Artykuł metodologiczny

In vitro Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego krezki w odcinkach jejunalnych i okrężnicy myszy

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54576

⸱

25 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of Antwerp, 2Visceral Pain Group, Discipline of Medicine, University of Adelaide, 3Department of Biomedical Sciences, University of Sheffield, 4Department of Pharmacy, Pharmacology and Postgraduate Medicine, University of Hertfordshire, 5Department of Gastroenterology and Hepatology, Antwerp University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Nerwy doprowadzające krezkowe przekazują informacje z przewodu pokarmowego w kierunku mózgu dotyczące normalnej homeostazy, jak również patofizjologii. Aktywność nerwów doprowadzających przewodu pokarmowego można ocenić, montując izolowane segmenty jelita z przyczepionymi nerwami doprowadzającymi do kąpieli narządowej, izolując nerw i oceniając aktywność podstawową i stymulowaną.

Streszczenie

Nerwy doprowadzające nie tylko przekazują informacje dotyczące normalnej fizjologii, ale także sygnalizują zaburzoną homeostazę i procesy patofizjologiczne różnych układów narządowych od peryferii do ośrodkowego układu nerwowego. W związku z tym zwiększona aktywność lub "uwrażliwienie" nerwów doprowadzających krezki przypisuje się ważną rolę w patofizjologii nadwrażliwości trzewnej i zespołów bólowych brzucha.

Aktywność nerwu doprowadzającego krezki może być mierzona in vitro w izolowanym segmencie jelita, który jest zamontowany w specjalnie zbudowanym pomieszczeniu narządowym i od którego odizolowany jest nerw splanchniczny, co pozwala badaczom bezpośrednio ocenić aktywność nerwów przylegających do odcinka przewodu pokarmowego. Aktywność można rejestrować na początku badania w warunkach znormalizowanych, podczas rozdęcia segmentu lub po dodaniu związków farmakologicznych podawanych doświetlnie lub surowiczo. Technika ta pozwala badaczowi łatwo zbadać działanie leków ukierunkowanych na obwodowy układ nerwowy w próbkach kontrolnych; Poza tym dostarcza kluczowych informacji o tym, jak zmienia się aktywność neuronów podczas choroby. Należy jednak zauważyć, że pomiar aktywności neuronów aferentnych stanowi tylko jedną stację przekaźnikową w złożonej kaskadzie sygnalizacji neuronalnej, a naukowcy powinni pamiętać, aby nie przeoczyć aktywności neuronalnej na innych poziomach (np. Zwoje korzenia grzbietowego, rdzeń kręgowy lub ośrodkowy układ nerwowy), aby w pełni wyjaśnić złożoną fizjologię neuronów w zdrowiu i chorobie.

Powszechnie używane aplikacje obejmują badanie aktywności neuronalnej w odpowiedzi na podanie lipopolisacharydu, oraz badanie aktywności nerwów doprowadzających w modelach zwierzęcych zespołu jelita drażliwego. W bardziej translacyjnym podejściu, izolowany segment jelita myszy może być wystawiony na działanie supernatantów okrężnicy od pacjentów z IBS. Co więcej, niedawno wykazano, że modyfikacja tej techniki ma zastosowanie w próbkach jelita grubego u ludzi.

Wprowadzenie

Sygnalizacja sensoryczna i percepcja bólu to złożony proces, który wynika ze skomplikowanego współdziałania między nerwami doprowadzającymi, neuronami rdzeniowymi, wznoszącymi się i opadającymi szlakami ułatwiającymi i hamującymi oraz kilkoma różnymi obszarami mózgu. W związku z tym zmiany na jednym lub więcej z tych poziomów mogą powodować zmienioną sygnalizację czuciową i ból trzewny w stanach chorobowych. Aby zbadać wszystkie te różne aspekty sygnalizacji sensorycznej, opracowano wiele technik, począwszy od eksperymentów z pojedynczymi komórkami (np. obrazowanie wapnia na neuronach) po modele całych zwierząt (np. reakcje behawioralne, takie jak odpowiedź trzewnoruchowa). Technika opisana w tym artykule pozwala naukowcom na specyficzną ocenę aktywności nerwów aferentnych in vitro z izolowanego odcinka jelita cienkiego lub okrężnicy u gryzoni. Krótko mówiąc, izolowany segment przewodu pokarmowego (zwykle jelito czcze lub okrężnica) jest montowany w specjalnie zbudowanej komorze rejestracyjnej wypełnionej fizjologicznym roztworem Krebsa. Nerw splanchniczny jest wycinany swobodnie i połączony z elektrodą, co umożliwia rejestrację aferentnej aktywności neuronalnej w nerwach doprowadzających splanchnicznych lub miednicznych. Aktywność nerwów może być rejestrowana zasadniczo lub w odpowiedzi na rosnące ciśnienie śródświetlne i/lub związki farmakologiczne, które mogą być stosowane bezpośrednio do komory rejestrującej (surowiczo) lub przez perfuzat śródświetlny (błona śluzowa) w celu oceny ich wpływu na wydzielinę aferentną 1-6. Warto zauważyć, że nerwy splanchniczne oprócz aferentów czuciowych zawierają również włókna odprowadzające i aferenty trzewno-ofugalne. Jedną z głównych zalet rejestracji nerwów splanchnicznych ex vivo jest fakt, że naukowcy mogą określić ilościowo aktywność nerwów bez modulacji lub wkładu z ośrodkowego układu nerwowego, co pozwala na badanie bezpośredniego wpływu miejscowo stosowanych związków na aktywność nerwów. Ponadto monitorowanie parametrów życiowych, które jest konieczne przy użyciu podejścia in vivo (zob. poniżej), nie ma już znaczenia. Zapis splanchnicznyczny in vitro jest wreszcie znacznie mniej czasochłonny niż jego odpowiednik in vivo.

