Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Summary

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Abstract

Identyfikacja molekularnych celów małych cząsteczek jest trudnym, ale koniecznym krokiem w kierunku zrozumienia ich mechanizmu działania. Chociaż opracowano i wykorzystano kilka metod identyfikacji celów, aby skutecznie wyjaśnić białka wiążące różne małe cząsteczki, techniki te mają wady, które sprawiają, że nie nadają się do wykrywania niektórych typów interakcji małych cząsteczek z celem. W szczególności interakcje niekowalencyjne, które zależą od natywnych warunków komórkowych, takie jak te białek błonowych, których struktury mogą być zaburzone podczas lizy komórki, często nie są podatne na metody identyfikacji docelowej oparte na powinowactwie. Tutaj demonstrujemy metodę, w której sonda zawierająca grupę fotolabilną jest używana do kowalencyjnego sieciowania z białkiem wiążącym małą cząsteczkę w środowisku żywej komórki, umożliwiając wykrycie i izolację białka docelowego bez konieczności utrzymywania interakcji po lizie komórki. Technika ta jest cennym narzędziem do badania interesujących biologicznie małych cząsteczek o nieznanych mechanizmach, zarówno w kontekście biologii podstawowej, jak i odkrywania leków.

Introduction

Bioaktywne małe cząsteczki zasadniczo działają poprzez interakcję i zmianę funkcji jednej lub więcej "docelowych" cząsteczek, najczęściej białek, w komórce. W procesie odkrywania leków, gdy związek aktywny jest odkrywany w wyniku fenotypowych badań przesiewowych, identyfikacja celu molekularnego (celów) molekularnych tego związku ma kluczowe znaczenie nie tylko dla zrozumienia mechanizmu działania i potencjalnych skutków ubocznych związku, ale także dla potencjalnego odkrycia nowej biologii leżącej u podstaw modelu choroby i utorowania drogi do opracowania nowych mechanistycznych klas terapeutycznych¹. Chociaż identyfikacja celu nie jest wymagana, aby lek mógł być stosowany terapeutycznie, w ostatnich latach coraz częściej uznaje się, że nowi kandydaci na leki mają większe szanse na sukces w badaniach klinicznych, a tym samym przynoszą lepszy zwrot z inwestycji, jeśli znany jest zatwierdzony cel². W związku z tym rośnie zainteresowanie metodami identyfikacji małocząsteczkowych białek docelowych.

Klasyczny eksperyment z identyfikacją celu zazwyczaj opiera się na oczyszczaniu powinowactwa, gdzie mała cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest immobilizowana na żywicy i inkubowana z całymi lizatami komórkowymi, po czym niezwiązane białka są wypłukiwane, a pozostałe białka są eluowane i identyfikowane³. Chociaż technika ta została wykorzystana do identyfikacji celów wielu małych cząsteczek 4, nie nadaje się jako uniwersalna metoda identyfikacji celu^z kilku powodów. Po pierwsze, białko docelowe musi zachować swoją natywną konformację podczas lizy komórki, aby zachować zdolność do wiązania się z małą cząsteczką. Może to być szczególnie problematyczne w przypadku białek błonowych, które często ulegają zmianom konformacyjnym po usunięciu z ich naturalnego środowiska lub po prostu agregują się i wytrącają z roztworu. Po drugie, mała cząsteczka musi zostać chemicznie zmodyfikowana w taki sposób, aby mogła zostać unieruchomiona na żywicy, zachowując jednocześnie jej zdolność do wiązania docelowego białka. Głębokie kieszenie wiążące mogą zatem stać się niedostępne dla małej cząsteczki po jej związaniu z żywicą. Po trzecie, powinowactwo wiązania musi być na tyle wysokie, aby interakcja była utrzymywana podczas etapów mycia, co utrudnia identyfikację oddziaływań o niższym powinowactwie. Po czwarte, warunki środowiskowe, takie jak pH, stężenie jonów lub obecność innych cząsteczek endogennych, mogą zmieniać się przestrzennie w komórce i czasami są warunkiem wstępnym interakcji lek-cel. W związku z tym znalezienie odpowiednich warunków umożliwiających i utrzymujących wiązanie na zewnątrz komórki może wymagać znacznej ilości prób i błędów.

