Artykuł metodologiczny

Tworzenie i przeszczepianie arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) w modelu gojenia się ran cukrzycowych

DOI:

10.3791/54539

⸱

4 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) są łatwo izolowane i zbierane z tłuszczu normalnych szczurów. Arkusze ASC mogą być tworzone przy użyciu inżynierii arkuszy komórkowych i mogą być przeszczepiane do tłustych szczurów z cukrzycą Zuckera, wykazujących defekty skóry na całej grubości z odsłoniętą kością, a następnie pokryte dwuwarstwą sztucznej skóry.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztuczna skóra osiągnęła znaczące wyniki terapeutyczne w praktyce klinicznej. Jednak leczenie sztucznej skóry ran u pacjentów z cukrzycą z utrudnionym przepływem krwi lub z dużymi ranami może być przedłużone. Terapie komórkowe pojawiły się jako nowa technika leczenia wrzodów cukrzycowych, a inżynieria arkuszy komórkowych poprawiła skuteczność przeszczepu komórek. Wiele doniesień sugeruje, że komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC), rodzaj mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC), wykazują potencjał terapeutyczny ze względu na ich względną obfitość w tkance tłuszczowej i dostępność do pobrania w porównaniu z MSCs z innych tkanek. Dlatego ASC wydają się być dobrym źródłem komórek macierzystych do użytku terapeutycznego. W tym badaniu z powodzeniem stworzono arkusze ASC z tłuszczu tłuszczowego najądrza normalnych szczurów Lewisa przy użyciu szalek hodowlanych reagujących na temperaturę i normalnej pożywki hodowlanej zawierającej kwas askorbinowy. Arkusze ASC zostały przeszczepione szczurom Zuckera z cukrzycowym tłuszczem (ZDF), szczurzemu modelowi cukrzycy typu 2 i otyłości, które wykazują zmniejszone gojenie się ran. Na tylnej powierzchni czaszki powstała rana, do rany przeszczepiono prześcieradła ASC, a do pokrycia prześcieradeł użyto dwuwarstwowej sztucznej skóry. Szczury ZDF, które otrzymały prześcieradła ASC, miały lepsze gojenie się ran niż szczury ZDF bez przeszczepu prześcieradeł ASC. Podejście to było ograniczone, ponieważ arkusze ASC są wrażliwe na suche warunki, co wymaga utrzymania wilgotnego środowiska rany. Dlatego do pokrycia arkusza ASC użyto sztucznej skóry, aby zapobiec wysuszeniu. Allogeniczny przeszczep arkuszy ASC w połączeniu ze sztuczną skórą może mieć również zastosowanie do innych trudnych do leczenia owrzodzeń lub oparzeń, takich jak te obserwowane w przypadku choroby tętnic obwodowych i choroby kolagenu, i może być podawany pacjentom, którzy są niedożywieni lub stosują sterydy. Tak więc leczenie to może być pierwszym krokiem w kierunku poprawy możliwości terapeutycznych gojenia się ran cukrzycowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Populacja pacjentów z cukrzycą rośnie na całym świecie i osiągnęła 400 milionów w 2015 roku1; szacuje się, że 15 - 25% pacjentów z cukrzycą jest zagrożonych progresją owrzodzenia cukrzycowego kończyny dolnej2. Owrzodzenia cukrzycowe kończyn dolnych są trudne do leczenia i mogą wymagać przedłużonego okresu terapeutycznego z treningiem rehabilitacyjnym po całkowitym wyzdrowieniu. Długi okres terapii często prowadzi do znacznego obniżenia jakości życia pacjenta. W związku z tym należy opracować nowe terapie, które zmniejszają lub zapobiegają zaostrzeniu choroby w leczeniu ran cukrzycowych. Aby ocenić gojenie się ran cukrzycowych, zoptymalizowaliśmy model gojenia się ran po wrzodach cukrzycowych u szczurów, który naśladuje praktyczne warunki kliniczne, i oceniliśmy, czy przeszczepianie arkuszy komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) przy użyciu inżynierii arkuszy komórkowych przyspiesza gojenie się ran.

