Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (ISSA) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54553

⸱

5 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Ecosystem and Forest Sciences, Faculty of Science, The University of Melbourne, 2Victorian AgriBiosciences Centre, La Trobe University R&D Park, 3College of Biological Sciences, Department of Plant Biology, University of California, Davis, 4Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który ułatwia funkcjonalną charakterystykę genów i konstruktów promotorowych w wtórnej tkance pnia drzewa w stosunkowo krótkim czasie. Jest wydajny, łatwy w użyciu i ma szerokie zastosowanie w przypadku wielu gatunków drzew.

Streszczenie

Wtórny wzrost pni drzew i związane z tym formowanie drewna są istotne zarówno z biologicznego, jak i komercyjnego punktu widzenia. Jednak stosunkowo niewiele wiadomo na temat kontroli molekularnej, która rządzi ich rozwojem. Wynika to częściowo z ograniczeń fizycznych, zasobowych i czasowych, często związanych z badaniem wtórnych procesów wzrostu. Zastosowano szereg technik in vitro, obejmujących część lub cały system roślinny zarówno u gatunków roślin drzewiastych, jak i niedrzewiastych. Jednak pytania o ich przydatność do badania wtórnych procesów wzrostu łodyg, krnąbrności niektórych gatunków i pracochłonności są często zaporowe w przypadku zastosowań o średniej i wysokiej przepustowości. Ponadto, jeśli chodzi o wtórny rozwój pnia i formowanie się drewna, konkretne badane cechy mogą stać się mierzalne dopiero pod koniec cyklu życia drzewa, po kilku latach wzrostu. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano alternatywne protokoły in vivo, zwane Indukowaną Analizą Sektorów Somatycznych, które polegają na tworzeniu transgenicznych sektorów tkanki somatycznej bezpośrednio w wtórnej łodydze rośliny. Celem tego protokołu jest zapewnienie skutecznego, łatwego i stosunkowo szybkiego sposobu tworzenia transgenicznej wtórnej tkanki roślinnej do charakterystyki funkcjonalnej genów i promotorów, która może być wykorzystana w wielu gatunkach drzew. Zaprezentowane tutaj wyniki pokazują, że transgeniczne wtórne sektory łodyg mogą być tworzone we wszystkich żywych tkankach i typach komórek w wtórnych pniach różnych gatunków drzew oraz że cechy morfologiczne drewna, a także wzorce ekspresji promotorów w pędach wtórnych mogą być łatwo oceniane, co ułatwia charakterystykę funkcjonalną o średniej i wysokiej przepustowości.

Wprowadzenie

Łodygi drzew stanowią znaczną część biomasy planety i mają ogromne znaczenie biologiczne, kulturowe i handlowe. Wtórne łodygi tworzą siedlisko, zapewniając zasoby i schronienie wielu innym formom życia. Świadczą one wiele innych usług na rzecz ekosystemów, które zamieszkują, i działają jako zasoby odnawialne do produkcji drewna, masy celulozowej i papieru oraz innych produktów drzewnych i niedrzewnych. Wtórny rozwój łodygi, a dokładniej tworzenie drewna, jest regulowany przez złożony system molekularny, który reguluje rozwój określonych typów komórek, skład biochemiczny ich ścian komórkowych oraz sposób ich ułożenia w celu utworzenia tkanek i narządów. Analiza molekularnych podstaw wtórnego rozwoju pni i formowania się drewna jest zakłócona przez wiele czynników, w tym zmienność właściwości drewna i pnia w obrębie pni i między nimi, długi czas generacji, krzyżujące się systemy kojarzenia, wysoką heterozygotyczność, wysokie obciążenie genetyczne, spoczynek sezonowy, długie okresy tworzenia się dojrzałych cech i sam rozmiar fizyczny dojrzałych drzew. W rezultacie, zrozumienie wtórnego rozwoju łodygi w stosunku do szczegółowej wiedzy na temat większości innych aspektów molekularnej kontroli rozwoju roślin jest wciąż w powijakach.

