chemotaktycznej komórki. Pasek skali = 10 μm. (C) Nałożone obrazy pokazują, że PKD1 lokalizuje się z tyłu krawędzi natarcia w komórkach HL60. Kolor zielony wskazuje lokalizację komórkową PKD1, a obraz DIC pokazuje wysunięty obszar krawędzi natarcia. Pasek skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W niniejszym badaniu pokazujemy dwa przykłady testów chemotaksji: po pierwsze, jednoczesne monitorowanie wielu testów chemotaksji za pomocą urządzenia do analizy mobilności komórek; Po drugie, wizualizacja gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w tych samych komórkach w czasie rzeczywistym.

Urządzenie do analizy ruchomości komórek do wielu jednoczesnych testów chemotaksji

W niniejszym badaniu wprowadziliśmy szczegółowy protokół wykonywania wielu jednoczesnych testów chemotaksji przy użyciu urządzenia do analizy ruchomości komórek. To urządzenie pozwala użytkownikowi obserwować zachowanie chemotaksji komórkowej za pomocą soczewki obiektywowej 10X w konwencjonalnej obserwacji w jasnym polu. Ze względu na dominującą dyfuzję charakterystykę przepływu płynu, urządzenie do analizy ruchomości komórek generuje wysoce przewidywalne, stabilne gradienty i umożliwia jednoczesne przeprowadzenie do sześciu testów chemotaksji. Krytycznymi etapami protokołu są uzyskanie wiarygodnych gradientów i wyrównanie komórek na linii tarasu. Użytkownik powinien ściśle przestrzegać instrukcji producenta dotyczących montażu uchwytu i wstrzykiwania chemoatraktantów i komórek. Szczegółowe instrukcje są również dostępne online. W porównaniu z alternatywnymi metodami chemotaksji11-13,15, urządzenie to znacznie poprawia wiarygodność i skuteczność testów chemotaksji. Dostępne są cztery rozmiary chipów urządzenia do analizy ruchomości komórek w rozmiarach 4, 5, 6 i 8 μm, aby dostosować się do różnych typów i rozmiarów komórek. Odkryliśmy, że chip urządzenia do analizy mobilności komórek o średnicy 4 lub 5 μm jest odpowiedni dla ogniw HL60 i D. discoideum , które mają średnicę około 10-15 μm. Jednak jednym ograniczeniem jest to, że to urządzenie nie nadaje się do wszystkich typów komórek. Odnieśliśmy niewielki sukces przy użyciu testu chemotaksji urządzenia do analizy mobilności komórek z komórkami Raw267.4. Powodem może być to, że komórki Raw267.4 migrują zbyt wolno. Czas potrzebny do wydajnej chemotaksji ogniw Raw267.4 może być znacznie dłuższy niż czas utrzymywania gradientu przez urządzenie. Zamiast tego test migracji transwell działał dobrze w przypadku komórek Raw267.49. Kolejnym ograniczeniem jest to, że obserwacja fluorescencyjna nie jest możliwa przy użyciu obecnego urządzenia. Przyszłościowym kierunkiem jest monitorowanie obrazowania fluorescencyjnego z większym powiększeniem. Jest to możliwe dzięki ulepszonemu urządzeniu do analizy ruchomości komórek, które jest wyposażone w detekcję fluorescencyjną i soczewkę obiektywu 100X. Ponadto zwiększono również liczbę jednoczesnych testów do 12. Wszystkie te ulepszenia ułatwiają zwiększenie przepustowości testów chemotaksji i obserwację dynamiki subkomórkowej w migrujących komórkach.

Wysoka skuteczność transfekcji komórek HL60 w celu ekspresji białka znakowanego białkiem fluorescencyjnym

Komórki HL60 są aktywnie dzielącą się linią komórkową białaczki i rosną w zawiesinie. Jak wcześniej informowano18-20, komórki HL60 są odporne na transfer genów. Przetestowano zarówno transfer genów lipidów, jak i elektroporacji, a wyższą skuteczność transfekcji uzyskano przy elektroporacji, co szczegółowo opisano w punkcie 4. Uzyskanie wysokiej żywotności po elektroporacji ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej wydajności transfekcji ze względu na poważne uszkodzenia wynikające z elektroporacji. Następnie wymagane jest dokładne i delikatne obchodzenie się z ogniwami, zwłaszcza po elektroporacji. Wszystkie podłoża muszą być wstępnie podgrzane i delikatnie dodane do ogniw w dowolnym etapie po elektroporacji. Bardzo ważne jest również zminimalizowanie czasu ekspozycji ogniw na odczynnik do elektroporacji. Aby uniknąć śmierci ogniwa, po elektroporacji należy natychmiast dodać do ogniw pożywkę do odzyskiwania elektroporacji RPMI 1640. Odkryliśmy, że 20% FBS w pożywce regeneracyjnej daje znacznie wyższy wskaźnik odzyskiwania komórek niż 10% FBS. Po elektroporacji inkubacja w pożywce regeneracyjnej do elektroporacji RPMI 1640 przez 30 minut ma kluczowe znaczenie dla większej żywotności i wydajności transfekcji. Aby jeszcze bardziej zwiększyć wydajność transfekcji, użyliśmy również 4 μg plazmidowego DNA na transfekcję, co stanowi prawie dwukrotność ilości plazmidu zalecanej przez producenta.

