Artykuł metodologiczny

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

DOI:

10.3791/54528

⸱

1 października 2016

 , 
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) jest gatunkiem szkodnika o niezwykle dużym znaczeniu dla rolnictwa. Wynika to z jego zachowań reprodukcyjnych: samice uszkadzają zewnętrzną powierzchnię owoców i warzyw, gdy składają jaja, a wyklute larwy żywią się ich miazgą. Dzikie populacje C. capitata są tradycyjnie kontrolowane za pomocą oprysków insektycydami i/lub podejść przyjaznych dla środowiska, z których najbardziej skuteczna jest technika sterylnych owadów (SIT). SIT opiera się na masowym chowu, sterylizacji opartej na promieniowaniu i wypuszczaniu w terenie samców, które zachowują zdolność do łączenia się w pary, ale nie są w stanie wydać płodnego potomstwa. Pojawienie się i następujący po nim szybki rozwój narzędzi biotechnologicznych, wraz z dostępnością sekwencji genomu muchówki, znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat biologii tego gatunku. Sprzyjało to rozprzestrzenianiu się nowych strategii manipulacji genomem, które można zastosować do kontroli populacji.

W tym kontekście, mikroiniekcja zarodków odgrywa podwójną rolę w rozszerzaniu zestawu narzędzi do zwalczania muchówek. Zdolność do ingerowania w funkcję genów, które regulują kluczowe procesy biologiczne, rzeczywiście poszerza naszą wiedzę na temat molekularnej maszynerii leżącej u podstaw inwazyjności muchówek. Co więcej, zdolność do transformacji linii zarodkowej ułatwia produkcję wielu szczepów transgenicznych, które mogą być testowane pod kątem przyszłych zastosowań terenowych w nowatorskich warunkach SIT. Rzeczywiście, manipulacja genetyczna może być wykorzystana do nadania pożądanych cech, które mogą być na przykład wykorzystane do monitorowania bezpłodnej męskiej wydajności w terenie lub które mogą skutkować śmiertelnością we wczesnym etapie życia. Tutaj opisujemy metodę mikrowstrzykiwania kwasów nukleinowych do zarodków muchówek, aby osiągnąć te dwa główne cele.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata to kosmopolityczny gatunek, który niszczy owoce i rośliny uprawne. Należy do rodziny Tephritidae, która obejmuje kilka gatunków szkodników, takich jak te należące do rodzajów Bactrocera i Anastrepha. Muchówka jest najlepiej przebadanym gatunkiem z tej rodziny i stała się modelem nie tylko do badania inwazji owadów1, ale także do optymalizacji strategii zwalczania szkodników2.

Muchówka to gatunek wielowoltowy, który może zaatakować ponad 300 gatunków dzikich i uprawianych roślin3,4. Uszkodzenia są powodowane zarówno przez dorosłe osobniki, jak i stadia larwalne: kryte samice przebijają powierzchnię owocu w celu złożenia jaj, pozwalając mikroorganizmom wpłynąć na ich jakość handlową, podczas gdy larwy żywią się miazgą owocową. Po trzech stadiach larwalnych larwy wyłaniają się z żywiciela i przepoczwarzają się do gleby. Ceratitis capitata występuje prawie na całym świecie, w tym w Afryce, na Bliskim Wschodzie, w Australii Zachodniej, Ameryce Środkowej i Południowej, Europie i obszarach Stanów Zjednoczonych5.

Najczęstsze strategie ograniczania inwazji muchówek obejmują stosowanie insektycydów (np. Malation, Spinosad) oraz przyjaznej dla środowiska Techniki Sterylnych Owadów (SIT)6. To ostatnie podejście polega na wypuszczeniu na wolność setek tysięcy samców, które stają się bezpłodne w wyniku narażenia na promieniowanie jonizujące. Krzyżowanie tak wysterylizowanych samców z dzikimi samicami skutkuje brakiem potomstwa, co powoduje zmniejszenie wielkości populacji, ostatecznie prowadząc do wytępienia. Chociaż SIT okazał się skuteczny w wielu kampaniach na całym świecie, jego główne wady obejmują wysokie koszty hodowli i sterylizacji milionów owadów, które mają zostać wypuszczone. Znakowanie wypuszczonych osobników jest niezbędne do odróżnienia owadów sterylnych od dzikich schwytanych w terenie podczas działań monitoringowych i obecnie odbywa się to za pomocą proszków fluorescencyjnych. Procedury te są kosztowne i mają niepożądane skutki uboczne7.

