Artykuł metodologiczny

Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

DOI:

10.3791/54517

⸱

10 września 2016

 ,  , 
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II, RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy fizjologiczne podejście, które pozwala na identyfikację i dogłębną analizę zdefiniowanej populacji neuronów czuciowych w ostrych wycinkach tkanki koronalnej mysiego narządu lemieszowo-nosowego za pomocą nagrań z całych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U większości ssaków narząd lemieszowo-nosowy (VNO) jest strukturą chemosensoryczną, która wykrywa zarówno hetero-, jak i współgatunkowe sygnały społeczne. Neurony czuciowe lemieszowo-nosowe (VSN) wyrażają specyficzny typ receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) z co najmniej trzech różnych rodzin genów chemoreceptorów, umożliwiając czułe i specyficzne wykrywanie sygnałów chemosensorycznych. Rodziny te obejmują rodziny genów V1r i V2r, a także rodzinę przypuszczalnych genów chemoreceptorów związanych z sekwencją receptora peptydu formylowego (FPR) (Fpr-rs). Aby zrozumieć fizjologię interakcji receptor-ligand lemieszowo-nosowy i sygnalizacji końcowej, konieczne jest zidentyfikowanie właściwości biofizycznych właściwych dla każdej określonej klasy VSN.

Opisane tutaj podejście fizjologiczne pozwala na identyfikację i dogłębną analizę zdefiniowanej populacji neuronów czuciowych za pomocą transgenicznej linii myszy (Fpr-rs3-i-Venus). Stosowanie tego protokołu nie jest jednak ograniczone do tej konkretnej linii, a zatem może być łatwo rozszerzone na inne linie genetycznie zmodyfikowane lub zwierzęta typu dzikiego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość zwierząt polega głównie na swoich zmysłach chemicznych, aby komunikować się z otoczeniem. Zmysł węchu odgrywa zasadniczą rolę w znajdowaniu i ocenie pożywienia, unikaniu drapieżników i lokalizowaniu odpowiednich partnerów do godów. U większości ssaków układ węchowy składa się z co najmniej czterech anatomicznie i funkcjonalnie odrębnych podsystemów obwodowych: głównego nabłonka węchowego1,2, zwoju Grueneberga3,4, narządu przegrody Masera5,6 i narządu lemieszowo-nosowego. VNO obejmuje obwodową strukturę czuciową dodatkowego układu węchowego (AOS), która odgrywa główną rolę w wykrywaniu sygnałów chemicznych, które przekazują informacje o tożsamości, płci, randze społecznej i stanie seksualnym7-10. VNO znajduje się u podstawy przegrody nosowej, tuż nad podniebieniem. U myszy jest to obustronna rurka z ślepym zakończeniem zamknięta w chrzęstnej kapsułce11-13. Narząd składa się zarówno z przyśrodkowego nabłonka czuciowego w kształcie półksiężyca, w którym znajdują się VSN, jak i z części nieczuciowej po stronie bocznej. Pomiędzy obydwoma nabłonkami znajduje się wypełnione śluzem światło, które jest połączone z jamą nosową przez wąski przewód lemieszowo-nosowy14. Duże boczne naczynie krwionośne w tkance nieczuciowej zapewnia mechanizm pompowania naczyniowego, aby ułatwić wnikanie stosunkowo dużych, przeważnie nielotnych cząsteczek, takich jak peptydy lub małe białka, do światła VNO przez podciśnienie15,16. Elementy strukturalne VNO są obecne przy urodzeniu, a narząd osiąga dorosłe rozmiary na krótko przed dojrzewaniem17. Jednak to, czy AOS gryzoni jest już funkcjonalny u młodych osobników, jest nadal przedmiotem dyskusji18-20.