Do badania i zrozumienia wtórnego rozwoju łodyg użyto wielu technik in vitro, w szczególności tworzenia się drewna i wtórnych ścian komórkowych. Protokoły te obejmują wykorzystanie całych systemów roślin lub części roślin, w których tworzone są rośliny transgeniczne lub określone wtórne komórki lub tkanki są przekształcane w celu zbadania określonych aspektów rozwoju drewna i/lub wtórnego pnia1. Rośliny transgeniczne można odzyskać po transformacji genetycznej z szerokiej gamy tkanek roślinnych i typów komórek, jednak postęp jest powolny, szczególnie podczas analizy cech włókien drzewnych ze względu na długi czas regeneracji i dojrzewania łodygi (w ciągu lat), wysokie wymagania techniczne i pracochłonne, niską przepustowość genów kandydujących, a także trudności w rozmnażaniu niektórych gatunków roślin drzewiastych. Podobne techniki zostały opracowane w modelach niezdrewniałych, takich jak Arabidopsis, które z powodzeniem przezwyciężają niektóre z tych ograniczeń, ale nie wszystkie wtórne typy komórek macierzystych obecne w tych łodygach i cechy związane z sezonowością lub długowiecznością nie mogą być badane u takich gatunków2. Alternatywnie, systemy części roślin, takie jak kultury kalusa Pinus radiata 3 skracają związane z tym ramy czasowe. Metody te są jednak ograniczone do badania pojedynczego typu komórek i podlegają podobnym ograniczeniom, jak w przypadku eksperymentów in vitro. Podobnie, wierzchołkowe kultury łodyg4 obejmujące eksplantaty całych łodyg okazały się obiecujące, ale jak dotąd nie zostały zastosowane do badania konkretnych genów lub promotorów zainteresowania. Niedawno opracowano alternatywny protokół obejmujący owłosione kultury korzeniowe dla eukaliptusów i został on z powodzeniem zastosowany5, jednak metoda ta nadal wymaga uprawy in vitro, obejmuje korzenie wtórne, a nie łodygi i do tej pory ogranicza się do jednego gatunku drzewa.

Indukowana analiza sektorów somatycznych (ISSA), opisana tutaj, została opracowana w celu przezwyciężenia niektórych z tych problemów, dostarczając narzędzie do badań funkcjonalnych o średniej i wysokiej przepustowości dla genów i promotorów z podejrzeniem roli w tworzeniu drewna i rozwoju wtórnych tkanek macierzystych. ISSA to system transformacji i badań przesiewowych in vivo, który został opracowany w celu skrócenia czasu potrzebnego do wytworzenia transgenicznych komórek i tkanek w nienaruszonym wtórnym trzonie, przy jednoczesnym przezwyciężeniu ograniczeń związanych z pracą, technologią i przepustowością rutynowo stosowanych metod in vitro. Opisane tutaj protokoły pozwalają na jednoczesne tworzenie setek niezależnie przekształconych sektorów tkanek i komórek w wtórnych łodygach w krótkim czasie, w interesujących gatunkach drzew i tkankach bez zmienności genetycznej i/lub środowiskowej w stosunkowo krótkich ramach czasowych i przy niskich kosztach pracy. Techniki ISSA in vivo zostały po raz pierwszy opisane dla drugorzędowych tkanek pnia6 i pąków7, a następnie zostały udoskonalone w drugorzędowej tkance macierzystej poprzez badania genów i / lub promotorów zaangażowanych w różnicowanie kambium i obejmują: tubulinę (TUB)8, arabinogalaktan faszywopodobny (FLA)9, syntazę celulozy (CESA)10, drugorzędową domenę nac związaną ze ścianą komórkową (SND2)11, ARBORKNOX (ARK1)12 i bardzo interesujący nowy gen (RING) białko H213. Badania te przeprowadzono na drugorzędowych łodygach topoli i eukaliptusa i dostarczyły informacji na temat morfologii komórek, chemii ściany komórkowej i ekspresji genów.

Opisane tutaj protokoły mają na celu zebranie doświadczenia i wiedzy zdobytej dzięki rozwojowi i zastosowaniu ISSA z szeregu opublikowanych i niepublikowanych badań w ciągu ostatniej dekady. Koncentrują się one na transformacji in vivo wtórnych tkanek macierzystych6 i koncentrują się na badaniach z udziałem klonu Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus, a także 11 klonów Eucalyptus globulus x camaldulensis. Dokument ten prowadzi badaczy przez protokół od uprawy roślin i bakterii, transformacji tkanek macierzystych, wzrostu i pobierania tkanek, identyfikacji komórek i tkanek transgenicznych, przygotowania do oceny fenotypowej oraz metod gromadzenia i analizy danych. Chociaż techniki zostały z powodzeniem zastosowane do pomiaru składu monosacharydów ściany komórkowejrównież 9,11, ze względu na ograniczenia przestrzenne, niniejszy dokument koncentruje się na technikach stosowanych do pomiaru morfologii komórek i tkanek oraz zrozumienia wzorców ekspresji genów tylko w drugorzędowych łodygach. W związku z tym przedstawiony protokół jest odpowiedni dla tych, którzy chcą uzyskać więcej informacji na temat roli i/lub ekspresji genów związanych z wtórnymi łodygami przy użyciu taniej, technicznie łatwej i średnio lub wysokoprzepustowej metody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie materiału roślinnego

  1. Przed przystąpieniem do eksperymentów należy wyhodować nowe siewki preferowanego gatunku drzewa z nasion lub ściętych drzew i uprawiać drzewo/drzewa, aż średnica pnia w obszarze przeznaczonym do eksperymentów osiągnie około 1 cm średnicy.
    Uwaga: Potrzebny czas może się różnić ze względu na tempo wzrostu roślin, dlatego na ten krok należy przeznaczyć od trzech do dziewięciu miesięcy.