W celu optymalizacji i/lub opracowania bardziej efektywnych metod zwalczania tego szkodnika, biologia i genetyka medfly były szeroko badane przez wielu badaczy na całym świecie. Dostępność sekwencjigenomu muchówki 8,9 ułatwi prowadzenie nowatorskich badań nad funkcjami genów. Interferencja RNA jest potężnym narzędziem do takich badań i można ją osiągnąć poprzez mikroiniekcję dsRNA (dwuniciowego RNA) lub siRNA (małego interferującego RNA). Technika ta została wykorzystana na przykład do wykazania, że kaskada molekularna determinacji płci u C. capitata jest tylko częściowo zachowana w stosunku do kaskady Drosophila10.

Opracowanie protokołów mikroiniekcji zarodków muchówek pozwoliło C. capitata stać się pierwszym genetycznie zmodyfikowanym gatunkiem muchy nienależącym do Drosophilid. Ponieważ jego jaja są podobne do jaj Drosophila, zarówno pod względem morfologii, jak i odporności na wysuszenie11, protokół dostarczania plazmidowego DNA do zarodków sprzed blastodermy, opracowany po raz pierwszy dla D. melanogaster12,13, został początkowo przystosowany do stosowania u C. capitata. Te pierwsze eksperymenty pozwoliły na transformację linii zarodkowej muchówki w oparciu o element transpozycyjny Minos11. Następnie, pierwotny system został zmodyfikowany14 przy użyciu innych podejść opartych na transpozonach. Tak jest w przypadku piggyBac z Lepidoptera Trichoplusia ni15. Od tego czasu protokół został jeszcze bardziej zoptymalizowany, co pozwoliło na transformację innych gatunków tefrytów16-21, a także wielu innych muchówek22-31. Wszystkie te systemy opierają się na wykorzystaniu typowego binarnego systemu transformacji wektora/plazmidu pomocniczego: sztuczne, wadliwe transpozony zawierające pożądane geny są łączone w plazmidowe DNA i integrowane z genomem owada poprzez dostarczanie enzymu transpozazy32. Wygenerowano szereg transgenicznych linii muchówek, z wieloma cechami, w tym szczepami przenoszącymi warunkowo dominujący gen letalny, który indukuje śmiertelność, szczepami produkującymi potomstwo wyłącznie męskie, a zatem niewymagającymi dodatkowych strategii określania płci oraz szczepami z fluorescencyjnymi plemnikami, co może zwiększyć dokładność fazy monitorowania SIT33-37. Chociaż uwolnienie organizmów transgenicznych w środowisku naturalnym miało miejsce w testach pilotażowych przeciwko komarom tylko38,39, co najmniej jedna firma ocenia pewną liczbę transgenicznych szczepów muchówek pod kątem ich zastosowania w terenie40.

