Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

14.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54582

⸱

14 grudnia 2016

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University

W tym artykule

Podsumowanie

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Streszczenie

Cechą charakterystyczną odporności humoralnej jest generowanie funkcjonalnych ASC, które syntetyzują i wydzielają Abs specyficzne dla antygenu (Ag), takiego jak patogen, i są używane do obrony gospodarza. W celu ilościowego określenia stanu funkcjonalnego humoralnej odpowiedzi immunologicznej danej osoby, zarówno Abs w surowicy, jak i krążące ASC są zwykle mierzone jako odczyty funkcjonalne. U ludzi krew obwodowa jest najwygodniejszą i najłatwiej dostępną próbką, którą można wykorzystać do określenia humoralnej odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez limfocyty B gospodarza. Odrębne podzbiory limfocytów B, w tym ASC, można wyizolować bezpośrednio z krwi obwodowej poprzez selekcję za pomocą mikrogranulek sprzężonych z Ab specyficznych dla linii lub poprzez sortowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Co więcej, oczyszczone naiwne i pamięciowe limfocyty B mogą być aktywowane i różnicowane w ASC w hodowli. Funkcjonalne działanie ASC przyczyniające się do wydzielania Ab można określić ilościowo za pomocą ELISpot, który jest testem, który łączy test immunoabsorbancji sprzężony z enzymami (ELISA) i technologie western blotting, aby umożliwić wyliczenie poszczególnych ASC na poziomie pojedynczej komórki. W praktyce test ELISpot jest coraz częściej stosowany do oceny skuteczności szczepionki ze względu na łatwość obsługi dużej liczby próbek krwi. W tym miejscu zostaną opisane metody izolowania ludzkich limfocytów B od krwi obwodowej, różnicowania komórek B w ASC in vitro oraz zastosowania ELISpot do ilościowego oznaczania całkowitych IgM- i IgG-ASC.

Wprowadzenie

Komórki B odgrywają kluczową rolę w rozwoju odporności humoralnej. Początkowo rozwijają się w szpiku kostnym i dostają się do krwiobiegu jako naiwne limfocyty B, które mogą migrować do tkanek limfatycznych, takich jak śledziona, węzły chłonne i migdałki, w celu dalszego rozwoju. Po napotkaniu Ag niektóre naiwne limfocyty B migrują do pęcherzyków limfatycznych, gdzie komórki B centrum rozrodczego mogą różnicować się w komórki B pamięci i plazmablasty (PB) / komórki plazmatyczne (PC). Podczas gdy większość PB/PC wydostaje się do krwiobiegu, kilka ostatecznie znajduje się w szpiku kostnym, aby przejść końcowe różnicowanie w długotrwałe PC1. Limfocyty B w krążeniu są niejednorodne, a w stanie stacjonarnym PB/PC są rzadkie we krwi obwodowej2. W wyniku dostępności markerów powierzchniowych specyficznych dla linii, cytometria przepływowa stała się popularną metodą identyfikacji i charakterystyki podzbiorów limfocytów B we krwi obwodowej. Rozszerzonym zastosowaniem cytometrii przepływowej jest dodanie funkcji sortowania komórek, która pozwala na separację i izolację poszczególnych podzbiorów komórek B o wysokiej czystości. Opierając się na ekspresji specyficznych receptorów powierzchniowych na różnych etapach rozwoju, ludzkie krążące limfocyty B są ogólnie klasyfikowane do trzech głównych subpopulacji: naiwne komórki B (CD19 + CD27--CD38-), komórki B pamięci (CD19 + CD27 + CD38-) i PB / PC (CD19 + CD27 + CD38 +)3-4 (Figura 1). Naiwne limfocyty B z natury nie spotkały się z Ags. Można je jednak różnicować w komórki B pamięci IgM + CD27 +. Chociaż naiwne limfocyty B są jednorodne w ekspresji cząsteczek związanych z receptorem antygenu komórek B (BCR) (np. CD19, CD20 i CD22), są niejednorodne w swoim repertuarze immunoglobulin5. Większość komórek B pamięci CD27+ można różnicować w CD27+/hiCD38+ PBs/PC6. Ponadto limfocyty B pamięci i PB/PC są poliklonalne i wykazują heterogeniczność rozwojową i funkcjonalną4-7. PB/PC w krążeniu są zwykle krótkotrwałe i nie wykazują ekspresji CD138, ale te, które osiedlają się w szpiku kostnym, ostatecznie różnicują się i stają się długowieczne. Terminalnie zróżnicowane PC wyrażają CD138 i obniżają poziom cząsteczek CD27 na swoich powierzchniach8. Ponieważ zarówno PB, jak i PC są zdolne do wydzielania Abs, w wielu przypadkach są one zbiorczo oznaczane jako ASC. W przeciwieństwie do tego, ani naiwne komórki B, ani komórki B pamięci nie mogą wytwarzać znacznych ilości Abs9-10. Niemniej jednak, po wyizolowaniu, zarówno naiwne, jak i pamięciowe limfocyty B mogą zostać zróżnicowane w ASC w ciągu 3 - 10 dni, po umieszczeniu w odpowiednich warunkach hodowli6, 11-15. W rzeczywistości ASC pochodzące z różnicowania in vitro mają podobne ekspresje powierzchniowe CD27 i CD38 z tymi bezpośrednio wyizolowanymi z krwi obwodowej6. Ponadto ASC zróżnicowane in vitro wykazują niski poziom powierzchniowego CD20, podobny do krążących PB/PC6. Chociaż wszystkie ASC pochodzące z hodowli są krótkotrwałe, mogą wydzielać Abs, co wskazuje, że są funkcjonalnie kompetentne i mogą przyczynić się do odporności humoralnej.