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) wykazują doskonały potencjał do przyspieszania gojenia się ran ze względu na ich zdolność do samoodnawiania, działanie immunomodulujące i zdolność do różnicowania się w różne linie komórkowe3. ASC są rodzajem MSC pochodzącego z tkanki tłuszczowej i wykazują kilka zalet w porównaniu z MSCs pochodzących z innych tkanek, w tym ich potencjał angiogenny i aktywność parakrynną4,5. Tkanka tłuszczowa występuje w organizmie człowieka stosunkowo obficie, a jej dostępność pozwala na pobieranie za pomocą mało inwazyjnych zabiegów. W związku z tym ASC zostały eksperymentalnie wykorzystane do zastosowań związanych z gojeniem ran6,7.

Poprzednie raporty wykazały, że bezpośrednie wstrzyknięcie zawiesin jednokomórkowych MSC w obszary wokół ran może przyspieszyć gojenie się ran8,9. Jednak pomimo doniesień o przyspieszeniu gojenia się ran w modelach owrzodzeń cukrzycowych po wstrzyknięciu zawiesin jednokomórkowych, czas przeżycia przeszczepionych komórek w miejscu rany nie jest jasny.

W tym badaniu zastosowaliśmy inżynierię arkuszy komórkowych, używając naczyń hodowlanych reagujących na temperaturę. Naczynia te mają wrażliwy na temperaturę polimer N-izopropylacrylamid kowalencyjnie związany na ich powierzchni10. Szczepiona warstwa polimeru pozwala na kontrolowane temperatury przyleganie komórek do powierzchni szalki hodowlanej lub oderwanie się od niej. Powierzchnia naczynia staje się hydrofobowa w temperaturze 37 °C, co pozwala komórkom przylegać i namnażać się, podczas gdy komórki spontanicznie odrywają się od powierzchni, gdy staje się ona hydrofilowa w temperaturach poniżej 32 °C. Hodowane komórki można zbierać jako ciągły arkusz komórek z nienaruszonymi połączeniami komórka-komórka i matrycami zewnątrzkomórkowymi (ECM) po prostu poprzez obniżenie temperatury; w związku z tym enzymy proteolityczne, które uszkadzają ECM, takie jak trypsyna, nie są wymagane11. Dlatego inżynieria arkuszy komórkowych może zachować połączenia między komórkami i poprawić skuteczność przeszczepu komórek.

Ponadto, przeszczep arkusza komórkowego zwiększa przeżywalność komórek w porównaniu do iniekcji komórek12. W tym protokole szczury z cukrzycowym tłuszczem cukrzycowym (ZDF) zostały wybrane jako model cukrzycy typu 2 i otyłości z opóźnionym gojeniem się ran. U szczurów ZDF spontanicznie rozwija się otyłość po około 4 tygodniach. Następnie rozwija się u nich cukrzyca typu 2 z otyłością między 8 a 12 tygodniem życia, w którym to momencie wykazują hiperglikemię związaną z insulinoopornością, dyslipidemią i hipertriglicerydemią13. Obserwuje się również opóźnione gojenie się ran, zmniejszony przepływ krwi w obwodowych naczyniach krwionośnych i nefropatię cukrzycową14,15,16. Co więcej, szczury ZDF mogą być odpowiednim modelem do badania gojenia trudnych do leczenia owrzodzeń skóry, takich jak wrzody cukrzycowe.