Mikroiniekcja zarodków może również sprzyjać rozwojowi nowych narzędzi do edycji genomu, takich jak nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALENs), zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) / nukleaza 9 białka związanego z CRISPR (Cas9) i geny endonukleaz naprowadzających (HEG), które umożliwią nowatorskie badania ewolucyjne i rozwojowe, a także poszerzą dostępny zestaw narzędzi biotechnologicznych. Metody edycji genomu pozwoliły już na wygenerowanie systemów napędu genowego u komarów41, a ich transfer do muchówki jest nieuchronny. Tutaj opisujemy uniwersalny protokół mikroiniekcji kwasów nukleinowych w zarodkach muchówek, który może być przydatny we wszystkich wyżej wymienionych zastosowaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Wymagania owadowe
    1. Utrzymuj wszystkie etapy życia C. capitata w temperaturze 25 °C, wilgotności 65% i 12/12 godzin światła/ciemności fotoperiodu.
    2. Umieść około 1,500-2,000 poczwarek medfly w klatce o pojemności 6 litrów. Użyj klatki z mosiężną siatką z jednej strony z otworami wystarczająco małymi, aby stymulować składanie jaj42. Włóż pasek gąbki przez mały otwór w podstawie klatki, aby zapewnić muchom wodę za pomocą działania kapilarnego. Użyj mieszanki drożdży i cukru (1:10) jako źródła pożywienia dla dorosłych (ryc. 1A). Zwiększ ilość drożdży (do 1:3, drożdże:cukier), jeśli samice nie złożą jaj.
    3. Umieść talerz wypełniony wodą pod klatką, aby zebrać jaja złożone przez siatkę. Ponieważ dziewicze samice mogą składać jaja, poczekaj, aż muchy osiągną wiek co najmniej 6-7 dni, zanim zbierzesz jaja do eksperymentów z mikroiniekcją. Zapewni to, że samice zostaną sparowane, a jaja zostaną zapłodnione.
    4. Zbierz jajka, filtrując wodę za pomocą drobnego sitka siatkowego. Przenieść jaja z sitka do plastikowego pojemnika zawierającego standardowy pokarm dla larw (1,5 l H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g środka przeciwdrobnoustrojowego o szerokim spektrum działania rozpuszczonego w 50 ml etanolu, 400 g cukru, 175 g demineralizowanych drożdży piwnych, 1 kg miękkich otrębów pszennych) za pomocą pipety Pasteura.
    5. Umieść każde pudełko w przezroczystym pojemniku zamkniętym siatkową pokrywką, aby umożliwić cyrkulację powietrza i zawierającym warstwę otrębów sprzyjających przepoczwarzeniu (Rysunek 1B).
    6. Po około 10 dniach sprawdź, czy nie ma larw w 3. stadium rozwojowym, które wyłaniają się z pokarmu dla larw i zeskakują do warstwy otrębów w celu przepoczwarzenia.
    7. 24 godziny później zbierz poczwarki do małego kubka za pomocą miękkiej szczoteczki i przenieś je do nowej klatki dla dorosłych. Dorosłe osobniki pojawiają się zwykle 10 dni po przepoczwarzeniu. Wyłaniająca się mucha wykorzystuje ptilinum, nadmuchiwaną kieszeń umieszczoną na głowie nad podstawą czułków, aby wypchnąć koniec poczwarki. Po wynurzeniu ptilinum trwale zapada się z powrotem w głowie.
  2. Przygotowanie 1 l pokarmu dla larw z mikroiniekcją
    1. Rozpuścić 2,5 g agaru w 300 ml H2O.
    2. Podgrzej 500 ml H2O na gorącej płycie mieszającej i rozpuść 4 g benzoesanu sodu, 4,5 ml 37% HCl, 42 g ekstraktu drożdżowego i 115 g suszonej marchwi w proszku
      3. .
    3. Dodać do mieszaniny roztwór 2,86 g środka przeciwdrobnoustrojowego o szerokim spektrum działania, rozpuszczony w 10 ml absolutnego alkoholu etylowego.
    4. Rozprowadź podłoże na okrągłych szalkach Petriego o średnicy 15 cm i pozostaw do ostygnięcia. W razie potrzeby przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotowanie preparatów
    1. Umieść 2 cm pasek taśmy dwustronnej na szkiełku mikroskopowym (75 x 26mm2) i zaznacz krawędzie markerem porcelanym, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się oleju i w konsekwencji wysuszeniu wstrzykniętych zarodków.
  4. Przygotowanie kwasów nukleinowych
    1. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą dostępnych na rynku zestawów34. Wytrącić plazmid za pomocą etanolu i ponownie zawiesić w buforze do wstrzykiwań (0,1 mM buforu fosforanowego, pH 7,4, 5 mM KCl) w żądanym stężeniu.
    2. Oczyść zsyntetyzowane in vitro długie dsRNA za pomocą fenolu-chloroformu, wytrącić za pomocą izopropanolu i ponownie zawiesić w buforze iniekcyjnym43.

