Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Podsumowanie

Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.

Streszczenie

Przeciwciała zaprojektowane do funkcji wewnątrzkomórkowych muszą nie tylko wykazywać powinowactwo do docelowego antygenu, ale muszą być również rozpuszczalne i prawidłowo złożone w cytoplazmie. Powszechnie stosowane metody wyświetlania i badań przesiewowych bibliotek rekombinowanych przeciwciał nie obejmują kontroli jakości fałdowania białek wewnątrzkomórkowych, a zatem zdolność wiązania antygenu oraz fałdowanie cytoplazmatyczne i rozpuszczalność przeciwciał zaprojektowanych przy użyciu tych metod często muszą być projektowane oddzielnie. W tym miejscu opisujemy protokół badania przesiewowego rekombinowanej biblioteki przeciwciał przeciwko jednołańcuchowym zmiennym fragmentom (scFv) pod kątem jednoczesnego wiązania antygenu i prawidłowego fałdowania cytoplazmatycznego. Metoda wykorzystuje wewnętrzny wewnątrzkomórkowy mechanizm kontroli jakości fałdowania szlaku translokacji podwójnej argininy (Tat) Escherichia coli w celu wyświetlenia biblioteki scFv na wewnętrznej błonie E. coli. Szlak Tat zapewnia, że tylko rozpuszczalne, dobrze pofałdowane białka są transportowane z cytoplazmy i wyświetlane na błonie wewnętrznej, eliminując w ten sposób słabo pofałdowane scFv przed badaniem w celu wiązania antygenu. Po usunięciu błony zewnętrznej, scFv wyświetlane na błonie wewnętrznej są przesuwane w stosunku do docelowego antygenu unieruchomionego na kulkach magnetycznych w celu wyizolowania scFv, które wiążą się z docelowym antygenem. Wtórne badanie przesiewowe oparte na teście immunoenzymatycznym (ELISA) służy do identyfikacji najbardziej obiecujących scFv w celu dodatkowej charakterystyki. Wiązanie antygenu i rozpuszczalność cytoplazmatyczną można poprawić dzięki kolejnym rundom mutagenezy i badaniom przesiewowym w celu uzyskania przeciwciał o wysokim powinowactwie i wysokiej rozpuszczalności cytoplazmatycznej do zastosowań wewnątrzkomórkowych.

Wprowadzenie

Przeciwciała zdolne do składania się i funkcjonowania w środowisku wewnątrzkomórkowym są obiecującymi narzędziami zarówno do badań, jak i zastosowań terapeutycznych. Mają zdolność modulowania aktywności białka poprzez wiązanie się z białkiem docelowym wewnątrz komórek, aby zapobiec interakcjom białko-białko, zakłócić interakcje białko-kwas nukleinowy lub zapobiec dostępowi substratu do enzymów^1-5.

Chociaż przeciwciała mają duży potencjał do zastosowań wewnątrzkomórkowych, zaprojektowanie ich pod kątem prawidłowego fałdowania i rozpuszczalności w środowisku wewnątrzkomórkowym przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do wiązania się z docelowym antygenem jest wyzwaniem. Redukujące środowisko cytoplazmatyczne zapobiega tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych, które są normalnie wymagane do stabilnego fałdowania przeciwciał o pełnej długości i fragmentów przeciwciał, w tym przeciwciał o zmiennym odłamie jednołańcuchowym (scFv)^6,7. Zastosowano szereg podejść ukierunkowanej ewolucji w celu zmodyfikowania przeciwciał o wysokim powinowactwie do docelowych antygenów^8-10. Podejścia te zwykle wykorzystują wyświetlanie fagów, wyświetlanie powierzchni drożdży lub wyświetlanie powierzchni bakterii do badania przesiewowego dużych bibliotek przeciwciał^11-13. Metody te są potężne i skuteczne w identyfikacji przeciwciał, które wiążą się z celami, ale zależą od szlaku wydzielniczego do transportu białek, które będą wyświetlane^14-16. Szlak wydzielniczy przemieszcza niesfałdowane białka z redukującej cytoplazmy do światła retikulum endoplazmatycznego u drożdży lub do peryplazmy u bakterii. Białka następnie fałdują się w warunkach utleniania i są wyświetlane na powierzchni komórki lub pakowane w cząstki faga w celu zbadania powinowactwa do wiązania^17,18. W rezultacie przeciwciała wyizolowane przy użyciu tych technik niekoniecznie będą dobrze fałdować się w cytoplazmie, a rozpuszczalność wewnątrzkomórkowa często musi być projektowana oddzielnie, jeśli przeciwciała będą używane w zastosowaniach wewnątrzkomórkowych.

Aby poprawić skuteczność inżynierii przeciwciał, które są dobrze pofałdowane w cytoplazmie, wcześniej informowaliśmy o sukcesie MAD-TRAP (membrane-anchored display for Tat-based recognition of associating proteins), metody przesiewowej biblioteki przeciwciał scFv przy użyciu wyświetlacza wewnętrznej błony Escherichia coli ¹⁹. Wyświetlanie błony wewnętrznej bakterii opiera się na szlaku translokacji podwójnej argininy (Tat) do transportu wyświetlanych przeciwciał, w przeciwieństwie do innych popularnych metod wyświetlania, które wykorzystują szlak wydzielniczy. Szlak Tat zawiera mechanizm kontroli jakości, który pozwala tylko rozpuszczalnym, prawidłowo pofałdowanym białkom na transport z cytoplazmy E. coli, przez błonę wewnętrzną i do peryplazmy^20,21. Nadekspresyjne substraty Tat (tj. białka ukierunkowane na szlak Tat z N-końcową fuzją z peptydem sygnałowym Tat ssTorA), które są dobrze pofałdowane w cytoplazmie, tworzą długotrwałą translokację pośrednią z N-końcem w cytoplazmie i C-końcem w peryplazmie¹⁹. Pozwala to na wyświetlanie prawidłowo pofałdowanych substratów Tat, w tym fragmentów przeciwciał, na peryplazmatycznej powierzchni błony wewnętrznej E. coli. Po usunięciu błony zewnętrznej przez trawienie enzymatyczne w celu wytworzenia sferoplastów, przeciwciała są wystawione na działanie przestrzeni zewnątrzkomórkowej (ryc. 1). Pozwala to na przesiewanie substratów Tat wyświetlanych na wewnętrznej membranie pod kątem wiązania z określonym celem. Co ważne, wykorzystanie szlaku Tat do wyświetlania na powierzchni komórki gwarantuje, że tylko przeciwciała w bibliotece, które są dobrze pofałdowane w cytoplazmie, będą badane pod kątem wiązania, co pozwala na jednoczesną inżynierię powinowactwa wiązania i fałdowania wewnątrzkomórkowego. W tym protokole opisujemy, jak wyświetlić bibliotekę scFv na wewnętrznej błonie E. coli, przesunąć bibliotekę pod kątem docelowego antygenu i wykonać wtórne badanie przesiewowe w celu zidentyfikowania najbardziej obiecujących składników biblioteki. Chociaż skupiamy się na protokole scFvs, metoda ta może być zastosowana do inżynierii dowolnego białka, którego zastosowanie wymaga wiązania i fałdowania wewnątrzkomórkowego.