Istnieją dwa główne ograniczenia transfekcji elektroporacji: przejściowość ekspresji białka i limit liczby komórek (2 x 106 komórek na transfekcję). W komórkach niezróżnicowanych ekspresja jest wykrywalna tylko podczas pierwszych kilku podziałów komórkowych, ponieważ plazmid wektorowy jest rozcieńczany o połowę po każdym podziale komórki. Dla zróżnicowanych komórek HL60 przeżywają nie dłużej niż 48 godzin. W rezultacie, każdy eksperyment wymaga świeżej transfekcji na 6 godzin przed eksperymentem. Liczba komórek dla jednej elektroporacji spełnia jedynie minimalne wymagania dla wszelkich testów biochemicznych. Do celów powtarzalnego stosowania lub dużej ilości zdecydowanie zaleca się utworzenie niezróżnicowanej linii komórkowej HL60, która stabilnie wyraża białko będące przedmiotem zainteresowania, które zostało oznaczone białkiem fluorescencyjnym przez wektor wirusowy, jeśli wektor wirusowy jest dostępny lub można go skonstruować.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnego interesu finansowego w odniesieniu do tej pracy.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez fundusz wewnętrzny NIAID, NIH.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640 Medium GlutaMAXLife technologies61870-036
Pirogronian soduThermo Fisher Scietific11360-070
Płodowa surowica bydlęcaGemini Bio-Products100-106
1 M sterylny roztwór HEPES, pH 7,3Quality Biological Inc.A611-J848-06
Penicylinowy roztwór streptomycynyFisher Scientific15140122
NucleofectorTM 2bLonzaAAB-1001
AmaxaTM Linia komórkowa NucleofectorTM zestaw V z roztworem NucleofectorTM, pipety jednorazowe, aluminium z certyfikatem AmaxaTM 100 ml aluminium kuwety elektrodoweLonzaVCA-1003
Lab-Tek komorowe #1.0 Borokrzemianowe szkło nakrywkoweNalge Nunc International Inc155383
2% roztwór żelatynySigma-AldrichG1393
FibronectinSigma-AldrichF1141
HBSS (Hanks' Zrównoważony roztwór soli)Life technologies14025-076
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA3803
Jednodołkowe komory szklane Lab-Tek IINalge Nunc International Inc155361
Czterodołkowe komory szklane Lab-Tek IINalge Nunc International Inc155383
Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-10438
fMLPSigma -AldrichF3506-5MG
Grubość szkła osłonowego (2) 22 mm x 22 mmCorning2855-22
EZ-TAXIScanEffector Cell Institute, Inc.Chip MIC-1001
EZ-TAXIScan (5 mm)Effector Cell Institute, Inc.EZT-F01-5
1701RN 10 μ l strzykawkaHamilton80030
Femtotips II Końcówki iniekcyjneEppendorf5242956003
Femtotips IIEppendorf930000043
TransferMan NK2, w tym moduł silnika, głowica X z regulatorem kąta i pomoce pozycjonujące. Eppendorf5188900056
Oprogramowanie DIASSolltech Inc.
LSM 780 META lub równoważny mikroskop konfokalny z obiektywem 40X 1,3 NA lub 60X 1,4 NA olejowym DIC Plan-NeofluarZeiss
Carl

Bibliografia

  1. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).
  2. Wen, Z., Zheng, J. Q. Directional guidance of nerve growth cones. Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).
  3. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  4. Zigmond, S. H. Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes. The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).
  5. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  6. Dong, X., et al. P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils. Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).
  7. Li, Z., et al. Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42. Cell. 114, 215-227 (2003).
  8. Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).
  9. Xu, X., et al. GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis. Mol Biol Cell. , (2015).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).
  11. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).
  12. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).
  13. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PloS one. 5, e15309(2010).
  14. Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis. Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).
  15. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  16. Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, 164-167 (2004).
  17. Eiseler, T., et al. Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).
  18. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).
  19. Schakowski, F., et al. Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines. Genet Vaccines Ther. 2, 1(2004).
  20. Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Testy chemotaksjireceptory sprzężone z białkiem Gmikroprzepływymigracja komórekbarwnik fluorescencyjnytranslokacja kinazyobrazowanie w czasie rzeczywistymanaliza mobilności komórekwizualizacja gradientu
Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.