Zarówno ELISA, jak i ELISpot są zdecydowanie najczęściej stosowanymi metodami, za pomocą których można uzyskać funkcjonalne informacje na temat humoralnej odpowiedzi immunologicznej. ELISA jest 96-dołkowym testem na płytce i jest często używany do pomiaru miana Abs specyficznego dla Ag w surowicy i innych analitów (np. cytokin). Jest wygodny i skalowalny. Test ELISA jest przeznaczony do wykorzystania testu enzymatycznego w fazie stałej do wykrywania obecności Abs lub innych substancji, takich jak surowica, w próbce cieczy16. Odczyty z testów ELISA w surowicy są szeroko stosowane do reprezentowania odpowiedzi immunologicznej organizmu. Narzędziem niezbędnym do pozyskiwania odczytów z testów ELISA jest spektrofotometryczny czytnik mikropłytek. Czytelnik może określić gęstość optyczną (O.D.) produktów końcowych zwykle wynikających z reakcji detekcji Abs sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP) i ich specyficznych substratów17. Jeśli chodzi o zgłaszanie humoralnej odpowiedzi immunologicznej, poziomy Ab w surowicy określone za pomocą testu ELISA oznaczają zbiorowe, ale nie indywidualne, działanie ASC w organizmie. Ponadto test ELISA nie bierze pod uwagę udziału komórek B pamięci, które nie wydzielają Abs.