2. Tworzenie wektorów binarnych

  1. Prace, o których mowa w niniejszej sekcji do sekcji 7, należy przeprowadzać w laboratorium lub szklarni, w której można pracować z Agrobacterium tumefaciens i w którym stosuje się odpowiednie środki ochrony indywidualnej przewidziane dla laboratorium.
  2. Przygotować wektor binarny zawierający kasetę z genem powodującym wyciszenie lub nadekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania oraz kasetę genu reporterowego β-glukuronidazy (GUS) lub promotor zainteresowania połączony z genem GUS, w zależności od rodzaju badania.
    Uwaga: Istnieje wiele binarnych szkieletów wektorowych, które można pozyskać komercyjnie lub za pośrednictwem sieci badawczych, a także liczne dostępne techniki wstawiania genów i promotorów zainteresowania do wektorów binarnych. W kontekście tego protokołu to do eksperymentatora należy podjęcie decyzji o tym, jak stworzyć wektor binarny.
  3. Przekształć wektor binarny w rozbrojony szczep A. tumefaciens za pomocą elektroporacji lub szoku cieplnego14 i przechowuj odpowiednio, dopóki nie będzie to potrzebne do eksperymentów.
  4. Powtórzyć krok 2.2 dla wszystkich kontroli dodatnich i/lub ujemnych.
    Uwaga: Kontrole ujemne powinny obejmować wektor binarny niezawierający genu będącego przedmiotem zainteresowania w badaniu genu będącego przedmiotem zainteresowania oraz GUS bez promotora w przypadku badania będącego promotorem zainteresowania. Kontrola pozytywna w badaniu promotora zainteresowania powinna obejmować promotor wirusa mozaiki kalafiora 35s (CaMV35s) połączony z reporterem GUS.

3. Przygotowanie A. tumefaciens do inokulacji

  1. Co najmniej tydzień przed eksperymentem należy pobrać niewielką ilość (około 1 μl) A. tumefaciens przygotowaną w kroku 2.2 i 2.3 i rozprowadzić cienko na oddzielnej pożywce LB z płytkami agarowymi14 zawierającymi odpowiednie antybiotyki do selekcji bakterii. Hodować w temperaturze 28 °C w inkubatorze, aby utworzyć małe kolonie, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
  2. Na 48 godzin przed eksperymentem przenieść jedną kolonię A. tumefaciens z każdej płytki do oddzielnych zakręcanych probówek o pojemności 50 ml zawierających 5 ml wstępnie podgrzanej (28 °C) pożywki LB14 zawierającej odpowiednie antybiotyki do selekcji bakteryjnej i mieszać z prędkością 200 obr./min w inkubatorze z wytrząsarką przez około 48 godzin w temperaturze 28 °C, aż mieszanina stanie się bardzo mętna.
  3. Między 4-6 godzinami przed inokulacją łodyg roślin (sekcja 4) dodać 1 ml mieszaniny LB/A. tumefaciens do świeżej 50 ml zakręcanej probówki zawierającej 19 ml (rozcieńczenie 1:20) świeżej, ciepłej (28 °C) pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami do selekcji bakterii. Jeżeli gęstość optyczna (OD) przy 600 nm (OD600, mierzona za pomocą spektroskopii) przekracza 0,1, należy rozcieńczyć ciepłą LB, aż do osiągnięcia tej wartości.
  4. Umieścić rozcieńczoną mieszaninę LB/A. tumefaciens z powrotem w inkubatorze wytrząsarki i wstrząsać w tych samych warunkach (200 obr./min, 28 °C) do momentu, gdy OD600 znajdzie się między 0,4-0,6 i usunąć.
  5. Odwirować mieszaninę LB/A. tumefaciens przez 15 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C.
  6. Zdekantować płyn i natychmiast ponownie zawiesić osad A. tumefaciens w 1 ml schłodzonej pożywki MS15, przenieść do mikroprobówki o pojemności 2 ml i przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie to potrzebne do zaszczepienia (sekcja 4). To rozwiązanie jest określane jako pożywka inokulacyjna.