Oznaczanie fotopowinowactwa pozwala obejść te problemy, umożliwiając kowalencyjne wiązanie małej cząsteczki i jej celu w natywnym kontekście komórki. Zamiast unieruchamiać małą cząsteczkę do dużej, masywnej żywicy, cząsteczka jest chemicznie modyfikowana w celu zainstalowania dwóch małych grup funkcyjnych: fotoaktywowanej części, która umożliwia kowalencyjne sieciowanie z białkiem docelowym po napromieniowaniu określoną długością fali światła, oraz grupy reporterowej, która umożliwia wykrycie białka docelowego, a następnie wyizolowanie. Żywe komórki są traktowane sondą fotopowinowactwa, sonda wiąże się i kowalencyjnie sieciuje krzyżowo z białkiem docelowym, a następnie kompleks sonda-białko jest izolowany w stanie nienaruszonym. Specyficzność wiązania sondy z celem jest wykazywana poprzez równoległe przeprowadzanie eksperymentu konkurencji, w którym nadmiar związku macierzystego jest używany do konkurowania o wiązanie sondy z białkiem docelowym.

Konstrukcja i synteza sond fotopowinowactwa różni się znacznie w zależności od małej cząsteczki i nie będzie omówiona w tym protokole; jednak kilka doskonałych dyskusji na ten temat zostało opublikowanych^5-9. Główną kwestią jest to, że sonda zachowuje bioaktywność związku macierzystego, a zatem przypuszczalnie wiąże się z tym samym celem (celami). Należy przeprowadzić badania zależności struktura-aktywność (SAR) w celu określenia, które części cząsteczki mogą być modyfikowane bez utraty bioaktywności. Jako fotoaktywowane środki sieciujące zastosowano wiele różnych grup chemicznych, w tym diazyrynę, benzofenon i azydek arylu, z których każda ma zalety i wady¹⁰. Podobnie, istnieje wiele znaczników reporterowych, które zostały użyte do wyizolowania białek wiążących sondę. Grupy reporterowe mogą funkcjonować samodzielnie, takie jak powszechnie stosowana biotyna lub znaczniki fluorescencyjne, lub mogą być prekursorami, które wymagają dalszej funkcjonalizacji po etapie fotosieciowania, które mają tę zaletę, że są mniejsze, a tym samym mniej prawdopodobne, że zagrozi bioaktywności¹¹.

W tym protokole użyliśmy sondy fotopowinowactwa zawierającej grupę fotosieciującą diazyrynę oraz końcowej alkinu do przyłączenia grupy reporterowej poprzez katalizowaną Cu(I) reakcję cykloaddycji (lub kliknięcia) Azide-Alkine Sharplessa-Hüisgena^12-15. Badania SAR, projekt i synteza sondy oraz wyniki tych badań zostały opublikowane w innych miejscach^16-18.

Protocol

UWAGA: Ten protokół został zaadaptowany z MacKinnon i Taunton¹⁰ do użytku w żywych komórkach.

1. Przygotowanie hodowanych komórek

1. Przygotować sterylne 6-centymetrowe naczynia do hodowli komórkowych dla żądanej liczby próbek (patrz poniżej).
   UWAGA: Na każdy warunek leczenia stosuje się jedno naczynie z komórkami, ale jeśli wymagana jest większa ilość białka, można przygotować 2 lub 3 naczynia na warunek i połączyć je po naświetlaniu promieniowaniem UV.
   1. Przygotuj co najmniej 3 naczynia z komórek; Kontrola ujemna tylko z DMSO (D), tylko leczenie sondą (P) i sonda + konkurent (C).
   2. Opcjonalnie przygotuj^4-te danie jako kontrolę UV, które ma być traktowane sondą, ale nie poddawane działaniu światła UV.
      UWAGA: Jeśli ma być testowanych wiele cząsteczek konkurencyjnych, takich jak różne analogi małej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, w razie potrzeby przygotuj dodatkowe płytki konkurencyjne
   .
2. Dodać HEK293T komórek do szalek hodowlanych w 4 ml pożywki hodowlanej. Użyj 3,5 miliona komórek na płytkę.
   UWAGA: Liczba komórek powinna być określona dla każdego typu komórki tak, aby komórki były prawie w 100% zlewające się na początku eksperymentu, w celu osiągnięcia maksymalnej wydajności białka. W przypadku HUVEC użyj 0,3 miliona komórek na płytkę. Dobre przybliżenie to 1/10 komórek w zlewającym się naczyniu o średnicy 15 cm. HEK293T komórki powinny być hodowane w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Modified Eagles Medium uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
3. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze hodowli (37 °C, 5% CO_{2 )} na noc.

