Method Article

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

DOI:

10.3791/54585

⸱

October 6th, 2016

 , 
1Institute for Genetics, Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster pojawiła się jako potężny eksperymentalny system do funkcjonalnych i mechanistycznych badań rozwoju i progresji guza w kontekście całego organizmu. Zaawansowane techniki generowania mozaik genetycznych ułatwiają indukcję wizualnie oznaczonych, genetycznie zdefiniowanych klonów otoczonych normalną tkanką. Klony mogą być analizowane za pomocą różnych podejść molekularnych, komórkowych i omicznych. W badaniu tym opisano, w jaki sposób generować znakowane fluorescencyjnie guzy klonalne o różnym złośliwym nachyleniu w krążkach imaginalnych oka/czułków (EAD) larw Drosophila przy użyciu techniki analizy mozaikowej z represyjnym markerem komórkowym (MARCM). Opisano w nim procedury, w jaki sposób odzyskać mozaikę EAD i mózg od larw oraz jak je przetworzyć w celu jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnych reporterów transgenicznych i barwienia przeciwciałami. Aby ułatwić charakterystykę molekularną tkanki mozaikowej, opisujemy protokół izolacji całkowitego RNA z EAD. Procedura preparacji jest odpowiednia do odzyskania EAD i mózgu z dowolnego stadium larwalnego. Protokół utrwalania i barwienia dysków wyobrażeniowych współpracuje z wieloma transgenicznymi reporterami i przeciwciałami, które rozpoznają białka Drosophila. Protokół izolacji RNA można zastosować do różnych narządów larwalnych, całych larw i dorosłych much. Całkowite RNA można wykorzystać do profilowania zmian ekspresji genów przy użyciu metod kandydujących lub obejmujących cały genom. Na koniec szczegółowo opisujemy metodę ilościowego określania inwazyjności guzów klonalnych. Chociaż metoda ta ma ograniczone zastosowanie, jej podstawowa koncepcja ma szerokie zastosowanie w innych badaniach ilościowych, w których należy unikać błędów poznawczych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak stanowi jedną z najbardziej genetycznie niejednorodnych grup chorób, której częstość występowania i śmiertelność dramatycznie wzrasta, szczególnie wśród osób starszych na całym świecie. Rak powstaje klonalnie z komórki inicjującej nowotwór, która wymyka się nieodłącznym mechanizmom supresorowym guza i dzieli się w sposób niekontrolowany. Stopniowa akumulacja zmian genetycznych, które wspólnie promują wzrost, proliferację i ruchliwość, jednocześnie hamując śmierć i różnicowanie, przekształca początkowy łagodny przerost w wysoce złośliwy, przerzutowy i śmiertelny nowotwór. Stało się oczywiste, że oprócz zmian genetycznych, progresja guza wymaga zmian w otaczającym zrębie i przesłuchu między guzem a wieloma typami komórek (np. fibroblastami, komórkami odpornościowymi i śródbłonka) w jego mikrośrodowisku. Zrozumienie zasad molekularnych leżących u podstaw przemian nowotworowych, w tym interakcji między nowotworem a zrębem, ma ogromne znaczenie dla opracowania strategii profilaktyki i wczesnych badań przesiewowych, a także nowych i skutecznych metod leczenia przerzutów raka i oporności na leki.

Muszka owocowa Drosophila melanogaster stała się atrakcyjnym systemem do badań nad rakiem 1-4 dzięki szybkiemu czasowi generacji, niezwykłemu zachowaniu węzłów sygnałowych między muchami a ludźmi, ograniczonej redundancji genetycznej i bogactwu zaawansowanych narzędzi genetycznych, które ułatwiają manipulację prawie każdym genem w sposób tymczasowo i przestrzennie ograniczony. Genetycznie zdefiniowane nowotwory o różnym złośliwym stopniu złośliwości mogą być odtwarzalnie modyfikowane u Drosophila poprzez wprowadzenie mutacji powodujących przyrost i utratę funkcji w podzbiorze komórek progenitorowych w tkance typu dzikiego przy użyciu techniki MARCM 5. Narzędzie MARCM łączy rekombinację mitotyczną za pośrednictwem FLP/FRT (rekombinaza FLP/FLP Recognition Target) 6 z docelowymi systemami ekspresji genów FLP-out 7 i Gal4/UAS (Upstream Activation Sequence) 8 9. Dzięki tej metodzie ekspresja dowolnego transgenu opartego na UAS, w tym onkogenu lub białka fluorescencyjnego cDNA lub powtórzeń odwróconego DNA w celu wyciszenia genów indukowanego przez dsRNA, zostanie ograniczona do klonu komórek, które utraciły określone locus genetyczne i represor Gal4 w wyniku rekombinacji (Figura 1A). Plamy klonalne oznaczone białkami zielonej fluorescencji (GFP) lub czerwonej fluorescencji (np. RFP, DsRed, mCherry) można łatwo śledzić przez cały okres rozwoju, izolować i analizować. Co ważne, ich zachowanie można bezpośrednio porównać do sąsiedniej tkanki typu dzikiego. W ten sposób można wygodnie badać pytania dotyczące autonomicznych i nieautonomicznych skutków zmian genetycznych w komórkach. Podobnie jak w przypadku ssaków, tylko klony, w których łączy się wiele zmian onkogennych, stają się złośliwe u Drosophila i przypominają kluczowe cechy raka ssaków. Nadmiernie się namnażają, unikają apoptozy, wywołują stany zapalne, stają się nieśmiertelne i inwazyjne, ostatecznie zabijając gospodarza 10-17.

