Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model powtarzającego się wstrząsu głowy u myszy

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54530

⸱

12 października 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Program for Neurotrauma, Neuroproteomics & Biomarkers Research, University of Florida, 2Department of Psychiatry, University of Florida, 3Department of Neuroscience, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Wstrząśnienie mózgu jest najczęstszym rodzajem urazowego uszkodzenia mózgu. W związku z tym powtarzalny model zwierzęcy wstrząsu mózgu, który odtwarza ważne cechy urazu u pacjentów, może zapewnić środki do badania wstrząsu mózgu w rygorystyczny, kontrolowany i skuteczny sposób.

Streszczenie

Pomimo tego, że wstrząs mózgu / łagodne urazowe uszkodzenie mózgu (mTBI) jest najczęstszym występowaniem urazowego uszkodzenia mózgu, nadal brakuje wiedzy na temat tego urazu i jego skutków. Aby lepiej zrozumieć wstrząsy mózgu, często wykorzystuje się zwierzęta, ponieważ zapewniają one kontrolowany, rygorystyczny i wydajny model. W badaniach dostosowano tradycyjne modele zwierzęce do wykonywania mTBI w celu stymulowania łagodnego nasilenia urazu poprzez zmianę parametrów urazu. Modele te zostały wykorzystane, ponieważ mogą powodować morfologicznie podobne uszkodzenia mózgu do stanu klinicznego i zapewniają spektrum ciężkości urazów. Mają one jednak ograniczoną zdolność do prezentowania identycznych cech urazów u pacjentów. Wykorzystując tradycyjny system uderzeniowy, model powtarzającego się urazu wstrząsowego (rCHI) może wywołać łagodne lub umiarkowane wstrząs mózgu podobny do ludzkiego. Stopień urazu można określić, mierząc okres utraty przytomności (LOC) ze znakiem przejściowego zakończenia oddychania. Model rCHI jest korzystny w użyciu ze względu na jego dokładność i prostotę w określaniu efektów mTBI i potencjalnych metod leczenia.

Wprowadzenie

Wstrząs mózgu, zwany również łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu (mTBI), jest najczęstszym występowaniem urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) i dotyka miliony ludzi w Stanach Zjednoczonych. Wstrząśnienie mózgu może być trudne do zdiagnozowania i nie ma konkretnego lekarstwa na wstrząs mózgu. Coraz częściej wiadomo i istnieją dowody na to, że łagodne urazy mechaniczne wynikające z urazów sportowych, walki wojskowej i innych fizycznie angażujących zajęć mogą mieć skumulowane i przewlekłe konsekwencje neurologiczne1,2. Wciąż jednak brakuje wiedzy na temat wstrząśnień mózgu i ich skutków. Obecna metodologia ogranicza badania patomorfologiczne i leczenie u ludzi, ponieważ do diagnozy klinicznej dostępna jest tylko ocena neurologiczna i ocena obrazowa. Modele zwierzęce dostarczają środków do badania wstrząsów mózgu w skuteczny, rygorystyczny i kontrolowany sposób z nadzieją na dalszą diagnostykę i leczenie mTBI.

Badania dostosowały tradycyjne modele TBI, takie jak kontrolowane uderzenie korowe (CCI), uderzenie płynu i uderzenie płynem (FPI), uraz spowodowany spadkiem masy ciała i uraz spowodowany wybuchem, aby wykonać mTBI i stymulować niską dotkliwość urazów poprzez zmianę parametrów urazu. Modele te są korzystne w użyciu ze względu na ich zdolność do replikowania urazów mózgu morfologicznie podobnych do stanu klinicznego; Mają jednak też swoje ograniczenia. Stopień urazu spowodowanego urazem spowodowanym przyspieszeniem (spadek masy ciała) jest często bardzo zmienny. Dwa wyniki łagodnego CCI – krwotok podpajęczynówkowy i stłuczenie ogniskowe – nie są porównywalne z typowymi wstrząśnieniami mózgu u ludzi. CCI i FPI wymagają kraniotomii, która nie ma znaczenia klinicznego, podczas gdy uraz spowodowany wybuchem jest bardziej kontrowersyjnym modelem w odniesieniu do różnych pomiarów pozycji ekspozycji i ciśnienia szczytowego, a także zmiennych urazów wtórnych podczas ekspozycji3-6. W badaniach niezbędny jest zaktualizowany model zwierzęcy wstrząsowy, który może przełożyć badania przedkliniczne na warunki kliniczne.