VSN różnią się zarówno lokalizacją nabłonka, jak i typem receptora, który wyrażają. VSN wykazują dwubiegunową morfologię z niezmielinizowanym aksonem i pojedynczym dendrytem wierzchołkowym, który wystaje w kierunku światła i kończy się guzkiem dendrytycznym z mikrokosmkami. Aksony VSN fascykulują się, tworząc nerw lemieszowo-nosowy, który opuszcza torebkę chrzęstną na końcu grzbietowo-ogonowym, wznosi się wzdłuż przegrody, przechodzi przez płytkę grzebienianą i wystaje do dodatkowej opuszki węchowej (AOB)21,22. Nabłonek czuciowy lemieszowo-nosowy składa się z dwóch warstw: warstwa wierzchołkowa znajduje się bliżej strony światła i zawiera zarówno V1R, jak i wszystkie oprócz jednego typu neuronów eksprymujących FPR-rs. Neurony te wykazują koekspresję białka G α-podjednostki Gαi2 i rzutują do przedniej części AOB23-25. Neurony czuciowe znajdujące się w bardziej podstawowej warstwie wyrażają V2R lub FPR-rs1 wraz z Gαo i wysyłają swoje aksony do tylnego obszaru AOB26-28.

Neurony lemieszowo-nosowe są prawdopodobnie aktywowane przez raczej małe semiochemikalia29-33 (V1R) lub związki białkowe34-38 (V2R), które są wydzielane do różnych płynów ustrojowych, takich jak mocz, ślina i płyn łzowy37,39-41. Eksperymenty in situ wykazały, że VSN są również aktywowane przez sformylowane peptydy i różne związki przeciwbakteryjne/związane ze stanem zapalnym25,42. Co więcej, heterologicznie eksprymowane białka FPR-rs dzielą widma agonistyczne z FPR ulegającymi ekspresji w układzie odpornościowym, co wskazuje na potencjalną rolę jako detektorów chorób u przedstawicieli tego samego gatunku lub zepsutych źródeł żywności25 (patrz odniesienie43).

Fundamentalne dla zrozumienia relacji receptor-ligand i kaskad sygnałowych w określonych populacjach VSN jest szczegółowa ocena ich podstawowych cech biofizycznych w rodzimym środowisku. W przeszłości analiza sygnalizacji komórkowej przyniosła ogromne korzyści ze zwierząt modyfikowanych genetycznie, które oznaczają określoną populację neuronów poprzez koekspresję białka markera fluorescencyjnego30,44-49. W tym protokole stosuje się transgeniczną linię myszy, która wyraża FPR-rs3 wraz z markerem fluorescencyjnym (Fpr-rs3-i-Venus). Podejście to ilustruje, w jaki sposób można wykorzystać taki genetycznie zmodyfikowany szczep myszy do przeprowadzenia analizy elektrofizjologicznej optycznie identyfikowalnej populacji komórek przy użyciu nagrań z pojedynczym neuronem w ostrych koronalnych wycinkach tkanki VNO. Napędzany ciśnieniem powietrza wielolufowy system perfuzyjny dla bodźców czuciowych i środków farmakologicznych umożliwia szybką, odwracalną i ogniskową stymulację neuronów lub hamowanie podczas nagrań. Zapisy całych komórek w preparatach warstwowych pozwalają na szczegółową analizę właściwości wewnętrznych, przewodności aktywowanych napięciem, a także wzorców wyładowań potencjału czynnościowego w natywnym środowisku ogniwa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z lokalnymi i europejskimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych (Dyrektywa 86/609/EWG) oraz z zaleceniami Federacji Europejskich Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA). Zarówno myszy C57BL/6, jak i myszy Fpr-rs3-i-Venus trzymano w grupach obu płci w temperaturze pokojowej w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum. Do eksperymentów wykorzystano młodych dorosłych (6-20 tygodni) obu płci. Nie zaobserwowano oczywistych różnic zależnych od płci.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy S1: 4-(2-hydroksy-etylo)piperazyno-1-etanosulfonowy roztwór (HEPES) buforowany roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający (w mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (skorygowane NaOH); osmolarność = 300 mOsm (skorygowana glukozą).
  2. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy S2: Natleniony karbogenem (95% O2, 5% CO2 ) roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający (w mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3,5 KCl, 1 CaCl2, 1MgSO4, 5 BES; pH = 7,3; osmolarność = 300 mOsm (skorygowana glukozą).
  3. Przygotować 4% roztwór agarozy o niskiej temperaturze żelowania (S3) do zatapiania w tkankach: 4% agaroza o niskiej temperaturze żelowania. Rozpuścić 2 g agarozy o niskiej żelacji w 50 ml S1 w szklanej butelce laboratoryjnej o pojemności 100 ml razem z mieszadłem magnetycznym. Aby stopić agarozę, należy umieścić butelkę w łaźni wodnej (z nieszczelnie zamkniętą pokrywką) w temperaturze 70 °C na około 20 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się przezroczysty, mieszając. Ostudzić i przechowywać rozpuszczoną agarozę w drugiej łaźni wodnej w temperaturze 42 °C do czasu dalszego użycia.
  4. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy S4: Roztwór pipetowany zawierający (w mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (wolny Ca2+ = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP; pH = 7,1 (skorygowany KOH); osmolarność = 290 mOsm.
  5. Modyfikować/dostosowywać skład S1, S2 i S4 zgodnie z indywidualnym planem doświadczalnym (np. blokery farmakologiczne w celu wyizolowania niektórych rodzajów prądów aktywowanych napięciem).