Aktywność neuronów aferentnych w odpowiedzi na inne bodźce, takie jak głaskanie błony śluzowej, sondowanie za pomocą włosów von Freya lub rozciąganie segmentu, może być badana w zmodyfikowanym układzie eksperymentalnym, w którym tkanka jelitowa jest przygwożdżona i otwierana wzdłużnie (co jest przeciwieństwem naszego układu wykorzystującego nienaruszony segment), jak to opisano w poprzednim numerze 7,8. Ponadto, dopiero niedawno, opisano technikę badania aktywacji nerwu doprowadzającego okrężnicy w samej ścianie okrężnicy za pomocą obrazowania wapnia, ponownie przy użyciu przypiętego, podłużnie otwartego segmentu 9.

Alternatywna wersja tej techniki in vivo polega na pomiarze aktywacji neuronów w pobliżu wejścia aferenta do rdzenia kręgowego. Krótko mówiąc, zwierzę poddane sedacji umieszcza się w pozycji leżącej, odsłaniając rdzeń kręgowy lędźwiowo-krzyżowy, do którego wystaje nerw doprowadzający będący przedmiotem zainteresowania, za pomocą laminektomii, budując studnię wypełnioną parafiną przy użyciu skóry nacięcia i udrapując korzeń grzbietowy na platynowej elektrodzie bipolarnej 10,11. Technika ta pozwala ponadto naukowcom scharakteryzować włókna na podstawie ich prędkości przewodzenia i odróżnić niezmielinizowane włókna C od cienko zmielinizowanych włókien Aδ. Ponadto korzonki grzbietowe zawierają wyłącznie czuciowe włókna doprowadzające, w przeciwieństwie do wspomnianych wcześniej mieszanych nerwów doprowadzających i odprowadzających.

Rejestrowanie wydzieliny nerwów aferentnych in vitro z izolowanych segmentów jelita może być również wykonane przy użyciu próbek ludzkich, ponieważ dwie grupy badawcze niezależnie opublikowały pierwsze manuskrypty rejestrujące aktywność nerwu doprowadzającego okrężnicy w próbkach do resekcji u ludzi 12,13. Wdrożenie tej techniki może skutkować łatwiejszą translacją danych mysich na stan humanitarny i może pozwolić naukowcom na łatwą identyfikację leków ukierunkowanych na uwrażliwiony nerw czuciowy. Kliniczne znaczenie scharakteryzowania aktywności nerwów doprowadzających, a także odkrycie nowych odczynników terapeutycznych, które celują w wygórowaną aktywność nerwów doprowadzających, zostało szczegółowo omówione przez wielu ekspertów w tej dziedzinie 14-19.

Wyżej wymieniona technika in vitro uzupełnia bardziej powszechnie znane pomiary aktywności nerwów doprowadzających in vivo. Podczas pomiaru aktywności neuronalnej in vivo, aktywność nerwów może być mierzona bezpośrednio u zwierzęcia poddanego sedacji, podczas którego segment zainteresowania jest identyfikowany, a następnie intubowany, a następnie budowana jest studzienka wypełniona ciekłą parafiną przy użyciu ściany brzucha i skóry gryzonia 20. Nerw doprowadzający będący przedmiotem zainteresowania jest następnie identyfikowany, dzielony i umieszczany na dwubiegunowej elektrodzie platynowej, co umożliwia pomiar aktywności neuronalnej. Technika ta pozwala badaczowi modulować aktywność nerwów doprowadzających u żywych, choć uspokojonych zwierząt; W związku z tym można badać aktywność neuronalną reagującą na zakłócenia, takie jak wzdęcia światła lub dożylne podawanie związku.

Badania translacyjne obecnie koncentrują się głównie na zastosowaniu supernatantów pochodzenia ludzkiego (np. z biopsji okrężnicy, hodowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, itp.) na aferentach myszy z jelita czczego i/lub okrężnicy 21,22. Naukowcy mogą bezpośrednio aplikować supernatanty albo do kąpieli narządowej, albo do roztworu śródświetlnego, który ukrwia odcinek jelita, dzięki czemu można badać różnicowy wpływ aplikacji surowiczej i śluzówkowej na doprowadzające wyładowanie nerwowe. W związku z tym wykazano, że supernatany biopsji błony śluzowej jelita grubego od pacjentów z zespołem jelita drażliwego mogą powodować nadwrażliwość w aferentach okrężnicy myszy, neuronach podśluzówkowych świnki morskiej i neuronach zwojów korzenia grzbietowego myszy 21,23,24.

