Artykuł metodologiczny

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

DOI:

10.3791/54582

⸱

14 grudnia 2016

1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cechą charakterystyczną odporności humoralnej jest generowanie funkcjonalnych ASC, które syntetyzują i wydzielają Abs specyficzne dla antygenu (Ag), takiego jak patogen, i są używane do obrony gospodarza. W celu ilościowego określenia stanu funkcjonalnego humoralnej odpowiedzi immunologicznej danej osoby, zarówno Abs w surowicy, jak i krążące ASC są zwykle mierzone jako odczyty funkcjonalne. U ludzi krew obwodowa jest najwygodniejszą i najłatwiej dostępną próbką, którą można wykorzystać do określenia humoralnej odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez limfocyty B gospodarza. Odrębne podzbiory limfocytów B, w tym ASC, można wyizolować bezpośrednio z krwi obwodowej poprzez selekcję za pomocą mikrogranulek sprzężonych z Ab specyficznych dla linii lub poprzez sortowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Co więcej, oczyszczone naiwne i pamięciowe limfocyty B mogą być aktywowane i różnicowane w ASC w hodowli. Funkcjonalne działanie ASC przyczyniające się do wydzielania Ab można określić ilościowo za pomocą ELISpot, który jest testem, który łączy test immunoabsorbancji sprzężony z enzymami (ELISA) i technologie western blotting, aby umożliwić wyliczenie poszczególnych ASC na poziomie pojedynczej komórki. W praktyce test ELISpot jest coraz częściej stosowany do oceny skuteczności szczepionki ze względu na łatwość obsługi dużej liczby próbek krwi. W tym miejscu zostaną opisane metody izolowania ludzkich limfocytów B od krwi obwodowej, różnicowania komórek B w ASC in vitro oraz zastosowania ELISpot do ilościowego oznaczania całkowitych IgM- i IgG-ASC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki B odgrywają kluczową rolę w rozwoju odporności humoralnej. Początkowo rozwijają się w szpiku kostnym i dostają się do krwiobiegu jako naiwne limfocyty B, które mogą migrować do tkanek limfatycznych, takich jak śledziona, węzły chłonne i migdałki, w celu dalszego rozwoju. Po napotkaniu Ag niektóre naiwne limfocyty B migrują do pęcherzyków limfatycznych, gdzie komórki B centrum rozrodczego mogą różnicować się w komórki B pamięci i plazmablasty (PB) / komórki plazmatyczne (PC). Podczas gdy większość PB/PC wydostaje się do krwiobiegu, kilka ostatecznie znajduje się w szpiku kostnym, aby przejść końcowe różnicowanie w długotrwałe PC1. Limfocyty B w krążeniu są niejednorodne, a w stanie stacjonarnym PB/PC są rzadkie we krwi obwodowej2. W wyniku dostępności markerów powierzchniowych specyficznych dla linii, cytometria przepływowa stała się popularną metodą identyfikacji i charakterystyki podzbiorów limfocytów B we krwi obwodowej. Rozszerzonym zastosowaniem cytometrii przepływowej jest dodanie funkcji sortowania komórek, która pozwala na separację i izolację poszczególnych podzbiorów komórek B o wysokiej czystości. Opierając się na ekspresji specyficznych receptorów powierzchniowych na różnych etapach rozwoju, ludzkie krążące limfocyty B są ogólnie klasyfikowane do trzech głównych subpopulacji: naiwne komórki B (CD19 + CD27--CD38-), komórki B pamięci (CD19 + CD27 + CD38-) i PB / PC (CD19 + CD27 + CD38 +)3-4 (Figura 1). Naiwne limfocyty B z natury nie spotkały się z Ags. Można je jednak różnicować w komórki B pamięci IgM + CD27 +. Chociaż naiwne limfocyty B są jednorodne w ekspresji cząsteczek związanych z receptorem antygenu komórek B (BCR) (np. CD19, CD20 i CD22), są niejednorodne w swoim repertuarze immunoglobulin5. Większość komórek B pamięci CD27+ można różnicować w CD27+/hiCD38+ PBs/PC6. Ponadto limfocyty B pamięci i PB/PC są poliklonalne i wykazują heterogeniczność rozwojową i funkcjonalną4-7. PB/PC w krążeniu są zwykle krótkotrwałe i nie wykazują ekspresji CD138, ale te, które osiedlają się w szpiku kostnym, ostatecznie różnicują się i stają się długowieczne. Terminalnie zróżnicowane PC wyrażają CD138 i obniżają poziom cząsteczek CD27 na swoich powierzchniach8. Ponieważ zarówno PB, jak i PC są zdolne do wydzielania Abs, w wielu przypadkach są one zbiorczo oznaczane jako ASC. W przeciwieństwie do tego, ani naiwne komórki B, ani komórki B pamięci nie mogą wytwarzać znacznych ilości Abs9-10. Niemniej jednak, po wyizolowaniu, zarówno naiwne, jak i pamięciowe limfocyty B mogą zostać zróżnicowane w ASC w ciągu 3 - 10 dni, po umieszczeniu w odpowiednich warunkach hodowli6, 11-15. W rzeczywistości ASC pochodzące z różnicowania in vitro mają podobne ekspresje powierzchniowe CD27 i CD38 z tymi bezpośrednio wyizolowanymi z krwi obwodowej6. Ponadto ASC zróżnicowane in vitro wykazują niski poziom powierzchniowego CD20, podobny do krążących PB/PC6. Chociaż wszystkie ASC pochodzące z hodowli są krótkotrwałe, mogą wydzielać Abs, co wskazuje, że są funkcjonalnie kompetentne i mogą przyczynić się do odporności humoralnej.

