Artykuł metodologiczny

Metody izolacji, hodowli i charakterystyki funkcjonalnej miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy

DOI:

10.3791/54555

⸱

23 października 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody izolacji miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego (SAM) od dorosłych myszy do elektrofizjologii lub badań obrazowych. Wyizolowane komórki mogą być wykorzystywane bezpośrednio lub mogą być utrzymywane w hodowli, aby umożliwić ekspresję interesujących białek, takich jak genetycznie kodowane reportery.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miocyty węzłów zatokowo-przedsionkowych (SAM) działają jak naturalne rozruszniki serca, inicjując każde uderzenie serca poprzez generowanie spontanicznych potencjałów czynnościowych (AP). Te AP rozrusznika serca odzwierciedlają skoordynowaną aktywność licznych prądów błonowych i wewnątrzkomórkowy obieg wapnia. Jednak dokładne mechanizmy, które napędzają spontaniczną aktywność rozrusznika serca w SAM, pozostają nieuchwytne. Ostro izolowane SAM są niezbędnym przygotowaniem do eksperymentów mających na celu zbadanie molekularnych podstaw rozrusznika serca. Jednak niewyraźna anatomia, złożona mikrodysekcja i wybredne warunki trawienia enzymatycznego uniemożliwiły powszechne stosowanie ostro izolowanych SAM. Ponadto do niedawna nie były dostępne metody pozwalające na długoterminową hodowlę SAM do badań ekspresji białek. Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku i demonstrację wideo dotyczącą izolacji SAM od dorosłych myszy. Zademonstrowano również metodę utrzymywania dorosłych myszy SAM in vitro oraz ekspresji białek egzogennych poprzez zakażenie adenowirusowe. Ostro wyizolowane i wyhodowane SAM przygotowane tymi metodami nadają się do różnych badań elektrofizjologicznych i obrazowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miocyty rozrusznika serca w węźle zatokowo-przedsionkowym serca (miocyty zatokowo-przedsionkowe, "SAM") generują spontaniczne, rytmiczne potencjały czynnościowe (AP), które rozchodzą się przez mięsień sercowy, inicjując każde uderzenie serca. Eksperymenty z użyciem ostro izolowanych SAM od wielu gatunków były niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów, które przyczyniają się do generowania aktywności rozrusznika serca. SAM to wysoce wyspecjalizowane kardiomiocyty, które znacznie różnią się od swoich odpowiedników w mięśniu sercowym przedsionkowym i komorowym pod względem morfologii, funkcji i ekspresji białek. Cechą charakterystyczną spontanicznych AP w SAM jest spontaniczna depolaryzacja podczas rozkurczu, która doprowadza potencjał błonowy do progu, aby wyzwolić następny AP1,2. Ten "potencjał rozrusznika" zależy od skoordynowanej aktywności wielu różnych prądów błonowych, w tym "prądu śmiesznego" (I f), prądów wapniowych typu T i L oraz prądu wymiennika sodowo-wapniowego (INCX), który jest napędzany przez uwalnianie Ca2+ z retikulum sarkoplazmatycznego3,4.

Podczas gdy dokładnie izolowane mysie SAM-y są niezbędnym eksperymentalnym przygotowaniem do badania rozruszników serca, izolacja SAM-ów od myszy może być trudna do przyjęcia, ponieważ niewyraźna anatomia i mały rozmiar mysiego SAN wymagają szczegółowej mikrodysekcji, a połączona enzymatyczna i mechaniczna dysocjacja komórek wymaga starannej optymalizacji.

Udostępniamy tutaj szczegółową demonstrację wideo protokołu, który został z powodzeniem wykorzystany do izolacji SAM od dorosłych myszy w celu nagrań z zaciskiem łaty5-8. O ile nam wiadomo, nie ma takiej wizualnej demonstracji dostępnej z żadnego innego źródła. Ponadto zademonstrowano nową metodę, w której wyizolowane SAM od dorosłych myszy mogą być utrzymywane in vitro przez kilka dni, umożliwiając w ten sposób wprowadzenie białek, genetycznie kodowanych cząsteczek reporterowych lub RNAi poprzez infekcję adenowirusową9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kampusu Medycznego Anschutz Uniwersytetu Kolorado. Poniższy standardowy protokół został zoptymalizowany przy użyciu samców myszy C57BL/6J w wieku 2-3 miesięcy.