Wreszcie, rejestrowanie aktywności neuronalnej nie jest ograniczone do neuronów krezkowych i/lub miednicznych unerwiających przewód pokarmowy. Inni wykazali, że zapisy nerwowe mogą być wykonywane w aferentach zaopatrujących staw kolanowy 25, podczas gdy inni scharakteryzowali również aktywność nerwów doprowadzających pęcherz moczowy 26-28 i wykazali, że aferenty miednicy z pęcherza moczowego oraz przewodu pokarmowego zbiegają się, co może prowadzić do przesłuchów neuronalnych 29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane poniżej eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej i ds. wykorzystania zwierząt doświadczalnych na Uniwersytecie w Antwerpii (numer akt 2012-42).

1. Przygotowanie tkanki nerwów doprowadzających jelita czczego i grubego

  1. Przygotowanie aferentnego nerwu jelita czczego
    1. przeprowadzić eutanazję gryzonia w wieku młodzieńczym lub dorosłym, która została zatwierdzona przed rozpoczęciem eksperymentu przez lokalną Komisję Etyczną (np.sedacja terminalna z następującą po niej punkcją serca, zwichnięcie stawów szyjnych, itp.).
      UWAGA: Do uśmiercenia zwierząt zastosowano zwichnięcie stawów obręczy szyjnej, dzięki czemu eksperymenty nie wymagały dalszego znieczulenia ani opieki pooperacyjnej podczas dalszego przetwarzania tkanek in vitro.
      UWAGA: Wykazano, że wiek osłabia funkcje mechanosensoryczne aferentnych włókien krezkowych 30zalecamy zatem badaczom trzymanie się konkretnej grupy wiekowej przez cały czas trwania pojedynczego eksperymentu.
    2. Umieść uśmiercone zwierzę laboratoryjne w pozycji grzbietnej i za pomocą skalpela wykonaj cięcie w linii środkowej brzucha przez skórę i warstwę mięśni brzucha, prowadząc je od wyrostka mieczykowatego do kości łonowej.
    3. Obmywaj jamę brzuszną zimnym roztworem Krebsa, aby zapobiec wysychaniu tkanek wewnątrzbrzusznych (skład roztworu Krebsa: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH2PO4, 15,43 mM NaHCO33, 1,21 mM MgSO₄4, 11,52 mM D-glukozy i 1,52 mM CaCl22).
    4. Szybko wyciąć całypusty jelito, używając ostrych nożyczek, poprzez wycięcie około 20 cm jelita cienkiego, zaczynając bezpośrednio dystalnie od zgięcia dwunastniczo-żylitowego, dbając o to, aby nie uszkodzić sąsiednich struktur i zachowując nienaruszoną krezkę jelita, która zawiera naczynia krwionośne oraz nerwy doprowadzające jelita cienkiego.
      UWAGA: Do samej sekcji jelita czczego w jamie brzusznej nie trzeba używać stereomikroskopu, ponieważ można ją łatwo przeprowadzić gołym okiem.
    5. Umieść wycięty odcinek jelita czczego w lodowatym roztworze Krebsa i przechowuj go w lodzie, stale napowietrzając roztwór Krebsa karbogenem (95% O2)2, 5% CO22).
    6. Przetnij jelito cienkie (część pustą) ostrymi nożyczkami na pętle o długości około 3 cm. Zlokalizuj wiązkę krezkową zawierającą naczynia i nerw trzewny, znajdującą się mniej więcej w centrum każdej pętli.
    7. Przepłucz każdy segment roztworem Krebsa, używając cewnika z tępym końcem, aby usunąć zawartość światła i chymus, ponieważ zawierają one enzymy trawienne, które przyspieszą degradację próbki tkanki. in vitro.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić światła pętli podczas płukania, ponieważ zniszczenie kosmki doprowadzi do uwolnienia mediatorów, które mogą zmieniać aktywność nerwów doprowadzających.
    8. Zidentyfikuj odcinek do pomiaru aktywności nerwu dośrodkowego (np., pierwszy segment jelita czczego dystalnie od więzadła Treitza lub zgięcia dwunastniczo-czczego) i umieścić go w specjalnie zaprojektowanej komorze rejestracyjnej pokrytej warstwą elastomeru silikonowego.
      UWAGA: Początek jelita czczego jest definiowany anatomicznie jako odcinek jelita cienkiego, w którym więzadło Treitza przecina jelito cienkie, nazywany również zgięciem dwunastniczo-czczym.
      UWAGA: Dno komory rejestracyjnej należy pokryć cienką warstwą elastomeru silikonowego z odpowiednim wyprzedzeniem przed rozpoczęciem eksperymentu. Przygotowanie tej warstwy elastomeru powinno zostać przeprowadzone zgodnie z instrukcjami producenta. 1.
    9. Komorę należy stale perfundować ciepłym, nasyconym karbogenem roztworem Krebsa z przepływem 10 ml/min, utrzymując stałą temperaturę roztworu Krebsa w komorze pomiarowej na poziomie 34 °C.
    10. Umieść odcinek jelita czczego w kąpieli organowej w taki sposób, aby koniec jamny był połączony z pompą strzykawkową zapewniającą przepływ w świetle jelita, a koniec przeciwjamny z odpływem. Lekko rozciągnij odcinek, dbając o to, by nie wywierać nadmiernego napięcia. Obie końce przymocuj ściśle do portów dopływowych i odpływowych za pomocą jedwabnych ligatur 4/0.
    11. Podłączyć pompę strzykawkową do końca jamnego i przeprowadzić perfuzję śródświatową odcinka jelita czczego roztworem Krebsa (nieuatlenionym, w temperaturze pokojowej) z prędkością 10 ml/h.
    12. Przytwierdź krezkę zamocowanego segmentu jelita na płasko do dolnej warstwy elastomeru silikonowego, używając szpilek entomologicznych. Rozciągnij krezkę, aby zoptymalizować wizualizację pęczka krezkowego; nie wywieraj nacisku na pęczek ani na jelito cienkie (jejunum).
    13. Wykonaj próbną rozkurczową dystensję rampową (patrz poniżej) poprzez zamknięcie portu wylotowego do momentu, aż ciśnienie wewnątrzświatłowe odcinka jelita osiągnie 60 mmHg, aby zweryfikować, czy z zamocowanego odcinka nie wycieka roztwór Krebsa. Należy zaobserwować miarowy wzrost ciśnienia wewnątrzświatłowego bez żadnych przerw.
    14. Obserwuj niewielkie skurcze segmentu (fale perystaltyczne) podczas początkowej fazy rozciągania. W razie potrzeby zablokuj aktywność perystaltyczną poprzez dodanie 1 µM blokera kanałów wapniowych typu L, nifedipiny, do roztworu Krebsa.
      UWAGA: Dodawanie 1 µM dodanie atropiny do roztworu Krebsa, oprócz nifedipiny, spowoduje całkowity paraliż segmentu jelita. Nie mamy jednak osobistego doświadczenia w stosowaniu atropiny oraz jej wpływie na rejestrację z nerwów dośrodkowych.
    15. Pod stereomikroskopem należy ostrożnie rozpocząć oddzielanie tkanki tłuszczowej od krezki, delikatnie pociągając ją dwiema małymi pincetami, dbając o to, aby nie uszkodzić naczyń oraz nerwu doprowadzającego znajdujących się w tkance tłuszczowej.