Zarówno ELISA, jak i ELISpot są zdecydowanie najczęściej stosowanymi metodami, za pomocą których można uzyskać funkcjonalne informacje na temat humoralnej odpowiedzi immunologicznej. ELISA jest 96-dołkowym testem na płytce i jest często używany do pomiaru miana Abs specyficznego dla Ag w surowicy i innych analitów (np. cytokin). Jest wygodny i skalowalny. Test ELISA jest przeznaczony do wykorzystania testu enzymatycznego w fazie stałej do wykrywania obecności Abs lub innych substancji, takich jak surowica, w próbce cieczy16. Odczyty z testów ELISA w surowicy są szeroko stosowane do reprezentowania odpowiedzi immunologicznej organizmu. Narzędziem niezbędnym do pozyskiwania odczytów z testów ELISA jest spektrofotometryczny czytnik mikropłytek. Czytelnik może określić gęstość optyczną (O.D.) produktów końcowych zwykle wynikających z reakcji detekcji Abs sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP) i ich specyficznych substratów17. Jeśli chodzi o zgłaszanie humoralnej odpowiedzi immunologicznej, poziomy Ab w surowicy określone za pomocą testu ELISA oznaczają zbiorowe, ale nie indywidualne, działanie ASC w organizmie. Ponadto test ELISA nie bierze pod uwagę udziału komórek B pamięci, które nie wydzielają Abs.