2. Przygotowanie miejsca pracy

  1. Napełnij komorę do przechowywania plastrów natleniających S2 co najmniej 30 minut przed rozbieraniem, umieść na lodzie w celu dostosowania temperatury i pH i stale natleniaj roztwór.
  2. Napełnij zbiornik do superfuzji plastrowej w konfiguracji nagrywania za pomocą S2 i natleniaj w sposób ciągły.
  3. Przed preparacją napełnij komorę wibratomu S2 i ułóż pokruszony lód wokół komory. Alternatywnie, przenieś zapasowy lodowaty roztwór natleniony z komory natleniającej do komory wibratomu i kontynuuj ciągłe natlenianie.
  4. Ułóż narzędzia chirurgiczne i materiały eksploatacyjne.
  5. Umieść okład z żelem lodowym pod mikroskopem preparacyjnym, przykryj ręcznikiem papierowym, aby zapobiec zamarzaniu tkanki VNO na dnie naczynia.
  6. Wyczyść żyletkę, krótko spłukując ją w 70% etanolu i wodzie destylowanej, a następnie zamontuj na wibratomie. Wymień przy każdej sesji krojenia.

3. Sekcja i osadzanie VNO

  1. Uśmierc zwierzę przez krótką ekspozycję na CO2 i odetnij głowę ostrymi nożyczkami chirurgicznymi. Uwaga: Ponieważ czas od złożenia zwierzęcia w ofierze do umieszczenia kapsuły VNO na lodzie jest krytyczny, należy zminimalizować czas do mniej niż 2 minut. Aby utrzymać żywotność tkanek, należy zanurzyć oba w pełni wypreparowane VNO w agarozie w czasie krótszym niż 30 minut.
  2. Usuń dolną szczękę dużymi nożyczkami chirurgicznymi. Wejdź przez jamę ustną i przetnij osobno kości żuchwy i mięśnie z każdej strony.
  3. Pozostałą część głowy umieść do góry nogami na dużej szalce Petriego.
  4. Odciągnij skórę górnej szczęki i wokół czubka nosa średnimi kleszczami, aby uzyskać lepszy dostęp do siekaczy.
  5. Użyj nożyczek do kości, aby odciąć największą część siekaczy pod kątem ~45° w kierunku rostralnym (ryc. 1A). Ułatwi to wyjęcie kapsułki VNO z jamy nosowej.
    Uwaga: Nie ciąć do korzenia zęba, aby zapobiec uszkodzeniu końcówki kapsułki VNO.
  6. Chwyć sztywne górne podniebienie za jego rostralną część za pomocą średnich kleszczy i ostrożnie oderwij z powrotem w jednym kawałku pod płaskim kątem (ryc. 1B).
    Uwaga: Kilkakrotnie spłukać lodowatym S2.
  7. Użyj nożyczek z mikrosprężyną, aby przeciąć zespolenie kostne między czubkiem kości lemieszowej a szczęką. Włóż końcówki nożyczek tak, aby zakrzywiona część końcówki była skierowana na zewnątrz od VNO i ostrożnie przeciąć kość małymi krokami zarówno po lewej, jak i prawej stronie po stronie kapsuły VNO.
  8. Aby usunąć kapsułkę VNO, za pomocą mikronożyczek sprężynowych przeciąć kość lemieszową w części ogonowej i ostrożnie wyjąć kość lemieszową z jamy nosowej za pomocą średnich kleszczy. Natychmiast przenieś VNO na małą szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym na opakowaniu z żelu lodowego, gdzie zostaną wykonane pozostałe etapy sekcji.
  9. Opłucz VNO w niewielkiej ilości lodowatego S2, aby zapobiec wyschnięciu chusteczki.