Rysunek 1. Wyświetlacz z wewnętrzną membraną. W E. coli przeciwciała scFv, które ulegają ekspresji jako fuzja z sekwencją sygnałową ssTorA i są prawidłowo sfałdowane w cytoplazmie, są transportowane przez błonę wewnętrzną. Tworzy się translokacja pośrednia, w której scFv są zakotwiczone w błonie wewnętrznej z N-końcem w cytoplazmie i C-końcem w peryplazmie. Błona zewnętrzna E. coli jest trawiona enzymatycznie w celu wytworzenia sferoplastów, wystawiając w ten sposób zakotwiczone przeciwciała na przestrzeń zewnątrzkomórkową i udostępniając je do wykrycia za pomocą przeciwciała, które wiąże się z C-końcowym połączonym znacznikiem epitopu na wyświetlanym przeciwciałie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przygotuj bibliotekę scFv jako fuzję z sekwencją sygnału ssTorA

1. Otrzymanie biblioteki kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) zawierającej warianty genu scFv.
   UWAGA: Biblioteka może być również skonstruowana przy użyciu dowolnego odpowiedniego trybu w celu wygenerowania różnorodności w całym genie scFv lub docelowych domenach (np. regiony określające trzecią komplementarność, CDR3s)²².
2. Wstawić bibliotekę DNA do plazmidu pIMD (ryc. 2) przy użyciu standardowych metod klonowania molekularnego²³.
   UWAGA: Ten plazmid wyraża scFvs jako fuzję genetyczną z sekwencją sygnałową ssTorA (N-koniec do scFv) i znacznik epitopu FLAG (C-koniec do scFv). Konstrukcja plazmidu do wyświetlania w błonie wewnętrznej została opisana wcześniej¹⁹. Plazmid pIMD jest dostępny u autorów.

Rysunek 2. Mapa plazmidu z wyświetlaczem błony wewnętrznej (pIMD) (kroki od 1.2 do 1.3). Ten plazmid zawiera promotor lac, pochodzenie replikacji ColE1 i gen oporności na chloramfenikol. Wstawiony gen scFv jest łączony z sekwencją sygnałową ssTorA, aby skierować scFv na szlak Tat i na znacznik epitopu FLAG, przy czym wszystkie trzy znajdują się w tej samej ramce odczytu. Wskazane są miejsca enzymów restrykcyjnych. W przypadku biblioteki wstawionej między miejsca enzymu restrykcyjnego XbaI i NotI, rozmiar plazmidu wynosi 2219 pz plus rozmiar scFv. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przekształć plazmidowe DNA zawierające bibliotekę w komórki MC4100 E. coli ²³. Odzyskaj i rozwiń tę bakteryjną formę biblioteki. Wirować przy 4 000× g przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu zebrania komórek. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić zebrane komórki w 25% glicerolu w pożywce Luria-Bertani (LB). Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne, lub przejść do kroku 2.
   UWAGA: Protokół został zweryfikowany z komórkami MC4100, chociaż oczekuje się, że inne szczepy E. coli również będą zgodne z protokołem. Elektroporacja jest preferowaną metodą transformacji, ze względu na wysoką wydajność transformacji. Na tym etapie biblioteka powinna zazwyczaj składać się z co najmniej 10⁹ wariantów scFv, a każda porcja powinna zawierać wystarczającą liczbę komórek, aby biblioteka była pokryta 100-krotnie.

2. Wyraź bibliotekę i przygotuj sferoplasty

1. Rozmrozić jedną podwielokrotność biblioteki bakteryjnej (z etapu 1.3) w temperaturze pokojowej i dodać podwielokrotność do kolby zawierającej 100 ml pożywki LB o stężeniu 20 μg/ml chloramfenikolu (Cm). Rosnąć przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 225 obr./min w inkubowanym wytrząsarce.
2. Po upływie 3 godzin wyjąć kolbę z wytrząsarki inkubowanej w temperaturze 37 °C. Pozwolić, aby wyrażanie z biblioteki scFv postępowało O/N przez 15 do 22 godzin w temperaturze 20 °C i 225 obr./min w inkubowanym wytrząsarce.
   UWAGA: W przypadku stosowania plazmidu pIMD nie jest potrzebny induktor, ponieważ promotor jest nieszczelny. Należy zauważyć, że komórki MC4100 nie wykazują nadekspresji represora Lac (a LacI nie znajduje się na plazmidzie).