1. Przygotuj zapasy roztworów i zapasy przed eksperymentami

UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat niezbędnego sprzętu i materiałów.

  1. Przygotować po 1 litrze każdego z następujących roztworów, jak wskazano w Tabeli 1: kompletny tyród, tyród o niskiej zawartości Ca2+/Mg2+, zmodyfikowany roztwór Krafta-Brühe'a (KB) i roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Do wszystkich roztworów używaj ultraczystej, filtrowanej wody dejonizowanej. Podzielić każdy roztwór na 50 ml porcji i przechowywać w temperaturze 20 °C przez okres do sześciu miesięcy. Rozmrozić poszczególne porcje bezpośrednio przed eksperymentami i przechowywać przez okres do jednego tygodnia w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 50 ml 10 mM roztworu adaptacyjnego NaCl i 1,8 mM CaCl2, rozpuszczając NaCl i CaCl2 w ultraczystej przefiltrowanej wodzie dejonizowanej (Tabela 1). Przechowywać w temperaturze pokojowej do sześciu miesięcy.
  3. Przygotować 4,75 porcji elastazy w jednostce aktywności enzymatycznej (U), pipetując do probówek do mikrofuge. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.
  4. Przygotować 375 μg podwielokrotności (w ultraczystymH2O) mieszaniny enzymów kolagenazy i proteazy, pipetując do probówek do mikrofuge. Przechowywać w temperaturze -20 °C do trzech miesięcy.
  5. Przygotuj dwie wypolerowane na ogniowo pipety Pasteura, jedną do transferu tkanek (~1,5 mm końcowa średnica otworu; Rysunek 1Aiv i Rysunek 1C) i jeden do dysocjacji (średnica ~2 mm; Rysunek 1Aiii i Rysunek 1C).
    1. Naciąć pipety Pasteura nożem do szkła i zatrzasnąć wzdłuż nacięcia, aby uzyskać otwór nieco większy niż pożądany rozmiar. Wypoleruj odciętą końcówkę każdej pipety przez ~ 30-60 sekund na małym ogniu na palniku Bunsena, aby uzyskać grubą wypolerowaną ściankę i otwór o pożądanej średnicy. Upewnij się, że wypolerowany ogniowo otwór jest wolny od pęknięć lub ostrych krawędzi.
  6. Przygotować dwie szalki rozwarstwiające, dodając ~25 ml elastomeru silikonowego zmieszanego zgodnie ze wskazówkami producenta do każdej szalki Petriego o średnicy 100 mm (Rysunek 1Ai i Rysunek 1B). Pozostawić do utwardzenia w temperaturze pokojowej przez 48 godzin.
  7. Wyłącznie w przypadku hodowli: przygotować po 25–50 ml pożywki galwanicznej i pożywki hodowlanej zgodnie z tabelą 2. Przechowywać do dwóch tygodni w temperaturze 4 °C.

2. Przygotuj roztwory do użycia w dniu izolacji komórek

UWAGA: Poniższe ilości służą do izolacji miocytów zatokowo-przedsionkowych od jednej myszy.

  1. Dodaj 2,5 ml Low Ca2+/Mg2+ Tyrode (pH 6,9) do każdej z trzech małych, okrągłodennych probówek hodowlanych. Umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C.
  2. Dodać 2,5 ml Low Ca2+/Mg2+ Tyrode do jednej dużej probówki hodowlanej z okrągłym dnem. Do tej probówki dodać 1 podwielokrotność (4,75 U) elastazy i jedną podwielokrotność (375 μg) mieszanki enzymów kolagenazy i proteazy. Zamieszaj, aby wymieszać. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C.
  3. Dodać 2,5 ml KB Medium do trzech dodatkowych małych, okrągłodennych probówek hodowlanych i jednej dodatkowej dużej, okrągłodennej probówki hodowlanej. Umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C.
  4. Dodać ~7 ml roztworu BSA do jednej dużej probówki hodowlanej z dnem. Trzymaj tę probówkę w temperaturze pokojowej.
  5. Umieścić 20-40 ml roztworu Complete Tyrode w zlewce o pojemności 50 ml (Rycina 1Aii). Dodać 10 USP/ml heparyny, zamieszać do wymieszania i umieścić zlewkę w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C.