    16. Zacznij w pewnej odległości od jelita czczego i odsłoń oba naczynia krwionośne w pęczku krezkowym.
    17. Obserwuj doprowadzający nerw jelita czczego pomiędzy oboma naczyniami jako cienką, białą nić otoczoną tkanką tłuszczową. Przystąp do dalszej dyssekcji w kierunku proksymalnym, ku jelitu czczemu, delikatnie usuwając tkankę tłuszczową za pomocą pęsety tylko wtedy, gdy wstępna identyfikacja obu naczyń krezkowych i/lub nerwu doprowadzającego jest utrudniona.
    18. Wypreparuj nerw krezkowy jelita czczego w obrębie wolnego segmentu na odcinku kilku milimetrów, usuwając przylegającą do nerwu tkankę tłuszczową.
    19. Przetnij nerw ostrymi nożyczkami do tkanek. W razie potrzeby usuń pozostałą tkankę tłuszczową i łączną, a także osłonkę epineuralną, delikatnie odciągając ją małą pęsetą.
    20. Za pomocą mikromanipulatora należy opuścić końcówkę elektrody ssącej, połączonej ze strzykawką z tłokiem, do kąpieli organowej, a następnie, manipulując tłokiem, delikatnie odessać niewielką ilość roztworu Krebsa z kąpieli, tak aby końcówka elektrody została w nim zanurzona (Rycina 1). Należy upewnić się, że roztwór Krebsa pokrywa elektrodę drucianą znajdującą się wewnątrz elektrody ssącej.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować borokrzemianową szklaną kapilarę ssącą z elektrodą drucianą, używając wyciągarki do pipet.
    21. Umieść końcówkę elektrody ssącej bezpośrednio obok przeciętego pasma nerwu dośrodkowego i wciągnij przecięte pasmo nerwu do kapilary na całej jego długości.
    22. Przesuń końcówkę elektrody w kierunku tkanki tłuszczowej i wciągnij ją do szklanej kapilary, silnie aspirując tłokiem, aby w ten sposób mechanicznie „uszczelnić” nerw w kapilarze, oddzielając go od zawartości kąpieli organowej.
    23. Zweryfikuj zapis aktywności nerwów doprowadzających za pomocą systemu akwizycji danych, np.poprzez wywołanie rampowego rozciągania prowadzącego do zwiększenia częstotliwości wyładowań aferentnych (zob. poniżej). Po odizolowaniu nerwu w elektrodzie ssącej, stabilizować preparat przez 15 min, aby uzyskać stan stacjonarny spontanicznej aktywności włókien aferentnych przed przystąpieniem do właściwych eksperymentów.
    24. Aby przeprowadzić rozciąganie rampowe, należy rozciągnąć odcinek jelita poprzez zamknięcie portu wyjściowego, co doprowadzi do stopniowego wzrostu ciśnienia w odcinku jelita (do 60 mmHg). Właściwy protokół eksperymentalny należy przeprowadzić dopiero wtedy, gdy trzy kolejne rozciągania rampowe (w odstępach 15-minutowych) wywołają powtarzalną wyładowanie wielojednostkowe (Rycina 2).
  2. Przygotowanie lędźwiowego splotu trzewnego doprowadzającego (nerwu doprowadzającego jelita grubego)
    UWAGA: Disekcja aferentnych włókien nerwowych okrężnicy wymaga bardziej szczegółowej preparacji. Odstępstwa od poprzedniego protokołu dotyczącego jelita czczego wymieniono poniżej:
    1. Uśmierć zwierzę za pomocą humanitarnej metody, ułóż je w pozycji grzbietnej, wykonaj laparotomię w linii pośrodkowej i obficie wlej lodowaty roztwór Krebsa do jamy brzusznej. UWAGA: Skład roztworu Krebsa: 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 1 mM NaH2PO42PO4, 22 NaHCO33, 1,2 mM MgSO₄4, 11 mM D-glukozy i 2,5 mM CaCl22, 3 µM indometacyna
      UWAGA: Należy zwrócić uwagę na zmieniony skład roztworu Krebsa; do roztworu dodaje się indometacyn w celu zapobieżenia wpływowi prostaglandyn na aktywność włókien aferentnych.
    2. Usuń tkankę tłuszczową, pęcherz moczowy oraz narządy rodne wewnętrzne, a następnie delikatnie przesuń jelito cienkie na jedną stronę w jamie brzusznej. Wykonaj rozszerzoną prelewację dystalnej części okrężnicy wraz z nienaruszonymi nerwami krezkowymi z brzucha.
      UWAGA: Ważne punkty orientacyjne, które mogą zostać uwzględnione w tej sekcji w celu ułatwienia dalszego przygotowania tkanki, obejmują aortę brzuszną i żyłę główną dolną, lewą nerkę oraz mięśnie dna miednicy.
      UWAGA: Podczas sekcji należy uważać, aby nie wywierać nacisku na tkankę łączną między okrężnicą a aortą brzuszną, ponieważ w tym obszarze znajdują się nerwy trzewne lędźwiowe.
    3. Przenieś segment tkanki do komory rejestracyjnej wyłożonej elastomerem silikonowym. Jako punkt wyjścia przyjmij lewą tętnicę nerkową, która odgałęzia się od aorty brzusznej. Podążaj wzdłuż aorty brzusznej w kierunku aboralnym, aż do momentu napotkania tętnicy krezkowej górnej wraz z pniem trzewnym i zwojem krezkowym górnym. Na koniec dotrzyj do tkanki łącznej pomiędzy dystalną częścią okrężnicy a aortą, w której znajduje się badany nerw.
    4. Zidentyfikuj tętnicę krezkową dolną odchodzącą od aorty brzusznej. Nerw trzewny lędźwiowy doprowadzający można zidentyfikować u podstawy tętnicy krezkowej dolnej; przebiega on równolegle do tętnicy (Rysunek 3).
    5. Po przecięciu nerwu delikatnie usuń otaczającą go osłonkę tkanki łącznej i rozdziel nerw na kilka cienkich włókien. Należy zachować bezpieczny odstęp od okrężnicy.
    6. Wprowadź jedną z tych pojedynczych nici do elektrody ssącej, „uszczelnij” kapilarę otaczającą tkanką tłuszczową zgodnie z wcześniejszym opisem i przeprowadź wybrany protokół eksperymentalny.
    7. Usunąć wszelkie zbędne fragmenty tkanki znajdujące się w kąpieli organowej (np. nerki, naczynia brzuszne, tkanka mięśniowa), ponieważ mogą one zakłócać sygnał doprowadzający.
      UWAGA: Nifedypina (1µM) można dodać do roztworu Krebsa w przypadku, gdy sygnał nerwu doprowadzającego jest zakłócony przez spontaniczne ruchy jelit wynikające ze skurczów komórek mięśni gładkich.
      UWAGA: Leki można podawać w trzech różnych miejscach: 1) seryzalnie, poprzez rozpuszczenie wybranego związku w roztworze Krebsa perfundującym komorę rejestracyjną, 2) bezpośrednio do kąpieli organowej przy jednoczesnym tymczasowym zatrzymaniu perfuzji lub 3) wewnątrzdobowo, poprzez rozpuszczenie interesującego związku w roztworze Krebsa w pompie strzykawkowej. Desensytyzacja włókien aferentnych może wystąpić w przypadku zbyt szybkiego, następującego po sobie podawania kumulatywnych dawek związku.

