Method Article

Obrazowanie żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach — na przykładzie nowatorskiego implantu z dzianiny tytanowej

DOI:

10.3791/54537

⸱

September 7th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Siegfried Weller Institute for Trauma Research at the BG Trauma Center, Eberhard Karls Universität Tübingen, 2Department of Orthopaedics, BG Trauma-Center, 3Buck GmbH and Co.KG

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy technikę obrazowania opartą na fluoroforach, która pozwala na wykrywanie żywotności komórek na nieprzezroczystym tytanowym rusztowaniu, jak również wykrywanie przebłysków zanieczyszczeń rusztowania. Ten protokół rozwiązuje problem z obrazowaniem interakcji komórka-komórka lub komórka-metal na nieprzezroczystych rusztowaniach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwyrodnienie krążka międzykręgowego i przepuklina dysku jest jedną z głównych przyczyn bólu dolnej części pleców. Zubożenie macierzy zewnątrzkomórkowej, którego kulminacją jest wytłoczenie jądra miażdżystego (NP), prowadzi do zniszczenia krążka międzykręgowego. Obecnie dostępne zabiegi chirurgiczne zmniejszają ból, ale nie przywracają mechanicznej funkcjonalności kręgosłupa. Aby zachować cechy mechaniczne kręgosłupa, całkowita wymiana dysku lub jądra stała się w ten sposób szerokim zainteresowaniem. Jednak ta era endoprotezoplastyki jest nadal w stanie niedojrzałym, ponieważ żaden z istniejących produktów nie został oceniony klinicznie.

To badanie ma na celu przetestowanie biokompatybilności nowego implantu jądrowego wykonanego z dzianych drutów tytanowych. Pomimo wszystkich zalet mechanicznych, materiał ten ma swoje ograniczenia w konwencjonalnej analizie optycznej, ponieważ powstały implant jest nieprzezroczysty. W tym miejscu przedstawiamy strategię, która opisuje wizualizację in vitro, śledzenie i badanie żywotności komórek osteochondro-progenitorowych na rusztowaniu. Protokół ten może być wykorzystany do wizualizacji skuteczności protokołu czyszczenia, a także do zbadania biokompatybilności tych i innych nieprzezroczystych rusztowań. Co więcej, protokół ten może być wykorzystany do pokazania wzorca przylegania komórek, a także żywotności komórek i szybkości proliferacji na/w rusztowaniu. Ten test biokompatybilności in vitro zapewnia korzystne narzędzie do analizy interakcji komórka-materiał w nieprzezroczystych i nieprzezroczystych rusztowaniach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekły ból pleców jest chorobą wieloczynnikową. Zainteresowanie minimalnie inwazyjną opcją leczenia choroby zwyrodnieniowej dysku wzrosło od lat 50. XX wieku. Do dziś najczęściej stosowaną metodą leczenia jest wielosegmentowe zespolenie kręgosłupa. Ponieważ metoda ta często prowadzi do ograniczeń w ruchomości dotkniętego segmentu1,2, badanie ery endoprotezoplastyki stało się szerokim zainteresowaniem. Znaczące postępy w całkowitej wymianie dysku i wymianie jądra stały się dobrą alternatywą w leczeniu przewlekłego bólu pleców1. Pomimo ogromnego postępu, żadna z metod nie została oceniona klinicznie. Mniej sztywne implanty jądra stanowią obiecującą alternatywę dla całkowitej wymiany dysku, pod warunkiem, że pierścień włóknisty jest nienaruszony3,4. Jednak obecnie obecne na rynku implanty jądra często wiążą się z powikłaniami, takimi jak zmiany w trzonie kręgów, zwichnięcia, pionowa utrata wysokości dysku i brak związanej z tym niezbędnej sztywności mechanicznej5. Aby przezwyciężyć obecne wady, z powodzeniem opracowano nowatorski implant jądrowy wykonany z dzianych drutów tytanowych6. Ze względu na unikalną strukturę dzianiny, to nowo opracowane rusztowanie wykazało wyróżniające się cechy biomechaniczne, np. zdolność tłumienia, wielkość porów, nośność i niezawodność7. Mając na celu przetestowanie biokompatybilności tego nowatorskiego implantu jądrowego, przedstawiono poważne ograniczenia w technikach analizy (optycznej) przypisywane nieprzezroczystemu charakterowi implantu.

