Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Summary

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Abstract

Identyfikacja molekularnych celów małych cząsteczek jest trudnym, ale koniecznym krokiem w kierunku zrozumienia ich mechanizmu działania. Chociaż opracowano i wykorzystano kilka metod identyfikacji celów, aby skutecznie wyjaśnić białka wiążące różne małe cząsteczki, techniki te mają wady, które sprawiają, że nie nadają się do wykrywania niektórych typów interakcji małych cząsteczek z celem. W szczególności interakcje niekowalencyjne, które zależą od natywnych warunków komórkowych, takie jak te białek błonowych, których struktury mogą być zaburzone podczas lizy komórki, często nie są podatne na metody identyfikacji docelowej oparte na powinowactwie. Tutaj demonstrujemy metodę, w której sonda zawierająca grupę fotolabilną jest używana do kowalencyjnego sieciowania z białkiem wiążącym małą cząsteczkę w środowisku żywej komórki, umożliwiając wykrycie i izolację białka docelowego bez konieczności utrzymywania interakcji po lizie komórki. Technika ta jest cennym narzędziem do badania interesujących biologicznie małych cząsteczek o nieznanych mechanizmach, zarówno w kontekście biologii podstawowej, jak i odkrywania leków.

Introduction

Bioaktywne małe cząsteczki zasadniczo działają poprzez interakcję i zmianę funkcji jednej lub więcej "docelowych" cząsteczek, najczęściej białek, w komórce. W procesie odkrywania leków, gdy związek aktywny jest odkrywany w wyniku fenotypowych badań przesiewowych, identyfikacja celu molekularnego (celów) molekularnych tego związku ma kluczowe znaczenie nie tylko dla zrozumienia mechanizmu działania i potencjalnych skutków ubocznych związku, ale także dla potencjalnego odkrycia nowej biologii leżącej u podstaw modelu choroby i utorowania drogi do opracowania nowych mechanistycznych klas terapeutycznych¹. Chociaż identyfikacja celu nie jest wymagana, aby lek m....

Protocol

UWAGA: Ten protokół został zaadaptowany z MacKinnon i Taunton¹⁰ do użytku w żywych komórkach.

1. Przygotowanie hodowanych komórek

1. Przygotować sterylne 6-centymetrowe naczynia do hodowli komórkowych dla żądanej liczby próbek (patrz poniżej).
   UWAGA: Na każdy warunek leczenia stosuje się jedno naczynie z komórkami, ale jeśli wymagana jest większa ilość białka, można przygotować 2 lub 3 naczynia na warunek i połączyć je po naświetlaniu promieniowaniem UV.
   1. Przygotuj co najmniej 3 naczynia z komórek; Kontrola ujemna tylko z DMSO (D), tylko leczenie sondą (P) i sonda + konkurent (C).
   2. Opcjonalnie....

Results

Przedstawione tutaj wyniki uzyskano za pomocą sondy fotopowinowactwa leku przeciwgrzybiczego itrakonazolu, którego zastosowanie zostało wcześniej opublikowane¹⁶. Wyniki te wskazują na zastosowanie techniki znakowania fotopowinowactwem żywych komórek w celu pomyślnej identyfikacji głównego białka wiążącego itrakonazol jako białka błonowego 35 kDa zależnego od napięcia kanału anionowego 1 (VDAC1).

Powyższy protokół zost.......

Discussion

Różne podejścia do identyfikacji celów małych cząsteczek można ogólnie podzielić na dwie kategorie: odgórne, w których fenotyp komórkowy leku jest wykorzystywany do zawężenia jego potencjalnych celów na podstawie ich znanych funkcji, lub oddolne, w których cel jest identyfikowany bezpośrednio za pomocą środków chemicznych lub genetycznych³. Badania odgórne lub fenotypowe mogą zidentyfikować pewne procesy komórkowe, na które wpływa lek (np. transkrypcja/translacja/synteza DNA, blok cyklu komórkowego, a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-karboksetylo)fosfina (TCEP)	Life Technologies	20490	Spraw, aby dzień użytkowania był świeży. Przygotuj 100 mM zapasu w wodzie z 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Przygotuj 1,7 mM zapas w proporcji 4:1 t-butanolu do DMSO, przechowuj w temperaturze -20  °C.
Siarczan miedzi (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Przygotuj 50 mM bulionu w wodzie, przechowuj w temperaturze pokojowej.
Biotyno-azydek	Kliknij Narzędzia chemiczne	AZ104-100	Przygotuj 10 mM zapasu w DMSO, przechowuj w temperaturze -20  °C.
Alexa Fluor 647-azydek	Life Technologies	A10277	Przygotuj 1 mM zapasu w DMSO, przechowuj w temperaturze -20  °C.
Lampa UV 365 nm	Spectroline	FC100	Okulary blokujące promieniowanie UV powinny być noszone podczas pracy.
Tabletki z inhibitorem proteazy, wolne od EDTA	Roche Life Science	11873580001	Przygotuj 50x roztwór w wodzie i przechowuj w temperaturze -20  °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Ustawiony na wyjście 1, praca 30%.
Skaner fluorescencyjny żelowy	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Użyj czerwonego lasera do wykrywania Alexa-fluor 647.
Kompatybilny z detergentem zestaw do oznaczania białka Dc	Bio-Rad	5000112
Streptawidyna o dużej pojemności Koraliki agarozowe	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, niski poziom glukozy	ThermoFisher Scientific	11885092
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana	ThermoFisher Scientific	26140079
roztwór penicyliny/streptomycyny	ThermoFisher Scientific	15140122
Scharakterystyka (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676