Różnice między ludźmi a gryzoniami w mechanizmach gojenia ran są związane z anatomicznymi różnicami w skórze. Gojenie się ran u normalnych szczurów opiera się na skurczu rany, podczas gdy gojenie się ran u ludzi opiera się na ponownym nabłonku i tworzeniu ziarniny. Zazwyczaj szynowanie ran stosowane w modelach gryzoni pomaga zminimalizować skurcz rany i pozwala na stopniowe tworzenie się ziarniny tkanki17, chociaż rany u szczurów bez cukrzycy są prawie całkowicie zamykane przez skurcz. Jednak skurcz rany cukrzycowej u szczurów ZDF jest upośledzony, a gojenie się ran następuje głównie poprzez reepitelializację i tworzenie ziarniny; Tak więc proces ten jest bardziej podobny do gojenia się ran u ludzi14.

Rany cukrzycowe z odsłoniętą kością po oczyszczeniu są często spotykane klinicznie. Poprzednie badania dotyczyły ran skóry o pełnej grubości 12 mm na grzbietach nagich myszy atymicznych18,19 oraz rany skóry o pełnej grubości 10 mm na grzbietach normalnych myszy20. Aby opracować model kliniczny dla ciężkich ran cukrzycowych, u szczurów z cukrzycą typu 2 i otyłością stworzono większe (15 x 10 mm2) pełnogrube defekty skóry z odsłoniętą kością i bez okostnej, jak wcześniej opisano21.

Rat ASC (rASC) arkusze z ASC normalnych szczurów Lewisa zostały stworzone poprzez allogeniczne przeszczepienie arkuszy ASC. W praktyce klinicznej przeszczep autologiczny jest niewykonalny, ponieważ pacjenci z cukrzycą z wrzodami często wykazują ciężkie powikłania cukrzycowe, takie jak niekontrolowany wysoki poziom glukozy we krwi i wysokie wskaźniki masy ciała, a powikłania te powodują zaburzenia gojenia się ran, które zwiększają trudność pozyskania tkanki tłuszczowej od tych pacjentów. Co więcej, ASC pochodzące od zwierząt z cukrzycą wykazują zmienione właściwości i upośledzone funkcjonowanie22. Dlatego przedstawiony tutaj protokół opisuje allogeniczny przeszczep arkuszy rASC od normalnych szczurów i zastosowanie sztucznej skóry u szczurów z cukrzycą.

Dwuwarstwowa sztuczna skóra używana w tym protokole zapobiega spontanicznemu kurczeniu się ran, wspomaga syntezę nowej macierzy tkanki łącznej i przypomina prawdziwą skórę właściwą23. W tym protokole sztuczna skóra jest umieszczana na arkuszu rASC i mocowana nylonowymi nitkami, aby zapobiec skurczowi lub powiększeniu rany wynikającej z luźnej skóry szczura. Ponadto sztuczna skóra zapewnia trójwymiarową ramę dla prześcieradeł ASC, utrzymuje wilgotne środowisko dla przeszczepionych prześcieradeł ASC i ran oraz chroni rany przed infekcjami i siłami zewnętrznymi. Na koniec na ranę nakłada się nieprzywierający opatrunek, aby chronić ją przed uderzeniami zewnętrznymi, utrzymać wilgotne środowisko rany i wchłonąć wysięk.

Arkusz rASC jest cienki, elastyczny i odkształcalny i może być przyklejony do ruchomych miejsc odbiorców, takich jak bijące serce24. Inżynieria arkuszy komórkowych została wykorzystana do rekonstrukcji różnych tkanek i może generować efekty lecznicze25,26. Arkusze ASC, które wykazują kliniczny potencjał terapeutyczny, mogą przyspieszać gojenie się wielu rodzajów ran. Co więcej, allogeniczne przeszczepienie arkuszy ASC, w połączeniu z użyciem sztucznej skóry, może mieć zastosowanie w leczeniu trudnych do leczenia owrzodzeń lub oparzeń, takich jak te obserwowane w chorobie tętnic obwodowych lub chorobie kolagenu, lub może być podawane pacjentom niedożywionym lub stosującym sterydy. Takie podejście zwiększa skuteczność przesadzania ASC. Model szczura gojącego się ran ZDF wytwarza ciężki stan rany, który przypomina proces gojenia się ran u ludzi i naśladuje warunki kliniczne u małego zwierzęcia doświadczalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie przedstawione poniżej protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Szkoły Medycznej Kobiecego Uniwersytetu Medycznego w Tokio i spełniały wszystkie wymagania Wytycznych dotyczących prawidłowego przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach.