2. Przygotowanie zarodków

  1. Umieść tacę wypełnioną wodą pod klatką zawierającą 6-7 dniowe dorosłe osoby.
  2. Pozwól samicom złożyć jaja przez 30 minut, a następnie zbierz zarodki, filtrując wodę za pomocą drobnego sitka. Zawsze przechowuj sitko w wodzie, aby uniknąć wysuszenia zarodków.
  3. Usuń zarodki, przetaczając sitko przez 5 sekund w komercyjnym 50% roztworze wybielacza.
  4. Dokładnie umyj zarodki, kilkakrotnie zanurzając sitko w czystej, ultraczystej wodzie (co najmniej 4-5 razy). Na koniec umieść sitko w czystej, ultraczystej wodzie. Zarodki należy zużyć maksymalnie w ciągu 2 godzin.
    UWAGA: Czas mikroiniekcji jest związany z koniecznością wstrzyknięcia do zarodków przed blastodermą, w fazie podziałów jądrowych przed komórkowaniem. Pozwala to na wchłonięcie wstrzykniętego DNA do jąder, a konkretnie do pierwotnych jąder komórek rozrodczych, z których wywodzą się gamety. U Drosophila celularyzacja w komórkach biegunowych rozpoczyna się po około 90 minutach od zapłodnienia (w temperaturze 25 °C), przy czym tworzenie blastodermy następuje około 30 minut później44, podczas gdy u muchówki komórkowanie następuje między 9 a 12 godziną45,46.
  5. Orientacja zarodka w rzędach
    1. Za pomocą cienkiego pędzla zbierz około 50 zarodków i umieść je na krążku z czarnej bibuły filtracyjnej nasączonej wodą.
    2. Pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym ułóż zarodki w rzędzie na górnej powierzchni dwustronnej taśmy na szkiełku mikroskopowym za pomocą cienkiego pędzla (000) (Rysunek 1C).
      UWAGA: Ustaw wszystkie zarodki w tej samej orientacji, ponieważ wstrzyknięcie jest wykonywane w tylnym biegunie, skąd będzie pochodziła linia zarodkowa; Tylny biegun znajduje się naprzeciwko obszaru mikropylowego.
    3. Przykryj zarodki warstwą oleju chlorotrifluoroetylenowego, upewniając się, że olej nie rozleje się na obramowania znaczników porcelany (patrz 1.3).
      UWAGA: Przed pokryciem zarodków olejem można wykonać kolejny krok: zarodki można wysuszyć przez kilka minut, aby zmniejszyć ich płynną zawartość i w ten sposób ułatwić przedostanie się wstrzykniętego roztworu DNA. Może to pomóc w uniknięciu pękania zarodków podczas wstrzykiwania lub nadmiernego wycieku wstrzykniętego roztworu, w wyniku wysokiego ciśnienia cieczy.

3. Mikroiniekcja zarodka

  1. Napełnić igłę (1-2 μl) plazmidowym roztworem DNA lub dsRNA (1-2 μg/μl) za pomocą mikropipety.
  2. Podłączyć igłę do aparatu do mikroiniekcji, który kontroluje czas iniekcji (0,5 sekundy), ciśnienie (800 hPa) i ciśnienie zwrotne (150 hPa).
  3. Wykonać mikroiniekcję pod mikroskopem stereoskopowym, używając mikromanipulatora do kontrolowania ruchów igły (ryc. 1D). Użyj stolika mikroskopu, aby przesunąć szkiełko.
    1. Umieść slajd na stoliku lunety.
    2. Wprowadzić końcówkę igły do tylnego bieguna zarodka ( Rysunek 1E ).
    3. Wstrzyknąć roztwór, aktywując system mikroiniekcji za pomocą pedału. Wstrzyknięty płyn wywołuje wzrost ciśnienia wewnętrznego, co skutkuje lekkim ruchem zarodka.
    4. Zwolnij pedał i natychmiast, ale delikatnie, wyjmij igłę z zarodka.
    5. Zauważyć niewielki wyciek cytoplazmatyczny w miejscu wstrzyknięcia.
      UWAGA: Aby odróżnić potencjalne śmiertelne skutki DNA/dsRNA/siRNA od śmiertelności z powodu samej procedury mikroiniekcji, należy przeprowadzić eksperymenty kontrolne. Obejmują one wstrzyknięcie samego buforu lub, w przypadku eksperymentów z genetyką odwrotną, dwuniciowego RNA pochodzącego z zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) (dsRNA-GFP) lub siRNA.
  4. Po wstrzyknięciu inkubować zarodki w temperaturze 25 °C.