Aby przetestować biokompatybilność, interakcja komórka-metal odgrywa znaczącą rolę8-10. Interakcja między komórkami a rusztowaniem jest niezbędna do stabilizacji, a tym samym do lepszej integracji implantu z systemem gospodarza. Jednak rosnąca głębokość wrastania może zmienić właściwości mechaniczne rusztowania. Mając na celu zbadanie, czy powierzchnia rusztowania stanowi podstawę do przyłączania, proliferacji i różnicowania komórek, czy też metal wpływa na żywotność komórek, ważne jest rozwiązanie powszechnego, dobrze znanego problemu obrazowania komórek na/w nieprzezroczystych i nieprzezroczystych rusztowaniach. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zbadano kilka technik opartych na fluorescencji. Firmy dostarczają szeroką gamę fluoroforów do wizualizacji żywych komórek, przedziałów komórkowych, a nawet określonych stanów komórkowych11. Fluorofory do tego eksperymentu zostały wybrane za pomocą internetowego narzędzia Spectral Viewer, aby jak najlepiej pasowały do naszego mikroskopu fluorescencyjnego.

Opracowana strategia analizy zachowania przylegających komórek na/w nieprzezroczystym rusztowaniu z dzianiny tytanowej obejmuje następujące elementy: 1) fluorescencyjne (zielone białko fluorescencyjne/GFP) znakowanie komórek osteochondro-progenitorowych, aby umożliwić śledzenie komórek na rusztowaniu, 2) pomiar żywotności (aktywność mitochondrialną) komórek, oraz 3) wizualizacja interakcji komórka-komórka i komórka-materiał w rusztowaniu. Zabieg ma tę zaletę, że można go łatwo przenieść na inne przylegające komórki i inne nieprzezroczyste lub nieprzezroczyste rusztowania. Co więcej, żywotność i wzorzec wrastania mogą być monitorowane przez kilka dni, dzięki czemu można go stosować z ograniczoną ilością materiału lub komórek rusztowania.

Obecne badanie pokazuje udane wykorzystanie naszego obecnego protokołu do pomiaru żywotności komórek i wizualizacji wzorca wzrostu komórek osteochondro-progenitorowych na/w nieprzezroczystym rusztowaniu z dzianiny. Ponadto opracowane protokoły mogą być wykorzystywane do określania zanieczyszczeń rusztowania i sprawdzania protokołów czyszczenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Do eksperymentów użyto nieśmiertelnych ludzkich mezenchymalnych komórek prekursorowych zrębu (komórek SCP-1). Komórki SCP-1 zostały dostarczone przez prof. Matthiasa Schiekera12.