1. Przygotowanie zwierząt, instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw

  1. Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną przy użyciu minimalnej ilości niezbędnej pożywki alfa zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Użyj dorosłych samców szczurów ZDF jako modelu otyłości cukrzycowej typu 2. Użyj poduszeczki tłuszczowej samców szczurów Lewisa, aby wyizolować tkankę tłuszczową w celu przygotowania arkuszy komórkowych.

2. Izolacja i kultura rASC

  1. Uzyskaj tkankę tłuszczową od szczurów Lewisa (8 - 33 tygodnie, samiec) w znieczuleniu ogólnym za pomocą izofluranu.
    1. Przygotuj respirator mechaniczny dla gryzoni i 4% izofluranu. Przygotuj kilka sterylnych bawełnianych końcówek, czyste gazy, skalpel, uchwyt na igłę, nożyczki operacyjne, parę kleszczy i nylonowy szew 5-0. Wysterylizuj narzędzia i materiały chirurgiczne.
    2. Przygotować 100-milimetrową szalkę Petriego z 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu tymczasowego zachowania uzyskanej tkanki tłuszczowej. Zważyć szalkę Petriego za pomocą PBS za pomocą wagi przed rozpoczęciem operacji w celu zmierzenia pobranej tkanki tłuszczowej. Rozłóż narzędzia chirurgiczne i przybory na sterylnej zasłonie.
    3. Znieczulenie szczurów za pomocą izofluranu w stężeniu 3-4% za pomocą respiratora mechanicznego dla gryzoni i utrzymanie szczurów na poziomie 2-3% izofluranu podczas operacji. Monitoruj głębokość znieczulenia, obserwując głębokość i tempo oddychania każdego szczura.
    4. Nosząc sterylne rękawiczki, ułóż szczura w pozycji leżącej na sterylnym serwowaniu. Ogol obszar operacyjny elektryczną maszynką do golenia i oczyść część brzuszną szczura za pomocą sterylnej gazy nasączonej 70% etanolem.
    5. Wykonaj nacięcie skóry o długości około 5 cm za pomocą skalpela w bocznej dolnej części brzucha szczura. Odsłoń i wypreparuj zewnętrzny mięsień skośny. Następnie należy odsłonić tkankę tłuszczową najądrza otaczającą najądrza. Delikatnie wyciągnij tkankę tłuszczową najądrza.
      UWAGA: Tkankę tłuszczową można uzyskać po obu stronach brzucha szczura.
    6. Wytnij tylko tkankę tłuszczową najądrza, unikając uszkodzenia najądrza, jądra i naczyń krwionośnych najądrza (ryc. S1). Namocz wyciętą tkankę tłuszczową w PBS na szalce Petriego, aby zapobiec wysuszeniu i zważyć tkankę.
    7. Zamknij mięsień brzucha za pomocą 5-0 VICRYL, a skórę za pomocą nylonowego szwu 5-0. Następnie umieść każdego szczura, który przeszedł operację, do oddzielnej klatki (jeden szczur na klatkę).
      UWAGA: Monitoruj szczury, aż w pełni wyzdrowieją.
  2. Wyizoluj rASC z 2 - 3 g tkanki tłuszczowej (wyciętej od szczura Lewisa i przetworzonej zgodnie z wcześniej opisaną metodą)27. Krótko, enzymatycznie trawić wyciętą tkankę tłuszczową 0,1% kolagenazą typu A w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu uzyskania frakcji zrębowo-naczyniowej (SVF; Rysunek S2).