Rysunek 3. Komórki E. coli i sferoplasty. (A) Komórki E. coli mają kształt cylindryczny. oraz Po sferoplastyce przy użyciu EDTA i lizozymu zewnętrzna błona komórek E. coli zostaje pęknięta, a powstałe sferoplasty mają kulisty kształt. Obrazy z mikroskopii różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) uzyskano przy użyciu obiektywu 100X na mikroskopie odwróconym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotuj bibliotekę spheroplasts.
   UWAGA: Feroplasty powstają w wyniku pęknięcia zewnętrznej błony E. coli i mają kulisty kształt (ryc. 3).
   1. Przygotuj niezbędne.
      UWAGA: Wszystkie powinny być sterylne.
      1. Przygotować 1× soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; pH 7,4), rozpuszczając 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ i 0,24 g KH₂PO₄ w destylowanym_H2Odo końcowej objętości 1 000 ml. Przechowywać na lodzie.
      2. Przygotować PBS z 0,1% (w/v) surowicy albuminy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 0,2 g BSA w 200 ml 1× PBS. Trzymaj na lodzie.
      3. Przygotować bufor frakcjonujący (FB) mieszając 7,5 ml sterylnie przefiltrowanej 1 M sacharozy, 1 ml 1 M buforu Tris (pH 8,0) i 1,5 ml destylowanego_H2O. Przechowywać na lodzie.
      4. Przygotować 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), dodając 30 μl 0,5 M EDTA do 14,97 ml destylowanego_H2O.
      5. Przygotować 0,5 M MgCl₂ rozpuszczając 4,76 g MgCl₂ w 100 ml destylowanego_H2O. Przechowywać na lodzie.
   2. Wyjąć kolbę z wytrząsarki i zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru w celu określenia gęstości komórek. Obliczyć objętość indukowanej kultury potrzebnej tak, aby każda próbka do sferoplastywy miała 1×10¹⁰ komórek.
      UWAGA: Można zastosować przybliżenie OD₆₀₀ wynoszącego 1 wskazujące stężenie 10⁹ komórek/ml dla E. coli ²⁴.
   3. Obliczoną objętość indukowanej kultury należy odwirować w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przy stężeniu 12 000 × g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Przygotować co najmniej dwie próbki na wypadek wystąpienia problemu z przygotowaniem próbki.
   4. Usunąć supernatant z odwirowanych kultur i ponownie zawiesić każdą komórkę w 100 μl lodowatego FB. Odwirować przy 12 000 × g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, a następnie usunąć supernatant przez pipetowanie. Zawiesić każdą osadkę w 350 μl lodowatego FB uzupełnionego 3,5 μl 10 mg/ml lizozymu.
   5. Powoli wirować każdą probówkę, dodając kroplami 700 μl 1 mM EDTA, a następnie inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 20 minut, powoli obracając się na rotatorze probówek w celu wymieszania próbek. Wyjmij probówki z rotatora, dodaj 50 μl lodowatego 0,5 M MgCl₂ do każdej probówki i inkubuj je na lodzie przez 10 minut. Odwirować probówki o sile 11 000 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
   6. Odizolować osad sferoplastowy.
      1. Użyj mikropipety z końcówką o pojemności 1 ml, aby powoli wyciągnąć część granulki. Trzymając probówkę pod kątem, z otworem bezpośrednio nad nową probówką o pojemności 1,5 ml, powoli wyjmij końcówkę pipety z supernatantu i wsuń osad do nowej probówki.
      2. Jeśli znaczna objętość supernatantu zostanie przeniesiona do nowej probówki, należy ją usunąć przez pipetowanie. Jeśli osad nie jest wystarczająco twardy, aby go przenieść, należy ponownie odwirować przy 11 000 × g przez 2 minuty i ponownie spróbować odizolować osad
      .
   7. Zawiesić osad sferoplastu w każdej probówce w 1 ml lodowatego 1× PBS. Na przemian pipetować i powoli wirować na uchwycie wirowym, aż do całkowitego zawieszenia osadu. Nie należy trzymać próbek z dala od lodu na dłużej niż 2 minuty jednorazowo i wrócić do lodu na co najmniej 5 minut przed ponownym wyjęciem z lodu. Przechowywać sferoplasty w temperaturze 4 °C (do 2 dni) do momentu użycia do płukania w kroku 4.

3. Unieruchomij docelowy antygen na kulkach magnetycznych

1. Biotynyluj docelowy antygen in vivo podczas produkcji rekombinowanej w komórkach E. coli. Alternatywnie, użyj koniugacji chemicznej²⁵ lub kup antygen docelowy, który został już poddany biotynylacji, i przejdź do kroku 3.2.
   1. Dodaj 816 g bicyny do 50 ml wody, aby uzyskać 10× bufor bicyny. Rozcieńczyć bufor do objętości 1× w destylowanym_H2Oi podgrzać do temperatury 50 °C. Dodać 14,7 mg biotyny do 12 ml podgrzanego buforu 1× biciny, aby otrzymać roztwór biotyny, który zawiera 5 mM biotyny w 10 mM buforze bicyny. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.
   2. Ekspresja i biotynylacja białka docelowego za pomocą plazmidu pAK400cb-BCCP²⁶, który umożliwia produkcję docelowego antygenu jako fuzji z białkiem nośnikowym karboksylu biotyny (BCCP).
      UWAGA: Komórki E. coli natywnie biotynylują BCCP, eliminując potrzebę oczyszczania i chemicznej biotynylacji białka docelowego przed immobilizacją na kulkach pokrytych streptawidyną. Natywna ligaza biotyny E. coli BirA jest wystarczająca do biotynylacji białka fuzyjnego.
      1. Hodować E. coli zawierającą plazmid biotynylacji (z docelowym antygenem wprowadzonym jako fuzja do N-końca BCCP) O/N przez 15 do 18 godzin w 5 ml pożywki LB uzupełnionej 20 μg/ml Cm w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.
      2. Zmierzyć OD przy 600 nm za pomocą spektrofotometru i obliczyć objętość kultury potrzebną (_{V add}) do subkultury przy początkowym OD 0,05 w 25 ml świeżej pożywki LB o stężeniu 20 μg/ml Cm, stosując równanie: V_dodać = (0,05 × 25 ml)/(OD₆₀₀ - 0,05), gdzie OD₆₀₀ jest gęstością optyczną kultury O/N i V_dodaje to objętość kultury O/N, którą należy dodać do świeżej subkultury LB. i osiągnąć OD 0,5 do 0,8 w inkubowanym wytrząsarce w temperaturze 37 °C i 225 obr./min.
      3. Dodać β-D-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu do końcowego stężenia 100 μM i biotynę do końcowego stężenia 5 μM. Wywołać ekspresję w inkubowanym wytrząsarce przez 15-22 godzin w temperaturze 20 °C i 225 obr./min.
   3. Zebrać bakterie przez odwirowanie w temperaturze 4 000 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Usunąć supernatant. Przechowywać granulki w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do użycia.
   4. Dodać 1 ml detergentu do lizy komórek na 0,2 g granulki komórek. Zawiesić przez pipetowanie i delikatnie obracać przez 20 minut, aby zlizować komórki. Po lizie odwirować w temperaturze 16 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Odpipetować rozpuszczalny lizat (supernatant) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
   5. Użyj kolumny odcięcia masy cząsteczkowej 3 kDa, aby usunąć niezwiązaną biotynę. Odpipetować lizat do kolumny i odwirować w temperaturze 20 °C zgodnie z instrukcjami producenta. Przemyć 1× PBS, aż biotyna w lizacie zostanie rozcieńczona 100-krotnie, a objętość przemytego lizatu będzie równa pierwotnej objętości lizatu. Przenieś lizat do nowej probówki.
2. Unieruchomić biotynylowany antygen docelowy na kulkach magnetycznych pokrytych streptawidyną.
   1. Przygotować 1× PBS i 1× PBS z 0,1% (w/v) BSA zgodnie z opisem w kroku 2.3.1.
   2. Przygotuj koraliki magnetyczne.
      UWAGA: Wymaga to użycia stojaka do separacji magnetycznej.
      1. Zawiesić kulki magnetyczne pokryte streptawidyną w oryginalnej fiolce. Wiruj przez co najmniej 30 sekund lub obracaj przez 5 minut.
      2. Przenieś 7-10 × 10⁹ kulek do probówki o pojemności 1,5 ml.
         UWAGA: Wymagana objętość będzie zależała od stężenia kulek dostarczonego przez producenta.
      3. Umieść rurkę zawierającą koraliki na stojaku magnetycznym na 2 minuty, aby zebrać koraliki z boku tuby. Trzymając probówkę nadal na magnesie, ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie, nie naruszając kulek.
      4. Aby umyć, wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w 1 ml 1× PBS, pipetując bez wytwarzania pęcherzyków. Umieść probówkę z powrotem na magnesie na 2 minuty, aby zebrać kulki i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania. Powtórz proces jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania. Upewnij się, że po ostatnim praniu w tubie nie pozostał żaden płyn.
   3. Dodaj lizat zawierający biotynylowany antygen do kulek magnetycznych.
      1. Wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w 1 ml lizatu (z kroku 3.1.5). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie obracając.
      2. Umieść probówkę na magnesie na 3 minuty, aby zebrać kulki pokryte antygenem. Umyć powleczone kulki pięciokrotnie 1× PBS z 0,1% BSA w taki sam sposób, jak opisano w krokach 3.2.2.3 do 3.2.2.4. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić kulki w 1× PBS z 0,1% BSA do tej samej objętości, co w kroku 3.2.2.2.
      3. Jeżeli unieruchomiony antygen docelowy jest stabilny w temperaturze 4 °C, należy przechowywać powlekane kulki w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne do płukania. W przeciwnym razie przejdź do kroku 4.