2. Leczenie komórek i fotosieciowanie

1. Następnego dnia należy wstępnie podacznie podaczkować następujące leki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml:
   1. Do pierwszego zabiegu dodaj 4 μl DMSO do 2 probówek i 4 μl konkurenta 10 mM (tj. niezmodyfikowanego związku macierzystego) do 1 probówki.
   2. W przypadku drugiego zabiegu dodaj 16 μl DMSO do 1 probówki i 16 μl sondy fotopowinowactwa 50 μM do 2 probówek.
      UWAGA: Optymalne stężenie może być różne dla różnych sond (patrz dyskusja), ale dobrym punktem wyjścia jest zakres 200-500 nM (tutaj używamy 200 nM). Stężenie konkurenta powinno przekraczać stężenie sondy co najmniej 20-krotnie (tutaj używamy 10 μM). Końcowe stężenie DMSO powinno być równe we wszystkich płytkach i nie powinno przekraczać 0,5% (objętość 20 μl).
2. Umieścić płytki komórkowe w kapturze do hodowli komórkowej i dodać wstępnie podymilizowane leki z kroku 2.1.1 w następujący sposób: Odessać 1 ml pożywki hodowlanej, ponownie zawiesić wstępnie podany lek w pożywce i delikatnie dodawać go z powrotem do płytki kroplami. Dodaj DMSO do płytki DMSO (D) i płytki sondy (P), a następnie dodaj konkurenta do płytki konkurencji (C). Włóż płytki do inkubatora hodowli na 30 minut.
3. Przy przyciemnionych światłach w okapie hodowlanym dodać wstępnie podtrzymaną sondę z kroku 2.1.2 do płytek sondy (P) i konkurencji (C) i dodać DMSO do płytki DMSO (D), jak powyżej. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze hodowlanym na 1 godzinę.
4. Podczas inkubacji przygotuj następujące elementy; Taca z lodem, która zmieści wszystkie talerze; lodowaty bufor do lizy (PBS [pH 8,5] + 1x koktajl inhibitorów proteazy [kompletny wolny od EDTA, rozcieńczony z 50x roztworu podstawowego przygotowanego w wodzie]; 200 μl/płytkę); probówki wirówkowe oznaczone jako D, P lub C dla każdego z różnych warunków obróbki, na lodzie.
5. Na 15 minut przed końcem 1 godzinnej inkubacji ustaw lampę UV (365 nm) w chłodni i włącz ją, aby rozgrzać żarówkę.
6. Po 1 godzinie inkubacji z sondą umieść naczynia na lodzie. Delikatnie umyj komórki 5 ml lodowatego PBS (pH 7,4), aby usunąć nadmiar sondy. Ponownie przykryj komórki 4 ml lodowatego PBS.
7. Umieść naczynie z komórkami wyśrodkowanymi 3 cm pod lampą UV na opakowaniu z lodem, aby zminimalizować nagrzewanie się lampy. Naświetlać przez 3 min. Wyjmij naczynie na tackę z lodem i powtórz tę czynność dla wszystkich próbek.
8. Po napromieniowaniu odessać PBS z komórek i dodać 200 μl lodowatego PBS (pH 8,5) z inhibitorami proteazy do każdej płytki. Oderwij komórki od płytki za pomocą gumowego skrobaka i przenieś do wstępnie oznakowanych probówek do mikrowirówek na lodzie.
9. Dodać SDS do końcowego stężenia 0,4% (10 μl 10% SDS do 250 μl próbki).
   UWAGA: Proszek SDS jest niebezpieczny. Unikaj wdychania proszku SDS, zakładając maskę na nos i usta.
10. Poddać komórki lizie przez sonikację zawiesiny przez 10 impulsów (wyjście 1, cykl pracy 30%) i inkubować na lodzie przez 1 minutę przed drugą rundą 10 impulsów.
11. W razie potrzeby usuń 2 μl zawiesiny i sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby zapewnić całkowitą lizę komórek.
12. Gotować próbki na gorącej płycie ustawionej na 95 °C przez 5 minut, aby zakończyć lizę komórek i denaturację wszystkich białek.
13. Zmierzyć stężenie białka w każdej próbce za pomocą spektrofotometrycznego testu białkowego kompatybilnego z detergentem, takiego jak test białka Dc¹⁹, zgodnie z instrukcjami producenta, za pomocą spektrofotometru ustawionego do pomiaru absorbancji przy 750 nm.
14. Znormalizować stężenie białka do 2,5 mg/ml (lub jeśli stężenia są niższe niż 2,5 mg/ml, znormalizować do próbki o najniższym stężeniu białka), dodając PBS pH 8,5 + 0,4% SDS w razie potrzeby (na przykład, jeśli próbki mają 5 mg/ml w 250 μl, dodaj 250 μl PBS pH 8,5 + 0,4% SDS, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 mg/ml).