1. Ekspansja komórek SCP-1

  1. Przed rozpoczęciem pracy z komórkami SCP-1 należy odpowiednio oczyścić obszar roboczy (wyznaczony gabinet bezpieczeństwa biologicznego I) 70% etanolem (v/v) w rękawicach.
  2. W oczyszczonej komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotować odpowiednią objętość pożywki do hodowli komórkowych, mieszając wymagane składniki, jak wskazano w tabeli 1. W celu utrzymania sterylności podłoża podstawowego należy dodawać suplementy, przechodząc przez sterylne filtry o wielkości porów 0,22 μm.
    1. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, przygotuj podłoże co najmniej 24 godziny przed użyciem. W celu sprawdzenia jego sterylności należy inkubować 1 ml pożywki na płytce do hodowli komórkowej bez komórek w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych: 37 °C, 5% CO2 , 20 % O2 i 90% wilgotności. Po 24 godzinach sprawdź podłoże pod mikroskopem, używając powiększenia co najmniej 200X.
  3. Utrzymuj komórki SCP-1 w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w warunkach wspomagających: 37 °C, 5% CO2, 20% O2 i 90% wilgotności.
  4. W celu utrzymania i ekspansji, hoduj komórki SCP-1, aż osiągną 80-90% konfluencji. W tym okresie kultury należy zmieniać pożywkę co 2-3 dni. Po osiągnięciu 80-90% konfluencji, podziel komórki SCP-1 (ogólnie w stosunku 1:2) do następnego przejścia w celu ekspansji lub płytki do eksperymentów (jak wskazano).
  5. W celu rozszczepienia komórek SCP-1, ogrzej pożywkę hodowlaną w temperaturze 37 °C i rozmroź trypsynę/EDTA za pomocą łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
  6. Całkowicie odessać pożywkę hodowlaną z 80-90% zlewających się komórek i wyrzucić ją do pojemnika na odpady.
  7. Umyj komórki co najmniej dwa razy DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco bez magnezu i wapnia, pH 7,2).
    1. Odpipetować odpowiednią objętość DPBS na komórki (5 ml DPBS dla kolby hodowlanej T75 i 12 ml dla kolby hodowlanej T175).
    2. Ostrożnie odessać DPBS i wyrzucić go do pojemnika na odpady.
  8. Pobrać pipetą odpowiednią objętość 0,25% trypsyny/EDTA na komórki (1 ml DPBS dla kolby hodowlanej T75 i 2 ml dla kolby hodowlanej T175) i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2, 20 % O2 i wilgotnością 90%.
  9. Usuń komórki, stukając w naczynie i upewnij się, że wszystkie komórki są odłączone od plastikowej kultury (trypsynizacja), obserwując pływające komórki pod mikroskopem.
  10. Dezaktywować reakcję trypsyny, dodając 10 ml pożywki hodowlanej. Ostrożnie wymieszać trypsynę i komórki z pożywką, powtarzając pipetowanie.
  11. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki reakcyjnej i odwirować przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki hodowlanej.
  13. Policz komórki metodą wykluczenia błękitu trypanowego, jak opisano w protokole 2.
  14. Zasiej komórki w zależności od projektu eksperymentalnego.

2. Liczenie komórek SCP-1

  1. Przeprowadzić żywotną liczbę komórek (metoda wykluczenia błękitu trypanowego) zawieszonych komórek za pomocą hemocytometru.
  2. Przed zliczeniem komórek wyczyść hemocytometr wodą z kranu. Wysuszyć elementy hemocytometru za pomocą niestrzępiącej się chusteczki. Zmontuj go, zwilżając szklankę nakrywkową i dociskając ją odwrotnie do dwóch szklanych prowadnic po każdej stronie obszaru liczenia. Upewnij się, że na szklanych prowadnicach widoczne są pierścienie Newtona (rysunek 1).
  3. Pobrać 10 μl zawieszonych komórek i wymieszać z 10 μl 0,1% roztworu błękitu trypanowego, aby uzyskać współczynnik rozcieńczenia równy 2.
  4. Załadować 10 μl całej próbki do wstępnie oczyszczonej i zmontowanej komory hemocytometru.
  5. Policz liczbę żywych (białe/przezroczyste komórki) i martwych (niebieskie jądra) komórek na kwadratach 4x4 (patrz rysunek 1B).
  6. Oblicz całkowitą liczbę komórek zgodnie z podanym wzorem:
    figure-protocol-1

3. Transfekcja komórek SCP-1 metodą GFP

UWAGA: Aby zaobserwować wzrost komórek SCP-1 na i w tytanowym rusztowaniu przez pewien okres hodowli, oznaczyliśmy komórki zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Nadekspresja GFP jest osiągana przez zakażenie cząstkami adenowirusa kodującymi GFP. Niekompetentne replikacyjnie (-E1/-E3) cząsteczki adenowirusa kodujące białko zielonej fluorescencji (GFP) zostały użyte do zainfekowania komórek SCP-1. Cząstki wirusa uzyskano od prof. Stevena Dooleya13 poprzez pobranie supernatantu renatywnego rekombinowanego adenowirusa (Ad5-GFP) transfekowanego HEK293T komórkach (Biosafety lab II). Trzy powtarzające się cykle zamrażania (-80 °C) i rozmrażania (37 °C w łaźni wodnej) sprawiły, że żadne HEK293T komórki nie pozostały zdolne do produkcji nowych cząsteczek wirusa. Użycie tego materiału nasiennego adenowirusa może skutecznie zainfekować komórki SCP-1 bez wytwarzania nowych cząsteczek wirusa. W ten sposób zakażone komórki mogą być przetwarzane w Laboratorium Bezpieczeństwa Biologicznego I.