4. Procedury po wstrzyknięciu

  1. Dwa dni po wstrzyknięciu należy sprawdzić szkiełka pod kątem wyklutych larw (ryc. 1F) pod mikroskopem stereoskopowym. Larwy mogą poruszać się w oleju, ale muszą zostać jak najszybciej przeniesione do pokarmu dla larw. Z tego powodu sprawdzaj slajdy kilka razy dziennie.
  2. Za pomocą cienkiego pędzla (000) delikatnie przenieś wyklute larwy do pokarmu dla larw na bazie marchwi. Przenieść maksymalnie 200 larw na każdą szalkę Petriego.
  3. Wysiadywać larwy w temperaturze 65% wilgotności (25 °C). Upewnij się, że pokrywka nie przykleja się do naczynia, utrudniając wymianę powietrza.
  4. Utrzymuj szalki Petriego z pokrywką w większości zamkniętą, tak aby larwy nadal miały dopływ powietrza. Aby uniknąć nadmiernego wysuszenia, codziennie sprawdzaj naczynia i, jeśli to konieczne, dodaj wodę, aby skompensować parowanie.
  5. Umieścić szalki Petriego w przezroczystym pojemniku zamkniętym pokrywką z siatki i zawierającym warstwę otrębów, aby ułatwić przepoczwarzenie. Jeśli chodzi o rutynowy odchów owadów, larwy w trzecim stadium wyskakują z pokarmu larwalnego i przepoczwarzają się w otrębach.
  6. Zbierz poczwarki i umieść je w małej klatce do odchowu dorosłych osobników i badań przesiewowych (to jest pokolenie 0, G0). Wychowuj potomstwo na standardowym pokarmie dla larw.
  7. W przypadku eksperymentów z transformacją linii zarodkowej należy sprawdzić, czy w następnym pokoleniu (G1) nie ma możliwych przekształconych osobników, ponieważ wstrzyknięte osobniki są zwykle chimerami. Zdarzenia transpozycji mogły rzeczywiście wystąpić w którymkolwiek z jąder embrionalnego syncytium, które utworzą albo linię zarodkową, albo somę.
    1. Wkrótce po pojawieniu się znieczulij osoby z G1 za pomocą CO2 i sprawdź zdarzenia transformacji pod stereomikroskopem epifluorescencyjnym. Aby wykryć obecność czerwonej fluorescencji, należy użyć filtra DsRedwide (wew. 546/12; Emm. 605/75), natomiast do badania przesiewowego zielonej fluorescencji należy użyć filtra EYFP (wew. 500/20; Emm. 535/30).
    2. Umieść przekształcone osobniki w małej klatce z dorosłymi osobnikami płci przeciwnej typu dzikiego i zapoczątkuj nowy, początkowo heterozygotyczny szczep.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy dwie aplikacje mikroiniekcji zarodka skierowane odpowiednio na funkcjonalną charakterystykę interesującego genu (Przypadek 1) oraz na generowanie szczepów transgenicznych (Przypadek 2).

Dostarczanie dsRNA do zarodków w celu rozwikłania funkcji genu.

Gen innexin-5 koduje połączenie szczelinowe, które u owadów ulega ekspresji specyficznie w g...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroiniekcja kwasów nukleinowych w zarodkach owadów jest uniwersalną techniką, która ułatwia zarówno analizę funkcji genów, jak i zastosowania biotechnologiczne.