4. Badanie przesiewowe biblioteki scFv poprzez panoramowanie względem docelowego antygenu (Rysunek 4)

Rysunek 4. Przesuwanie (krok 4). Kulki magnetyczne pokryte antygenem są inkubowane ze sferoplastami wyrażającymi warianty biblioteki przeciwciał. Plazmidowe DNA ze sferoplastów związanych z kulkami jest odzyskiwane i wykorzystywane do wygenerowania podbiblioteki, która jest badana za pomocą wtórnego badania przesiewowego opartego na ELISA. Odnotowuje się odpowiednie kroki protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Inkubuj powlekane kulki za pomocą sferoplastów.
   1. Użyj stosunku sferoplastu do ściegu około 5:1. Dodać 4 × 10⁹ sferoplastów i 8 × 10⁸ kulek do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Załóżmy, że podczas procesu sferoplastyki nie utracono żadnych komórek, więc stężenie nadal wynosi 1 × 10¹⁰ sferoplastów/ml.
   2. Dodać 1× PBS z 0,1% BSA, aby uzyskać całkowitą objętość do 4 ml. Porcję rozlać do czterech probówek o pojemności 1,5 ml każda. Inkubować reakcje w temperaturze 4 °C przez 5 godzin, delikatnie obracając.
2. Przygotuj sferoplasty związane z kulkami do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
   1. Umieścić probówki reakcyjne do płukania na magnesie na 3 minuty. Usunąć supernatant przez pipetowanie i przemyć sferoplasty związane z kulkami czterokrotnie lodowato zimnym 1× PBS z 0,1% BSA w taki sam sposób, jak opisano w krokach 3.2.2.3 do 3.2.2.4. Zawiesić sferoplasty związane z kulkami w każdej probówce w 25 μl destylowanego_H2O. Przechowywać kulki w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 4.3.
3. Wykonaj PCR całego plazmidu na sferoplastach związanych z koralikami, aby amplifikować plazmidy zawierające geny scFv związane z koralikami.
   1. Otrzymaj startery o następujących sekwencjach: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3' (starter do przodu) i 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3' (starter odwrotny).
      UWAGA: Będą one wiązać się od końca do końca na przeciwległych niciach plazmidu pIMD (Figura 2) i są zaprojektowane do wyżarzania do wspólnej cechy pIMD, więc amplifikacja nastąpi niezależnie od sekwencji wariantu scFv.
   2. Fosforylować podkłady.
      UWAGA: Bez fosforylacji nie nastąpi ponowna ligacja. Startery można również zamówić z fosforylacją 5', zamiast stosować tę metodę fosforylacji w tym protokole.
      1. W probówce o pojemności 0,5 ml należy przeprowadzić reakcję fosforylacji startera do przodu PCR, jak opisano w Tabeli 1. Powtórz ten proces dla odwróconego startera.
      2. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Następnie inkubować je w temperaturze 65 °C przez 20 minut, aby dezaktywować kinazę polinukleotydową T4 (PNK). Ufosforylowane podkłady należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
   3. Wykonaj PCR.
      1. W probówce do PCR przygotować reakcję PCR zgodnie z opisem w tabeli 2.
         UWAGA: W celu uzyskania wyższej wydajności można przygotować wiele reakcji. Niewykorzystane sferoplasty związane z kulkami można przechowywać w temperaturze -20 °C.
      2. Podgrzewać reakcje PCR w temperaturze 98 °C przez 15 minut w termocyklerze, aby zapewnić pełną lizę sferoplastów. Wyjmij probówki z termocyklera i dodaj do każdej z nich 0,5 μl polimerazy o wysokiej wierności. Zwróć lampy do termocyklera i uruchom przy użyciu programu opisanego w Tabeli 3.
      3. W razie potrzeby należy połączyć produkty PCR. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 4.4.

Tabela 1. Reakcja fosforylacji PNK (etap 4.3.2.1).

Odczynnik	Objętość (μl)
Destylowany H2O	15
10x bufor reakcyjny ligazy DNA T4	cyfra arabska
Podkład 100 μM	cyfra arabska
Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK)	1

Tabela 2. Reakcja PCR z udziałem całego plazmidu (etap 4.3.3.1).

pkt.

Odczynnik	Objętość (μl)
Destylowany H2O	28,5
5x Bufor polimerazy o wysokiej wierności	10
10 μM Fosforylowany starter do przodu	Rozdział 2.5
10 μM fosforylowany podkład odwrotny	Rozdział 2.5
Miks 40 mM dNTP (po 10 mM dNTP)	1
Feroplasty związane z koralikami	5

Tabela 3. Program PCR (krok 4.3.3.2).

krok	Temperatura (°C)	Czas (min:s)	Liczba cykli
Początkowa denaturacja	Rozdział 98	Godzina 0:30	1
Deturat	Rozdział 98	Godzina 0:10	35
Wyżarzanie	Rozdział 69	Godzina 0:30
rozszerzenie	72 Rozdział 72	0:30 na KB
Końcowe przedłużenie	72 Rozdział 72	godz. 6:00	1
trzymać	12	nieskończony	1