3. Dołączanie znacznika fluorescencyjnego za pomocą kliknięcia chemii do wizualizacji znakowanych białek

1. Usunąć 40 μl lizatu komórkowego i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Zachowaj pozostałe lizaty do reakcji z azydkiem biotyny (krok 4).
2. Dodaj kolejno następujące odczynniki: 0,2 μl fluor-azydku (1 mM roztwór podstawowy w DMSO), 0,58 μl TCEP (100 mM zapasu w wodzie z dodatkiem 4 równoważników NaOH, przygotowany na świeżo) i 3,38 μl TBTA (1,7 mM zapas w stosunku 4:1 t-butanolu do DMSO). Wirować do mieszania.
3. Dodać 1,14 μl CuSO_{4-5H 2}O (50 mM w wodzie), aby rozpocząć reakcję. Krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
4. Dodać 50 μl 2x buforu próbki SDS w celu wygaszenia reakcji. W tym momencie należy umieścić próbki bezpośrednio na żelu SDS-PAGE²⁰, aby uzyskać najlepsze wyniki, lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc, jeśli to konieczne.
5. W przypadku zamrożenia próbek, podgrzewać ponownie przez 5 minut w temperaturze 95 °C przed załadowaniem do żelu.
   UWAGA: Ponieważ masa cząsteczkowa docelowego białka zazwyczaj nie jest znana na tym etapie, zaleca się stosowanie 2 żeli o różnych stężeniach akrylamidu (tj. 8% i 15%) lub żelu gradientowego o szerokim zakresie mas cząsteczkowych (tj. 4-15%), aby zapewnić pełne pokrycie masy cząsteczkowej.
6. Gdy przód barwnika dotrze do końca żelu, kontynuuj uruchamianie żelu przez dodatkowe 5 minut, aby upewnić się, że cały nadmiar nieprzereagowanego azydku fluoru całkowicie opuścił żel.
7. Wyjąć żel do pojemnika z_ddH2O i inkubować przez 10 minut, delikatnie mieszając, aby zmyć nadmiar azydku fluoru.
8. Umieść żel na szklanej płytce i zeskanuj żel za pomocą skanera fluorescencyjnego do żelu Typhoon zgodnie z instrukcjami producenta.

4. Dołączanie znacznika biotyny za pomocą kliknięcia Chemia do oczyszczania powinowactwa znakowanych białek

1. Spośród pozostałych lizatów z kroku 3.1 należy użyć maksymalnej ilości po normalizacji białka, tak aby wszystkie próbki miały tę samą objętość (na przykład, jeśli po normalizacji do 2,5 mg/ml otrzymane objętości próbki wynoszą 500, 550 i 600 μl, należy użyć 500 μl każdego z nich).
2. Wstępnie oczyść lizaty, dodając do 50 μl granulek agarozy streptawidyny o dużej pojemności, wstępnie umytych 2x PBS (pH 7,4). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z rotacją.
Granulki osadzać
3. przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do nowej probówki do mikrowirówki na lodzie i wyrzucić kulki.
4. Usuń 1-2% próbki DMSO do nowej probówki oznaczonej jako "wejście". Dodać równoważną objętość 2 próbek SDS i przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Na 500 μl lizatu dodać następujące odczynniki: 1,38 μl azydku biotyny (10 mM zapasu w DMSO), 5,5 μl TCEP i 32,5 μl TBTA. Wirować do mieszania.
6. Dodać 11 μl CuSO_{4-5H 2}O na 500 μl lizatu i krótko odwirować. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
7. Dodać 4 objętości próbki acetonu schłodzonego do temperatury -20 °C. Próbki należy przemieszać wirowo i inkubować przez noc w temperaturze -80 °C, aby całkowicie wytrącić białka i usunąć nieprzereagowany azydek biotyny.
8. Odwirować próbki w temperaturze 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wytrąconych białek.
9. Całkowicie odessać supernatant i rozpuścić białka przez sonikację w 150 μl PBS (pH 7,4) + 1% SDS.
10. Dodać 600 μl PBS (pH 7,4), aby rozcieńczyć stężenie SDS do 0,2%.
11. Dodać próbki do 30 μl, wstępnie umytych, wysokopojemnych kulek agarozy streptawidyny i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z rotacją.
Granulki osadzać
12. przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant zawierający niezwiązane białka i odrzucić.
13. Dodać 1 ml buforu do przemywania (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) do kulek i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z rotacją.
14. Powtórz kroki 4.12 i 4.13 3 razy.
15. Całkowicie odessać bufor płuczący z kulek i dodać 30 μl 2x buforu do próbek SDS.
16. Inkubować przez 5 minut na bloku grzewczym o temperaturze 95 °C, aby uwolnić białka z kulek.
17. Odwirowywać kulki przez 1 minutę w temperaturze 13 000 x g w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą gotowe do uruchomienia SDS-PAGE. W przypadku zamrażania próbek przed użyciem należy ponownie podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
18. Ostrożnie odpipetować bufor próbki zawierający białka z kulek i załadować na kartę charakterystyki na stronie²⁰ (patrz ważne uwagi poniżej). W razie potrzeby kulki można zachować do późniejszego ponownego wgotowania.
    UWAGA: W przypadku wykrywania białek za pomocą barwienia srebrem lepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu żelu o grubości 1 mm. Jeżeli z barwionego srebrem żelu ma zostać wycięta prążek do analizy metodą spektrometrii mas (MS), należy przygotować wszystkie odczynniki świeże ze sterylnych roztworów i pozostawić pustą studzienkę między próbkami na żelu. Dla każdego pasma wyciętego z toru sondy, należy pobrać równoległy wycinek z toru DMSO, aby można było odjąć białka tła. W celu walidacji identyfikacji białka za pomocą western blot ważne jest, aby podczas uruchamiania żelu SDS-PAGE załadować również próbkę wejściową z kroku 4.4.
19. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem dla barwienia srebrem²¹ lub Western blot²², aby wykryć docelowe białko (białka).