Niedawna publikacja sekwencji genomów coraz większej liczby gatunków owadów prowadzi do pilnego zapotrzebowania na narzędzia do funkcjonalnej charakterystyki genów o nieznanej jeszcze funkcji. Okazało się, że interferencja RNA jest jedną z najcenniejszych metod wnioskowania o funkcjach molekularnych49 , a mikroiniekcja zar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom Laboratorium "Genetyki i Genomiki Owadów", w szczególności Lorenzo Ghiringhelliemu, który przez ostatnie trzydzieści lat pracował nad rozwojem, adaptacją i utrzymaniem hodowli medfly. Część reprezentatywnych wyników tej pracy została przedrukowana z N. Biotechnology, 25(1) przez Scolari F. et al., Fluorescencyjne znakowanie nasienia w celu poprawy walki ze szkodnikiem owada Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, za zgodą Elsevier (numer licencji 3796240759880). Prace te otrzymały wsparcie ze strony Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 x bufor0,1 mM bufor fosforanowy pH 7,4, 5  mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNAOczyszczony fenol-chloroform
Standardowy pokarm1,5 l H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g środka przeciwdrobnoustrojowego o szerokim spektrum działania stosowanego w produktach farmaceutycznych rozpuszczony w 50  ml etanolu, 400 g cukru, 175 g demineralizowanych drożdży piwnych, 1 kg miękkich otrębów pszennych
Carrot Larval Food2,5 g agar, 4 g benzoesanu sodu, 4,5 ml 37% HCl, 42 g ekstraktu drożdżowego, 115 g sproszkowanej marchwi, 2,86  g środek przeciwdrobnoustrojowy o szerokim spektrum działania, woda do 1 l
Adult FoodEkstrakt drożdżowy i cukier (1:10)
Szkiełka mikroskopoweSigma-AldrichZ692247
Igły iniekcyjne Eppendorf5242956000
MikroładowarkiEppendorf5242956003
Podwójnie przesuwana taśma
Whatman okrągły papierSigma-AldrichZ695505
BleachDiluite 1:2 przed użyciem
Pędzel (000)
MikromanipulatorNarishigeMN-153
MikrowtryskiwaczEppendorfFemtojet
Klatki
Olej chlorotrifluoroetylenowySigma-AldrichH8898
Ceratitis capitataStosowany szczep to ISPRA
do wstrzykiwań dla larw dla dorosłych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Diamantidis, A. D., Carey, J. R., Nakas, C. T., Papadopoulos, N. T. Population-specific demography and invasion potential in medfly. Ecol. Evol. 1, 479-488 (2011).
  2. Augustinos, A. A., et al. Exploitation of the Medfly Gut Microbiota for the Enhancement of Sterile Insect Technique: Use of Enterobacter sp. in Larval Diet-Based Probiotic Applications. PLoS ONE. 10, e0136459(2015).
  3. Liquido, N., Shinoda, L., Cunningham, R. Host plants of Mediterranean fruit fly: an annotated World review. Ann Entomol Soc Am. 77, 1-52 (1991).
  4. Szyniszewska, A. M., Tatem, A. J. Global assessment of seasonal potential distribution of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). PLoS ONE. 9, e111582(2014).
  5. Malacrida, A. R., et al. Globalization and fruitfly invasion and expansion: the medfly paradigm. Genetica. 131, 1-9 (2007).
  6. Dyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. Sterile Insect Technique: Principles and practice in Area-wide Integrated Pest Management. , Springer. (2005).
  7. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  8. i5k Genome Sequencing Initiative for Insects and Other Arthropods. , Available from: http://arthropodgenomes.org/wiki/i5K (2016).
  9. Handler, A. Medfly Genome Annotation Groups. , Available from: https://www.hgsc.bcm.edu/arthropods/medfly-genome-annotation-groups (2016).
  10. Pane, A., Salvemini, M., Delli Bovi, P., Polito, C., Saccone, G. The transformer gene in Ceratitis capitata provides a genetic basis for selecting and remembering the sexual fate. Development. 129, 3715-3725 (2002).
  11. Loukeris, T. G., Livadaras, I., Arcà, B., Zabalou, S., Savakis, C. Gene transfer into the medfly, Ceratitis capitata, with a Drosophila hydei transposable element. Science. 270, 2002-2005 (1995).
  12. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  13. Hoy, M. Insect Molecular Genetics. An Introduction to Principles and Applications. , 3rd edn, Academic Press. (2013).
  14. Christophides, G. K., Livadaras, I., Savakis, C., Komitopoulou, K. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns. Genetics. 156, 173-182 (2000).
  15. Handler, A. M., McCombs, S. D., Fraser, M. J., Saul, S. H. The lepidopteran transposon vector, piggyback, mediates germ-line transformation in the Mediterranean fruit fly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 7520-7525 (1998).
  16. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31, 199-205 (2001).