    1. Przygotuj kilka sitek do komórek o średnicy 100 μm, kilka probówek o pojemności 50 ml, kilka probówek o pojemności 15 ml i dwa skalpele na czystej biologicznie ławce. Włączyć wirówkę i podgrzać łaźnię wodną do temperatury 37 °C. Ponadto należy przygotować około 50 ml sterylnego PBS w probówce o pojemności 50 ml z 0,1% (stężeniem końcowym) kolagenazy typu A.
    2. Tkankę tłuszczową zmielić na małe kawałki za pomocą dwóch skalpeli.
    3. Przenieś całą zmieloną tkankę tłuszczową do probówki o pojemności 50 ml i dodaj PBS, aby uzyskać całkowitą objętość do 15 ml.
    4. Odstaw probówkę o pojemności 50 ml w pozycji pionowej przez 5 minut. Wyrzuć górną warstwę i zbierz dolną warstwę z wyjątkiem zanieczyszczeń.
    5. Dodać 0,1% roztworu kolagenazy typu A do 50-mililitrowej probówki z PBS zawierającej górną warstwę w celu enzymatycznego trawienia tkanki tłuszczowej.
      UWAGA: Podgrzej około 20 ml PBS na 2 - 3 g tkanki tłuszczowej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    6. Przechylić i delikatnie wstrząsnąć probówką o pojemności 50 ml z prędkością 120 - 130 obr./min przez 1 godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    7. Odstaw probówkę o pojemności 50 ml w pozycji pionowej na 5 minut po wstrząśnięciu.
    8. Przefiltrować roztwór za pomocą sitka o pojemności 100 μm i wlać roztwór do nowej probówki o pojemności 50 ml. Dozować przefiltrowany roztwór do dwóch probówek o pojemności 15 ml.
    9. Odwirować roztwór w probówkach o pojemności 15 ml przez 5 minut przy sile 700 x g. Ostrożnie usunąć górną warstwę supernatantu i pozostawić 5 ml dolnej warstwy roztworu. Nie zasysać osadu.
    10. Dodać około 5 ml kompletnej pożywki do każdej probówki o pojemności 15 ml, do 10 ml na probówkę o pojemności 15 ml i ostrożnie ponownie zawiesić osad.
    11. Powtórz kroki 2.2.8 - 2.2.9. Następnie uzyskaj SVF.
  3. Przygotuj dwie naczynia z kulturami o średnicy 60 cm2. Zebrać SVF po dwóch wirowaniach w ilości 700 × g przez 5 minut. Zawiesić SVF i umieścić 10 ml roztworu SVF na każdym 60-centymetrowymnaczyniu hodowlanym 2.
  4. Hodować naczynia przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    5. .
  5. Przygotować PBS i 0,25% kwas tetraoctowy (EDTA) trypsyny-etylenodiaminy, które można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  6. Po wstępnym posiewie (24 godziny) umyj komórki PBS 3 razy, aby usunąć nieprzyczepione komórki i zanieczyszczenia. Dodaj świeże, kompletne podłoże.
  7. Przejdź przez komórki, które są prawie zlewające się w 3 dniu. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 3 - 5 minut.
    UWAGA: Zakończ etap trypsynizacji w ciągu 10 minut, aby zapobiec uszkodzeniu komórek.
  8. Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym po trypsynizacji, aby potwierdzić, że wszystkie komórki dokładnie oderwały się od naczyń. Następnie dodaj 9 ml kompletnej pożywki hodowlanej do szalek.
  9. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  10. Subkulturuj komórki o gęstości 1,7 x 103 komórki/cm2 co 3 dni, aż do pasażu 3. Hodować subhodowlane komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze inkubatora o stężeniu 5%CO2
    11. .