Results

Przedstawione tutaj wyniki uzyskano za pomocą sondy fotopowinowactwa leku przeciwgrzybiczego itrakonazolu, którego zastosowanie zostało wcześniej opublikowane¹⁶. Wyniki te wskazują na zastosowanie techniki znakowania fotopowinowactwem żywych komórek w celu pomyślnej identyfikacji głównego białka wiążącego itrakonazol jako białka błonowego 35 kDa zależnego od napięcia kanału anionowego 1 (VDAC1).

Powyższy protokół zost...

Discussion

Różne podejścia do identyfikacji celów małych cząsteczek można ogólnie podzielić na dwie kategorie: odgórne, w których fenotyp komórkowy leku jest wykorzystywany do zawężenia jego potencjalnych celów na podstawie ich znanych funkcji, lub oddolne, w których cel jest identyfikowany bezpośrednio za pomocą środków chemicznych lub genetycznych³. Badania odgórne lub fenotypowe mogą zidentyfikować pewne procesy komórkowe, na które wpływa lek (np. transkrypcja/translacja/synteza DNA, blok cyklu komórkowego, a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-karboksetylo)fosfina (TCEP)	Life Technologies	20490	Spraw, aby dzień użytkowania był świeży. Przygotuj 100 mM zapasu w wodzie z 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina (TBTA)	AnaSpec	63360-50	Przygotuj 1,7 mM zapas w proporcji 4:1 t-butanolu do DMSO, przechowuj w temperaturze -20  °C.
Siarczan miedzi (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Przygotuj 50 mM bulionu w wodzie, przechowuj w temperaturze pokojowej.
Biotyno-azydek	Kliknij Narzędzia chemiczne	AZ104-100	Przygotuj 10 mM zapasu w DMSO, przechowuj w temperaturze -20  °C.
Alexa Fluor 647-azydek	Life Technologies	A10277	Przygotuj 1 mM zapasu w DMSO, przechowuj w temperaturze -20  °C.
Lampa UV 365 nm	Spectroline	FC100	Okulary blokujące promieniowanie UV powinny być noszone podczas pracy.
Tabletki z inhibitorem proteazy, wolne od EDTA	Roche Life Science	11873580001	Przygotuj 50x roztwór w wodzie i przechowuj w temperaturze -20  °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Ustawiony na wyjście 1, praca 30%.
Skaner fluorescencyjny żelowy	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Użyj czerwonego lasera do wykrywania Alexa-fluor 647.
Kompatybilny z detergentem zestaw do oznaczania białka Dc	Bio-Rad	5000112
Streptawidyna o dużej pojemności Koraliki agarozowe	Life Technologies	20359
Dulbecco's Modified Eagles Medium, niski poziom glukozy	ThermoFisher Scientific	11885092
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana	ThermoFisher Scientific	26140079
roztwór penicyliny/streptomycyny	ThermoFisher Scientific	15140122
Scharakterystyka (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676