  10. Oddziel chrzęstne kapsułki, które zawierają tkanki miękkie VNO, chwytając tylną część kości lemieszowej średnimi kleszczami. Ustaw kapsułę tak, aby uzyskać widok grzbietowy, tak aby widoczna była przerwa między oboma VNO (Rysunek 1Di).
  11. Użyj końcówki cienkich kleszczy, aby oddzielić obie chrzęstne kapsułki VNO od kości środkowej, jednocześnie utrzymując kość lemieszową przygwożdżoną w tylnej części.
    Uwaga: Używaj kleszczyków tylko na brzegu torebki chrzęstnej i bardzo uważaj, aby nie przebić chrząstki, ponieważ delikatny nabłonek czuciowy łatwo ulega uszkodzeniu.
  12. Po rozdzieleniu dwóch VNO zacznij usuwać chrząstkę otaczającą pierwszy VNO.
  13. Chwyć górną krawędź kapsułki jednym cienkim kleszkiem i odłup ścianę chrząstki, która wcześniej była przymocowana do kości lemieszowej (strona przyśrodkowa).
  14. Aby usunąć pozostałą chrząstkę, obróć VNO zakrzywioną boczną stroną do dna naczynia i bezpiecznie przyciśnij chrząstkę z jednej strony za pomocą kleszczy. Ostrożnie przesuń drugie cienkie kleszcze od tyłu pod bardzo płaskim kątem między chrząstką a VNO, aby poluzować połączenie między tkanką a chrząstką.
  15. Powoli odklej VNO od chrząstki, trzymając ją za końcówkę ogonową, aby uniknąć uszkodzenia nabłonka czuciowego.
  16. Po wyjęciu VNO z kapsułki należy usunąć wszystkie pozostałe małe części chrząstki, ponieważ wszelkie pozostałe kawałki chrząstki oderwą tkankę od otaczającej agarozy podczas procesu krojenia.
  17. Umieść małą kroplę lodowatego S2 na pierwszym wypreparowanym VNO, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki. Duże naczynie krwionośne po bocznej stronie stanie się widoczne, co wskazuje, że narząd jest nadal nienaruszony i nie został poważnie uszkodzony podczas sekcji (ryc. 2Aii). W przypadku, gdy naczynie krwionośne zostanie uszkodzone, nadal warto będzie kontynuować krojenie VNO, o ile ogólna morfologia nie została wyraźnie naruszona.
  18. Natychmiast przeanalizuj drugi VNO.
  19. Aby osadzić VNO, należy napełnić obie małe szalki Petriego aż do brzegu stopionym S3 (przechowywanym w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C; patrz 1.3).
  20. Przytrzymaj VNO na szerszym końcu ogonowym za pomocą cienkich kleszczy, aby uniknąć uszkodzenia nabłonka czuciowego.
  21. Zanurz VNO w agarozie i kilkakrotnie przesuń go poziomo do przodu iz powrotem, aby usunąć film roztworu zewnątrzkomórkowego, a także wszelkie pęcherzyki powietrza z jego powierzchni.
  22. Ustaw VNO pionowo z końcówką ogonową skierowaną w stronę dna naczynia. Zamiast ściskać VNO bezpośrednio kleszczami, dostosuj orientację, przesuwając końcówkę kleszczy w bliskiej odległości od VNO.
    Uwaga: Orientacja podczas osadzania jest kluczowa, ponieważ określa płaszczyznę przekroju i dostępność dla neuronów czuciowych podczas eksperymentu.
  23. Umieść naczynia na żelowym woreczku z lodu i poczekaj, aż agaroza stężeje.
    Uwaga: Nie zmieniaj orientacji VNO, gdy agaroza zacznie krzepnąć, ponieważ spowoduje to oderwanie tkanki od otaczającej agarozy.