Podobnie jak ELISA, ELISpot jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania i monitorowania odpowiedzi immunologicznej w próbkach krwi obwodowej17-18. ELISpot to technika związana z testem ELISA kanapkowym. W nim komórki są umieszczane w studzienkach z polifluorkiem winylidenu (PVDF) z 96-dołkowymi mikropłytkami w celu krótkotrwałej hodowli. Test ELISpot jest analogiczny do wykonywania western blot na mikropłytce i rozwijania plam na membranie PVDF w każdym dołku. Wymagany jest zautomatyzowany czytnik ELISpot lub mikroskop stereoskopowy do ręcznego liczenia. Główną zaletą ELISpot w wykrywaniu odpowiedzi immunologicznej jest jego doskonała czułość w oznaczaniu ilościowym ASC i komórek wydzielających cytokiny. Informuje o ich aktywności funkcjonalnej odpowiednio w odporności humoralnej i komórkowej. W pomiarze humoralnej funkcji immunologicznej poziomy Ab w surowicy określone za pomocą testu ELISA i liczba ASC wyliczonych za pomocą testu ELISpot są często skorelowane, ale odczyty danych z tych dwóch testów mają pewne różnice w implikacjach funkcjonalnych19-20. Główną zaletą ELISpot jest czułość metody. Poziom mian Ab w surowicy podawany przez test ELISA jest przedstawiany częściowo ilościowo jako odczyty OD, oznaczające względny poziom Ab, lub bardziej ilościowo, jako odczyty stężenia, gdy w celach informacyjnych uwzględniono znaną ilość odpowiednich izotypów Abs. Natomiast wyniki ELISpot są przedstawiane jako bezwzględna liczba ASC w puli komórek będących przedmiotem zainteresowania (np. Niefrakcjonowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i oczyszczone limfocyty B z PBMC). ELISpot może wykryć pojedynczy ASC, ale ELISA wymaga ilości Ab z ASC, aby osiągnąć zoptymalizowane stężenia zależne od testu przed pomiarem. W związku z tym ELISpot jest oczywiście lepszy od ELISA pod względem czułości kwantyfikacji. Co więcej, ELISpot nadaje się również do ilościowego oznaczania ASC zróżnicowanych in vitro z aktywowanych komórek B pamięci. Limfocyty B pamięci nie wydzielają Abs, ale mogą różnicować się w ASC po aktywacji; W związku z tym nie mają one wpływu na Abs w surowicy wykrywane przez test ELISA. Tak więc ELISpot jest metodą z wyboru w pomiarze odpowiedzi immunologicznej krążących komórek B pamięci po aktywacji w hodowli. Pozwala na monitorowanie utrzymania długotrwałej odporności humoralnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzka krew obwodowa musi być pobierana od zdrowych dawców za świadomą zgodą, a wykorzystanie próbek krwi musi być zgodne z zatwierdzonymi wytycznymi ustanowionymi przez poszczególne instytucjonalne komisje rewizyjne. W tym badaniu protokół wykorzystania ludzkiej krwi do demonstracji wyników cytometrii przepływowej (ryc. 1) i testów ELISpot (ryc. 3) został zatwierdzony przez Wewnętrzną Komisję Rewizyjną Narodowego Tajwańskiego Szpitala Uniwersyteckiego (numer protokołu 201307019RINB).