Podobnie jak ELISA, ELISpot jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania i monitorowania odpowiedzi immunologicznej w próbkach krwi obwodowej17-18. ELISpot to technika związana z testem ELISA kanapkowym. W nim komórki są umieszczane w studzienkach z polifluorkiem winylidenu (PVDF) z 96-dołkowymi mikropłytkami w celu krótkotrwałej hodowli. Test ELISpot jest analogiczny do wykonywania western blot na mikropłytce i rozwijania plam na membranie PVDF w każdym dołku. Wymagany jest zautomatyzowany czytnik ELISpot lub mikroskop stereoskopowy do ręcznego liczenia. Główną zaletą ELISpot w wykrywaniu odpowiedzi immunologicznej jest jego doskonała czułość w oznaczaniu ilościowym ASC i komórek wydzielających cytokiny. Informuje o ich aktywności funkcjonalnej odpowiednio w odporności humoralnej i komórkowej. W pomiarze humoralnej funkcji immunologicznej poziomy Ab w surowicy określone za pomocą testu ELISA i liczba ASC wyliczonych za pomocą testu ELISpot są często skorelowane, ale odczyty danych z tych dwóch testów mają pewne różnice w implikacjach funkcjonalnych19-20. Główną zaletą ELISpot jest czułość metody. Poziom mian Ab w surowicy podawany przez test ELISA jest przedstawiany częściowo ilościowo jako odczyty OD, oznaczające względny poziom Ab, lub bardziej ilościowo, jako odczyty stężenia, gdy w celach informacyjnych uwzględniono znaną ilość odpowiednich izotypów Abs. Natomiast wyniki ELISpot są przedstawiane jako bezwzględna liczba ASC w puli komórek będących przedmiotem zainteresowania (np. Niefrakcjonowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i oczyszczone limfocyty B z PBMC). ELISpot może wykryć pojedynczy ASC, ale ELISA wymaga ilości Ab z ASC, aby osiągnąć zoptymalizowane stężenia zależne od testu przed pomiarem. W związku z tym ELISpot jest oczywiście lepszy od ELISA pod względem czułości kwantyfikacji. Co więcej, ELISpot nadaje się również do ilościowego oznaczania ASC zróżnicowanych in vitro z aktywowanych komórek B pamięci. Limfocyty B pamięci nie wydzielają Abs, ale mogą różnicować się w ASC po aktywacji; W związku z tym nie mają one wpływu na Abs w surowicy wykrywane przez test ELISA. Tak więc ELISpot jest metodą z wyboru w pomiarze odpowiedzi immunologicznej krążących komórek B pamięci po aktywacji w hodowli. Pozwala na monitorowanie utrzymania długotrwałej odporności humoralnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka krew obwodowa musi być pobierana od zdrowych dawców za świadomą zgodą, a wykorzystanie próbek krwi musi być zgodne z zatwierdzonymi wytycznymi ustanowionymi przez poszczególne instytucjonalne komisje rewizyjne. W tym badaniu protokół wykorzystania ludzkiej krwi do demonstracji wyników cytometrii przepływowej (ryc. 1) i testów ELISpot (ryc. 3) został zatwierdzony przez Wewnętrzną Komisję Rewizyjną Narodowego Tajwańskiego Szpitala Uniwersyteckiego (numer protokołu 201307019RINB).