Schemat układu perfuzji jelita czczego z przetwornikiem ciśnienia, wzmacniaczem sygnału i analizą danych.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd dedykowanej komory rejestracyjnej i elektrody ssącej. Szczegółowy przegląd układu technicznego z zainstalowaną elektrodą ssącą i komorą rejestracyjną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat analizy neurogramu; wykresy Hz, V, mmHg; badanie aktywności nerwu i odpowiedzi ciśnieniowej.
Rycina 2: Reprezentatywny zapis rejestracji in vitro aktywności aferentnej nerwu jelita czczego. Typowy zapis wielkojednostkowej aktywności aferentnej nerwu jelita czczego (imp.sec-1) (panel górny) w stanie spoczynku oraz w odpowiedzi na 2 rampowe rozciągnięcia do 60 mmHg (panel dolny), a następnie identyfikacja (analiza wavemark) różnych pojedynczych jednostek w sygnale nerwowym (panel trzeci). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat unerwienia okrężnicy z połączeniami z rdzeniem kręgowym i rozmieszczeniem elektrod rejestrujących.
Rysunek 3: Neuroanatomia okrężnicy. A) Informacje sensoryczne z okrężnicy są przekazywane za pośrednictwem lędźwiowych nerwów okrężniczych (LCN) w kierunku ośrodkowego układu nerwowego, przy czym LCN biegną w bliskim sąsiedztwie tętnicy krezkowej dolnej (IMA). Część włókien z tego lędźwiowego nerwu okrężniczego przebiega wzdłuż nerwu międzykrezkowego (IMN), tworząc lędźwiowe nerwy trzewne (LSN). Zwoj krezkowy dolny (IMG) znajduje się u ujścia IMA z aorty brzusznej. Rejestracja dystalnie względem IMG jest niezbędna, jeśli badacze chcą analizować aktywność aferentną nerwów wiscerofugalnych. B) Schematyczny przegląd układu eksperymentalnego. Rejestracja aferentna LCN jest wykonywana w narządzie za pomocą elektrody ssącej podłączonej do systemu akwizycji danych. Rozciąganie rampowe można przeprowadzić po zamknięciu portu wylotowego, kontynuując dopływ roztworu Krebsa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Pozyskiwanie danych