4. Krojenie tkanek koronalnych VNO

  1. Użyj małej szpatułki, aby usunąć blok agarozy z małego naczynia do pokrywki dużej szalki Petriego, odwróć agarozę do góry nogami, pozostawiając ogonowy koniec VNO skierowany do góry.
  2. Pokrój blok w kształt piramidy za pomocą skalpela chirurgicznego (3-4 mm na końcu, 8-10 mm na dole). Uważaj, aby nie uszkodzić osadzonej tkanki.
  3. Użyj super kleju, aby przymocować blok w kształcie piramidy do środka płytki próbki wibratomu i poczekaj ~ 1 minutę, aż klej całkowicie wyschnie.
  4. Przenieść płytkę z próbką do komory krojenia i odpowiednio przygotować drugi VNO. Przechowywać płytkę z drugą próbką w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  5. Użyj mikrotomu z wibrującymi ostrzami o następujących ustawieniach: grubość: 150-200 μm; prędkość: 3,5 a.u. = 0,15 mm/s; częstotliwość: 7,5 a.u. = 75 Hz. Przenieś plastry do komory natleniającej do czasu użycia po krótkim sprawdzeniu morfologii plastrów pod mikroskopem preparacyjnym. Plastry można przechowywać przez kilka godzin.

5. Jednokomórkowe zapisy elektrofizjologiczne

  1. Do nagrań należy używać pionowego mikroskopu stałopozycyjnego wyposażonego w obiektywy zanurzeniowe w wodzie, Dodt lub kontrast różnicowy w podczerwieni (IR-DIC) i epi-fluorescencję, a także chłodzoną kamerę CCD. Do akwizycji danych należy użyć wzmacniacza patch-clamp, stopnia głównego, karty interfejsu AD/DA i komputera PC (w tym oprogramowania do nagrywania).
  2. Przygotuj zapas 10-20 pipet z wsadkami (4-7 MΩ). Wyciągnąć pipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego (1,50 mm OD/0,86 mm ID) za pomocą ściągacza do mikropipet i wypolerować ogniowo za pomocą microforge.
    Uwaga: Polerowanie ogniowe końcówek pipet ma kluczowe znaczenie podczas łatania raczej małych VSN. Pomoże to zapobiec pękaniu błony komórkowej podczas stosowania podciśnienia w celu uzyskania uszczelnienia o wysokiej wytrzymałości. Po wypolerowaniu otwór pipety powinien wynosić około 1 μm.
  3. Pipety należy przechowywać w pojemniku do przechowywania pipet, aby zapobiec uszkodzeniom i gromadzeniu się kurzu do czasu użycia.
  4. Przygotuj system perfuzyjny, napełniając zbiorniki roztworu i rurki zgodnie z projektem eksperymentalnym.
    Uwaga: Całkowicie usuń pęcherzyki powietrza z przewodów, ponieważ będą one silnie zakłócać zapisy elektrofizjologiczne.
  5. Dostosuj ciśnienie, aby osiągnąć przepływ ~3 ml / min.
    Uwaga: Wysokie ciśnienie spowoduje ruch wycinka tkanki, a także zakończenie zapisów elektrofizjologicznych.
  6. Przenieś plasterek VNO do komory obrazowania i ustal pozycję plastra za pomocą kotwy ze stali nierdzewnej okablowanej włóknami syntetycznymi o grubości 0,1 mm (Rysunek 2B-C).
    Uwaga: Nie przykrywaj plastra tkanki jedną z nici z włókien syntetycznych, ale raczej agarozą otaczającą plasterek.
  7. Przenieś komorę obrazowania do zestawu rejestrującego i w sposób ciągły przetapiaj plaster z natlenionym S2 w temperaturze pokojowej za pomocą aplikacji kąpielowej.
  8. Dopasuj kapilę ssącą do powierzchni roztworu, aby uzyskać powolne ssanie w celu ciągłej wymiany roztworu kąpieli. Wyreguluj wielolufowy "ołówek perfuzyjny" 8 w 1 powyżej i blisko nieczuciowej części wycinka VNO, który zawiera naczynie krwionośne (Rysunek 2C, 3A)50. Korzystne będzie ustawienie ołówka perfuzyjnego i pipety rejestrującej tak, aby były skierowane w stronę plasterka z przeciwnych kierunków.
  9. Połączyć elektrodę referencyjną i roztwór do kąpieli za pomocą mostka agarowego w kształcie litery L (wypełnionego 150 mM KCl).
  10. Napełnij pipetę z plastrem roztworem pipety S4.
  11. Zamontuj pipetę na elektrodzie krosowej pokrytej chlorkiem srebra podłączonej do stopnia głowicy bez zeskrobywania powłoki i mocno zamocuj.
  12. Przed wejściem do kąpieli należy zastosować lekkie nadciśnienie (około 1 ml na plastikowej strzykawce o pojemności 10 ml) w pipecie z plastrem.
  13. Opuść pipetę do kąpieli za pomocą mikromanipulatorów na tyle daleko, aby móc zanurzyć obiektyw bez uderzania w niego (Rysunek 2D).
  14. Monitorowanie rezystancji pipet (R, w zakresie 4-7 MΩ) za pomocą oprogramowania do elektrofizjologii podłączonego do stopnia głowicy.
    Uwaga: Jeśli R wynosi <4 MΩ, szklana końcówka jest pęknięta. Jeśli R wynosi >10 MΩ, końcówka jest najprawdopodobniej zatkana i pipetę należy wymienić.
  15. Wizualizuj wycinek VNO za pomocą kamery CCD, wykorzystując zoptymalizowany pod kątem podczerwieni różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) i zidentyfikuj komórki eksprymujące FPR-rs3-i-Venus (lub podobnie oznakowane neurony) za pomocą oświetlenia fluorescencyjnego i odpowiedniej kostki filtrującej.