1. Izolacja i oczyszczanie ludzkich komórek B krwi obwodowej

  1. Pobrać ~ 10 ml krwi z żyły łokciowej środkowej (w dole łokciowym przed łokciem) do 15-mililitrowej probówki zawierającejK2EDTA(1,5 do 2,0 mg/ml krwi) i natychmiast kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów.
  2. Dodać 35 ml autoklawizowanego (121 °C, 15 min) buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 1 mM EDTA; pH 7,4) do probówki zawierającej świeżą próbkę krwi (≥ 3:1 obj./obj.) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) nie dłużej niż 5 min.
    UWAGA: Pojawienie się przepuszczalności światła przez rurkę wskazuje na zakończenie lizy RBC.
  3. Wirować przy 600 x g przy RT przez 5 minut. Upewnij się, że osad ma biały kolor.
  4. Zawiesić osad w 10 ml autoklawowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 i 1,47 mM KH2PO4; pH 7,4) i odwirować jak w kroku 1.3.
  5. Wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad z 10 ml pożywki RPMI 1640 (dodatki: 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy), a następnie umieść komórki w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym (10 ml krwi na szalkę). Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 30 minut.
  6. Delikatnie zakręć naczyniem hodowlanym kilka razy i umieść pożywkę hodowlaną (komórki zawiesinowe) w plastikowych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Wyrzuć przylegające komórki (głównie makrofagi) na szalkach hodowlanych.
  7. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  8. Zawiesić osad z 1 ml pożywki RPMI 1640. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Żywotność izolowanych leukocytów jest zwykle większa niż 90% przez wykluczenie błękitu trypanowego.
  9. Odwirować jak w kroku 1.7 i ponownie zawiesić komórki w ~ 200 μl zimnego buforu PBS (0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA) w stężeniu 5 - 10 x 106 komórek/ml.
  10. Dodać 5 μl biotynylowanego anty-ludzkiego koktajlu Ab specyficznego dla komórek krwi (dla negatywnej selekcji komórek B) na 106 komórek i inkubować na lodzie przez 30 minut21,
    UWAGA: Anty-ludzki koktajl Ab powinien zawierać co najmniej Abs specyficzne dla CD2 (lub CD3), CD14 i CD16.
  11. Dodać 10-krotny nadmiar sterylnego PBS do komórek, odwirować przy 600 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
  12. Dodać równe ilości mikrogranulek sprzężonych ze streptawidyną (5 μl na10-6 komórek) do osadu i dokładnie wymieszać.
  13. Inkubować na lodzie przez 30 minut w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  14. Dodać 2 ml buforu PBS do probówki.
  15. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 8 minut. Brązowe mikrogranulki będą stopniowo przyczepiać się do ścianki rurki obok magnesu22.
  16. Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie przenieś supernatant do nowej sterylnej probówki22 o pojemności 15 ml.
  17. Powtórz kroki od 1.14 do 1.16 i połącz dwa supernatanty, które zawierają nietknięte limfocyty B. Wyrzuć mikrogranulki.
  18. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  19. Ponownie zawiesić granulkę w podłożu RPMI 1640 w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Zazwyczaj można wyizolować 1 - 5 x 105 komórek B o czystości większej niż 95% z 10 ml krwi obwodowej23.

2. Oczyszczanie i oddzielanie pamięci i naiwnych komórek B od izolowanych komórek B

  1. Użyj komórek oczyszczonych z kroku 1 i określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl zimnego buforu PBS po odwirowaniu w stężeniu 600 x g i RT przez 5 minut.
  3. Dodać 1 - 2 μg biotynylowanego mAb CD27 na 106 komórek i inkubować na lodzie przez 30 minut.
  4. Dodać 10 ml buforu PBS do probówki i odwirowywać przy 600 x g przez 5 minut.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu PBS.
  6. Dodaj równe ilości mikrokulek magnetycznych streptawidyny (1 - 2 μg/106 komórek) do komórek w 15-mililitrowej plastikowej stożkowej probówce.
  7. Delikatnie dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
  8. Dodać 2 - 3 ml buforu PBS do probówki.
  9. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 8 minut, aby brązowe mikrokulki przyczepiły się do strony znajdującej się najbliżej magnesu.
  10. Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie przenieś frakcję supernatantu do nowej sterylnej probówki. Frakcja ta zawiera wzbogacone limfocyty B nienawątkowe CD27.
  11. Dodaj 5 ml do probówki zawierającej mikrogranulki i delikatnie ponownie zawieś mikrogranulki (tj. wzbogaconą frakcję komórek B pamięci CD27+)24-25.
  12. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ponownie zawiesić granulki z pożywką RPMI 1640 do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: Zazwyczaj ~ 30 - 60% komórek B można oczyścić jako komórki pamięci CD27 + z PBMC zdrowego dawcy7, 25-26.