3. Przygotuj dodatkowe roztwory i materiały dla hodowanych komórek (pomiń te kroki dla komórek ostro izolowanych)

  1. W sterylnym kapturze do hodowli tkankowych umieścić dwa okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm na mysz w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki.
    UWAGA: Płytka 24-dołkowa jest używana, ponieważ studzienki mają wygodny rozmiar, co służy do ograniczania objętości dla kolejnych infekcji wirusowych.
  2. Na każde szkiełko nakrywkowe pobrać pipetą około 200 μl roztworu mysiej lamininy o stężeniu 100 ng/ml rozcieńczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Szkiełka nakrywkowe inkubować z lamininą przez cały czas izolacji (co najmniej 1 godzinę) w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  4. Wstępnie podgrzać pożywkę galwaniczną i pożywkę hodowlaną (z kroku 1.7 i tabeli 3) do temperatury 37 °C.

4. Izolacja węzła zatokowo-przedsionkowego

  1. W dygestorium chemicznym umieść mysz w jednej komorze dwukomorowego pudełka i znieczulenie ~200 μl płynnego izofluranu wprowadzonego za pomocą wacika do drugiej komory. Potwierdź znieczulenie (zwykle w ciągu ~30-60 sekund) szczyptą palca u nogi. Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Do utworzenia pudełka dwukomorowego można użyć pustego pudełka na końcówki do pipet o pojemności 1 ml; Odwróć stojak do góry nogami w pudełku, aby utworzyć oddzielną komorę na izofluran, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi myszy z nim.
  2. Usuń sierść z klatki piersiowej za pomocą nożyczek i klatki piersiowej przez transekt, aby odsłonić klatkę piersiową za pomocą zewnętrznych kleszczy tkankowych (ryc. 1Aviii) i nożyczek do preparowania (ryc. 1Avix). Umyj klatkę piersiową w ~2 ml ogrzanego Complete Tyrode's z heparyną za pomocą pipety transferowej.
    UWAGA: W razie potrzeby kontynuować kąpiel klatki piersiowej, nie dopuścić do wyschnięcia preparatu.
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń płuca i grasicę za pomocą wewnętrznych nożyczek (ryc. 1Avi) i kleszczy preparacyjnych (ryc. 1Avii).
  4. Delikatnie przytrzymując wierzchołek serca wewnętrznymi kleszczami preparacyjnymi, ostrożnie przeciąć żyłę główną dolną i aortę nożyczkami wewnętrznymi, aby usunąć serce z jamy klatki piersiowej. Przenieś serce do jednej z silikonowych naczyń rozwarstwiających i wykąp się w ~4 ml podgrzanego heparynizowanego Complete Tyrode's za pomocą pipety transferowej.
  5. Ustaw serce tak, aby tylne naczynia były widoczne i skierowane do góry, z prawym przedsionkiem zwierzęcia po prawej stronie eksperymentatora i lewym przedsionkiem po lewej stronie eksperymentatora. Po orientacji unieruchom serce należy unieruchomić, przypinając wierzchołek do silikonowego naczynia preparacyjnego.
  6. Zlokalizuj rowek między komorami a przedsionkami (przezroczysty pierścień nad komorami).
  7. Za pomocą wewnętrznych nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w rowku, trzymając się bliżej komór niż przedsionków. W razie potrzeby przepłukać rowek i nacięcie dodatkowymi rozgrzanymi heparynizowanymi Complete Tyrode, aby zapewnić wyraźny widok przedsionków i zastawek. Kontynuuj cięcie wzdłuż rowka, aby oddzielić przedsionki od komór.
  8. Przenieś tkankę przedsionkową do drugiego silikonowego naczynia rozwarstwiającego i wykąp się w ~ 3 ml podgrzanego heparynizowanego Complete Tyrode's.
  9. Ustaw tkankę tak, aby prawy przedsionek zwierzęcia znajdował się teraz po lewej stronie eksperymentatora, a lewe przedsionek po prawej.
    UWAGA: Prawe przedsionek jest bardziej przezroczysty, podczas gdy lewe przedsionek ma bardziej ciemnoczerwony odcień.
  10. Przypiąć tkankę przez żyłę główną dolną i górną oraz przydatki prawego i lewego przedsionka, delikatnie rozciągając preparat. Usuń resztki tłuszczu lub innej tkanki, aby zapewnić wyraźny widok preparatu (należy uważać, aby nie przeciąć ściany przedsionka, ponieważ węzeł zatokowo-przedsionkowy jest dość delikatny i może łatwo ulec uszkodzeniu).
  11. Otwórz przednią ścianę przedsionków, przecinając żyły główne. W razie potrzeby zmień położenie szpilek, aby uwidocznić przegrodę międzyprzedsionkową.
  12. Przeciąć wzdłuż przegrody międzyprzedsionkowej, aby usunąć lewy przedsionek. Ponownie przypnij preparat, delikatnie rozciągając.
  13. Usuń wyrostek prawego przedsionka i uwolnij węzeł zatokowo-przedsionkowy, przecinając wzdłuż cristae terminalis, który pojawia się jako ciemnopomarańczowa smuga granicząca z uszkiem przedsionka.
  14. Ponownie przypnij tkankę węzłową i przetnij ją bocznie (prostopadle do crista terminalis), aby uzyskać trzy paski o jednakowej wielkości.