  1. Ponownie zawiesić komórki docelowe (komórki SCP-1) o gęstości wysiewu 50 000 komórek/ml w pożywce hodowlanej. Pipetować pipetą 2 ml na studzienkę do 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych; 5% CO2, 20% O2 i 90% wilgotności, aż komórki SCP-1 osiągną konfluencję 70-80%.
    UWAGA: Konfluencja zależy od gęstości wysiewu komórek. Dla wyżej wymienionych warunków, komórki SCP-1 osiągają konfluencję 70-80% w ciągu 1,5-2 dni.
  3. Przy zbiegu 70-80%, bez zasysania pożywki hodowlanej, dodać 100 μl materiału siewnego adenowirusa na 1 ml pożywki hodowlanej.
    1. Zakres stężeń należy określić indywidualnie w zależności od ilości cząstek wirusa w każdym preparacie nasiennym wirusa. W przypadku, gdy skuteczność infekcji jest zbyt niska, oczyść i zagęść cząsteczki wirusa za pomocą różnych dostępnych na rynku zestawów.
  4. Inkubować przez godzinę w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C (5% CO2 , 20 % O2 i 90 % wilgotności).
  5. Usunąć pożywkę zawierającą materiał siewny wirusa i zebrać go do usunięcia. Dodać świeżą pożywkę hodowlaną 2 ml na dołek 6-dołkowej płytki hodowlanej w celu uzupełnienia.
    1. Upewnij się, że przed usunięciem pożywka zawierająca cząstki wirusa jest sterylizowana w autoklawie.
  6. Oceń wewnątrzkomórkową ekspresję GFP (skuteczność infekcji) 24 godziny po infekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z kostką GFP LED / zestawem filtrów.
    1. Obserwuj morfologię komórki (ryc. 2). Komórki odłączające się od plastiku hodowlanego mogą dawać fałszywie dodatnie wyniki.

4. Czyszczenie rusztowań z dzianiny tytanowej

  1. Umieść do 5 rusztowań w probówce reakcyjnej o pojemności 50 ml.
  2. Rusztowanie (o grubości 6-7 mm) umyć trzykrotnie 30 ml destylowanej wody dejonizowanej przez 20 minut w temperaturze pokojowej, stosując warunki wirnika (8 x g).
  3. Zastąp destylowaną wodę dejonizowaną 30 ml 1% (w/v) roztworu Triton-X-100 (rozpuszczonego w destylowanej wodzie dejonizowanej), a następnie umyj rusztowania raz przez 20 minut w temperaturze pokojowej, stosując warunki wirnika (8 x g).
  4. Wyrzucić roztwór Triton-X-100, a następnie przemyć 30 ml destylowanej wody dejonizowanej dwukrotnie (po 5 minut w temperaturze pokojowej), utrzymując warunki wirnika (8 x g).
  5. Wymień wodę destylowaną dejonizowaną. Rusztowania płukać kolejno odczynnikami klasy 99% acetonu, 99% izopropanolu i 99% etanolu (po 30 ml) przez 2 x 5 min każdy w łaźni ultradźwiękowej (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
  6. Przemyć ponownie trzy razy 30 ml destylowanej wody dejonizowanej przez 5 minut, utrzymując stałą obróbkę kąpielą ultradźwiękową.
  7. Umieść rusztowania na niestrzępiącej się chusteczce, aby wyschły na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.
  8. Autoklawować rusztowanie przez 15 minut w temperaturze 121 °C przy ciśnieniu 15 psi.
  9. Potwierdź protokół czyszczenia za pomocą fluorescencji pośredniej, jak opisano w protokole 5.

5. Obrazowanie struktur rusztowania za pomocą fluorescencji pośredniej

UWAGA: Obecny protokół opisuje obrazowanie struktur rusztowania za pomocą pośredniej fluorescencji przy użyciu fluoroforu sulforodaminy B, która daje jaskrawoczerwoną fluorescencję przy długości fali ex/em 565/586 nm. Fluorofor można jednak zmienić, aby lepiej pasował do danych ustawień mikroskopu lub ewentualnej autofluorescencji rusztowania.