4. Inokulacja łodygi rośliny A. tumefaciens

  1. Rozpocznij eksperymenty późną wiosną lub wczesnym latem, używając roślin stworzonych w sekcji 1, które mają aktywne i szybko rosnące kambium. Dobrą diagnostyką dla aktywnego i szybko rosnącego kambium jest to, że łyko można łatwo oderwać od ksylemu.
  2. Znajdź czysty prosty odcinek łodygi w pobliżu podstawy rośliny i usuń wszelkie liście i gałęzie.
  3. Za pomocą ostrego skalpela (najlepiej nr 11) lub żyletki, utwórz "okno kambimiczne" o długości 1 cm2 w przezroczystym odcinku łodygi, wprowadzając dwa pionowe równoległe nacięcia przez łyko o długości 20 mm i jedno w odległości 5 mm od siebie, a następnie poziome cięcie, które łączy dwa pionowe nacięcia na ich podstawowym końcu.
  4. Oderwij pasek łyka utworzony przez nacięcie do góry, odsłaniając rozwijającą się tkankę ksylemu i dodaj wystarczającą ilość pożywki inokulacyjnej z kroku 3.6, aby zwilżyć powierzchnię odsłoniętego rozwijającego się ksylemu za pomocą pipety (zwykle 5-10 μl). Natychmiast ponownie włóż pasek łyka.
  5. Zwiąż pasek łyka mocno z łodygą za pomocą Parafilm.
  6. Powtórzyć kroki 4.2-4.5 dla wszelkich dodatkowych okien kambialnych dla genu(-ów) lub promotora(-ów) będącego(-ych) przedmiotem zainteresowania, tworząc nowe okna kambialne co najmniej 1 cm powyżej lub poniżej innych okien kambialnych i przy przesunięciu o 90°.
  7. Wykonać kroki 4.2–4.5 dla wektorów kontroli dodatniej i ujemnej (etap 2.4), upewniając się, że każdy wektor został dodany do tej samej łodygi każdej rośliny użytej w doświadczeniu.
  8. Okresowo monitorować wzrost średnicy łodygi i zbiór do testu GUS (sekcja 5), gdy zaobserwowano promienisty wzrost łodyg o co najmniej 5 mm.
    Uwaga: Potrzebna wielkość przyrostu promieniowego zależy od ilości tkanki wymaganej do dalszej analizy.

5. Pobieranie do testu histologicznego GUS

  1. Usunąć "okno kambium" z łodygi, usuwając wszelkie tkanki niebędące częścią nowego wzrostu w obrębie okna kambialnego.
    1. W przypadku badań związanych z morfologią dojrzałego ksylemu i komórek/tkanek łyka należy oderwać łyko od ksylemu.
    2. W przypadku badań, w których wymaga, aby strefa kambialna pozostała nienaruszona lub mają być oceniane wzorce ekspresji promotora, okienko kambium należy pokroić okienko kambium poprzecznie za pomocą żyletki lub innego ostrego ostrza na krążki o grubości od 0,5 do 1 mm.
  2. Umieścić przetworzone tkanki z okienkiem kambialnym w 14 ml probówkach z okrągłym dnem i dwukrotnie spłukać w 0,1 M buforze fosforanowym o pH7-14. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona, pozostaje w roztworze przez co najmniej pięć minut, a cały nadmiar roztworu jest usuwany pod koniec drugiego płukania.
  3. Dodać 5 ml odczynnika GUS (0,5 mM X-gluc (kwas 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-glukuronowy), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 v/v, 0,5 mM żelazocyjanku(III) potasu, 0,05 mM żelazocyjanku(II) potasu, uzupełnionego do końcowej objętości 0,1 mM buforu fosforanowego o pH 7; patrz Hawkins i wsp.16) do każdej tuby. Jeśli tkanka nie jest całkowicie zanurzona, dodaj dodatkowy odczynnik GUS.
  4. Inkubować probówki przez 10 minut w temperaturze 55 °C w ciemności.
  5. Inkubować probówki przez kolejne 12-16 godzin na inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C w ciemności, delikatnie mieszając (między 30 a 60 obr./min), aby umożliwić mieszanie.
  6. Po wyjęciu z inkubatora wytrząsarki wyrywkowo sprawdź pH odczynnika GUS w małym podzestawie probówek za pomocą papierka lakmusowego o zakresie pH 0-7.
    1. Jeśli którakolwiek z probówek ma pH poniżej 6, oznacz je. Kontynuuj sprawdzanie pozostałych probówek, aby potwierdzić pH i oznaczyć, jeśli pH wynosi 6 lub mniej.
      Uwaga: Próbki o pH poniżej 6 mogą nie nadawać się do analizy. Próbki te muszą być wyłączone z dalszej analizy.
  7. Zdekantować odczynnik GUS i zastąpić go wystarczającą ilością 70% etanolu, aby pokryć tkankę.
  8. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.