5. Trawienie węzłów zatokowo-przedsionkowych

  1. Za pomocą wąskiej, wypolerowanej ogniowo pipety (ryc. 1Aiv) przenieś trzy paski tkanki węzła zatokowo-przedsionkowego do pierwszej z trzech małych, okrągłodennych probówek zawierających 2,5 ml tyrode o niskiej zawartości Ca2+/Mg2+ w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C. Inkubować przez 5 minut.
  2. Przenieść paski tkanek do drugiej małej, okrągłej probówki zawierającej 2,5 ml Tyrode o niskiej zawartości Ca2+/Mg2+ w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C, używając tej samej wąskiej pipety. Umyj paski chusteczek, delikatnie obracając rurkę lub delikatnie pipetując wąską pipetą. Nie odwracaj rurki.
  3. Przenieść paski tkanek do trzeciej małej, okrągłej probówki zawierającej 2,5 ml Tyrode o niskiej zawartościCa2+/Mg2+ i powtórzyć etap płukania opisany w kroku 5.2.
  4. Przenieść paski do dużej probówki okrągłodennej zawierającej 2,5 ml Tyrode o niskiej zawartościCa2+/Mg2+ z enzymami (elastaza plus mieszanina kolagenazy i proteazy) w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C. Upewnij się, że wszystkie trzy paski tkanek są obecne. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze 35 ± 1 °C. Mieszać co 5 minut, delikatnie obracając probówkę. Nie odwracaj rurki.