4. Ponownie cyrkularyzuj produkty PCR z całego plazmidu i użyj zligowanego produktu do transformacji komórek E. coli MC4100.
   1. Oczyść produkt PCR, przeprowadzając reakcję PCR na żelu agarozowym²³, barwiąc DNA w żelu²³ i używając zestawu do czyszczenia żelu w celu oczyszczenia zlinearyzowanego plazmidu, postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru przy długości fali 260 nm. Oczyszczony fragment przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny, lub przejść do kroku 4.4.2.
   2. Ponownie cyrkularyzować plazmid z produktu PCR.
      1. Aby zapobiec ligacji międzycząsteczkowej produktu PCR, należy przeprowadzić reakcję ligacji przy niskim stężeniu²⁷ 1 ng/μl produktu PCR. Obliczyć objętość potrzebną do przygotowania reakcji ligacji 800 μl przy tym stężeniu.
      2. Przygotować reakcję podwiązywania na lodzie. Do probówki dodać objętość obliczoną w kroku 4.4.2.1 produktu PCR, 80 μl 10× buforu ligazy DNA i destylować_H2Odo 800 μl. Dodać 4 μl ligazy DNA T4 i natychmiast umieścić probówki w temperaturze 16 °C w łaźni wodnej lub termocyklerze. Inkubować w temperaturze 16 °C O/N przez 14–18 godzin. Zakończyć reakcje podwiązania przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne, lub przejść do kroku 4.4.3.
   3. Umieścić reakcję ligacji na bloku grzewczym w temperaturze 65 °C na 15 minut w celu inaktywacji termicznej ligazy DNA. Następnie użyj membrany do mikrodializy lub zestawu do czyszczenia DNA, aby odsolić ligowane DNA. Przechowywać w temperaturze 20 °C lub przejść do kroku 4.4.4.
   4. Użyj całego inaktywowanego termicznie, odsolonego produktu ligacji do przekształcenia komórek MC4100 E. coli ²³. Przygotować zapasy glicerolu, jak opisano w kroku 1.3, komórek zawierających otrzymaną podbibliotekę z panoramą i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
5. Powtórz krok 4 w całości, używając porcji z kroku 4.4.4, aby wykonać drugie panoramowanie w podbibliotece.
   UWAGA: Drugie panoramowanie pomaga wzbogacić składniki biblioteki, które dobrze wiążą się z docelowym antygenem¹⁹.

5. Wykonaj wtórne badanie przesiewowe za pomocą metody testu immunoenzymatycznego, aby zidentyfikować obiecujące klony do dalszej charakterystyki (Rysunek 5)

Rysunek 5. Wtórne badanie przesiewowe oparte na teście ELISA (etap 5). (A) Warianty biblioteczne z podbiblioteki wzbogacone podczas płukania są zaszczepiane w indywidualnych studzienkach płytki hodowlanej w celu wzrostu i ekspresji. (B) Płytkę ELISA pokrywa się antygenem docelowym. (C) Warianty biblioteki są sprawdzane przy użyciu dodatkowego ekranu opartego na teście ELISA opisanego w protokole. Na podstawie analizy danych uzyskanych z ekranu wtórnego wybierane i charakteryzowane są interesujące warianty. Odnotowuje się odpowiednie kroki protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Rozmrozić jedną probówkę z wypłukaną podbiblioteką (od kroku 4.4.4) i umieścić płytkę na płytkach agarowych LB. Umieścić kilka rozcieńczeń w stężeniach wystarczająco niskich, aby zapewnić indywidualne kolonie (np. 10²- do 10^6-krotnych rozcieńczeń). Inkubować płytki przez 15-18 godzin w temperaturze 37 °C. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C lub przejść do kroku 5.2.
2. Hodowla i indukcja kolonii z wypłukanej podbiblioteki. Wykonaj wszystkie kroki w sterylnych warunkach. Użyj pipetora wielokanałowego do etapów obejmujących płytki 96-dołkowe.
   1. Dodać 200 μl LB z 20 μg/ml cm do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej z okrągłym dnem.
   2. Wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej za pomocą końcówki pipety, umieść końcówkę w pierwszym dołku 96-dołkowej płytki i delikatnie wymieszaj, aby zaszczepić. Użyj nowej końcówki dla każdej studzienki. Zaszczep jedną kolonię w każdej studzience. Jako kontrolę, należy uwzględnić co najmniej jedną studzienkę kontrolną sterylności, w której nie zaszczepiono kolonii.
   3. Powtórzyć kroki 5.2.1 i 5.2.2, aby zaszczepić kilka 96-dołkowych płytek.
   4. Umieścić 96-dołkowe płytki na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 310 obr./min. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20-24 godziny w celu ekspresji scFvs.
3. Dla każdej płytki hodowlanej przygotowanej w kroku 5.2 pokryć jedną 96-dołkową płytkę ELISA docelowym antygenem.
   1. Rozcieńczyć oczyszczony antygen docelowy do odpowiedniego stężenia (np. 1 μg/ml do 4 μg/ml) w 1× PBS w celu uzyskania roztworu powlekającego. Przygotować 5 ml roztworu powlekającego na każdą płytkę 96-dołkową.
      UWAGA: Odpowiednie stężenie zależy od konkretnego używanego antygenu i może wymagać dostosowania.
   2. Dodać 50 μl roztworu powlekającego do każdego dołka 96-dołkowej przezroczystej płytki ELISA z polistyrenu o wysokiej wiązce. Delikatnie postukaj płytką o powierzchnię blatu, aby upewnić się, że cała powierzchnia każdej studzienki jest pokryta. Powtórz dla każdej płytki. Inkubować płytki w temperaturze 4 °C O/N.
4. Powtórz kolonie z 96-dołkowych płytek hodowlanych na płytkach agarowych.
   1. Umieść sterylny replikator polistyrenu w studzienkach płytki hodowlanej, aby zebrać niewielką ilość płynu. Ostrożnie podnieść replikator i przenieść na płytkę agarową o średnicy 15 cm LB tak, aby wszystkie końcówki stykały się z płytką. Po przeniesieniu cieczy należy podnieść replikator prosto do góry. Powtórz te czynności dla każdej płytki hodowlanej.
   2. Oznaczyć płytkę agarową w odpowiedniej orientacji, tak aby wyniki z ekranu wtórnego w płytce 96-dołkowej mogły być dopasowane do właściwej powtórzonej kolonii na płytce, jeśli pożądana jest dalsza charakterystyka. Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 15 do 18 godzin, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
5. Wykonaj dodatkowe badanie przesiewowe ELISA.
   1. Przygotować roztwór blokujący, przygotowując 2% (w/v) mleka w proszku w 1× PBS. Opróżnij roztwór powlekający z płytek ELISA. Dodać 100 μl roztworu blokującego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny lub blokować O/N w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotować bufor do przemywania przez dodanie polisorbatu 20 do końcowego stężenia 0,05% w 1× PBS. Przygotuj 250 ml na płytkę ELISA.
   3. Dodać 20 μl skoncentrowanego detergentu do lizy komórek do każdego dołka na okrągłodennej płytce hodowlanej i inkubować płytkę hodowlaną na wytrząsarce do mikropłytek w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut. Rozpocząć lizę w tym samym czasie, gdy blokowanie płytek ELISA jest zakończone, tak aby można było przeprowadzić jednocześnie etap lizy i przemywania 5.5.4.
   4. Opróżnij roztwór blokujący z płytek ELISA. Zablokowane płytki ELISA należy przemyć czterokrotnie 200 μl buforu do płukania na studzienkę na pranie. Opróżnij bufor płuczący ze studzienek.
   5. Przenieść 50 μl z każdej studzienki płytki do lizy komórek do odpowiedniego dołka płytki ELISA, używając nowej końcówki dla każdego dołka. Inkubować płytkę ELISA w temperaturze pokojowej przez 1 do 2 godzin.
   6. Przygotować roztwór przeciwciał w celu wykrycia związanych scFvs.
      1. Użyj przeciwciała pierwszorzędowego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), które wiąże się ze znacznikiem epitopu FLAG połączonym z biblioteką scFvs.
      2. Rozcieńczyć przeciwciało do odpowiedniego rozcieńczenia do użycia w teście ELISA (patrz zalecenia dostawcy) w 2% (m/v) mleku w proszku w 0,05% polisorbatu 20 w 1× PBS. Przygotuj 5 ml na każdą płytkę.
   7. Umyć płytki ELISA czterokrotnie buforem do płukania, jak opisano w kroku 5.5.4.
   8. Dodać 50 μl roztworu przeciwciała do każdego dołka płytki ELISA. Inkubować przez 1 do 2 godzin w temperaturze pokojowej.
   9. Przygotować substrat HRP, rozpuszczając tabletki dichlorowodorku o-fenylenodiaminy (OPD) w destylowanym_H2Ozgodnie z protokołem producenta, unikając światła. Przygotować 20 ml na płytkę ELISA.
   10. Przygotować 3 M H₂SO₄ przez rozcieńczenie stężonego H₂SO₄ destylowanym_H2O, jeśli to konieczne. Przygotować 5 ml na płytkę ELISA.
       Uwaga:_H2SO4 jest mocnym kwasem. Pamiętaj, aby nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
   11. Umyć płytki ELISA czterokrotnie buforem do przemywania zgodnie z opisem w kroku 5.5.4.
   12. Inkubować płytki ELISA z substratem HRP.
       1. Do każdej studzienki dodać 200 μl substratu HRP. Aby zminimalizować ekspozycję na światło, dodawaj podłoże do jednej płytki ELISA na raz i owiń folią aluminiową przed przejściem do następnej płytki. Inkubować płytki przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
       2. Po pierwszych 30 minutach sprawdź, czy podłoże nie ciemnieje, a w razie potrzeby inkubuj dłużej, aby uwidocznić rozwijający się kolor.
   13. Dodać 50 μl 3 M H₂SO₄ do każdego dołka w celu wygaszenia reakcji. Używając innej końcówki do każdego dołka, wymieszaj roztwór w studzienkach, delikatnie pipetując w górę iw dół bez spieniania. Aby uzyskać spójność i zapobiec nasyceniu, należy szybko i ostrożnie dodać H₂SO₄ do wszystkich płytek ELISA przed zmieszaniem roztworu dla każdej płytki.
   14. Zmierzyć absorbancję roztworu w studzienkach każdej płytki przy długości fali 492 nm za pomocą czytnika płytek.
   15. Przeanalizuj dane dotyczące absorbancji, aby zidentyfikować warianty scFv, które wykazują obiecujące sygnały wiązania i scharakteryzować te obiecujące scFv. Wybierz scFv, które wykazują sygnały absorbancji wyższe niż sygnał tła i wyższe niż średni sygnał na każdej płytce.
       UWAGA: Poziom absorbancji będzie zależał od właściwości zastosowanego antygenu i przeciwciała anty-FLAG, a także od siły wariantów scFv, które zostały wyizolowane w badaniu przesiewowym.