Kluczowym problemem w modelowaniu łagodnego TBI jest zdefiniowanie eksperymentalnej ciężkości urazu, która najbardziej odwzorowuje uraz w warunkach klinicznych. Ostatnio różne grupy badawcze opracowały model zamkniętego urazu głowy lub wstrząsowego urazu głowy (CHI)7-10. CHI jest modyfikacją CCI bez kraniotomii, ale nadal wykorzystuje tradycyjny elektroniczny magnetyczny system uderzeniowy do generowania uderzenia głową. CHI może wywołać wstrząs mózgu w zakresie od łagodnego do umiarkowanego poprzez dostosowanie parametrów uderzenia. Utratę przytomności (LOC) można zaobserwować bezpośrednio po zderzeniu, wykrywając zmniejszenie częstości oddechów lub przejściowe zakończenie oddychania. Okres LOC służy do określenia ciężkości urazu. Ten artykuł zawiera nieco ulepszoną i zaktualizowaną wersję powtarzalnego modelu CHI (rCHI) u myszy, wraz ze szczegółowym protokołem krok po kroku i reprezentatywnymi wynikami. Strategie badawcze modelu rCHI są korzystne w określaniu efektów mTBI i potencjalnych metod leczenia, zwłaszcza że nie ma indywidualnego modelu zwierzęcego zdolnego do naśladowania wszystkich zmian patologicznych wywołanych wstrząsem mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z protokołami #201207692 zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Florydy oraz zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Opieka nad zwierzętami

  1. Użyj 3–4-miesięcznych samców myszy C57BL/6J. Zapewnij ściółkę, materiał do gniazdowania, jedzenie i wodę ad libitum. Utrzymuj myszy w temperaturze otoczenia kontrolowanej na poziomie 20 - 22 °C ze stałymi 12-godzinnymi cyklami światła/12-godzinnymi ciemnościami.

2. Przygotowanie przed wprostowaniem

  1. Przymocuj wykonaną na zamówienie metalową końcówkę pokrytą gumą silikonową do elektromagnetycznego stereotaktycznego urządzenia udarowego. Upewnij się, że płaski spód końcówki jest równoległy do powierzchni końcówki sondy (Rysunek 1A).
  2. Znieczulij mysz 4% izofluranem, a następnie znieczuleniem podtrzymującym 2,5% izofluranu. Sprawdź znieczulenie za pomocą przepływomierza. Monitoruj poziom znieczulenia, aż zwierzę osiągnie chirurgiczny poziom znieczulenia, wykazując utratę odruchu wycofania pedału.
  3. Umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej. Użyj stożka nosowego w kształcie lejka, aby utrzymać mysz pod narkozą. Całkowicie ogol głowę za pomocą trymera. Użyj maści petrolatum okulistycznej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.

3. Ustawienie parametrów wpływu

UWAGA: System uderzeniowy zawiera skrzynkę kontrolną do ustawiania parametrów uderzenia, siłownik do wykonywania uderzenia oraz cyfrową ramę stereotaktyczną z 3-ruchowymi osiami.

  1. Wstępnie ustaw prędkość urządzenia udarowego na 4 m/s i czas oczekiwania na 240 ms na skrzynce sterowniczej.

4. Umiejscowienie centrum uderzenia

  1. Umieść miękką poduszkę grzewczą pod ciałem zwierzęcia, aby utrzymać temperaturę ciała w pobliżu 39 °C. Zamontuj mysz w ramce stereotaktycznej w pozycji leżącej za pomocą nauszników.
  2. Opuść końcówkę udarową blisko głowy myszy, przesuwając sterownik Z. Wyreguluj płaską końcówkę udarową (średnica 9 mm), przesuwając przetworniki X i Y w połowie współrzędnych celu powyżej szwu strzałkowego.
  3. Upewnij się, że jedna krawędź końcówki udarowej jest pionowo równoległa do wyimaginowanej poziomej linii narysowanej między dwoma uszami (Rysunek 1C). Środek uderzenia odpowiada centralnemu szwowi strzałkowemu w połowie drogi między szwami międzyczołowymi i lambdoidalnymi (międzyuszne 9 mm do międzyusznych 0 mm, boczne 4,5 mm).