1. Izolacja i oczyszczanie ludzkich komórek B krwi obwodowej

  1. Pobrać ~ 10 ml krwi z żyły łokciowej środkowej (w dole łokciowym przed łokciem) do 15-mililitrowej probówki zawierającejK2EDTA(1,5 do 2,0 mg/ml krwi) i natychmiast kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów.
  2. Dodać 35 ml autoklawizowanego (121 °C, 15 min) buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 1 mM EDTA; pH 7,4) do probówki zawierającej świeżą próbkę krwi (≥ 3:1 obj./obj.) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) nie dłużej niż 5 min.
    UWAGA: Pojawienie się przepuszczalności światła przez rurkę wskazuje na zakończenie lizy RBC.
  3. Wirować przy 600 x g przy RT przez 5 minut. Upewnij się, że osad ma biały kolor.
  4. Zawiesić osad w 10 ml autoklawowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 i 1,47 mM KH2PO4; pH 7,4) i odwirować jak w kroku 1.3.
  5. Wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad z 10 ml pożywki RPMI 1640 (dodatki: 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy), a następnie umieść komórki w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym (10 ml krwi na szalkę). Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 30 minut.
  6. Delikatnie zakręć naczyniem hodowlanym kilka razy i umieść pożywkę hodowlaną (komórki zawiesinowe) w plastikowych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Wyrzuć przylegające komórki (głównie makrofagi) na szalkach hodowlanych.
  7. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  8. Zawiesić osad z 1 ml pożywki RPMI 1640. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Żywotność izolowanych leukocytów jest zwykle większa niż 90% przez wykluczenie błękitu trypanowego.
  9. Odwirować jak w kroku 1.7 i ponownie zawiesić komórki w ~ 200 μl zimnego buforu PBS (0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA) w stężeniu 5 - 10 x 106 komórek/ml.
  10. Dodać 5 μl biotynylowanego anty-ludzkiego koktajlu Ab specyficznego dla komórek krwi (dla negatywnej selekcji komórek B) na 106 komórek i inkubować na lodzie przez 30 minut21,
    UWAGA: Anty-ludzki koktajl Ab powinien zawierać co najmniej Abs specyficzne dla CD2 (lub CD3), CD14 i CD16.
  11. Dodać 10-krotny nadmiar sterylnego PBS do komórek, odwirować przy 600 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
  12. Dodać równe ilości mikrogranulek sprzężonych ze streptawidyną (5 μl na10-6 komórek) do osadu i dokładnie wymieszać.
  13. Inkubować na lodzie przez 30 minut w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  14. Dodać 2 ml buforu PBS do probówki.
  15. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 8 minut. Brązowe mikrogranulki będą stopniowo przyczepiać się do ścianki rurki obok magnesu22.
  16. Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie przenieś supernatant do nowej sterylnej probówki22 o pojemności 15 ml.
  17. Powtórz kroki od 1.14 do 1.16 i połącz dwa supernatanty, które zawierają nietknięte limfocyty B. Wyrzuć mikrogranulki.
  18. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  19. Ponownie zawiesić granulkę w podłożu RPMI 1640 w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Zazwyczaj można wyizolować 1 - 5 x 105 komórek B o czystości większej niż 95% z 10 ml krwi obwodowej23.

2. Oczyszczanie i oddzielanie pamięci i naiwnych komórek B od izolowanych komórek B

  1. Użyj komórek oczyszczonych z kroku 1 i określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl zimnego buforu PBS po odwirowaniu w stężeniu 600 x g i RT przez 5 minut.
  3. Dodać 1 - 2 μg biotynylowanego mAb CD27 na 106 komórek i inkubować na lodzie przez 30 minut.
  4. Dodać 10 ml buforu PBS do probówki i odwirowywać przy 600 x g przez 5 minut.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu PBS.
  6. Dodaj równe ilości mikrokulek magnetycznych streptawidyny (1 - 2 μg/106 komórek) do komórek w 15-mililitrowej plastikowej stożkowej probówce.
  7. Delikatnie dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
  8. Dodać 2 - 3 ml buforu PBS do probówki.
  9. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 8 minut, aby brązowe mikrokulki przyczepiły się do strony znajdującej się najbliżej magnesu.
  10. Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie przenieś frakcję supernatantu do nowej sterylnej probówki. Frakcja ta zawiera wzbogacone limfocyty B nienawątkowe CD27.
  11. Dodaj 5 ml do probówki zawierającej mikrogranulki i delikatnie ponownie zawieś mikrogranulki (tj. wzbogaconą frakcję komórek B pamięci CD27+)24-25.
  12. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ponownie zawiesić granulki z pożywką RPMI 1640 do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Zazwyczaj ~ 30 - 60% komórek B można oczyścić jako komórki pamięci CD27 + z PBMC zdrowego dawcy7, 25-26.