3. Sortowanie komórek dla zbioru naiwnych komórek B, komórek B pamięci i PB/PC

  1. Korzystając z komórek oczyszczonych z kroku 1, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  2. Ponownie zawiesić komórki w zimnym buforze PBS w stężeniu10-7 na ml w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml.
  3. Dodać 1 - 2 μg ludzkiej IgG na10-6 komórek i inkubować na lodzie przez 10 minut w celu uzyskania bloku Fc.
  4. Dodać po 1 μg anty-CD19-APC (klon: HIB19), anty-CD27-eFluor450 (klon: O323) i anty-CD38-PE (klon: HIT2) na 106 komórek; dobrze wymieszać i inkubować na lodzie przez 30 minut4, 27.
  5. W ciągu ostatnich 5 minut w kroku 3.4 dodaj 5 μl dostępnej na rynku 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD).
  6. Dodać 2 ml PBS do probówki, wirować i wirować przy 600 x g przez 5 minut.
  7. Ponownie zawiesić komórki w buforze sortującym (sterylny PBS z 2% BSA i 2 mM EDTA) w stężeniu 1 - 5 x 10 7 komórek na ml w probówce o pojemności 15 ml.
  8. Przefiltruj komórki przez sitko z nylonowej siatki (rozmiar porów 40 μm), aby wyeliminować grudki komórek.
  9. Oddziel komórki za pomocą sortera cytometrycznego przepływowego wyposażonego w trzy lasery: fioletowy (405 nm), niebieski (488 nm) i czerwony (640 nm).
    UWAGA: Sam niebieski laser jest wystarczający do 3-kolorowej cytometrii przepływowej27-28.
  10. Posortuj komórki do trzech probówek o pojemności 15 ml (zawierających 5 ml pożywki RPMI) w celu jednoczesnego zbierania naiwnych komórek B (CD19 + CD27-), komórek B pamięci (CD19 + CD27 +) i PB / PC (CD19 + CD27 + / hiCD38 +) 3-4, 28,
    UWAGA: Posortowane naiwne i pamięciowe komórki B można hodować zgodnie z opisem w kroku 4.

4. Różnicowanie in vitro izolowanych ludzkich komórek B CD19+, komórek B pamięci CD19+ CD27+ i komórek B niewcześniej nieleczonych CD19+CD27

  1. Korzystając z komórek oczyszczonych w krokach 1.19, 2.10, 2.11 i 3.10, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  2. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki RPMI 1640 o stężeniu 1 - 10 x10,5 na ml i podać je do dołków 12-dołkowej płytki.
  3. Dodaj CpG (ODN 2006) w stężeniu 5 μg/106 komórek/ml18, 29.
  4. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5 dni.
  5. Zbierz komórki z każdej studzienki, umieść je osobno w probówkach o pojemności 15 ml, dodaj 5 ml PBS do każdej probówki i odwiruj je przy 600 x g i RT przez 5 minut.
  6. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zawiesić komórki w stężeniu 1 - 10 x 105 na ml za pomocą pożywki RPMI 1640.