  1. Rejestruj aktywność nerwową za pomocą elektrody ssącej podłączonej do przedwzmacniacza głowicowego. Wzmocnij (wzmocnienie 10k) i przefiltruj sygnał (filtr pasmowy 500 - 5,000 Hz) 20.
    UWAGA: W układzie eksperymentalnym należy zastosować eliminator szumów 50/60 Hz w celu usunięcia sygnałów zakłóceń elektrycznych o częstotliwości 50/60 Hz. Sygnał jest automatycznie digitalizowany i próbkowany z częstotliwością 20 kHz w celu przeprowadzenia analizy.

3. Analiza5,20

  1. Zarejestruj wyładowania nerwu dośrodkowego jako całkowitą liczbę impulsów/sekundę dla całego nerwu lub użyj specjalistycznego oprogramowania do przeprowadzenia dalszej analizy, ponieważ wielojednostkowe zapisy ogólnej aktywności nerwu zawierają potencjały czynnościowe o różnym kształcie, amplitudzie i szerokości, odpowiadające różnym jednostkom nerwowym w każdym włóknie dośrodkowym (Rysunek 2).
  2. Dopasuj poszczególne wzorce falowe do zdefiniowanych szablonów, co pozwoli na rozróżnienie pojedynczych jednostek. Przed przypisaniem impulsu do określonego wzorca falowego należy zapewnić stosunek sygnału do szumu >2:1.
    UWAGA: Podczas analizy wzorców falowych tworzymy nowy szablon, gdy oprogramowanie analityczne zidentyfikuje co najmniej 10 podobnych impulsów. Nie tworzy się szablonów dla kształtów występujących rzadziej niż raz na 50 impulsów. Impuls jest dopasowywany do szablonu za pomocą analizy głównych składowych, gdy co najmniej 80% jego punktów jest identycznych z impulsem szablonowym. Dopasowywanie do szablonu zależy od operatora i zawsze powinno być wykonywane przez tego samego badacza w sposób zaślepiony.
  3. Oblicz odpowiedzi potencjału czynnościowego, odejmując aktywność spontaniczną w stanie spoczynku (ciśnienie wewnątrzwłókniste 0 mmHg) od odpowiedzi podczas rozciągania w ustalonych punktach czasowych (przyrosty 5 mmHg od 0 do 20 mmHg ciśnienia wewnątrzwłóknistego, przyrosty 10 mmHg powyżej 20 mmHg). Pomiar wyładowań dośrodkowych w stanie spoczynku należy przeprowadzić, stosując interwał czasowy wynoszący 10 sec.
  4. Wykorzystaj analizę pojedynczych jednostek do klasyfikacji włókien na podstawie ich profilu wyładowań podczas stopniowego rozciągania (Rysunek 4). Ponadto analiza pojedynczych jednostek może być wykorzystana do badania profilu chemosensorycznego różnych typów jednostek, ponieważ nie wszystkie typy jednostek będą wykazywać taką samą zmienioną aktywność wyładowań w odpowiedzi na lek lub związek chemiczny.
  5. Klasyfikuj włókna jako włókna o niskim progu pobudliwości ('LT', zazwyczaj wykazują zwiększone wyładowania przy niższych ciśnieniach rozciągania), włókna o wysokim progu pobudliwości ('HT', wykazują zwiększone wyładowania przy najwyższych ciśnieniach rozciągania), włókna o szerokim zakresie dynamicznym ('WDR', wykazują zwiększoną aktywność podczas całego procesu stopniowego rozciągania) lub włókna dośrodkowe nieczułe mechanicznie ('MIA', włókna nerwowe, które zazwyczaj nie reagują na stopniowe rozciąganie) 5;20.
  6. Wyraź odpowiedź wyładowań nerwu przy 20 mmHg jako procent maksymalnej odpowiedzi wyładowań podczas rozciągania (LT%), ponieważ odzwierciedla to stopień wyładowań przy niskim ciśnieniu rozciągania.
    UWAGA: Zatem włókna LT charakteryzują się wartością LT% > 55%, natomiast włókna HT definiuje wartość <15%. Wartości dla jednostek WDR mieszczą się w przedziale od 15 do 55% (20). Jednostka MIA wykazuje spontaniczne wyładowania dośrodkowe, na które rozciąganie nie ma wpływu.