  1. Przygotować roztwór barwiący sulforodaminę B (0,04%) w 1% kwasie octowym i przechowywać w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  2. Weź 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i zanurz oczyszczone rusztowanie w 500 μl roztworu barwiącego sulforodaminę B, umieszczając go w studzience za pomocą kleszczy.
  3. Uchwyć negatywowe obrazy rusztowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    1. Rób zdjęcia za pomocą zestawu modułów/filtrów RFP LED o długości fali wzbudzenia 531/40 nm i długości fali emisji 593/40 nm. Alternatywnie można dobrać odpowiednią długość fali wzbudzenia i emisji za pomocą wizjera widma fluorescencji20. Sulforodamina B osiąga szczyt wzbudzenia przy 578 nm, a szczyt emisji przy 593 nm.
    2. W celu zobrazowania konstrukcji rusztowania należy wykonać zdjęcia w mniejszych powiększeniach, np. 4X lub 10X (Rysunek 3). Korzystając z tych zdjęć, określ cechy, np. wielkość i kształt porów za pomocą ImageJ.
    3. W celu wykrycia zanieczyszczeń rusztowania należy wykonywać zdjęcia w większych powiększeniach, np. 20X lub 40X, biorąc pod uwagę, że ograniczy to głębokość analizy. Upewnij się, że cząsteczki/substancje brudu nie są widoczne (patrz reprezentatywne wyniki; Rysunek 3).

6. Test biokompatybilności in vitro

  1. Podgrzać pożywkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
  2. Weź 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i za pomocą kleszczy umieść oczyszczone i wysterylizowane rusztowania w każdym dołku testowym w aseptyku. Praca pod wstępnie oczyszczoną szafą bezpieczeństwa biologicznego I!
  3. Namoczyć/inkubować rusztowania z pożywką hodowlaną przez około 15 minut (500 μl na studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej) w celu usunięcia powietrza z wnętrza rusztowania.
  4. W międzyczasie, ponownie zasmuć 500 000 komórek SCP1 zainfekowanych Ad-GFP w 1 ml pożywki hodowlanej.
  5. Po 15 minutach namaczania rusztowania należy całkowicie odessać podłoże z rusztowania.
  6. W celu wysiewu komórek na rusztowaniu należy ostrożnie dozować 100 μl zawiesiny komórkowej na powierzchnię rusztowania (umieszczonego na płytce 24-dołkowej). Podczas wysiewu komórek należy zachować minimalną objętość zawiesiny komórek, aby zapewnić, że żadne podłoże nie wypłynie z rusztowania.
  7. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (5%CO2, 20%O2 i 90% wilgotności).
  8. Dodać 500 μl więcej pożywki hodowlanej i inkubować przez 24 godziny w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 , 20% O2 i 90% wilgotności).
  9. Oceń wzorzec przylegania komórek i rozprzestrzenianie się komórek na powierzchni rusztowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    1. Rób zdjęcia za pomocą zestawu modułów/filtrów GFP LED o długości fali wzbudzenia 470/22 nm i długości fali emisji 510/42 nm. Alternatywnie można dobrać odpowiednią długość fali wzbudzenia i emisji za pomocą wizjera widmowego fluorescencji. GFP ma szczytowe wzbudzenie przy 488 nm, a szczytową emisję przy 507 nm.
    2. Aby zobrazować wzorzec przylegania komórek, uchwyć obrazy przy mniejszych powiększeniach, np. 4X lub 10X (Rysunek 4). Aby zaobserwować rozprzestrzenianie się komórek, potrzebne jest większe powiększenie (co najmniej 100X) — co ogranicza głębokość ostrości.
  10. W celu dalszej oceny rozprzestrzeniania się komórek na powierzchni rusztowania, utrwal komórki 4% formaliną i przystąp do konwencjonalnego barwienia fluorescencyjnego struktur komórkowych, np. włókien aktynowych (falloidyny). Należy jednak dostosować czasy inkubacji i znakowanie fluorescencyjne przeciwciał w celu dopasowania do indywidualnych cech rusztowania, np. czasów dyfuzji lub autofluorescencji14.
  11. Następnego dnia zmień pożywkę hodowlaną, aby usunąć nieprzylegające komórki.
  12. Obliczyć procent przylegających komórek na rusztowaniu za pomocą pomiaru konwersji rezazuryny, jak opisano w protokole 7.