5. Test ELISpot

  1. Dodaj 30 μl 35% etanolu w wodzie destylowanej do każdej studzienki płytek ELISpot na 30 s.
    UWAGA: Podczas pipetowania należy unikać dotykania membrany w studzienkach.
  2. Odwróć płytki ELISpot, aby usunąć etanol.
  3. Umieścić 150 μl autoklawizowanego ddH2O do każdej studzienki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu wypłukania pozostałości etanolu; następnie przemywać sterylnym PBS w temperaturze pokojowej przez 3 minuty
    UWAGA: Kroki od 5.1 do 5.3 mogą być opcjonalne, w zależności od producenta płyt.
  4. Umieścić 50 μl 5 μg/ml poliklonalnego fragmentu F(ab')2 anty-ludzkiego Ig (IgG + IgM + IgA) (w PBS) do każdej studzienki na płytkach ELISpot i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc (preferowane) lub 37 °C przez 2 godziny11,
    UWAGA: Uszczelnij krawędzie płyt Parafilmem do czasu użycia.
  5. Odwrócić płytki, aby usunąć niezwiązane Abs, dodać 200 μl PBS do każdego dołka i inkubować je dwukrotnie w temperaturze pokojowej przez 3 minuty za każdym razem.
  6. Dodać 200 μl PBS z 5% BSA (lub pożywką RPMI 1640) do każdego dołka w celu zablokowania i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  7. Odwróć płytki, aby usunąć bufor blokujący. Umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS, jak w kroku 5.5.
  8. Dodać 100 μl pożywki RPMI 1640 do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C.
  9. Gdy będziesz gotowy do wysiewu komórek, odwróć płytki, aby usunąć pożywkę RPMI 1640.
  10. Wysiewaj 100 μl (5 x 104), 50 μl (2,5 x 104) i 25 μl (1,25 x 104) komórek (z kroków 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 i 4.6) do dołków płytki ELISpot. Za pomocą pożywki RPMI 1640 doprowadzić objętość do 150 μl/studzienkę.
    UWAGA: Zaleca się co najmniej jedno lub dwa 2-krotne seryjne rozcieńczenia do powlekania ogniw.
  11. Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 8 - 14 godzin18. Unikaj przesuwania płytek podczas inkubacji.
  12. Odwróć płytki, aby usunąć komórki i pożywkę RPMI 1640.
  13. Dodać 200 μl/basenik PBS-T (PBS z 0,05% Tween 20) i inkubować je 5 razy w temperaturze sotki, za każdym razem przez 3 minuty. Odwrócić płytkę, aby usunąć bufor do płukania między każdym z 5 płukań.
  14. Dodać kozią anty-ludzką fosfatazę alkaliczną IgG (AP), Abs specyficzny dla Fcγ (do wykrywania IgG, 1:5 000 w PBS-T) lub kozie anty-ludzkie IgM-AP, Fcμ specyficzne dla fragmentów Abs (do wykrywania IgM, 1:5 000 w PBS-T) do wyznaczonych dołków i inkubować w RT przez 2 godziny w ciemności.
  15. Umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS, jak w kroku 5.5.
  16. Dodać 50 μl/studzienkę roztworu substratu bromochloroindolilofosforanu i błękitu tetrazolowego (BCIP/NBT). Fioletowe plamy pojawiają się zwykle po 5 - 15 minutach.
  17. Dodać 100 μl/basenik ddH2O, aby zapobiec nadmiernemu rozwojowi plam.
  18. Opłucz płytki bieżącą wodą z kranu po całkowitym rozwinięciu się wszystkich plam.
  19. Usuń odpływ płytek i pozwól im wyschnąć na powietrzu w ciemności.
  20. Policz plamki za pomocą automatycznego czytnika płytek z jednostką akwizycji/analizy obrazu (np. skanerem automatycznym lub ręcznie za pomocą mikroskopu preparacyjnego).
    UWAGA: Płyty mogą być przechowywane w RT w ciemności i analizowane później.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PBMCs zostały pozbawione erytrocytów i przylegających komórek (kroki od 1.2 do 1.7). Podwielokrotność (2 x 106) komórek poddano analizie cytometrii przepływowej w celu zilustrowania populacji naiwnych komórek B, komórek B pamięci i PB / PC we krwi obwodowej (ryc. 1). W PBMC tego dawcy około 10% limfocytów stanowiły limfocyty B CD19+. W przedziale komórek B odsetek komórek B nieleczonych wcześniej CD19 + CD27- wynosił około 50%. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i oczyszczanie ludzkich komórek B krwi obwodowej

Zwykle erytrocyty mogą być skutecznie rozerwane i usunięte przez bufor do lizy (krok 1.2). Ważne jest, aby nie inkubować PBMC z buforem do lizy RBC dłużej niż 5 minut, ponieważ chlorek amonu może mieć wpływ na żywotność komórek. Alternatywnie, erytrocyty i płytki krwi mogą być jednocześnie usuwane za pomocą następującego protokołu.