  17. Koukidou, M., et al. Germ line transformation of the olive fly Bactrocera oleae using a versatile transgenesis marker. Insect Mol Biol. 15, 95-103 (2006).
  18. Condon, K. C., et al. Germ-line transformation of the Mexican fruit fly. Insect Mol Biol. 16, 573-580 (2007).
  19. Raphael, K. A., et al. Germ-line transformation of the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni, using a piggyBac vector in the presence of endogenous piggyBac elements. Genetica. 139, 91-97 (2011).
  20. Meza, J. S., Nirmala, X., Zimowska, G. J., Zepeda-Cisneros, C. S., Handler, A. M. Development of transgenic strains for the biological control of the Mexican fruit fly, Anastrepha ludens. Genetica. 139, 53-62 (2011).
  21. Schetelig, M. F., Handler, A. M. Strategy for enhanced transgenic strain development for embryonic conditional lethality in Anastrepha suspensa. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9348-9353 (2012).
  22. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  23. Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38, 701-710 (2001).
  24. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem Mol Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  25. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. J Biol Chem. 277, 8759-8762 (2002).
  26. Rodrigues, F. G., Oliveira, S. B., Rocha, B. C., Moreira, L. A. Germline transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 101, 755-757 (2006).
  27. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. J Vis Exp. , e216(2007).
  28. Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti embryos to obtain transgenic mosquitoes. J Vis Exp. , e219(2007).
  29. Concha, C., et al. Efficient germ-line transformation of the economically important pest species Lucilia cuprina and Lucilia sericata (Diptera, Calliphoridae). Insect Biochem Mol Biol. 41, 70-75 (2011).
  30. Takken, W., Scott, T. W. Ecological Aspects for Application of Genetically Modified Mosquitoes. , Springer. Netherlands. (2003).
  31. Handler, A. M., James, A. A. An Introduction to the History and Methodology of Insect Gene Transfer. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. 3-26 (2000).
  32. Handler, A. M. A current perspective on insect gene transformation. Insect Biochem Mol Biol. 31, 111-128 (2001).
  33. Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
  34. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). N Biotechnol. 25, 76-84 (2008).
  35. Schetelig, M. F., et al. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18171-18176 (2009).
  36. Schetelig, M. F., Caceres, C., Zacharopoulou, A., Franz, G., Wimmer, E. A. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). BMC Biol. 7, 4(2009).
  37. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochem Mol Biol. 43, 1-8 (2013).
  38. Lacroix, R., et al. Open field release of genetically engineered sterile male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS ONE. 7, e42771(2012).
  39. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
  40. Leftwich, P. T., et al. Genetic elimination of field-cage populations of Mediterranean fruit flies. Proc. Biol. Sci. 281, (2014).
  41. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E6736-E6743 (2015).
  42. Economopoulos, A. P., Judt, S. Artificial Rearing of the Mediterranean Fruit Fly (Diptera: Tephritidae): Size of Oviposition Holes. J. Econ. Entomol. 82, 668-674 (1989).
  43. Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 13677-13681 (2011).
  44. Gilbert, L. Insect Development. Morphogenesis, Molting and Metamorphosis. , Academic Press. (2009).
  45. Schetelig, M. F., Horn, C., Handler, A. M., Wimmer, E. A. Area-Wide control of insect pests. From research to field implementation. Vreysen, M. J., Robinson, A., Hendrichs, J. , Springer. 85-93 (2007).
  46. Gabrieli, P., et al. Sex and the single embryo: early development in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Dev Biol. 10, 12(2010).
  47. Tazuke, S. I., et al. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
  48. Gabrieli, P., Marois, E., Catteruccia, F. Transgenic insects: techniques and applications. Benedict, M. Q. , CABI. 188-207 (2014).
  49. Scolari, F., et al. How functional genomics will impact fruit fly pest control: the example of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. BMC Genet. 15, Suppl 15 2. S11(2014).
  50. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  51. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nucleic Acid DeliveryMedfly EmbryosGermline TransformationGene SilencingTransgenic StrainsMicroinjection ApparatusFluorescence ScreeningSterile Insect Technique

Powiązane artykuły