6. Identyfikacja tkanki transgenicznej

  1. Za pomocą kleszczy wyjmij całą tkankę okienka kambialnego z probówki i umieść ją na małej tacy lub szalce Petriego, aby umożliwić wizualizację mikroskopową.
  2. Używając mikroskopu preparacyjnego o powiększeniu od 1X do 4X, zidentyfikuj i policz liczbę komórek lub tkanek, które mają jasnoniebieskie zabarwienie. Od tego momentu zabarwione na niebiesko komórki lub tkanki są określane jako sektor. Zlicz je w następujący sposób.
    1. W przypadku próbek, z których usunięto łyko (etap 5.1.1), należy policzyć liczbę sektorów w tkance kambialnej znajdujących się na powierzchni rozwijającego się ksylemu (sektor kambialny, rysunek 1a).
    2. W przypadku próbek, które zostały pocięte na krążki (krok 5.1.2), należy policzyć sektory liczbowe znajdujące się w różnych typach komórek lub tkanek (rysunek 1b, 1c, 1d). Sektory można znaleźć w następujących typach tkanek: peryderma (sektor Periderm, ryc. 1e), łyko (sektor łyka, ryc. 1f), tkanka kambialna (sektor kambialny, ryc. 1g, 1h, 1I), miąższ rany (sektor miąższu rany, ryc. 1j) oraz w tylozach (sektor łyka, ryc. 1k).
      1. Podczas oceny mikroskopowej upewnij się, że obie strony dysku zostały obejrzane i że sektory, które występują na dwóch dyskach, są dopasowane, aby liczby nie były zawyżone.
  3. Umieść tylko sektory zawierające tkankę z powrotem w probówce zawierającej 70% etanolu i przechowuj, aż będą potrzebne.
  4. Powtórzyć kroki od 6.1 do 6.3 dla wszelkich dodatkowych okien kambialnych, w tym kontroli dodatniej i/lub ujemnej.
  5. Obliczyć średnią wydajność transformacji dla każdego typu sektora dla każdego genu lub promotora będącego przedmiotem zainteresowania oraz oddzielnie dla kontroli, dzieląc całkowitą liczbę sektorów przez całkowitą liczbę okien kambialnych 1 cm2 w celu uzyskania średniej liczby zdarzeń transformacji nacm2 zaszczepionego kambium (ATScm-2).
  6. Przejdź do kroku 7.2 i 8 w celu analizy wzorców ekspresji promotora oraz kroku 7.1, 7.2 lub 7.3 w celu oceny morfologii komórek i tkanek w tkance kambialnej.

7. Analiza morfologii komórek i tkanek w tkance kambialnej

Uwaga: Poniżej znajduje się wybór technik, które zostały z powodzeniem wykorzystane do analizy próbek pochodzących z ISSA.