3. Tworzenie arkuszy rASC

  1. Przygotuj kilka naczyń hodowlanych o średnicy 35 mm reagujących na temperaturę. Wstępnie pokryć naczynia FBS (lub kompletną pożywką zawierającą FBS) w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez ponad 1 godzinę
    UWAGA: Naczynie hodowlane reagujące na temperaturę o średnicy 35 mm jest produktem dostępnym na rynku.
  2. Przygotować płytkę termiczną i inkubować w temperaturze 37 °C w celu przeprowadzenia następujących procedur doświadczalnych.
    UWAGA: Każdą procedurę należy wykonywać przy użyciu naczyń hodowlanych reagujących na temperaturę na płytce termicznej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec spontanicznemu odłączaniu się komórek od naczynia.
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentów ogrzać kompletną pożywkę hodowlaną użytą w procedurach do temperatury 37 °C.
    2. Pasaż nasion: 3 rASC pochodzące od szczurów Lewisa na naczynie hodowlane o średnicy 35 mm reagującej na temperaturę o gęstości 1,5 x 105 komórek/szalkę przez 3 dni przy użyciu 2 ml całkowitej objętości kompletnej pożywki hodowlanej.
      UWAGA: Po posianiu rASC na nowej szalce hodowlanej, naczynie należy powoli kołysać w przód iw tył oraz w lewo i w prawo w inkubatorze, aby uzyskać równomierny wysiew rASC i jednolicie gruby arkusz rASC.
    3. Zmienić 2 ml pożywki na 2 ml kompletnej pożywki zawierającej 16,4 μg/ml n-hydratu (AA) fosforanu kwasu L-askorbinowego i soli magnezu (AA) w 3. dniu po wysianiu na szalki hodowlane reagujące na temperaturę inkubowane na płytce termicznej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Rozpuszczony AA można przechowywać w temperaturze -30 °C przez wiele miesięcy.
    4. Hoduj komórki przez dodatkowe 4 - 5 dni i wymieniaj pożywkę co 2 dni na świeżą pożywkę zawierającą AA.
    5. Potwierdź proliferację i wytwarzanie ASC pod mikroskopem świetlnym, aby określić, czy wystąpiły przerwy między komórkami w ciągłym arkuszu komórek.
  3. Przenieś arkusze komórek z inkubatora na stół na 15 - 20 minut, aby schłodzić je do temperatury pokojowej; obserwuj, jak komórki spontanicznie odrywają się jako ciągły arkusz komórek. Zbierz arkusz rASC z powierzchni naczynia za pomocą kleszczy.
    UWAGA: Zazwyczaj arkusze rASC można obsługiwać za pomocą kleszczy. W razie potrzeby można użyć membrany transferowej do przeniesienia arkusza komórek z naczynia hodowlanego do miejsca rany, jeśli arkusz komórek jest kruchy i kruchy.