Tutaj opisujemy protokół generowania genetycznie zdefiniowanych guzów klonalnych w tkance oka/czułka i mózgu larw Drosophila za pomocą techniki MARCM. Metoda opiera się na wyrobie testera MARCM, który wyraża drożdżową rekombinazę FLP pod kontrolą wzmacniacza bezocznego (eyFLP) 18,19. W ten sposób klony znakowane GFP są generowane zarówno w nabłonku okołopodniowym, jak i walcowatym EAD oraz w neuroepithelium mózgu w stadiach embrionalnych i larwalnych (ryc. 1A, B i odniesienie 20). Klony można łatwo śledzić aż do osiągnięcia dorosłości, ponieważ EAD rozwija się w dorosłe oko, antenę i torebkę głowy, podczas gdy nabłonek nerwowy powoduje powstawanie neuroblastów, które wytwarzają zróżnicowane neurony płata wzrokowego.

Aby ułatwić obszerną molekularną, funkcjonalną i fenotypową charakterystykę tkanki mozaiki, opisujemy protokół preparacji EAD i mózgu od larw trzeciego stadium rozwojowego i nakreślamy, jak je przetwarzać dla trzech różnych zastosowań: (i) wykrywanie transgenicznych reporterów fluorescencyjnych i barwienie immunologiczne, (ii) kwantyfikacja inwazyjności guza oraz (iii) analiza zmian ekspresji genów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) lub wysokoprzepustowe sekwencjonowanie mRNA (sekwencjonowanie mRNA) (Figura 1C).

Protokół barwienia immunologicznego może być wykorzystany do wizualizacji dowolnego interesującego białka z określonym przeciwciałem. Transgeniczne fluorescencyjne reportery transkrypcyjne dostarczają wygodnych i precyzyjnych informacji czasoprzestrzennych na temat aktywności określonego szlaku sygnałowego. Z drugiej strony reportery specyficzne dla linii komórkowej odzwierciedlają jakościowe i ilościowe zmiany w populacjach komórek w tkance mozaiki i wśród nowotworów o różnych genotypach. Kwantyfikacja zachowań inwazyjnych ułatwia porównanie złośliwości nowotworu między genotypami. Wreszcie, protokół opisujący pobieranie i przetwarzanie mozaikowego EAD do izolacji RNA jest odpowiedni zarówno do małych, jak i dużych zastosowań downstream, takich jak odwrotna transkrypcja, a następnie qRT-PCR i sekwencjonowanie mRNA całego genomu. Dane jakościowe i ilościowe uzyskane z tych testów dostarczają nowych informacji na temat zachowań społecznych nowotworów klonalnych. Co więcej, stanowią one solidną podstawę do badań funkcjonalnych nad rolą poszczególnych genów, sieci genetycznych i mikrośrodowiska nowotworu w różnych stadiach i aspektach nowotworzenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: W tej pracy wykorzystano eyFLP1; act>y+>Gal4, UAS-GFP; FRT82B, tuba-Gal80 MARCM 82B Zielona linia testera 11. Krzyżowanie dziewic testera MARCM 82B Green z samcami szczepów takich jak w; Bezzałogowy statek powietrzny-a; Genotyp mut UAS-bRNAi, FRT82B cda potomstwo, w którym rekombinacja mitotyczna zajdzie między prawymi ramionami 3. chromosomów homologicznych. W ten sposób w obrębie EAD i neuroepithelium mózgu zostaną wygenerowane klony homozygotycznego mutanta genu c zlokalizowanego dystalnie do miejsca FRT82B. Te klony będą eksprymować GFP, transgen a i dsRNA dla genu b (Figura 1A). Stworzono różne linie testerów eyFLP-MARCM do rekombinacji w modelach X, 2L, 2R, 3L i 3R, które są dostępne w społeczności muchowej.