Wykresy odpowiedzi progowej, równania LT%=firing(axial), schemat przedstawiający wyładowania aferentne w funkcji ciśnienia.
Rysunek 4: Schematyczne przedstawienie różnych jednostek włókien aferentnych w zależności od ich profilu mechanosensytywnego. Jednostki są klasyfikowane na podstawie procentu (LT%) ich częstotliwości wyładowań przy ciśnieniu rozciągania 20 mmHg w porównaniu do maksymalnej odpowiedzi wyładowań podczas rozciągania. Włókna o niskim progu (lewy górny panel) wykazują głównie zwiększoną aktywność nerwową przy niskich ciśnieniach rozciągania, co skutkuje LT% powyżej 55%. Jednostki o wysokim progu (prawy górny panel) przeciwnie, wykazują wzrost częstotliwości wyładowań tylko przy ciśnieniach noicyjnych (%LT < 15). Włókna o szerokim zakresie dynamicznym (lewy dolny panel) wykazują stopniowy wzrost aktywności nerwowej podczas całego rozciągania (%LT w zakresie od 15 do 55), natomiast włókna niewrażliwe mechanicznie (prawy dolny panel) nie reagują na zwiększające się ciśnienie rozciągania. LT%: (wyładowania aferentne przy 20 mmHg / maksymalne wyładowania aferentne) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aktywność włókien aferentnych jelita czczego mierzono w stanie spoczynku oraz w odpowiedzi na rampowe rozciąganie u 9 ośmiotygodniowych samców myszy OF-1. Zwierzęta utrzymywano w grupach w zestandaryzowanych warunkach (6 zwierząt w klatce, 20 - 22 °C, wilgotność 40 - 50%, 12-godzinny cykl światła i ciemności) z nieograniczonym dostępem do wody kranowej i standardowej karmy. Odcinki jelita czczego myszy wykazywały nieregularne spontaniczne wyładowania nerwów aferentnych w stanie spoczynku ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół w tym artykule opisuje powtarzalną technikę laboratoryjną do badania aktywności nerwu doprowadzającego krezki u gryzoni, stosowaną przez naszą grupę i innych 3,4,7,8,12,20,21,31. Krytyczne kroki w ramach protokołu obejmują szybką izolację tkanki, aspirację pasma nerwowego do elektrody ssącej oraz odpowiednie "uszczelnienie" szklanej kapilary z kąpieli narządowej poprzez zasysanie otaczającej tkanki tłuszczowej do naczynia włosowatego. Otwór szklanej kapilary powinien być precyzyjnie określony: zbyt ma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