  16. Skoncentruj się i celuj w ogniwa fluorescencyjne lub niefluorescencyjne w zależności od projektu eksperymentalnego.
  17. Aby zbliżyć się do korpusu komórki, użyj pokręteł ręcznych, aby uzyskać maksymalną czułość. Ze względu na nadciśnienie niewielkie wgniecenie w błonie soma komórkowej staje się widoczne, gdy końcówka pipety znajdzie się w bliskiej odległości.
  18. Zwolnij nadciśnienie i zastosuj lekkie podciśnienie, aby zassać błonę komórkową w celu uzyskania uszczelnienia o wysokiej rezystancji (1-20 GΩ). Zastosuj krótkie i delikatne ssanie, aby przerwać błonę komórkową i ustalić konfigurację całej komórki.
  19. Stale monitoruj opór dostępu podczas eksperymentu.
    Uwaga: Do analizy należy uwzględnić tylko neurony wykazujące mały i stabilny opór dostępu (≤3%danych wejściowych R; zmiana <20% w trakcie eksperymentu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać wgląd w biofizyczne i fizjologiczne właściwości zdefiniowanych populacji komórek, wykonujemy ostre wycinki tkanki koronalnej myszy VNO (Rysunek 1-2). Po rozbiorzeniu plastry można przechowywać w lodowato natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym (S2) przez kilka godzin. W konfiguracji zapisu ciągła wymiana ze świeżym natlenionym roztworem (ryc. 2D) zapewnia żywotność tkanek przez cały czas trwania eksperymentu. Używa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VNO to struktura chemosensoryczna, która wykrywa substancje semiochemiczne. Do tej pory większość receptorów lemieszowo-nosowych pozostaje do desierotyzacji, ponieważ zidentyfikowano tylko kilka par receptor-ligand. Wśród nich V1rb2 został opisany jako specyficznie aktywowany przez męski feromon moczowy 2-heptanon30, V2rp5 aktywowany przez męski feromon specyficzny dla mężczyzn ESP157 , a także V2r1b i V2rf2 aktywowane odpowiednio przez peptydy MHC SYFPEITHI48 i SEIDLILGY58. Wa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Ivanowi Rodriguezowi i Benoit von der Weidowi za stworzenie linii myszy FPR-rs3-i-venus, ich konstruktywną krytykę i owocne dyskusje. Praca ta została sfinansowana z grantów Fundacji Volkswagena (I/83533), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) oraz z Inicjatywy Doskonałości rządu federalnego i krajów związkowych Niemiec. MS jest profesorem Fundacji Volkswagena w Lichtenbergu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
Agaroza (niska temperatura żelowania)PeqLab35-2030
ATP (Mg-ATP)Sigma-AldrichA9187
Kwas bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowy (BES)Sigma-AldrichB9879
Chlorek wapniaSigma-AldrichC1016
Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)Sigma-AldrichE3889
GlukozaSigma-AldrichG8270
GTP (Na-GTP)Kwas Sigma-Aldrich51120
(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)Sigma-AldrichH3375
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266
Chlorek potasuSigma-AldrichP9333
Wodorotlenek potasuSigma-Aldrich03564
Chlorek soduSigma-AldrichS7653
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS8045
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Narzędzia i materiały eksploatacyjne
Duża szalka Petriego, 90 mmDekapitacja VWRsekcja kapsułki VNO
Mała szalka Petriego, 35 mmVNO, szalka do zatopienia w agarozie
Ostre duże nożyczki chirurgiczneFine Science Toolsdekapitacja, usuwanie żuchwy
Mocne nożyczki do kościFine Science Toolssiekacze tnące
Średnie kleszcze, pęseta Dumont #2Narzędzia Fine Science Toolsdo usuwania skóry i podniebienia
Nożyczki mikrosprężynowe, 8,5 cm, zakrzywione, ostrza 7 mm Narzędzia do nauki precyzyjnej, wycinanie VNO 
Dwie pary cienkich kleszczy, pęseta Dumont #5Fine Science Toolspreparowanie VNO z torebki chrzęstnej
Mała szpatułka ze stali nierdzewnejFine Science Toolsobsługująca blok agarozy i plastry tkanek
Skalpeldo cięcia bloku agarozy w kształt piramidy
NazwaCompanyNumer katalogowy<strong>Komentarze
Sprzęt
WzmacniaczHEKA ElektronikEPC-10
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (1,50 mm OD/0,86 mm ID)Science Products
Kamera CCD-LeicaMicrosystemsDFC360FX
Kostka filtracyjna, wzbudzenie: BP 450-490, tłumienie: LP 515Leica MicrosystemsI3
Lampa fluorescencyjnaLeica MicrosystemsEL6000
Mieszadło magnetyczne z płytą grzejnąSnijders34532
Microforge NarishigeMF-830
 Luigs & Ściągacz doSM-5
, pionowy dwustopniowyNarishigePC-10 
MikroskopLeica MicrosystemsCSM DM 6000 SP5