6. Dysocjacja miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego

  1. Po roztrawieniu enzymatycznym za pomocą wąskiej, wypolerowanej ogniowo pipety delikatnie przenieść paski tkanek do pierwszej małej, okrągłodennej probówki zawierającej 2,5 ml roztworu KB w temperaturze 35 ± 1 °C. Umyć chusteczkę, delikatnie obracając probówkę.
    Uwaga: Paski tkanek będą wydawać się nieco przezroczyste i mogą w tym momencie zbijać się ze sobą. Po trawieniu enzymatycznym należy obchodzić się bardzo delikatnie, aby uniknąć utraty komórek.
  2. Przenieść chusteczkę do drugiej małej probówki okrągłodennej zawierającej 2,5 ml KB w temperaturze 35 ± 1 °C. Delikatnie zamieszać do przemycia.
  3. Przenieść chusteczkę do trzeciej małej probówki okrągłodennej zawierającej 2,5 ml KB w temperaturze 35 ± 1 °C. Delikatnie zamieszać do przemycia.
  4. Przenieść tkankę do dużej probówki okrągłodennej zawierającej 2,5 ml KB w temperaturze 35 ± 1 °C.
  5. Używając większej, polerowanej ogniowo pipety (Rysunek 1Aiii i Rysunek 1C), rozdzielić komórki w dużej probówce z okrągłym dnem poprzez ciągłe wycieranie z częstotliwością około 0,5-1 Hz przez 5-10 minut, uważając, aby rurka dysocjująca była zanurzona w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C i aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków do roztworu.
    Uwaga: Czas rozcierania różni się w zależności od średnicy pipety dysocjacyjnej i siły pipetowania. Czas należy dostosować tak, aby fragmenty tkanki pozostałe na końcu dysocjacji wydawały się cienkie, przezroczyste i delikatne. Jeśli tkanka zachowa jakikolwiek kolor, dysocjacja prawdopodobnie będzie niepełna. Częstotliwość (0,5-1 Hz) jest określana ręcznie.
  6. Wyjąć okrągłodenną probówkę zawierającą zdysocjowane SAM z łaźni wodnej i równoważyć w temperaturze pokojowej przez 5 minut.

7. Readaptacja wapnia w węźle zatokowo-przedsionkowym (przeprowadzona w temperaturze pokojowej)

UWAGA: Dla SAM-ów przeznaczonych do eksperymentów hodowlanych, procedury opisane w następnej sekcji powinny być wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej. Jeśli SAM mają być używane do ostrych eksperymentów, nie ma potrzeby wykonywania tych kroków w sterylnym środowisku.

  1. Dodać 75 μl roztworu adaptacyjnego NaCl/CaCl2 (Tabela 2). Delikatnie mieszaj i inkubuj przez 5 minut.
  2. Dodać 160 μl roztworu adaptacyjnego NaCl/CaCl2. Delikatnie mieszaj i inkubuj przez 5 minut.
  3. Dodać 390 μl roztworu BSA (tabela 2). Delikatnie zamieszać i inkubować przez 4 minuty.
  4. Dodać 1,25 ml roztworu BSA. Delikatnie zamieszać i inkubować przez 4 minuty.
  5. Dodać 4,37 ml roztworu BSA. Delikatnie mieszać i inkubować przez 4 min.
    Uwaga: Końcowe stężenie wapnia wyniesie 1,8 mM.
  6. Po readaptacji wapnia zebrać SAM, pozostawiając do osiadania grawitacyjnie przez ~10 minut lub przez wirowanie przy ~2,000 x g przez 3 minuty.
    1. W przypadku ostro wyizolowanych komórek delikatnie usuń i wyrzuć około 5 ml supernatantu za pomocą szklanej pipety Pasteura, pozostawiając komórki w objętości ~2 ml. Przechowuj te komórki w temperaturze pokojowej do ~8 godzin w celu nagrań patch clamp.
    2. W przypadku komórek hodowlanych należy usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml wstępnie ogrzanego (37 °C) podłoża galwanicznego (tabela 2).

8. Posiew i hodowla miocytów zatokowo-przedsionkowych (pomiń dla komórek ostro izolowanych)

  1. Usunąć roztwór lamininy z szkiełek nakrywkowych z kroku 3.3 za pomocą pipety Pasteura. Natychmiast wysiewać 500 μl (~50-100 komórek) na każde szkiełko nakrywkowe pokryte lamininą (od kroku 3).
    UWAGA: Inhibitor kurczliwości monoksymu 2,3-butanodionu (BDM) jest zawarty w pożywce posiewnej i hodowlanej, aby zapobiec skurczowi, który powoduje ścieranie komórek9.
  2. Włożyć 24-dołkową płytkę zawierającą nowo wysiane SAM do inkubatora i utrzymywać w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza/5% CO2 . Pozostawić komórki do przylegania do szkiełek nakrywkowych przez 4-6 godzin w podłożu galwanicznym (Tabela 2).
  3. Delikatnie usunąć podłoże galwaniczne za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Zastąp 500 μl na studzienkę wstępnie ogrzanego (37 °C) podłoża hodowlanego (tabela 2).