  1. Analiza obszaru komórek ksylemu, obszaru światła, grubości ściany komórkowej i powierzchni ściany komórkowej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
    Uwaga: Protokół ten wymaga minimalnego przygotowania próbki i pozwala na stosunkowo wysoką wydajność analizy sektorów związanych z nakreślonymi cechami morfologicznymi.
    1. Począwszy od tego kroku, należy upewnić się, że fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice są używane za każdym razem, gdy dotykana jest tkanka drzewna i traktowana.
    2. Zidentyfikuj sektor kambium do analizy i wykonaj nacięcie około 0,5 mm z każdej jego strony, używając żyletki z pojedynczą krawędzią, aby utworzyć krążek (Rysunek 2a).
    3. Odetnij nadmiar tkanki ksylemu, pozostawiając około 1 mm tkanki ksylemu na styczną stronę sektora (ryc. 2b).
    4. Ostrożnie przeciąć poprzecznie środek sektora za pomocą świeżej żyletki z podwójną krawędzią (Rysunek 2c).
    5. Wykonaj dwa dodatkowe płytkie nacięcia promieniowe na płaszczyźnie poprzecznej po obu stronach sektora, aby wyznaczyć tkankę transgeniczną (ryc. 2d). Ponieważ barwienie GUS nie wnika głęboko w tkankę, podążaj wzdłuż promieniowych plików komórek po obu stronach barwionej tkanki znajdującej się na powierzchni kambium.
    6. Przymocuj przygotowany sektor kambium stroną do góry do stopnia montażu króćca SEM za pomocą taśmy przewodzącej SEM (rysunek 2e) i trzymaj w eksykatorze, aż będzie potrzebny do wizualizacji SEM.
    7. Powtórzyć kroki 7.1.2-7.1.6 dla wszystkich dodatkowych sektorów, w tym sektorów objętych kontrolą ujemną.
    8. Korzystając z SEM w trybie niskiej próżni (energia 5 kV, punkt 3,0 nm), wizualizuj i rób zdjęcia komórek/tkanek w sektorze, a także komórek/tkanek bezpośrednio przylegających do sektora (rysunek 2f). Wielkość powiększenia zależy od interesujących nas cech. W przypadku włókien ksylemu odpowiednie jest 2,000X (rysunek 2g).
    9. Po wizualizacji sektora kambium i wykonaniu zdjęć w odpowiednim powiększeniu, zmierz interesujące cechy morfologiczne komórek/tkanek ksylemu za pomocą oprogramowania do pomiaru obrazu.
    10. W celu analizy statystycznej należy przeprowadzić wiele analiz parami przy użyciu sparowanych testów t, aby porównać różnicę między morfologią zmierzoną w sektorze transgenicznym a sąsiednimi nietransgenicznymi komórkami/tkankami kontrolnymi (mierzonymi w odległości 0,5 mm od krawędzi sektora) dla każdego sektora w celu wyznaczenia wartości p.
    11. Powtórzyć krok 7.1.10 dla kontroli ujemnej.
      1. W przypadkach, gdy kontrola pozytywna wykazuje niską wartość p (α <0,05), należy obliczyć różnicę między transgenicznymi i sąsiednimi komórkami/tkankami nietransgenicznymi dla cechy morfologicznej. Tę "wartość różnicy" należy wykorzystać w niesparowanym teście t, aby porównać wpływ genu będącego przedmiotem zainteresowania z kontrolą ujemną w celu określenia wartości p.
  2. Analiza histochemiczna morfologii komórek/tkanek kambialnych lub wzorców ekspresji promotorów w komórkach/tkankach macierzystych przy użyciu mikroskopii świetlnej.
    Uwaga: Chociaż metoda ta jest bardziej czasochłonna, pozwala na więcej opcji analizy, w tym aspektów dynamiki kambialnej, np. szerokości kambium, a także wzorców ekspresji promotora. Ponadto, jeśli nie można uzyskać dostępu do SEM, protokół ten może być użyty jako alternatywa dla kroku 7.1.
    1. Wyciąć sektor będący przedmiotem zainteresowania za pomocą żyletki i niektórych otaczających tkanek w postaci małych bloków (nie większych niż 1 mm3) i umieścić bezpośrednio w 1-3 ml 100% etanolu w fiolce z próbką z zakrętką na co najmniej 2 dni w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. Przygotuj mały blok w taki sposób, aby mikrotom umożliwił dostęp do interesującej go powierzchni.
    2. Powtórzyć te czynności dla wszystkich dodatkowych sektorów, w tym sektorów objętych kontrolą ujemną.
    3. Usuń płyn i zastąp 25% etanolem: 75% białą mieszanką LR przez 2 dni, utrzymując warunki.
    4. Powtórzyć krok 7.2.3 z 50% etanolem: 50% białym LR, 25% etanolem: 75% białym LR, a następnie dwukrotnie ze 100% białym LR.
    5. Umieść mały blok w formie do zatapiania tak, aby powierzchnia zainteresowania była wyrównana do krótkiego końca i ostrożnie przykryj świeżą bielą LR i polimeryzuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Wytnij odcinki o długości 5 μm od interesującej Cię powierzchni na obrotowym mikrotomie i zamontuj na szkiełku podstawowym. Użyj barwienia Safraniną O (0,01%), aby uwidocznić ścianę komórkową i/lub inne cechy.
    7. Dodaj nośnik montażowy, umieść szkiełko nakrywkowe i pozostaw na noc do zastygnięcia.
    8. Oglądaj pod mikroskopem świetlnym w powiększeniu od 100x do 600x i uchwyć obraz.
    9. Uchwyć cechy morfologiczne z obrazów za pomocą oprogramowania do pomiaru obrazu.
      1. W celu przeprowadzenia analizy statystycznej ilościowych cech morfologicznych należy postępować zgodnie z krokiem 7.1.10.
      2. W celu jakościowej analizy cech morfologicznych należy porównać i opisać wzorce zaobserwowane dla genu lub promotora będącego przedmiotem zainteresowania oraz kontroli negatywnej i/lub pozytywnej.
  3. Analiza kąta mikrofibrylnego (MFA) we zmacerowanych włóknach za pomocą mikroskopii świetlnej.
    1. Wyciąć transgeniczną tkankę ksylemu bezpośrednio z sektora, jak również z przylegającej do niego tkanki nietransgenicznej (w promieniu 0,5 mm, ryc. 2h) i umieścić w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć te czynności dla wszystkich dodatkowych sektorów, w tym sektorów objętych kontrolą ujemną.
    2. Wykonaj kroki od 7.3.3 do 7.3.5 w dygestorium.
    3. Do każdej probówki dodać 250 μl nadtlenku wodoru i 250 μl lodowatego kwasu octowego.
    4. Umieścić rurkę w bloku grzewczym w temperaturze 90 °C na 2 godziny w dygestorium.
    5. Wyjmij chusteczkę z probówek i ostrożnie spłucz wodą destylowaną co najmniej dwa razy.
    6. Używając rozpuszczalnego w wodzie podłoża montażowego, zamocuj chusteczkę na szkiełku podstawowym i rozerwij ostrymi kleszczami przed nałożeniem szkiełka nakrywkowego.
    7. Oglądaj pod mikroskopem świetlnym i uchwyć obrazy pojedynczych włókien w powiększeniu większym niż 400X.
    8. Aby określić kąt mikrofibryli włókien, zmierz kąt między otworami wgłębień i/lub prążkami ściany komórkowej a długą osią włókna (rysunek 2i) za pomocą oprogramowania do pomiaru obrazu.
    9. W przypadku analizy statystycznej należy postępować zgodnie z krokiem 7.1.10.