Wyniki

Wewnątrzkomórkowy mechanizm kontroli jakości fałdowania białek szlaku Tat u E. coli ogranicza transport przez wewnętrzną błonę komórkową do białek, które są dobrze pofałdowane w redukującym środowisku cytoplazmatycznym. Poprzez nadekspresję fuzji scFv z sekwencją sygnałową ssTorA (sekwencja sygnałowa z białka TorA, która jest naturalnie transportowana przez szlak Tat²⁰), translokacja zostaje zatrzymana, co powoduje wyświetlanie scFvs na błonie wewnętrznej¹⁹. Po enzymatycznym rozerwaniu błony zewnętrznej, wyświetlane przeciwciała są udostępniane do badań przesiewowych pod kątem aktywności wiążącej antygen. Zdolność do wykorzystania szlaku Tat do wyświetlania scFv wykazali Karlsson i wsp.¹⁹ (Rysunek 6). Przeciwciała scFv scFv13 i scFv13.R4 zostały połączone z natywną sekwencją ssTorA lub zmodyfikowanym ssTorA, który nie ma pary reszt arginina-arginina rozpoznawanej przez szlak Tat. scFv13.R4 został zaprojektowany przez Martineau i wsp. z scFv13 przez cztery rundy ukierunkowanej ewolucji i wiadomo, że dobrze się fałduje w cytoplazmie⁹. Ten scFv był wyświetlany na błonie wewnętrznej, ale tylko wtedy, gdy był wyrażony jako fuzja z natywną sekwencją sygnałową ssTorA (ryc. 6). W przeciwieństwie do tego, scFv13 nie jest dobrze pofałdowany cytoplazmatycznie⁹, więc nie jest dobrze wyświetlany na błonie wewnętrznej, niezależnie od sekwencji sygnałowej, z którą jest połączony. Dodatkowo, jeśli scFv ulegały ekspresji w komórkach, w których brakowało białka TatC, istotnego składnika maszynerii Tat^20,28, nie zaobserwowano wyświetlacza, co pokazuje ważny związek między wyświetlaniem błony wewnętrznej a szlakiem Tat. Wyniki te pokazują, że tylko białka, które zawierają peptyd sygnałowy Tat i które są prawidłowo pofałdowane w cytoplazmie, są wyświetlane na błonie wewnętrznej, umożliwiając transport przez szlak Tat działanie jako ekran do fałdowania wewnątrzkomórkowego.

Rysunek 6. Wykrywanie wyświetlanych scFv na membranie wewnętrznej. Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono w celu wykrycia wyświetlania słabo złożonego scFv13 i dobrze złożonego scFv13.R4 na błonie wewnętrznej. scFv zostały połączone z natywnym ssTorA lub ssTorA(KK), gdzie para Arg-Arg w sekwencji ssTorA została zmodyfikowana do Lys-Lys. C-końcowe znaczniki epitopów FLAG na scFv wykryto za pomocą przeciwciała anty-FLAG sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Komórki bez białka TatC (ΔtatC) i ssTorA-scFv13 bez znacznika FLAG zostały przetestowane jako kontrole. M oznacza medianę wartości fluorescencji. Przedruk z odnośnika ¹⁹ za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyświetlacz wewnętrznej błony może z powodzeniem wyizolować przeciwciała scFv o wysokim poziomie powinowactwa do docelowego białka i wysokim poziomie rozpuszczalności cytoplazmatycznej. Dodatkowo, kolejne rundy ukierunkowanej ewolucji z wykorzystaniem wyświetlacza błony wewnętrznej poprawiają charakterystykę przeciwciał¹⁹. Aby to zademonstrować, podatną na błędy bibliotekę PCR opartą na scFv13, która ma niski poziom powinowactwa wiązania do β-galaktozydazy, przetasowano względem docelowego antygenu β-galaktozydazy przy użyciu metody wyświetlania i panoramowania opisanej w protokole. scFv 1-4 wyizolowano po jednej rundzie mutagenezy i panoramowania i wykazano wyższe powinowactwo wiązania do β-galaktozydazy niż scFv13 (Figura 7A) i wyższy poziom rozpuszczalności cytoplazmatycznej (Figura 7B).