3. Sortowanie komórek dla zbioru naiwnych komórek B, komórek B pamięci i PB/PC

  1. Korzystając z komórek oczyszczonych z kroku 1, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  2. Ponownie zawiesić komórki w zimnym buforze PBS w stężeniu10-7 na ml w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml.
  3. Dodać 1 - 2 μg ludzkiej IgG na10-6 komórek i inkubować na lodzie przez 10 minut w celu uzyskania bloku Fc.
  4. Dodać po 1 μg anty-CD19-APC (klon: HIB19), anty-CD27-eFluor450 (klon: O323) i anty-CD38-PE (klon: HIT2) na 106 komórek; dobrze wymieszać i inkubować na lodzie przez 30 minut4, 27.
  5. W ciągu ostatnich 5 minut w kroku 3.4 dodaj 5 μl dostępnej na rynku 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD).
  6. Dodać 2 ml PBS do probówki, wirować i wirować przy 600 x g przez 5 minut.
  7. Ponownie zawiesić komórki w buforze sortującym (sterylny PBS z 2% BSA i 2 mM EDTA) w stężeniu 1 - 5 x 10 7 komórek na ml w probówce o pojemności 15 ml.
  8. Przefiltruj komórki przez sitko z nylonowej siatki (rozmiar porów 40 μm), aby wyeliminować grudki komórek.
  9. Oddziel komórki za pomocą sortera cytometrycznego przepływowego wyposażonego w trzy lasery: fioletowy (405 nm), niebieski (488 nm) i czerwony (640 nm).
    UWAGA: Sam niebieski laser jest wystarczający do 3-kolorowej cytometrii przepływowej27-28.
  10. Posortuj komórki do trzech probówek o pojemności 15 ml (zawierających 5 ml pożywki RPMI) w celu jednoczesnego zbierania naiwnych komórek B (CD19 + CD27-), komórek B pamięci (CD19 + CD27 +) i PB / PC (CD19 + CD27 + / hiCD38 +) 3-4, 28,
    UWAGA: Posortowane naiwne i pamięciowe komórki B można hodować zgodnie z opisem w kroku 4.

4. Różnicowanie in vitro izolowanych ludzkich komórek B CD19+, komórek B pamięci CD19+ CD27+ i komórek B niewcześniej nieleczonych CD19+CD27

  1. Korzystając z komórek oczyszczonych w krokach 1.19, 2.10, 2.11 i 3.10, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  2. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki RPMI 1640 o stężeniu 1 - 10 x10,5 na ml i podać je do dołków 12-dołkowej płytki.
  3. Dodaj CpG (ODN 2006) w stężeniu 5 μg/106 komórek/ml18, 29.
  4. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5 dni.
  5. Zbierz komórki z każdej studzienki, umieść je osobno w probówkach o pojemności 15 ml, dodaj 5 ml PBS do każdej probówki i odwiruj je przy 600 x g i RT przez 5 minut.
  6. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zawiesić komórki w stężeniu 1 - 10 x 105 na ml za pomocą pożywki RPMI 1640.