8. Analiza wzorców ekspresji promotora

  1. Analiza wzorców ekspresji promotorów w drugorzędowych tkankach macierzystych.
    1. Zlicz częstotliwość występowania każdego rodzaju sektora w odniesieniu do promotora będącego przedmiotem zainteresowania, jak również kontrole dodatnie i ujemne, jak podano w kroku 6.2.2.
    2. Porównaj częstość występowania różnych typów sektorów dla promotora będącego przedmiotem zainteresowania z kontrolą pozytywną, stosując testy chi-kwadrat w celu ustalenia wartości p. W razie potrzeby można przeprowadzić dalszą analizę swoistości komórkowej/tkankowej, wykonując krok 7.2.
      1. Jeżeli badany jest więcej niż jeden promotor będący przedmiotem zainteresowania, należy powtórzyć tę analizę, dokonując porównania między wszystkimi promotorami będącymi przedmiotem zainteresowania a kontrolą pozytywną.
      2. Jeżeli w kontroli ujemnej obserwuje się sektory lub niebieskie zabarwienie, należy dodać je do analizy lub porzucić w zależności od zakresu lub jeśli podejrzewa się barwienie endogenne (patrz Dyskusja).
  2. Analiza wzorców ekspresji promotorów podczas rozwoju i różnicowania pochodnych kambium.
    1. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zwizualizuj wszystkie sektory kambium (Figura 1g, 1h, 1i) zidentyfikowane w kroku 6.2 i określ obecność/brak niebieskiego zabarwienia w trzech typach tkanek pochodzących z kambium; łyko (P), rozwijająca się ksylem (X1) lub rozwinięta tkanka ksylemu (X2) (patrz Rysunek 3a).
    2. Zgodnie z krokiem 8.1.2 porównaj częstość występowania/braku barwienia GUS w regionach P, X1 i X2 promotora zainteresowania z kontrolą dodatnią za pomocą testów chi-kwadrat w celu ustalenia wartości p. W razie potrzeby można przeprowadzić dalszą analizę swoistości komórkowej/tkankowej, wykonując krok 7.2.
      1. Zobacz kroki 8.1.2.1 i 8.1.2.2, aby zapoznać się z dodatkowymi uwagami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z tym protokołem wszystkie żywe komórki macierzyste oraz typy tkanek wtórnych okazały się podatne na transformację przez A. tumefaciens i zostały sklasyfikowane do typów sektorów na podstawie pierwotnie przekształconego typu komórki oraz jej późniejszego wzorca wzrostu rozwojowego. Typy sektorów obejmują naskórek, floem, miazgię, miękisz rany i zatkania (tylozy) (Ryc. 1b, 1c, 1d) i występują w spójnych lokalizacjach opisa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ISSA jest stosunkowo prostą i skuteczną metodą tworzenia transgenicznych tkanek pni u gatunków drzew w ciągu kilku miesięcy w celu analizy genów i promotorów zainteresowania zaangażowanych w tworzenie drewna i pni. Niewielki wysiłek, poza utrzymaniem roślin przy życiu, jest wymagany do wyhodowania transgenicznej tkanki łodygi po zaszczepieniu, co kontrastuje z metodami in vitro , w których wymagana jest intensywna hodowla w celu utrzymania tkanek lub roślin, gdzie rozpoczęcie produkcji drewna może trwać...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe dla tego aspektu pracy poprzez Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) i LP0211919 (GB) oraz partnerów przemysłowych Sappi i Mondi, a także Australian Postgraduate Award (EM) od Australian Research Council oraz Young Innovators and Scientist Award przez Australijski Departament Rolnictwa (LT). Chcielibyśmy również podziękować Zanderowi Myburgowi, Qing Wangowi, Colleen MacMillan i Simonowi Southertonowi za wiele dyskusji i pomysłów, które przedstawili podczas opracowywania tego protokołu, a także Martinowi Ranikowi, Minique De Castro, Julio Najerze, Valerie Frassiant, Angelique Manuel i Noemie Defaix za pomoc w pracach związanych z laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RoślinyNANAW razie potrzeby skonsultuj się z lokalnymi dostawcami szkółek roślin
Szczep AgrobacteriumNANAIstnieje wiele możliwych sposobów uzyskania szczepów Agrobactrium. Sugerujemy skontaktowanie się z lokalną społecznością badawczą, ponieważ mogą istnieć ograniczenia w pozyskiwaniu bakterii w Twoim kraju i regionie.