Nowa biblioteka, oparta na scFv 1-4, została stworzona przy użyciu podatnego na błędy PCR, a panoramowanie tej biblioteki drugiej generacji pod kątem β-galaktozydazy zostało wykonane przy użyciu modyfikacji opisanego protokołu. Płukanie przeciwko β-galaktozydazie w drugiej rundzie ewolucji przeprowadzono w obecności oczyszczonego, rozpuszczalnego scFv 14 jako konkurenta w celu zwiększenia prawdopodobieństwa wyizolowania klonów o wyższym powinowactwie niż scFv 1-4. Po tej drugiej rundzie mutagenezy i panoramowania, scFv 2-1 i scFv 2-3 wyizolowano za pomocą wtórnego badania przesiewowego opartego na ELISA. Te scFv nie tylko wykazywały wyższe powinowactwo wiązania do β-galaktozydazy niż scFv13, ale także wykazywały lepsze wiązanie niż klon pierwszej rundy scFv 1-4. scFv 2-1 wykazywał wiązanie β-galaktozydazy porównywalne do scFv13.R4 (Figura 7A). scFv 2-3 wykazuje również dalszy wzrost rozpuszczalności cytoplazmatycznej w porównaniu z scFv 14, co podkreśla jednoczesną inżynierię rozpuszczalności i wiązania antygenu. Ponieważ powinowactwo i rozpuszczalna ekspresja scFv są badane jednocześnie, możliwe jest, że wybrany scFv ma umiarkowaną rozpuszczalność, ale wysokie wiązanie lub odwrotnie. Na przykład scFv 2-1 ma niższą rozpuszczalną ekspresję niż scFv 2-3, ale wykazuje większe powinowactwo wiązania do β-galaktozydazy.

Rysunek 7. Wiązanie celu i ekspresja cytoplazmatyczna wariantów scFv izolowanych za pomocą wyświetlacza błony wewnętrznej. (A) scFv ulegały ekspresji w cytoplazmie komórek E. coli (np. bez sekwencji sygnałowej ssTorA) za pomocą znacznika heksahistydyny (6×-His) i oczyszczano za pomocą kolumn spinowych kwasu niklowo-nitrylotroctowego. Wiązanie oczyszczonych scFvs z β-galaktozydazą mierzono za pomocą testu ELISA. Oczyszczone scFv załadowano na płytki ELISA pokryte β-galaktozydazą, a związane scFv wykryto przeciwciałem anty-6×-His. Dane są średnią z sześciu powtórzeń, a na pasku błędu wyświetlany jest błąd standardowy średniej. (B) Rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje lizatów komórkowych z komórek wykazujących cytoplazmatyczną ekspresję scFvs analizowano za pomocą Western blot badanego przeciwciałem anty-6×-His. Całkowite stężenie białka wykorzystano do normalizacji obciążenia próbek. Przedruk (A) i adaptacja (B) z odnośnika ¹⁹ za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Inżynieria przeciwciał dla aktywności cytoplazmatycznej jest trudnym zadaniem ze względu na redukujące się środowisko cytoplazmy, które utrudnia tworzenie stabilizujących wiązań dwusiarczkowych^6,7. Powoduje to, że większość przeciwciał jest cytoplazmatycznie nieaktywna, chyba że są one zaprojektowane pod kątem stabilności i rozpuszczalności w cytoplazmie, a także są zaprojektowane pod kątem powinowactwa wiązania. Istniejące metody wyświetlania fagów, ekspozycji powierzchni bakterii i metod wyświetlania powierzchni drożdży wykorzystują szlak wydzielniczy^14-16 do wyświetlania zmodyfikowanych przeciwciał, ale metody te nie mają środków do inżynierii fałdowania wewnątrzkomórkowego. Przeciwciała zmodyfikowane przy użyciu wyświetlacza błony wewnętrznej poprawiły stabilność cytoplazmatyczną i rozpuszczalność, ponieważ kontrola jakości fałdowania szlaku Tat zapobiega translokacji przeciwciał, które są słabo sfałdowane i niestabilne w cytoplazmie. Metoda ta upraszcza iteracyjny proces inżynierii przeciwciał wewnątrzkomórkowych pod kątem powinowactwa i rozpuszczalności, ponieważ te dwie właściwości są projektowane w jednym kroku. Chociaż metoda ta została zaprojektowana do inżynierii przeciwciał o rozpuszczalności w redukującym środowisku wewnątrzkomórkowym, może być również stosowana do inżynierii przeciwciał tak, aby działały w warunkach nieredukcyjnych, ponieważ białka zmodyfikowane tą metodą utrzymują fałdowanie w środowisku utleniającym peryplazmy.

Chociaż technika ta upraszcza proces inżynierii przeciwciał o wysokim powinowactwie i wysokiej rozpuszczalności cytoplazmatycznej, podczas korzystania z tego protokołu należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Analizując sygnały ELISA z wtórnego badania przesiewowego w celu zidentyfikowania obiecujących wariantów scFv, próg rozróżnienia między potencjalnie interesującymi wariantami a tymi, które mogą nie wykazywać odpowiedniego wiązania antygenu, prawdopodobnie nie będzie widoczny, dopóki kilka klonów nie zostanie dalej scharakteryzowanych. Ważne jest, aby szukać lepszego wiązania z przeciwciałem macierzystym; Jednak nienormalnie wysoki sygnał może wskazywać na awidność²⁹ lub efekty agregacji³⁰, co nie jest wyzwaniem charakterystycznym dla podejścia opartego na ekranowaniu wyświetlacza z wnętrzną błoną. Kluczowym ograniczeniem, o którym należy pamiętać podczas korzystania z tego protokołu, jest brak możliwości odzyskania sferoplastów po płukaniu, ponieważ są one niezdolne do życia (dane niepublikowane). Wymaga to etapów amplifikacji i transformacji DNA w celu odzyskania plazmidów kodujących przeciwciała.