5. Ustawienie głębokości uderzenia

  1. Aby prawidłowo ustawić głębokość uderzenia, użyj dodatkowej końcówki sondy, aby zastąpić izolowaną końcówkę udarową pokrytą gumą silikonową.
  2. Aby upewnić się, że po przełączeniu końcówek nie nastąpi przesunięcie środka uderzenia, przed przełączeniem końcówek ustaw kanały X i Y na cyfrowym stereotaktycznym panelu sterowania.
  3. Przesuń końcówkę sondy do środka obszaru uderzenia, ręcznie przesuwając napędy X i Y.
  4. Przypnij czujnik kontaktowy do ogona myszy.
  5. Przesuń impaktor (napęd Z) w dół, aż końcówka sondy dotknie powierzchni miejsca uderzenia.
  6. Ustaw kanał Z na stereotaktycznym panelu sterowania na zero.
  7. Przesuń końcówkę udarową z powrotem do obszaru uderzenia, ręcznie regulując przetworniki X i Y (NIE przyciski zerowe na cyfrowym stereotaktycznym panelu sterowania), aż przetworniki X i Y osiągną zero (w miejscu, w którym wcześniej znajdowała się końcówka udarowa).
  8. Wycofaj siłownik, przesuwając przełącznik cofania na skrzynce sterowniczej. Ręcznie przesunąć impaktor w dół (sterownik Z) o 4 mm.

6. Wpływ

  1. Wyzwól uderzenie, klikając przełącznik udarowy na skrzynce sterowniczej i osiągnij głębokość odkształcenia 4 mm.

7. Po zaklinowaniu

  1. Zmierz czas od uderzenia do pierwszego oddechu myszy za pomocą timera.
  2. Wyjmij zwierzę z instrumentu i połóż je na ciepłej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku.
  3. Poczekaj na regenerację przed powrotem zwierzęcia do czystej klatki. Nie należy zwracać zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje w pełni.
  4. Obserwuj i waż myszy codziennie. Jeśli myszy wykazują oznaki bólu, należy wstrzyknąć im meloksykam w dawce 1-2 mg/kg mc. co 12-24 godziny.