Wektor binarny (gen i promotor)NANAOpracowaliśmy szereg wektorów pasujących do protokołu ISSA przy użyciu systemu rekombinazy bramy. Obejmuje to nadekspresję, nokauty RNAi i wektory fuzji promotorów oparte na zmodyfikowanych wektorach pCAMBIA i chętnie dostarczymy je w razie potrzeby. Ponadto istnieje wiele wektorów, które są dostępne dla społeczności naukowej.
Pożywka LBSigmaL3022Ten sam produkt może pochodzić z innej firmy
Pożywka LB z agaremSigmaL2897Podobny produkt może pochodzić od innej firmy
AntybiotykiSigmaNANumer katalogowy będzie zależał od antybiotyku, którego potrzebujesz, ponieważ szereg antybiotyków jest używanych do selekcji bakteryjnej w wektorach binarnych. Ten produkt może pochodzić z  Zakres firm
50 ml Rurki zakręcaneFisher Scientific14-432-22Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
2 ml MikroprobówkaWatson Bio Lab132-620CTen sam produkt może pochodzić od innej firmy
MS MediaSigmaM9274Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
Ostrze skalpela nr 11SigmaS2771Ten sam produkt może pochodzić z innej firmy
Parafilm "M"BemisPM996Jest to najlepszy produkt do użycia do wiązania kambialnego słupka okiennego 
Probówki okrągłe 14 mlThermo Scientific150268Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
EDTASigmaE6758Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
TritonSigmaX100Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
X-Gluc X-GLUCdirectAby złożyć zamówienie, musisz wejść na stronę internetową - http://www.x-gluc.com/index.html
Żelazocyjanek potasu(III)Sigma244023Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
Żelazocyjanek potasu(II)SigmaP9387Ten sam produkt może pochodzić z innej firmy
Papierek lakmusowySigmaWHA10360300Ten sam produkt może pochodzić z innej firmy
Żyletka z pojedynczą krawędziąProSciTechL055Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
Żyletka z podwójną krawędziąProSciTechL056Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
SEM Pin StubProSciTechGTP16111Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
Fiolka na próbkę z nakrętkąProSciTechL6204Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
EtanolsigmaE7023Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
LR białyProSciTechC025Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy
Forma do zatapianiaProSciTechRL090Polecamy tę odmianę, jednak dostępnych jest wiele opcji
Nośniki montażowe Water SoulableProSciTechIA019Jeden przykład nośnika montażowego, który może być użyty, jednak istnieją inne opcje i można je zbadać.
Nadtlenek wodoruSigma216763Produkt podobny może pochodzić od innej firmy
Lodowaty kwas octowySigmaA9967Produkt podobny może pochodzić od innej firmy
Safranin OProSciTechC138Podobny produkt może pochodzić od innej firmy
Quanta Środowiskowy skaningowy mikroskop elektronowyFEIJest to instrument używany w części tego badania, ale każdy inny SEM, który ma tryb niskiej próżni, może być wykorzystany Oprogramowanie
obrazowania ImageJmożna pobrać z następującego adresu URL http://rsbweb.nih.gov/ij/
do

Bibliografia

  1. Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
  2. Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
  3. Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
  4. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
  5. Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
  6. Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
  7. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
  8. Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
  9. MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
  10. Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
  11. Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
  12. Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
  13. Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
  14. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
  17. Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
  18. Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Charakterystyka promotora genutransgeniczne sektory tkanekinokulacja w oknie kambialnymtest GUStransformacja gatunk w drzewpobieranie tkanek odygiocena fenotypowa
Wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (ISSA) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.