figure-protocol-2
Rycina 5: Kalendarium testu in vitro. (A) Zestaw doświadczalny do posiewu komórek. (B) Ilustracja procedury, podkreślająca znaczenie początkowego protokołu i walidacji funkcjonalności komórki do 7 dnia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Pomiar konwersji resazurin

UWAGA: Test konwersji resazuryny służy do pomiaru aktywności mitochondriów, a tym samym pośrednio proliferacji komórek. Redukcja resazuryny do rezorufiny generuje sygnał fluorescencyjny, który opiera się na aktywności mitochondrialnej związanej z liczbą żywotnych komórek (ryc. 7A).

  1. Całkowicie odessaj pożywkę hodowlaną z komórek SCP-1 i wyrzuć ją do pojemnika na odpady.
  2. Umyj komórki SCP-1 raz za pomocą DPBS, aby usunąć oderwane komórki. Dodać 500 μl DPBS na dołek z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej komórki SCP-1 na rusztowaniu.
  3. Przykryć komórki wymaganą ilością sterylnego roztworu roboczego rezazuryny (0,25% rezazuryny w pożywce hodowlanej) i inkubować w temperaturze 37 °C w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (5%CO2, 20%O2 i 90% wilgotności) przez 30 minut.
    1. Zwróć uwagę, że czas inkubacji zależy od typu komórki i gęstości komórek. Może wynosić od 10 minut do 6 godzin. Zoptymalizowany czas inkubacji dla komórek SCP-1 wynosi 30 minut.
  4. Jako kontrolę tła należy włączyć co najmniej jedną studzienkę z roztworem roboczym reazuryny, ale bez komórek, którą inkubuje się w temperaturze 37 °C w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (5%CO2, 20%O2 i 90% wilgotności) przez ten sam okres czasu.
  5. Przenieść 100 μl kondycjonowanego supernatantu z każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej na 96-dołkową płytkę do mikrodołków.
  6. Pozostałe komórki przemyć trzykrotnie 1 ml DPBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pozostałości roztworu roboczego resazuryny. Po trzecim przemyciu dodaj pożywkę hodowlaną do implantów z komórkami SCP-1 (500 μl na studzienkę z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej) i kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (5%CO2, 20%O2 i 90% wilgotności) w celu dalszych pomiarów przebiegu czasu.
    1. Na tym etapie (2-4) należy upewnić się, że skonfigurowano replikaty, aby zminimalizować liczbę błędów pipetowania.
  7. W międzyczasie umieść 96-dołkową płytkę w czytniku mikropłytek i zmierz fluorescencję utworzonej rezorufiny.
    1. W celu zmniejszenia sygnału tła należy zmierzyć fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 545 nm i długości fali emisji 585 nm.
    2. Alternatywnie można dobrać odpowiednią długość fali wzbudzenia i emisji za pomocą wizjera widmowego fluorescencji. Rezorufina osiąga szczyt wzbudzenia przy 572 nm, a szczyt emisji przy 585 nm. Podane natężenie sygnału to średnio 25 indywidualnych odczytów (25 błysków na dołek).
  8. Zmierzyć fluorescencję utworzonej rezorufiny w kondycjonowanym podłożu za pomocą dolnego układu optycznego.
    1. Należy pamiętać, że przyrost zależy od średniej ilości przekształconej rezazuryny i może wahać się od 10 do 4,000. Dostosuj wzmocnienie do indywidualnego czytnika mikropłytek, pipetując wzorcową krzywą rezorufiny, tak aby sygnał fluorescencyjny był poniżej 80% maksymalnego wykrywalnego natężenia sygnału (w tym przypadku 20 000). Zoptymalizowane wzmocnienie dla komórek SCP-1 wynosi 800.
  9. Odjąć sygnał tła (roztwór roboczy rezazuryny bez komórek) od sygnału badanych próbek.
  10. W zależności od konfiguracji/celu eksperymentu przejdź do dalszych kroków:
  11. Obliczyć procent żywotności komórek na rusztowaniu przy użyciu krzywej standardowej. Wykonaj indywidualną krzywą standardową osobno dla każdej użytej linii komórkowej.
  12. Analizuj wzrost/proliferację komórek, szacując względny wzrost konwersji rezazuryny w czasie uprawy. Na potrzeby tego obliczenia należy ustawić konwersję resazuryny w dniu 1 jako odniesienie. Świeżo przygotuj roztwór roboczy rezazuryny do tego rodzaju analizy. Ponadto czasy inkubacji muszą być równe dla różnych pomiarów.
  13. Powtórz cały protokół pomiaru konwersji resazuryny co najmniej trzy razy, aby uzyskać spójne wyniki.

