Pokazujemy, jak przygotować ukośne wycinki rdzenia kręgowego u młodych myszy. Preparat ten pozwala na stymulację korzeni brzusznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zapisy elektrofizjologiczne z wycinków rdzenia kręgowego okazały się cenną techniką do badania szerokiego zakresu pytań, od właściwości komórkowych po sieciowe. Pokazujemy, jak przygotować żywotne skośne plastry rdzenia kręgowego młodych myszy (P2 - P11). W tym przygotowaniu motoneurony zachowują swoje aksony wychodzące z brzuszne korzenie rdzenia kręgowego. Stymulacja tych aksonów wyzwala wstecznie propagujące potencjały czynnościowe atakujące somy neuronów ruchowych i pobudzające zabezpieczenia neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym. Rejestracja antydromicznych potencjałów czynnościowych jest natychmiastowym, ostatecznym i eleganckim sposobem scharakteryzowania tożsamości neuronu ruchowego, który przewyższa inne metody identyfikacji. Co więcej, stymulacja zabezpieczeń motoneuronów jest prostym i niezawodnym sposobem na pobudzenie celów pobocznych neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym, takich jak inne neurony ruchowe lub komórki Renshawa. W protokole tym przedstawiono zapisy antydromiczne z somy motoneuronów oraz pobudzenie komórek Renshawa, wynikające ze stymulacji korzeni brzusznych.
Wprowadzenie
Historycznie, zapisy motoneuronów za pomocą ostrej elektrody były przeprowadzane in vivo na dużych zwierzętach, takich jakkoty czy szczury1 lub na izolowanym całym rdzeniu kręgowym u myszy2. Pojawienie się techniki nagrywania patch-clamp w latach 80. wymagało bezpośredniego dostępu do somy neuronów ruchowych, ponieważ uszczelnienie musiało być osiągnięte pod nadzorem wizualnym. W związku z tym przygotowanie plastra rdzenia kręgowego jest łatwo osiągane od wczesnych lat 90.3. Jednak wczesne przygotowanie plastrów często nie pozwalało na stymulację korzeni brzusznych. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, tylko dwa badania wykazały ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z dyrektywami europejskimi (86/609/CEE i 2010-63-UE) oraz francuskim ustawodawstwem, a protokół został zatwierdzony przez komisję etyczną Uniwersytetu Paryż Descartes.
1. Przygotowanie skrawków rdzenia kręgowego
- Przygotować następujące roztwory codziennie lub z jednodniowym wyprzedzeniem. W przypadku przechowywania przez noc napowietrzyć mieszaniną 95% O2 i 5% CO2 oraz przechowywać w lodówce w szczelnie zamkniętych butelkach.
- Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) o niskiej zawartości Na+: 3 mM KCl, 1 mM NaH....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Potwierdzenie tożsamości motoneuronów za pomocą antidromicznych potencjałów czynnościowych
Targetowanie komórkowe
Motoneurony znajdują się w rogu przednim (widoczne na czerwono na Rysunku 2C). Należy rozpocząć od pęczka aksonów tworzących korzeń przedni i przesuwać się w górę, aż do pełnego rozproszenia pęczka i pojawien.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ukośne cięcie rdzenia kręgowego jest ważne, ponieważ pozwala na jednostronną stymulację puli neuronów ruchowych i komórek Renshawa w pojedynczym segmencie kręgu w niezawodny, kompleksowy i specyficzny sposób. Co więcej, pozwala na szybką, elegancką i jednoznaczną identyfikację zarejestrowanych neuronów ruchowych. Następnie podkreślimy zalety tej techniki w porównaniu z innymi metodami przygotowania plastrów, a następnie podkreślimy najczęstsze pułapki, których należy unikać podczas wykonywania tej procedury.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Marinowi Manuelowi i Olivii Goldman-Szwajkajzer za pomoc w zrobieniu zdjęć. Autorzy dziękują również Arjunowi Masukarowi i Tobiasowi Bockowi za korektę rękopisu. Wsparcie finansowe zostało udzielone przez Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-01), NIH-NINDS (R01NS077863), Fundację Thierry'ego Latrana (projekt OHEX), francuskie stowarzyszenie na rzecz miopatii (numer grantu 16026) i Target ALS są z wdzięcznością. Felix Leroy otrzymał tytuł doktora nauk humanistycznych w Ecole Normale Supérieure w Cachan.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Na-kynurenian | ABCAM | ab120256 | rozpuszcza się lepiej niż inne marki |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sacharoza | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Jakość Biologiczna | 351-033-721 | |
| glukoza | Sigma | G5767 | |
| kwas askorbinowy | Sigma | A5960 | |
| z pirogronianem | Sigma | P2250 | |
| K-glukonian | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| Kwas glukonowy | Sigma | G1951 | |
| Roztwór wodorotlenku cezu | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Nożyczki sprężynowe Vannas - 2.5mm | FST | 15000-08 | używany wyłącznie do cięcia opony twardej, może ulec uszkodzeniu w przypadku cięcia kości |
| Stymulator | Systemy AM | Izolowany stymulator impulsów Model 2100 | |
| Vibratome | Campden Wibracyjny mikrotom 7000 - Model 7000smz-2 |
Bibliografia
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