5. Test ELISpot

  1. Dodaj 30 μl 35% etanolu w wodzie destylowanej do każdej studzienki płytek ELISpot na 30 s.
    UWAGA: Podczas pipetowania należy unikać dotykania membrany w studzienkach.
  2. Odwróć płytki ELISpot, aby usunąć etanol.
  3. Umieścić 150 μl autoklawizowanego ddH2O do każdej studzienki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu wypłukania pozostałości etanolu; następnie przemywać sterylnym PBS w temperaturze pokojowej przez 3 minuty
    UWAGA: Kroki od 5.1 do 5.3 mogą być opcjonalne, w zależności od producenta płyt.
  4. Umieścić 50 μl 5 μg/ml poliklonalnego fragmentu F(ab')2 anty-ludzkiego Ig (IgG + IgM + IgA) (w PBS) do każdej studzienki na płytkach ELISpot i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc (preferowane) lub 37 °C przez 2 godziny11,
    UWAGA: Uszczelnij krawędzie płyt Parafilmem do czasu użycia.
  5. Odwrócić płytki, aby usunąć niezwiązane Abs, dodać 200 μl PBS do każdego dołka i inkubować je dwukrotnie w temperaturze pokojowej przez 3 minuty za każdym razem.
  6. Dodać 200 μl PBS z 5% BSA (lub pożywką RPMI 1640) do każdego dołka w celu zablokowania i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  7. Odwróć płytki, aby usunąć bufor blokujący. Umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS, jak w kroku 5.5.
  8. Dodać 100 μl pożywki RPMI 1640 do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C.
  9. Gdy będziesz gotowy do wysiewu komórek, odwróć płytki, aby usunąć pożywkę RPMI 1640.
  10. Wysiewaj 100 μl (5 x 104), 50 μl (2,5 x 104) i 25 μl (1,25 x 104) komórek (z kroków 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 i 4.6) do dołków płytki ELISpot. Za pomocą pożywki RPMI 1640 doprowadzić objętość do 150 μl/studzienkę.
    UWAGA: Zaleca się co najmniej jedno lub dwa 2-krotne seryjne rozcieńczenia do powlekania ogniw.
  11. Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 8 - 14 godzin18. Unikaj przesuwania płytek podczas inkubacji.
  12. Odwróć płytki, aby usunąć komórki i pożywkę RPMI 1640.
  13. Dodać 200 μl/basenik PBS-T (PBS z 0,05% Tween 20) i inkubować je 5 razy w temperaturze sotki, za każdym razem przez 3 minuty. Odwrócić płytkę, aby usunąć bufor do płukania między każdym z 5 płukań.
  14. Dodać kozią anty-ludzką fosfatazę alkaliczną IgG (AP), Abs specyficzny dla Fcγ (do wykrywania IgG, 1:5 000 w PBS-T) lub kozie anty-ludzkie IgM-AP, Fcμ specyficzne dla fragmentów Abs (do wykrywania IgM, 1:5 000 w PBS-T) do wyznaczonych dołków i inkubować w RT przez 2 godziny w ciemności.
  15. Umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS, jak w kroku 5.5.
  16. Dodać 50 μl/studzienkę roztworu substratu bromochloroindolilofosforanu i błękitu tetrazolowego (BCIP/NBT). Fioletowe plamy pojawiają się zwykle po 5 - 15 minutach.
  17. Dodać 100 μl/basenik ddH2O, aby zapobiec nadmiernemu rozwojowi plam.
  18. Opłucz płytki bieżącą wodą z kranu po całkowitym rozwinięciu się wszystkich plam.
  19. Usuń odpływ płytek i pozwól im wyschnąć na powietrzu w ciemności.
  20. Policz plamki za pomocą automatycznego czytnika płytek z jednostką akwizycji/analizy obrazu (np. skanerem automatycznym lub ręcznie za pomocą mikroskopu preparacyjnego).
    UWAGA: Płyty mogą być przechowywane w RT w ciemności i analizowane później.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z PBMC usunięto erytrocyty oraz komórki adherentne (kroki 1.2 do 1.7). Alikwot (2 x 106) komórek poddano analizie cytometrycznej w celu przedstawienia populacji naiwnych limfocytów B, komórek B pamięci oraz PBs/PCs we krwi obwodowej (Rysunek 1). W PBMC tego dawcy około 10% limfocytów stanowiły komórki B CD19+. W obrębie frakcji limfocytów B odsetek naiwnych limfocytów B CD19+CD27- wynosił około 50%. Z kolei około 50% limfocytów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Izolacja i oczyszczanie ludzkich komórek B krwi obwodowej

Zwykle erytrocyty mogą być skutecznie rozerwane i usunięte przez bufor do lizy (krok 1.2). Ważne jest, aby nie inkubować PBMC z buforem do lizy RBC dłużej niż 5 minut, ponieważ chlorek amonu może mieć wpływ na żywotność komórek. Alternatywnie, erytrocyty i płytki krwi mogą być jednocześnie usuwane za pomocą następującego protokołu.