8. Powtarzające się zaklinowanie

  1. Daj myszom dodatkowe obrażenia w 4, 7 i 10 dniu po początkowym urazie (72-godzinny odstęp między uderzeniami).

9. Immunohistochemia (IHC)

  1. Perfuzja przezsercowa
    1. Znieczulić myszy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe z pentobarbitalem o stężeniu 200 m/kg.
    2. Oceń i zapewnij znieczulenie na płaszczyźnie chirurgicznej przez uszczypnięcie palca u nogi. Zabezpiecz mysz w pozycji leżącej, delikatnie przyklejając przednie i tylne łapy taśmą do styropianowej powierzchni roboczej wewnątrz okapu oparów chemicznych.
    3. Wykonaj nacięcie przez skórę wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej od momentu tuż pod wyrostkiem mieczykowatym do obojczyka. Wykonaj dwa dodatkowe nacięcia skóry w wyrostku mieczykowatym i postępuj wzdłuż podstawy brzusznej klatki piersiowej z boku.
    4. Otwórz klatkę piersiową i odsłoń serce, przecinając mięśnie klatki piersiowej i klatkę piersiową.
    5. Zabezpiecz bijące serce kleszczami i wykonaj 1 - 2 mm nacięcie w lewej komorze.
    6. Natychmiast włóż igłę motylkową do prawego przedsionka. Rozpocząć infuzję 20 ml soli fizjologicznej, powoli popychając strzykawkę.
    7. Zamień sól fizjologiczną na 4% paraformaldehydu. Kontynuuj perfuzję z 20 ml paraformaldehydu.
    8. Odetnij głowę myszy i usuń skórę nożyczkami. Odizoluj mózg od czaszki za pomocą noża do kości.
  2. Cięcie kriostatu
    1. Osadzać tkanki mózgowe w preparacie o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.) i zamrażać w temperaturze -80 °C. Umieść mózg w kriostacie w orientacji strzałkowej. Wytnij skrawki mózgu o grubości 5 μm.
  3. Barwienia
    1. Suszyć zamrożone sekcje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Inkubować szkiełka ze 100 μl 2% koziej surowicy i 0,1% Triton X-100 w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj szkiełka 3 razy 300 μl PBS. Następnie inkubować szkiełka z przeciwciałem anty-GFAP (1:200) lub przeciwciałem anty-ferrytynowym (1:200) oddzielnie przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Umyj szkiełka 3 razy 300 μl PBS. Następnie inkubować szkiełka przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z biotyną.
    5. Umyj szkiełka 3 razy 300 μl PBS. Następnie inkubować szkiełka z roztworem kompleksu awidyny-biotyny (ABC) (1:50) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    6. Umyj szkiełka 3 razy 300 μl PBS. Następnie inkubować w roztworze substratu 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) (50 ml PBS, 10 μlH2O2, tabletka 10 mg DAB, przefiltrować przed użyciem) przez 5 - 8 minut. Obserwuj szkiełka pod mikroskopem, aż pojawią się komórki dodatnie.
    7. Opłucz szkiełka w wolno płynącej wodzie z kranu przez 5 minut. Wyczyść szkiełka chusteczką laboratoryjną. Następnie zamontuj sekcje za pomocą podłoża montażowego i szkiełka nakrywkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym modelu (Rysunek 1 A-C) wystąpiły krótkie okresy głośnego łapania powietrza i płytkiego oddychania. Utratę przytomności (stan nieprzytomności) zdefiniowano jako spadek częstości oddechów lub przejściowe zaprzestanie oddychania przed powrotem do normalnej respiracji. Uderzenie w środek głowy spowodowało krótkotrwałą utratę przytomności (odpowiednio 7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 s przy każdym uderzeniu osobno, Rysunek 1D). Mózgi myszy wyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby naśladować urazy mózgu morfologicznie podobne do stanu klinicznego, oczekuje się objawów po wstrząśnieniu mózgu. Objawy po wstrząśnieniu mózgu na ogół obejmują bóle głowy, zawroty głowy, zawroty głowy, zmęczenie, problemy z pamięcią i snem, problemy z koncentracją, a także lęk i obniżony nastrój. Ponieważ objawy somatyczne mogą nie być jeszcze mierzalne w modelach zwierzęcych, zmiany funkcji motorycznych i poznawczych oraz zachowania emocjonalnego są wykorzystywane jako kryteria racjonalnej oceny wstrząsu mózgu w mod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnego interesu finansowego do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z grantu Florida Health (Brain and spinal cord injury research fund) (KKW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
aparat anestezjologicznyEagle Eye Anesthesia, IncModel 150 znieczulenie
Impaktor elektromagnetycznyLeicaBiosystemsImpact One Impaktor stereotaktycznywykonuje impkcję
Cyfrowy instrument stereotaktycznyLeicaBiosystems39462501mocowanie myszy i końcówki pozycjonujące
Metalowa końcówka pokryta gumą SicilonePrecyzyjne narzędzie i Inżynieria, Gainesvill FLwykonana na zamówieniekońcówka udarowa
Trymer litowo-jonowy All-in-OneWAHL Home Produkty9854-600golenie włosów myszy
spinacze do papieruwykonana nakońcówka sondy
Aplikatory z bawełnianą końcówkąGłowicaMDS202055z solą fizjologiczną
Tissue Tek OCTASKURA FINETEK USA INC4583zatapiania w tkankach
dla przeciwciała IHC
anty FerritinSigmaF6136dla IHC
VECTASTAIN Elite ABC  zestawLaboratoria wektorowePK-6100System detekcji IHC
Podłoże montażowe PermountFisher ScientificSP15-100
Skaner Aperio XT ScanScopeLeica Microsystems Inc,slajdów
Leica AutoStainer XLLeica firma patologicznaST2010H& Barwienie E
DAB System detekcji IHCsigmaD3939
zamówienie peelingująca MEDLINE przeciwciało anty-GFAP Dako CA93013 do skanowanie

Bibliografia

  1. Baugh, C. M., et al. Chronic traumatic encephalopathy: neurodegeneration following repetitive concussive and subconcussive brain trauma. Brain Imaging Behav. 6 (2), 244-254 (2012).
  2. McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J. Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
  3. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75 Suppl (4), S34-S49 (2014).
  4. Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimers Res Ther. 6 (5), 64(2014).
  5. Gold, E. M., et al. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. RegenMed. 8 (4), 483-516 (2013).
  6. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  7. Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Front Neurol. , 5-12 (2014).
  8. Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Sci Rep. 10 (5), 11178(2015).
  9. Zhang, J., et al. Inhibition of monoacylglycerol lipase prevents chronic traumatic encephalopathy-like neuropathology in a mouse model of repetitive mild closed head injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 443-453 (2015).
  10. Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
  11. Lumpkins, K. M., Bochicchio, G. V., Keledjian, K., Simard, J. M., McCunn, M., Scalea, T. Glial fibrillary acidic protein is highly correlated with brain injury. J Trauma. 65 (4), 778-782 (2008).
  12. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  13. Liu, H., et al. Increased expression of ferritin in cerebral cortex after human traumatic brain injury. Neurol Sci. 34 (7), 1173-1180 (2013).
  14. Jordan, B. D., et al. The clinical spectrum of sport-related traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 9 (4), 222-230 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model mysisystem uderze elektromagnetycznychmodelowanie urazowego uszkodzenia m zgupomiar utraty przytomno cianaliza aktywacji astrocyt wkom rki ferrytynowo pozytywnepozycjonowanie w aparacie stereotaktycznymkalibracja g boko ci uderzeniaprotok wielokrotnych uraz w
Model powtarzającego się wstrząsu głowy u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.