Kilka kluczowych etapów protokołu umożliwia jednoczesną inżynierię fałdowania i wiązania przeciwciał. Aby badanie przesiewowe zakończyło się sukcesem, przeszukiwana biblioteka scFv musi być wyrażona jako fuzja z peptydem sygnałowym ssTorA. Bez tej sekwencji przeciwciała nie zostaną skierowane na szlak Tat, a tym samym nie zostaną przemieszczone do peryplazmy¹⁹. Ponadto konieczne jest połączenie C-końcowego znacznika epitopu z przeciwciałami, aby umożliwić wykrycie wyświetlanych przeciwciał w testach wiązania. Oczywiste jest, że szczep E. coli używany do ekspresji scFv musi również mieć niezbędną maszynerię szlaku Tat, ale jest to prawdą w przypadku powszechnie stosowanych szczepów E. coli .

Modyfikacje tego protokołu są możliwe w celu zwiększenia jego potencjału do izolowania przeciwciał o pożądanych cechach. Przed panoramowaniem względem antygenu docelowego można wykonać etap subtraktywnego panoramowania w celu wyczerpania biblioteki scFv niepożądanych składników. Sferoplasty biblioteczne mogą być inkubowane z kulkami magnetycznymi pokrytymi samym BCCP lub pokrytymi niepożądanym białkiem, a sferoplasty, które wiążą się z tymi kulkami, można wyrzucić przed przesiewaniem pozostałych niezwiązanych sferoplastów pod kątem wiązania z pożądanym celem. Jak wspomniano w reprezentatywnych wynikach, metodą poprawy powinowactwa izolowanego scFv jest włączenie rozpuszczalnego konkurenta do reakcji płukania, aby konkurować z scFv wyświetlanymi na sferoplastach. Ponieważ rozpuszczalny konkurent jest oczyszczonym białkiem, nie jest z niego amplifikowane DNA, więc w reakcji PCR zostaną odzyskane tylko sekwencje scFv wyświetlane na sferoplastach. Ponadto metoda ta może zostać rozszerzona na inne rodzaje przeciwciał lub na białka niewiążące przeciwciał.

Wyświetlacz błony wewnętrznej E. coli jest potężną platformą do inżynierii przeciwciał o wysokim powinowactwie i wysokim poziomie rozpuszczalności wewnątrzkomórkowej. Metoda ta jest szczególnie przydatna do efektywnej inżynierii przeciwciał zaprojektowanych do funkcjonowania w środowisku wewnątrzkomórkowym. Te wewnątrzkomórkowe przeciwciała są już badane jako potencjalne terapie w wielu dziedzinach, w tym w chorobach neurodegeneracyjnych, nowotworach i infekcjach wirusowych³¹. Technika ta umożliwi szersze zastosowanie przeciwciał wewnątrzkomórkowych jako narzędzi badawczych i medycznych w tych dziedzinach i każdej innej dziedzinie, w której pożądane jest badanie docelowego białka in situ.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Biblioteka scFv	Różni się		Odpowiednią bibliotekę scFv należy uzyskać ze źródła komercyjnego lub akademickiego.
MC4100 E. coli	komórki Coli Genetic Stock Center	6152	Komórki muszą być kompetentne chemicznie lub elektrokompetentne, w zależności od wybranej metody transformacji.
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Difco odwodnione podłoże hodowlane LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	BD	244610
Chloramfenikol (Cm)	Fisher Scientific	BP904-100
Chlorek sodu (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-1
Chlorek potasu (KCl)	Fisher Scientific	BP366-500
Fosforan sodu, dwuzasadowy (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-500
Fosforan potasu, monozasadowy (KH2PO4)	Fisher Scientific	BP362-500
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Fisher Scientific	BP9706-100
Sacharoza	Fisher Scientific	BP220-1
Baza Tris	Fisher Scientific	BP1521
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,5 M	Fisher Scientific	BP2482-500
Chlorek magnezu (MgCl2)	Fisher Scientific	BP214-500
Lizozym	Sigma Aldrich	L3790-10X1ML
Mieszalnik wirowy	VWR	97043-564
Bicine	Fisher Scientific	BP2646100
D-Biotyna	Fisher Scientific	BP232-1
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd	Fisher Scientific	BP1755-1
BugBuster Master Mix (detergent do lizy komórek)	EMD Millipore	71456
Vivaspin 2 MWCO, 3,000  daltons	GE Healthcare Sciences	28932240
Antygen docelowy	Różni się	Nie dotyczy	Oczyszczony antygen docelowy można zakupić lub wyprodukować/oczyścić.
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen	65601
Magnes Dynamag-2	Invitrogen	12321D
Tube rotator	VWR	13916-822
Startery do PCR	IDT	N/A	Sekwencje starterów są zgodne z opisem w protokole.
10x bufor reakcyjny ligazy DNA T4	New England BioLabs	B0202S
T4 (PNK)	New England BioLabs	M0201S	Upewnij się, że bufor ligazy T4 stosowany w reakcji fosforylacji startera zawiera 1 mM ATP.
5x pakiet buforowy Phusion HF	New England BioLabs	B0518S
mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP), po 10 mM każdy dNTP	New England BioLabs	N0447L
Polimeraza DNA Phusion	New England BioLabs	M0530S	Inne polimerazy o wysokiej wierności mogą być stosowane jako alternatywa, ale temperatura wyżarzania w Tabela 3 musi zostać dostosowana.
Termocykler C1000 Touch z podwójnym modułem szybkiej reakcji 48/48	Bio-Rad	185-1148
Agaroza	Promega	V3121
SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNA	Invitrogen	S33102
Wizard SV i system czyszczenia PCR	Promega	A9281
Ligaza DNA T4	New England BioLabs	M0202S Mikrodializa
filtr membranowy	EMD Millipore	VSWP04700
Agar	BD	214030
96-dołkowe płytki do hodowli komórek polistyrenowych z okrągłym dnem	VWR	10062-902
Pokrywki do ogólnych płytek do oznaczania polistyrenu Costar	Corning	3931
Wytrząsarka do mikromiareczkowania	VWR	12620-926
Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash przezroczysta mikropłytka z płaskiego polistyrenu o wysokim poziomie wiązania	Corning	3369
Bel-blotter z poliwęglanu 96-dołkowe narzędzie do replikowania	Bel-Art Produkty	378760002
Błyskawiczne beztłuszczowe mleko w proszku	Jakość Biologiczna	A614-1000
Tween 20 (polisorbat 20)	Fisher Scientific	BP337-500
Odczynnik PopCulture (skoncentrowany detergent do lizy komórek)	EMD Millipore	71092-3
Monoklonalne przeciwciało ANTI-FLAG M2-peroksydazy (HRP) wytwarzane u myszy	Sigma	Aldrich A8592
SigmaFast OPD	Sigma Aldrich	P9187-50SET
Kwas siarkowy (H2SO4), 10  Roztwór N	Fisher Scientific	SA200-1
Reynolds Wrap folia aluminiowa	VWR	89079-075
Spektrofotometr mikropłytkowy BioTek Epoch	Fisher Scientific	11120570