8. Barwienie żywych żywych trupów

  1. Umieść komórki SCP1 na rusztowaniu z gęstością wysiewu 50 000 komórek/rusztowanie i pozwól mu rosnąć na rusztowaniu, zachowując standardowe warunki hodowli komórkowej (szczegóły w protokole 1 i 2).
  2. Po 24-48 godzinach całkowicie odessaj pożywkę hodowlaną z komórek SCP-1 i wyrzuć ją do pojemnika na odpady.
  3. Umyj komórki SCP-1 raz za pomocą DPBS, aby usunąć oderwane komórki. Dodać 500 μl DPBS do dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Splamić SCP-1 za pomocą fluoroforów (wszystkie trzy plamy w tym samym czasie):
    1. Od teraz trzymaj rusztowania w ciemności, aby chronić bielenie fluoroforów przed światłem dziennym!
    2. Ustaw czas inkubacji na 30 minut, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie w całym rusztowaniu. W przypadku przenoszenia na inne rusztowania należy zoptymalizować czas inkubacji, aby dopasować go do indywidualnych cech rusztowania (wielkość porów, głębokość rusztowania itp.).
    3. W celu wykrycia żywych komórek na rusztowaniu, należy wybarwić komórki kalceiną AM w końcowym stężeniu 2 μM (w pożywce hodowlanej).
    4. W celu wykrycia wszystkich komórek na rusztowaniu, należy wybarwić komórki preparatem Hoechst 33342 w końcowym stężeniu 0,002 μg/μl (w pożywce hodowlanej).
    5. W celu wykrycia martwych komórek należy inkubować rusztowanie z homodimerem etydyny w końcowym stężeniu 4 μM (w pożywce hodowlanej).
  5. Po czasie inkubacji przemyć komórki 3 razy DPBS (1 ml na studzienkę) co 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Natychmiast rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    1. Zrób zdjęcia kalceiny (żywych komórek) za pomocą zestawu sześciennego/filtra LED GFP (długość fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 470/22 nm i 510/42 nm). Alternatywnie można dobrać odpowiednią długość fali wzbudzenia i emisji za pomocą wizjera widmowego fluorescencji. Kalceina ma szczytowe wzbudzenie przy 488 nm, a szczytową emisję przy 507 nm. Uwaga: Upewnij się, że nie używasz komórek transfekcyjnych GFP do barwienia fluorescencyjnego kalceiną lub innymi zielonymi barwnikami fluorescencyjnymi.
    2. Zrób zdjęcia Hoechst 33342 za pomocą zestawu kostki/filtra LED DAPI o długości fali wzbudzenia 357/44 nm i długości fali emisji 447/60 nm. Alternatywnie można dobrać odpowiednią długość fali wzbudzenia i emisji za pomocą wizjera widmowego fluorescencji. Hoechst 33342 ma szczytowe wzbudzenie przy 347 nm, a szczytową emisję przy 483 nm.
    3. Zrób zdjęcia homodimeru etydyny za pomocą zestawu modułów/filtrów RFP LED (długość fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 531/40 nm i 593/40 nm). Alternatywnie można dobrać odpowiednią długość fali wzbudzenia i emisji za pomocą wizjera widmowego fluorescencji. Homodimer etydyny ma szczytowe wzbudzenie przy 530 nm, a szczytową emisję przy 618 nm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstępne wyniki pokazały, że opisywany nowy implant jądra nie tylko ma dobre właściwości tłumiące, ale także jest biokompatybilny z komórkami SCP-1. Podczas procesu produkcji implantu ma on kontakt z silnie i toksycznymi substancjami (smar, zaprawa, roztwór elektropolerski). Dzięki technikom pośredniego barwienia fluorescencyjnego byliśmy w stanie zobrazować pozostałe zanieczyszczenia, a w konsekwencji zoptymalizować protokół czyszczenia, wykazując znaczne zmniejszenie obciążenia substancj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powierzchnia rusztowania odgrywa ważną rolę w jego interakcji z otaczającymi tkankami in vivo , decydując tym samym o trwałości funkcjonalnej implantów. W związku z tym, biokompatybilność rusztowania jest badana za pomocą testów in vitro z użyciem komórek (linia komórkowa SCP1), po posieciu na rusztowaniach.