SN przeprowadził opisane powyżej eksperymenty, przeprowadził analizę danych i sporządził manuskrypt. AD i JDM wdrożyły tę technikę w naszych ośrodkach badawczych i pomogły w analizie danych. HC pomagał w przeprowadzaniu eksperymentów. WJ, CK i DG pomogły we wdrożeniu techniki pomiarów aferentnych w naszym laboratorium, analizie danych i interpretacji wyników. Badanie zaprojektowały SF, JDM i BDW. Wszyscy autorzy krytycznie przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu. SN jest członkiem Funduszu Badań Naukowych (FWO) we Flandrii (11G7415N). Prace te były wspierane finansowo przez FWO (G028615N i G034113N).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
chlorek sodu (NaCl)VWR Chemicals27,810,295związek roztwór Krebsa
chlorek potasu (KCl)Acros organics196770010związek Krebs roztwór
diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)VWR Chemicals1 063 461 000związek roztwór Krebsa
wodorowęglan sodu (NaHCO3)Merck1,063,291,000złożony roztwór Krebsa
siarczan magnezu (MgSO4)Merck1,058,861,000złożony roztwór Krebsa
chlorek wapnia (CaCl2)Merck23,811,000złożony roztwór Krebsa
D-glukozaVWR Chemicals1011175Proztwór
KrebsaZwiązek wodyRoztwór Krebsa
Rurki PVCMateriałySegment jelitowy powinien być zamontowany na rurkach PVC
Rurki silikonoweMateriałyReszta rurki, najlepiej na bazie silikonu - łatwiejsze usuwanie zanieczyszczeń w rurki
Nić jedwabnaPearsall Limited10B15S220Mocowanie segmentu na rurce PVC
Sterownik strzykawkiAparat Harvarda55-2222Wlew śródświetlny lornetki Krebsa
- w tym 10-krotne powiększenie w okuZeiss STEMI 2000Optymalna wizualizacja do rozwarstwienia nerwu doprowadzającego
Homeotermiczny koc sterujący AparatHarvarda507214Ogrzewanie komory
narządowejWykonana na zamówienie łaźnia organowa z dnem pokrytym Sylgardem
OprogramowanieRejestracja i analiza danych
Szpilki do owadów, 500 sztuk, stal nierdzewna, średnica 0,2 mmSzpilki do owadów Austerlitz minéticsRozwarstwienie nerwu doprowadzającego
Pęseta Dumont #5 inox 11 cmŚwiatowy instrument precyzyjny500341Rozwarstwienie nerwu
doprowadzającegoNożyczki, sprężynowe, 14 cmWorld Precision Instrument15905Rozwarstwienie nerwu doprowadzającego
DB digitimer NL 108T2/10przetwornik ciśnienia
MikromanipulatorNarishigeM-3333Manipulacja 3D elektrody ssącej
MikromanipulatorX-4 blokManipulacja 3D elektrody ssącej
MikromanipulatorGJ-8 StojakManipulacja 3D elektrody ssącej
LightSourceEuromex Microscopes Holandia EK-1Optymalna wizualizacja do preparacji nerwu doprowadzającego
rejestrująca CED 1401Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego
Humbug 50/60 Hz Eliminator szumówQuest Scientific InstrumentsEliminacja szumów tła
Pompa infuzyjnaGibson Minipuls 2Infuzja komory narządowej, w której zamontowany
jest segmentPółogniwa uchwytu mikroelektrody 1,5 mmŚwiatowy instrument precyzyjnyMEH2SWElektroda ssąca do izolacji włókna doprowadzającego
Kapilary ze szkła borokrzemianowego, 300 szt.; 1,5/0,84 OD/IDWorld Precision Instrument1B150-4Kapilara do izolacji nerwu doprowadzającego
destylowanej laboratoryjne Materiały laboratoryjne do laboratoriów naukowych Spike2 obrotowy magnetyczny Aparatura

Bibliografia

  1. Donovan, J., Grundy, D. Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS. Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).
  2. Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction. Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).
  3. Keating, C., et al. Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism. J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).
  4. Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide. Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).
  5. Deiteren, A., et al. Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling. Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).
  6. Nullens, S., et al. The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice. Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22(2015).
  7. Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  8. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings. J Vis Exp. (95), e52310(2015).
  9. Travis, L., Spencer, N. J. Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon. Front Neurosci. 7, 179(2013).
  10. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).
  11. Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).
  12. Jiang, W., et al. First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents. Gut. 60 (2), 281-282 (2011).
  13. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
  14. Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. Extrinsic primary afferent signalling in the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).
  15. Bulmer, D. C., Grundy, D. Achieving translation in models of visceral pain. Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).
  16. De Winter, B. Y., De Man, J. G. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).
  17. Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57 (7), 923-929 (2008).
  18. De Schepper, H. U., et al. TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats. J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).
  19. Vermeulen, W., et al. Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats. Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).
  20. Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat. Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).
  21. Hughes, P. A., et al. Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes. Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).
  22. Hughes, P. A., et al. Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients. Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).
  23. Buhner, S., et al. Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity. Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).
  24. Wouters, M. M., et al. Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome. Gastroenterology. , (2016).
  25. Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain. Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).
  26. Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level. Pain. 128 (3), 235-243 (2007).
  27. Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity. Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).
  28. Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder. J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).
  29. Wyndaele, M., et al. Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats. J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).
  30. Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse. J Physiol. , (2015).
  31. Valdez-Morales, E. E., et al. Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2. Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Segmenty jelita czczego i grubegoizolacja nerw w trzewnychtechnika k pieli organowejprotok stopniowego rozci ganiakwantyfikacja aktywno ci nerwowejbadanie nadwra liwo ci trzewnejmodel zespo u jelita dra liwegoanaliza zwoj w korzeni grzbietowych

Powiązane artykuły