Zmieszać świeżą krew pełną z buforem kwasowo-cytrynianowo-dekstrozowym (ACD) (39 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant badawczy z Ministerstwa Nauki i Technologii Wykonawczego Yuana Tajwanu (NSC99-2320-B-002-011). Chciałbym podziękować za doskonałą obsługę świadczoną przez Rdzeń Analizy i Sortowania Cytometrii Przepływowej w Pierwszym Laboratorium Podstawowym w Kolegium Medycznym Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD Vacutainer K2EBD Biosciences367525probówka 10 ml
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
0,5% roztwór błękitu trypanowegoBiological Industries03-102-1B
IMag Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów BBD Biosciences558007
Biotynylowany mAb CD27Biolegend302804klon O323
Mikrokulki magnetyczne streptawidynyBD Biosciences9000810
15 ml probówki FalconBD Falcon352196
Niebieskie sitko do komórek z nylonowej siatki, 40 μ mBD Falcon352340
Anty-ludzki CD19-APCBiolegend302212klon HIB19
Anty-ludzki CD27-eFluor 450eBioscience48-0279-42klon O323
Anty-ludzki CD38-PE-Cy7Biolegend303516klon HIT2 
Anty-ludzki klon CD38-PE-Cy7BD Biosciences560677HIT2 
Anty-ludzki klon 304006 CD45-FITCBiolegendHI30
Anty-ludzki CD45-FITC555482BiosciencesHI30
Anty-mysz/szczur/człowiek Klon124213 BiolegendLG.3A10
Anty-ludzki CD27-PerCP Cy5.5BD Biosciences65429klon L128
Anty-ludzki CD19-FITCMiltenyi Biotec130-098-064klon LT19
Anti-human CD19-FITCGeneTexGTX75599klon LT19
Anti-human CD20-FITCBD Biosciences555622klon 2H7
biotynylowany anty-ludzki CD27Biolegend302804klon O323
biotynylowany anty-ludzki CD27eBioscience13-0279-80klon O323
7-aminoaktynomycyna D (7-AAD)BD Biosciences559925
CpG (ODN 2006) InvivoGentlrl-2006typ B CpG
Rekombinowane ludzkie IL-2PeproTech200-02
Rekombinowane ludzkie IL-10PeproTech200-10
Rekombinowane ludzkie IL-21PeproTech200-21
Rekombinowane ludzkie sCD40LPeproTech310-02
Białko A S. aureus Cowan (SAC)Sigma-Aldrich82526
Pokeweed mitogen (PWM)Sigma-AldrichL9379
Płytki filtracyjne MultiScreen, 0,45 i mikro; m wielkość porówMerck MilliporeMSIPS4510sterylna, przezroczysta 96-dołkowa płytka filtracyjna z hydrofobową membraną PVDF
Roztwór BCIP/NBTSigma-AldrichB6404
BCIP/NBT, substrat fosfatazy alkalicznejMerck MilliporeES006
Ludzka IgGJackson ImmunoResearch009-000-003
Ludzka IgG, fragmentFc Jackson ImmunoResearch009-000-008
F(ab')2 fragment koziego anty-ludzkiego Ig (IgG + IgM + IgA)Jackson ImmunoResearch109-006-127
Anty-ludzka fosfataza IgG-alkaliczna kozi, Fcγ specyficzna dla fragmentuJackson ImmunoResearch109-055-008
Kozia anty-ludzka fosfataza IgM-alkaliczna, Fc&mikro; specyficzna dla fragmentuJackson ImmunoResearch109-055-043
Anty-ludzka peroksydaza IgG-peroksydaza kozia, Fcγ specyficzna dla fragmentuJackson ImmunoResearch109-035-008
Kozia anty-ludzka peroksydaza IgM, Fc&mikro-fragment specyficznaJackson ImmunoResearch109-035-095
Zestaw substratów BD ELISPOT AECBiosciences551951
Analizator C.T.L. ImmunoSpotC.T.L.
bez endotoksyn Klon BD Pojedynczy odczynnik BD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
  2. Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
  3. Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
  4. Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
  5. Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
  6. Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
  7. Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81(2011).
  8. Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108(2014).
  9. Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
  10. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
  11. Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
  12. Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
  13. Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806(2012).
  14. Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
  15. Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
  16. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
  17. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
  18. Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
  19. Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403(2016).
  20. Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
  21. Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  22. Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
  23. Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
  24. Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  25. Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
  26. Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
  27. Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  28. Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
  29. Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
  30. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  31. Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
  32. Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
  33. Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
  34. Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
  35. Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
  36. Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
  37. Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
  38. Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
  39. Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
  40. Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
  41. Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972(2009).
  42. Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
  43. Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test ELISpotizolacja limfocyt w Bcytometria przep ywowar nicowanie limfocyt w Bskuteczno szczepionkidetekcja pojedynczych kom rekmononuklearne kom rki krwi obwodowejhodowla kom rkowa

Powiązane artykuły