4. Przygotowanie pełnogrubego modelu rany ubytku skóry i przeszczepienie arkuszy rASC

  1. Przygotuj respirator mechaniczny dla gryzoni i 4% izofluranu. Przygotuj kilka sterylnych bawełnianych końcówek, czystą gazę, nylonowy szew 5-0, skalpel, okostną raspatorium, uchwyt na igłę, nożyczki operacyjne i parę kleszczy. Wysterylizuj narzędzia i materiały chirurgiczne. Rozłóż narzędzia chirurgiczne i przybory na sterylnej zasłonie.
  2. Przygotuj PBS i utrzymuj go w temperaturze pokojowej, wraz ze sztuczną skórą i nieprzywierającym opatrunkiem. Wstępnie przyciąć sztuczną skórę (15 x 10 mm) i opatrunek nieprzywierający (20 × 15 mm). Namocz wewnętrzną warstwę gąbki kolagenowej sztucznej skóry w soli fizjologicznej przed użyciem sztucznej skóry.
    UWAGA: Sztuczna skóra składa się z dwóch warstw: zewnętrznej warstwy arkusza silikonu i wewnętrznej gąbki kolagenowej.
  3. Użyj szczurów ZDF (16 - 18 tygodni, samce, 500 - 600 g) jako model gojenia się ran w cukrzycy typu 2 i otyłości.
  4. Znieczulić szczury ZDF poprzez wdychanie 4% izofluranu za pomocą respiratora mechanicznego gryzoni. Wywołać znieczulenie za pomocą izofluranu w dawce 4 - 5% za pomocą respiratora mechanicznego dla gryzoni i utrzymać je na poziomie 3 - 4% podczas operacji. Monitoruj głębokość znieczulenia, obserwując głębokość i szybkość oddychania każdego szczura za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  5. Nosząc sterylne rękawiczki, ułóż szczura w pozycji leżącej na sterylnym serwowaniu. Oczyść głowę szczura sterylną gazą nasączoną 70% etanolem, ogol obszar operacyjny elektryczną maszynką do golenia, a skórę po goleniu oczyść sterylną gazą nasączoną 70% etanolem.
  6. Stwórz kwadratową ubytek skóry o pełnej grubości (15 x 10 mm2) na głowie znieczulonych szczurów ZDF, usuwając tkankę skórną z naskórka do okostnej. Wyciąć skórę i tkankę skórną skalpelem i usunąć okostną za pomocą okostnej.
  7. Bezpośrednio przed przesadzeniem przenieść rASC na naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm reagującej na temperaturę z inkubatora do środowiska o temperaturze pokojowej.
  8. Obserwuj, jak rASC na naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm reagującej na temperaturę samoistnie odrywają się jako arkusz od powierzchni szalki po utworzeniu się rany. Zbierz arkusze rASC po 7 dniach hodowli na szalkach hodowlanych reagujących na temperaturę. Usunąć pożywkę hodowlaną i trzykrotnie umyć arkusz rASC PBS. Namocz arkusz rASC w PBS do czasu przeszczepu, aby zapobiec wysuszeniu.
  9. Umieść arkusz rASC bezpośrednio nad wadą czaszki za pomocą kleszczy. Jeśli arkusz komórek jest kruchy i kruchy, membrana może być użyta jako rusztowanie do przenoszenia arkusza komórkowego z naczynia hodowlanego na miejsce rany.
  10. Przykryj arkusz rASC i ubytek sztuczną skórą (15 x 10 mm2) i zamknij ranę około 10 szwami za pomocą nylonowego szwu 5-0. Aby zabezpieczyć ranę, należy założyć nieprzylepny opatrunek (20 x 15 mm2) na sztuczną skórę, używając nylonowych szwów 5-0, aby utrzymać wilgotność rany i wchłonąć wysięk.
    UWAGA: Opatrunki nieprzywierające zostaną usunięte przez szczury ZDF w ciągu kilku dni po aplikacji. Dlatego konieczne jest regularne monitorowanie szczurów po przeszczepie. Zazwyczaj opatrunek nieadhezyjny wymienia się co 2 dni w znieczuleniu ogólnym.
  11. Umieść każdego szczura, który przeszedł operację, do oddzielnej klatki, aż w pełni wyzdrowieją (jeden szczur na klatkę). Po okresie obserwacji szczury należy poddać eutanazji przy użyciu zatwierdzonej metody przedawkowania izofluranu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół próbował ustanowić nową terapię komórkową dla trudnych do leczenia ran cukrzycowych. W skrócie (jak pokazano na rycinie 1), allogeniczne arkusze rASC zostały stworzone z normalnych szczurów przy użyciu inżynierii arkuszy komórkowych, a następnie przeszczepione przy użyciu dwuwarstwowej sztucznej skóry na ubytek skóry o pełnej grubości u szczura z cukrzycą. Obrazy z mikroskopu świetlnego przedstawiające dobry przykład arkusza rASC (rysunek 2A)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytyczne kroki dla pomyślnego wyhodowania arkusza rASC są następujące: 1) Temperatura musi być utrzymywana na poziomie około 37 °C podczas hodowli na szalkach hodowlanych reagujących na temperaturę. Podczas tworzenia arkusza rASC każda procedura była wykonywana na płytce termicznej o temperaturze 37 °C, a każdy odczynnik był podgrzewany do 37 °C, aby zapobiec samoistnemu odłączaniu się komórek od naczynia31. 