9. Transdukcja adenowirusowa kultur dorosłych miocytów zatokowo-przedsionkowych (pomiń dla komórek ostro izolowanych)

  1. Oszacuj liczbę komórek w szkiełku nakrywkowym bezpośrednio przed nałożeniem adenowirusa, licząc komórki w polu widzenia pod mikroskopem, dostosowując do powiększenia. Policz wszystkie komórki, nie tylko SAM.
  2. Rozcieńczyć adenowirusa w pożywce 199 i dostosować rozcieńczenie do miana wirusa tak, aby wymagane było zastosowanie 1-10 μl w celu uzyskania końcowej wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 100 jednostek wirusowych na komórkę. Roztwór adenowirusowy dodawać kroplami bezpośrednio na posiane SAM.
  3. Inkubuj komórki z pożywką zawierającą wirusa przez noc (~12-14 godzin). Następnie wymień ze świeżą pożywką hodowlaną. Utrzymuj komórki w inkubatorze, zmieniając pożywkę hodowlaną co 48 godzin, aż do uzyskania pożądanej ekspresji białka.

10. Ocena funkcjonalna ostro izolowanych lub hodowanych SAM

UWAGA: Poniższy protokół jest przykładem oceny funkcjonalnej izolowanych SAM przy użyciu techniki perforowanej łaty amfoterycyny do rejestrowania zarówno spontanicznych AP, jak i If z tej samej komórki (patrz odniesienie9).