Techniki mikroskopowe, które dobrze sprawdzają się w przypadku cienkich i optycznie przezroczystych rusztowań, nie nadają się do stosowania w przypadku rusztowań nieprzez...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów. Żadna część pracy nie była ani nie jest obecnie rozważana do publikacji ani nie została opublikowana gdzie indziej.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt jest częściowo finansowany przez Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. Opłata za publikację została pokryta przez szpital urazowy BG w Tybindze w Niemczech.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytki 6/24/48-dołkowe, kolba hodowlana T25/ T75Greiner Bio-One GmbH*
* Płytki 24-dołkoweGreiner Bio-One GmbHCELLSTAR 662 160
* Płytki 48-dołkoweCorning Incorporated USA3548
* Płytki 6-dołkoweFalcon353046
* T25Greiner Bio-One GmbH690 175
* T75Greiner Bio-One GmbH658 175
Kwas octowy, purum ≥ 99.0%Carl Roth3738.4
AcetonCarl Roth5025.1
Axioplan-2 Carl Zeiss, Niemcy
Szafy bezpieczeństwa biologicznegoThermo Scientificsafe 2020
Ester acetoksymetylowy kalceiny (kalceina AM)Sigma17783
Spoiwo do inkubatora kultur komórkowych, Tuttlingen, Niemcy9040-0078
Jednostka filtrująca (0,22 i mikro; m)Millipore, IRLSLGP033RS
Wirówki 5810 R i 5417 RThermo Fisher Scientific, NYMegafuge 40R
Dimethylsulfoxide (DMSO)Carl Roth4720.2
Dulbecco' s PBS bez Ca & MgSigmaH15-002
Etanol 99%  SAV płyn prod. GmBH475956
Ethidium homodimerSigma46043
EVOS System obrazowania fluorescencyjnegoTechnologie życioweAMF4300
Płodowa surowica bydlęca (FCS)Gibco10270-106
HemocytometrHausser Scientific, PA, USA
Hoechst 33342Sigma14533-100MG
Dzianinowy implant jądra tytanowegoBuck co & KG, Niemcy
Modyfikacja MEM Alpha z glutaminą bez nukleozyduSigmaE15-832
Czytnik mikropłytek OmegaBMG Labtech, NiemcyFLUOstar Omega
Penicylina / StreptomycynaSigmaP11-010
Sól sodowa rezazurynySigma199303-1G
Sól sodowa sulforodaminy BSigmaS1402-1G
Rotator probówekLabinco BV, HolandiaModel LD-76
TRIS (hydroksymetylo) aminometanCarl RothAE15.1
TritonCarl Roth3051.2
Trypan Blue 0,5%Carl RothCN76.1
Trypsyna / EDTASigmaL11-004

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
  2. Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
  3. Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
  4. Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
  5. Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
  6. Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).
  7. Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
  8. Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  9. Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
  10. Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
  11. Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999(2013).
  12. Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
  13. Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101(2012).
  14. Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. Optical Techniques in Regenerative Medicine. , CRC Press. (2013).
  15. Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263(2013).
  16. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
  17. Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
  18. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  19. Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
  20. Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
  21. Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Non transparent Scaffold ImagingCell Viability TestingFluorescent Imaging TechniquesKnitted Titanium ImplantOsteochondro progenitor CellsLive dead StainingResazurin Conversion AssayScaffold Cleaning ProtocolCell Adhesion AnalysisFluorescence Microscopy

Related Articles