1. Prowadzenie lotu, krzyżowanie i inscenizacja

  1. Rozszerz odpowiedni zapas testera MARCM w temperaturze pokojowej, napełniając wiele butelek w tym samym czasie. Dorosłe osobniki należy przerzucać do świeżych butelek co 2-3 dni, aby można było zebrać wystarczającą ilość dziewic do kolejnych krzyżówek.
    UWAGA: Podczas zbierania dziewic należy unikać długotrwałego narażenia na CO2 , ponieważ zagraża to płodności kobiet.
  2. W zależności od skali eksperymentu, należy umieścić krzyżówki muchowe w fiolkach przy użyciu co najmniej 10 dziewic testowych MARCM i 4 samców (np. do obrazowania reporterów fluorescencyjnych i barwienia immunologicznego) lub w butelkach z co najmniej 30 dziewicami i 10 samcami (np. w celu izolacji RNA i ilościowego określenia inwazyjności).
  3. Wychowywać potomstwo w temperaturze 25 °C w długim dniu trwającym 16 godzin/8 godzin w cyklu jasno-ciemnym. Wkładaj rodziców do nowych fiolek/butelek co 24 godziny, aby ułatwić powtarzalne stadium larw i zapobiec przepełnieniu.
    UWAGA: Począwszy od 6 dnia po złożeniu jaj (AEL), larwy kontrolne w późnym stadium trzecim przestają żerować, zaczynają wędrować i wchodzą w okres przepoczwarzania. W przeciwieństwie do tego, początek przejścia larwala-poczwarka może być opóźniony lub nie istnieć u larw z EAD z hiperplastycznymi lub złośliwymi guzami klonalnymi.

2. Zbieranie larw trzeciego stadium rozwojowego

  1. W celu barwienia immunologicznego zbierz około 20 larw w późnym stadium rozwoju (wędrujących po ścianie i tych o porównywalnej wielkości ciała z pożywienia). Za pomocą kleszczy delikatnie wybierz larwy z fiolki lub butelki i przenieś je do szklanego naczynia z zarodkami wypełnionego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    1. W celu wyizolowania RNA i ilościowego określenia inwazyjności należy zebrać co najmniej 80 larw późnego stadium rozwojowego (wędrujących po ścianie i tych o porównywalnej wielkości ciała z pożywienia). Użyj butelki ze spryskiwaczem, aby wstrzyknąć PBS do butelki na muchy zawierającej larwy, aż powierzchnia zostanie pokryta.
    2. Zmiękcz górne warstwy jedzenia szpatułką i wlej zacier spożywczy zawierający larwy na szalkę Petriego. Za pomocą kleszczy delikatnie wybierz larwy i przenieś je do szklanego naczynia z zarodkami wypełnionego PBS.
  2. Umyj larwy PBS, aż wszystkie resztki pokarmu zostaną usunięte. Sprawdź larwy pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym w powiększeniu od 8 do 16x, aby odrzucić wszystkie "larwy lamparta", które mają losowe plamki GFP dodatnie w całym ciele larwy (Rysunek 2A, 2B i patrz sekcja Dyskusja).
    UWAGA: W przypadku izolacji RNA należy wykonać przedostatni etap płukania w 70% EtOH przez 1 minutę.
  3. Umieścić naczynie zawierające wybrane larwy w PBS na lodzie do momentu rozbioru. Przetwarzaj larwy w ciągu 30 minut, aby uniknąć niepożądanych skutków zimna i głodu.