  1. Przygotować roztwory do nagrywania zgodnie z opisem w tabeli 3.
  2. Przygotować roztwór podstawowy 20 mg/ml amfoterycyny-B w DMSO świeży w dniu rejestracji. Przechowywać bulion w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem. Rozcieńczyć zapas amfoterycyny-B w roztworze wewnątrzkomórkowym do końcowego stężenia 200 ug/ml bezpośrednio przed użyciem. Końcowy roztwór pipet należy utrzymywać na lodzie i chronić przed światłem.
    UWAGA: Roztwór pipety zawierający amfoterycynę do doświadczeń powinien być przygotowywany świeży co godzinę, rozcieńczając podwielokrotność roztworu podstawowego do roztworu wewnątrzkomórkowego i wirując przez co najmniej 1 minutę.
  3. Przenieść podwielokrotność ostro zdysocjowanej zawiesiny komórek SAM lub fragment szklanego szkiełka nakrywkowego zawierającego wyhodowane SAM do komory rejestracyjnej zawierającej roztwór Tyrode'a w temperaturze 35 ± 1 °C. Perfuzję komórek roztworem Tyrode'a przez co najmniej 2 minuty przed zapisami elektrofizjologicznymi w celu usunięcia wszelkich pozostałości BDM z pożywki hodowlanej.
    UWAGA: Spontaniczne skurcze powinny być widoczne natychmiast po przeniesieniu do roztworu Tyrode. SAM do rejestracji można zidentyfikować na podstawie kombinacji cech, w tym spontanicznej aktywności skurczowej, charakterystycznej morfologii (np. Ryc. 2), braku prążków, ekspresji białka HCN4, obecności prądu IF, pojemności błony <50 pF i spontanicznych AP z przebiegami, które obejmują rozkurczową fazę depolaryzacji i powolny ruch w górę.
  4. Za pomocą pipet ze szkła borokrzemianowego o rezystancji 1,5-3,0 MΩ napełnij końcówkę roztworem wewnątrzkomórkowym pozbawionym amfoterycyny, zanurzając ją na 10-30 sekund. Następnie napełnić pipetę roztworem zawierającym amfoterycynę. Plombę dołączoną do ogniwa GΩ należy uzyskać tak szybko, jak to możliwe. Jeśli formowanie uszczelki jest trudne, należy wydłużyć czas napełniania końcówki.
    UWAGA: Rezystancja dostępu powinna być stale monitorowana po utworzeniu plomby przymocowanej do ogniwa, a zapisy należy rozpocząć dopiero po uzyskaniu stabilnej rezystancji dostępu <10 MΩ.
  5. Aby nagrywać spontaniczne punkty dostępowe, przełącz wzmacniacz w tryb szybkich cęgów prądowych bez wstrzykiwania prądu.
    UWAGA: Izoproterenol 1 nM jest zawarty w zewnątrzkomórkowym roztworze Tyrode'a podczas nagrywania AP w celu ustabilizowania szybkości wypalania, jak wcześniej zgłoszono10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj protokoły były wcześniej stosowane do izolowania spontanicznie aktywnych SAM od dorosłych myszy, które są odpowiednie do różnych badań z zaciskami łatowymi5-8. Ponadto protokoły pozwalają na izolowane SAM, które mogą być utrzymywane w kulturze przez okres do jednego tygodnia. Transfer genów do hodowanych komórek może być dokonany poprzez infekcję adenowirusową9. Wyniki przedstawione w tej sekcji pochodzą z naszych poprzednich prac i są tutaj pokazane ja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pracy przedstawiono szczegółowe protokoły izolacji i hodowli w pełni zróżnicowanych miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego od dorosłych myszy. Protokół izolacji niezawodnie wytwarza spontanicznie aktywne mysie SAM-y nadające się do natychmiastowej analizy elektrofizjologicznej lub późniejszej hodowli. Podobne protokoły zostały zgłoszone przez wiele innych grup (na przykład patrz odnośniki11,12,10,13-17). Jednak nasz protokół utrzymywania dorosłych myszy SAM in vitro zachowuje charakterystyczną morf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Christianowi Rickertowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były wspierane przez grant z National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) dla CP. EJS był wspierany przez 5T32-AG000279 z National Institute on Aging. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw Sylgruard/Elastomer DowCorning184 SIL ELAST KIT 0,5KG
Pipety borokrzemianowe 9"Pasteur Fisher Scientific13-678-20C
Małe, okrągłodenne probówki hodowlaneFisher Scientific352059
Duże, okrągłodenne probówki hodowlaneCorning14-959-11B
ElastaseWorthington BiochemicznyLS002279
Liberase TMRoche5401119001Roztwór do dysocjacji tkanek
HeparynaSAGENT Pharmaceuticals NDC 25021-400-10
Mysz LamininCorningCB-354232
12 mm okrągłe szklane szkiełka nakrywkoweFisher 12-545-80
24-dołkowa płytka hodowlanaFisher08-772-1
Ad-mCherryVector Biolabs1767
Ad-eGFPVector Biolabs1060
Plastikowa, jednorazowa pipeta transferowaFisher Scientific
Micro nożyczkiFisher Scientific17-467-496
Dumont #4 KleszczeRoboz InstrumentsRS-4904
Kleszcze do tkanekRoboz InstrumentsRS-8164
Nożyczki do preparowania tęczówkiWPI, Inc.
Szpilki preparacyjneFine Science Tools26002-20
NaClSigma71376
KClSigma60128
KH2PO4Sigma60353
HEPESSigma54457
glukozaSigmaG0350500
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
taurynaSigmaT0625
BSASigmaA2153
K-glutaminianSigmaG1501
K-asparaginianSigmaA6558
MgSO< sub>4SigmaM7506
kreatynaSigmaC0780
EGTASigmaE3889
Mg-ATPSigmaA9187
Amfoterycyna-BFisher Scientific1397-89-3
IzoproterenolCalbiochem420355
Media199SigmaM4530
Monoksym 2,3-butanodionu (BDM)SigmaB0753
Surowica bydlęca płodu (FBS)SigmaSH30071
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA5611
Insulina   SigmaI3146
TransferynaSigmaI3146
SelenSigmaI3146
PenicylinaGE HealthcareSV30010
StreptomycynaHyclonSV30010
501264

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
  2. DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
  3. Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
  4. Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
  5. Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
  6. Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
  7. Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
  8. St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
  9. St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
  10. Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
  11. Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
  12. Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
  13. Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
  14. Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
  15. Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652(2012).
  16. Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633(2013).
  17. Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  18. Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
  19. Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
  20. Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom reksekcja tkanektrawienie enzymatycznepatch clampobrazowanie wapniainfekcja adenowirusowahodowla kom rkowaelektrofizjologia

Powiązane artykuły