2) Szczury ZDF biorcy muszą być monitorowane, aby zapobiec usunięciu opatrunk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący autorzy ujawniają powiązania finansowe związane z tą publikacją: Teruo Okano jest założycielem i dyrektorem zarządu firmy Cell Seed Inc., która udziela licencji na technologię i patenty z Tokijskiego Kobiecego Uniwersytetu Medycznego, a Teruo Okano i Masayuki Yamato są udziałowcami Cell Seed Inc. Tokijski Kobiecy Uniwersytet Medyczny otrzymuje fundusze na badania od Cell Seed Inc. Pozostali autorzy oświadczają, że nie łączą ich powiązania finansowe mające związek z niniejszą publikacją.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Yukiko Koga z Wydziału Chirurgii Plastycznej i Rekonstrukcyjnej Juntendo University School of Medicine za udzielenie praktycznych porad. Dziękujemy również panu Hidekazu Muracie z Centrum Diabetyków Szkoły Medycznej Kobiecego Uniwersytetu Medycznego w Tokio za doskonałe wsparcie techniczne. Badanie to było wspierane przez Program Tworzenia Centrów Innowacji dla Zaawansowanych Interdyscyplinarnych Obszarów Badawczych w ramach Projektu Rozwoju Systemów Innowacji "Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)" z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
α-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Surowica bydlęca płodu (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Penicylina/streptomycynaLife Technologies15140-122
Kolagenaza ARoche Diagnostics10 103 578 001Mannheim, Niemcy
60 cm2 Naczynie do hodowli tkankowej PrimariaBD Biosciences353803Franklin Lakes, NJ
Sól fizjologiczna buforu fosforanowego Dulbecco (PBS)Life Technologies1490-144
0,25% Kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Life Technologies25200-056
Fosforan kwasu L-askorbinowego sól magnezowa n-hydratWako013-19641
35-milimetrowe naczynie hodowlane reagujące na temperaturę (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Tokio, Japonia
Mikrociepła płytka (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Wentylator mechaniczny gryzoniStoelting#50206Wood Dale, IL
4% izofluranPfizer Japan114-13340-3Tokio, Japonia
Sztuczna skóra (Pelnac® )Smith& SiostrzeniecPN-R40060  Tokio, Japonia
Opatrunek nieadhezyjny (Hydrosite plus® )Smith& Siostrzeniec66800679Znany jako Allevyn non-hessing® w Stanach Zjednoczonych
5-0 nylonowy szewAlfresaEP1105NB45-KF2
20 PROBÓWKI CELLSTARGreiner Bio-one227 261
15 mL Probówka wirówkowaCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEALHu-FriedyP14Chicago, IL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
  2. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
  3. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  4. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  5. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
  8. Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
  9. Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
  10. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
  11. Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
  12. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  13. Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
  14. Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
  15. Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
  16. Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
  17. Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
  18. Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
  19. McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
  20. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  21. Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
  22. Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
  23. Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
  24. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  25. Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  26. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  27. Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
  28. Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
  29. Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
  30. Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
  31. Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mezenchymalne kom rki macierzyste pochodzenia t uszczowegonaczynie hodowlane reaguj ce na temperaturfrakcja naczyniowo stromalnaszczur cukrzykowy Zucker ZDFsztuczna sk ratransplantacja kom rektkanka t uszczowa przym kkowape nowarstwowy defekt sk ry

Powiązane artykuły