Zmieszać świeżą krew pełną z buforem kwasowo-cytrynianowo-dekstrozowym (ACD) (39 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant badawczy z Ministerstwa Nauki i Technologii Wykonawczego Yuana Tajwanu (NSC99-2320-B-002-011). Chciałbym podziękować za doskonałą obsługę świadczoną przez Rdzeń Analizy i Sortowania Cytometrii Przepływowej w Pierwszym Laboratorium Podstawowym w Kolegium Medycznym Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD Vacutainer K2EBD Biosciences367525probówka 10 ml
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
0,5% roztwór błękitu trypanowegoBiological Industries03-102-1B
IMag Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów BBD Biosciences558007
Biotynylowany mAb CD27Biolegend302804klon O323
Mikrokulki magnetyczne streptawidynyBD Biosciences9000810
15 ml probówki FalconBD Falcon352196
Niebieskie sitko do komórek z nylonowej siatki, 40 μ mBD Falcon352340
Anty-ludzki CD19-APCBiolegend302212klon HIB19
Anty-ludzki CD27-eFluor 450eBioscience48-0279-42klon O323
Anty-ludzki CD38-PE-Cy7Biolegend303516klon HIT2 
Anty-ludzki klon CD38-PE-Cy7BD Biosciences560677HIT2 
Anty-ludzki klon 304006 CD45-FITCBiolegendHI30
Anty-ludzki CD45-FITC555482BiosciencesHI30
Anty-mysz/szczur/człowiek Klon124213 BiolegendLG.3A10
Anty-ludzki CD27-PerCP Cy5.5BD Biosciences65429klon L128
Anty-ludzki CD19-FITCMiltenyi Biotec130-098-064klon LT19
Anti-human CD19-FITCGeneTexGTX75599klon LT19
Anti-human CD20-FITCBD Biosciences555622klon 2H7
biotynylowany anty-ludzki CD27Biolegend302804klon O323
biotynylowany anty-ludzki CD27eBioscience13-0279-80klon O323
7-aminoaktynomycyna D (7-AAD)BD Biosciences559925
CpG (ODN 2006) InvivoGentlrl-2006typ B CpG
Rekombinowane ludzkie IL-2PeproTech200-02
Rekombinowane ludzkie IL-10PeproTech200-10
Rekombinowane ludzkie IL-21PeproTech200-21
Rekombinowane ludzkie sCD40LPeproTech310-02
Białko A S. aureus Cowan (SAC)Sigma-Aldrich82526
Pokeweed mitogen (PWM)Sigma-AldrichL9379
Płytki filtracyjne MultiScreen, 0,45 i mikro; m wielkość porówMerck MilliporeMSIPS4510sterylna, przezroczysta 96-dołkowa płytka filtracyjna z hydrofobową membraną PVDF
Roztwór BCIP/NBTSigma-AldrichB6404
BCIP/NBT, substrat fosfatazy alkalicznejMerck MilliporeES006
Ludzka IgGJackson ImmunoResearch009-000-003
Ludzka IgG, fragmentFc Jackson ImmunoResearch009-000-008
F(ab')2 fragment koziego anty-ludzkiego Ig (IgG + IgM + IgA)Jackson ImmunoResearch109-006-127
Anty-ludzka fosfataza IgG-alkaliczna kozi, Fcγ specyficzna dla fragmentuJackson ImmunoResearch109-055-008
Kozia anty-ludzka fosfataza IgM-alkaliczna, Fc&mikro; specyficzna dla fragmentuJackson ImmunoResearch109-055-043
Anty-ludzka peroksydaza IgG-peroksydaza kozia, Fcγ specyficzna dla fragmentuJackson ImmunoResearch109-035-008
Kozia anty-ludzka peroksydaza IgM, Fc&mikro-fragment specyficznaJackson ImmunoResearch109-035-095
Zestaw substratów BD ELISPOT AECBiosciences551951
Analizator C.T.L. ImmunoSpotC.T.L.
bez endotoksyn Klon BD Pojedynczy odczynnik BD

Bibliografia

  1. Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
  2. Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
  3. Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
  4. Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
  5. Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
  6. Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
  7. Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81(2011).
  8. Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108(2014).
  9. Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
  10. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
  11. Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
  12. Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
  13. Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806(2012).
  14. Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
  15. Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
  16. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
  17. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
  18. Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
  19. Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403(2016).
  20. Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
  21. Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  22. Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
  23. Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
  24. Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  25. Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
  26. Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
  27. Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  28. Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
  29. Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
  30. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  31. Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
  32. Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
  33. Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
  34. Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
  35. Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
  36. Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
  37. Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
  38. Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
  39. Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
  40. Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
  41. Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972(2009).
  42. Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
  43. Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test ELISpotizolacja limfocytów Bcytometria przepływowaróżnicowanie limfocytów Bskuteczność szczepionkidetekcja pojedynczych komórekmononuklearne komórki krwi obwodowejhodowla komórkowa
Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.