Eliminator szumów 50/60 Hz (HumBug)Quest Cel naukowy
 Oscyloskop Leica MicrosystemsHCX APO L20x/1.00 W
TektronikTDS 1001B
Osmometr GonotecOsmomat 030
System perfuzyjny 8-w-1AutoMate pięć
w obsłudze Słoik do przechowywania pipet
Luigs & Mini komora
ŻyletkiWilkinson Sword GmbHWilkinson Sword Classic
Komora do przechowywania plastrów dotleniających; alternatywnymi komorami komercyjnymi są: np. , BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) lub komora wstępna (BSC-PC; Warner Instruments)wykonany
mikroskop stereoskopowyLeica MicrosystemsS4E
Interfejs spustu Wibratom HEKA ElektronikTIB-14 S
 Leica MicrosystemsVT 1000 S
 MemmertWNB 45
, pokrywka VWR do sekcji chirurgiczny Mikromanipulator mikropipet Neumann Naukowy pH-metr łatwych Mettler Toledo World Precision Instruments e212 Komora nagrywająca Neumann Slicena zamówienieKąpiel wodna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  3. Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
  4. Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
  5. Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
  6. Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
  7. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  8. Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
  9. Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
  10. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  11. Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
  12. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
  13. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
  14. Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
  15. Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
  16. Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
  17. Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
  18. Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
  19. Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
  20. Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
  21. Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
  22. Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
  23. Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
  24. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
  25. Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
  26. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  27. Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
  28. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  29. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
  30. Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
  31. Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
  32. Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
  33. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  34. Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
  35. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  36. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
  37. Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
  38. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  39. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
  40. Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
  41. Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
  42. Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
  43. Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
  44. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  45. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  46. Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  47. Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
  48. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
  49. Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
  50. Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
  51. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  52. Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
  53. Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
  54. Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
  55. Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
  56. Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
  57. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  58. Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
  59. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Vomeronasal OrganAcute Tissue SlicesSingle Cell ElectrophysiologyVomeronasal Sensory NeuronsFpr rs3 i Venus MicePatch Clamp RecordingTissue DissectionVibratome SectioningFluorescence ImagingChemosensory Detection

Powiązane artykuły