3. Sekcja larw

  1. Aby wypreparować EAD pod mikroskopem stereoskopowym, użyj jednej pary kleszczy, aby delikatnie docisnąć środkową część larwy do dna szklanego naczynia. Za pomocą drugich kleszczy chwyć haczyki do ust larw i odciągnij je od ciała (ryc. 2C).
    UWAGA: Siła ciągnąca jest często wystarczająca do złamania łodyg wzrokowych łączących parę EAD z płatami mózgowymi. Jeśli mózg lub jego części pozostają przyczepione do EAD, a ich obecność nie jest pożądana do dalszych zastosowań, przetnij łodygi wzrokowe za pomocą dwóch par kleszczy. W przypadku nowotworów inwazyjnych (np. rasV12scrib1) związek między EAD a płatami mózgu staje się z czasem coraz bardziej zaciemniony przez przerost i migrację komórek klonalnych.
    1. Aby przygotować kompleks EAD/mózg z nienaruszonym brzusznym rdzeniem nerwowym (VNC) (ryc. 2D), użyj kleszczy, aby przeciąć larwę w środku ciała. Wyrzuć tylną połowę.
    2. Przytrzymaj przednią połowę ciała larwy między końcami jednego kleszcza, odwróć larwę na lewą stronę, wciskając haczyki w usta końcówką drugiego kleszcza i tocząc po nim naskórek pierwszą parą kleszczy.
  2. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń wszystkie obce tkanki (np. gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita), pozostawiając parę EAD lub kompleks EAD/mózg połączony z haczykami ustnymi. Rozplątać haczyki ust z leżącego nad nimi naskórka. Uwolnij VNC, przecinając wypustki aksonalne rozciągające się na mięśnie ciała i naskórek (ryc. 1B, 2C, 2D).
    UWAGA: Haczyki do ust pozwalają na bezpieczne manipulowanie tkanką za pomocą kleszczy oraz ułatwiają sprawniejsze topienie i łatwe rozpoznanie chusteczki podczas mycia. Wypreparowany EAD zmienia morfologię stosunkowo szybko, gdy nie jest utrwalony w PBS. Ogranicz czas preparacji do 20-30 minut.
  3. Aby przenieść tkankę, pokryj końcówkę mikropipety P20, pipetując pozostałe tusze ciała kilka razy w górę i w dół. Aby przenieść większe kompleksy EAD/mózg, odetnij końcówkę mikropipety P20 nożyczkami.
    UWAGA: Procedura powlekania ma kluczowe znaczenie, aby zapobiec przywieraniu i utracie wypreparowanej tkanki podczas transferu. Zastosowanie mikropipety P20 minimalizuje przenoszenie PBS do roztworu utrwalającego, ograniczając niepożądane rozcieńczenie.
    1. W celu barwienia immunologicznego przenieś wypreparowany EAD do 0,5 ml probówki wypełnionej 400 μl 4% utrwalaczem paraformaldehydu (PFA). Użyj probówki o pojemności 1,5 ml z 1 ml PFA w przypadku większych kompleksów EAD/mózg przeznaczonych do oceny inwazyjności.
      UWAGA: PFA jest wysoce toksyczny. Nosić rękawice i odzież ochronną. Unikać kontaktu ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi.
    2. W celu izolacji RNA przenieś wypreparowany EAD do nowego szklanego naczynia wypełnionego zimnym PBS. Użyj kleszczy, aby oczyścić EAD z pierścienia i gruczołów limfatycznych, aby zminimalizować zanieczyszczenie próbki.
    3. Odłącz EAD od haczyków do ust, przecinając połączenie między tarczami anteny a haczykami do ust za pomocą kleszczy (Rysunek 2E). Aby uniknąć degradacji RNA i artefaktów ekspresji genów, ogranicz czas sekcji do 30 minut. Przejdź do kroku 7.
      UWAGA: Doświadczony badacz może wypreparować około 60 larw w ciągu 30 minut, nie licząc czasu potrzebnego na zebranie larw i umycie. Całkowita wydajność RNA zależy od wielkości EAD, która różni się w zależności od genotypu i etapów rozwoju. Rozbior 80-100 par kontrolnych EAD z larw późnego stadium rozwojowego powinien dać 5-8 μg całkowitego RNA.

4. Utrwalanie, barwienie immunologiczne i montaż

  1. Utrwalać próbki w utrwalaczu PFA przez 25 minut, podczas nutowania w temperaturze pokojowej. Czas utrwalenia można wydłużyć do 60 minut bez zmiany morfologii tkanek i antygenowości białek.
  2. Usunąć utrwalacz i przemyć próbki PBST (PBS z 0,1% Triton X-100) trzy razy przez 10 minut za pomocą nutatora. Użyć wystarczającej objętości PBST na każdy etap płukania (tubka 400 μl/0,5 ml).
    UWAGA: Stałe kompleksy EAD/mózg przeznaczone do oceny inwazyjności nie wymagają barwienia immunologicznego. Sygnał GFP pozostaje dobrze widoczny po fiksacji. Przejdź do kroku 4.4, aby przeprowadzić ostateczną sekcję.
    1. W celu barwienia immunologicznego należy zablokować tkankę w 200 μl roztworu blokującego (PBST z 0,3% BSA) na 20 minut z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
      1. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 100 μl roztworu blokującego przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając. Zapoznaj się z arkuszem danych przeciwciał pierwszorzędowych lub opublikowaną literaturą, aby uzyskać informacje na temat zalecanego rozcieńczania przeciwciał.
        UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych może wymagać optymalizacji.
      2. Po pięciu 10-minutowych płukaniach w PBST wybarwić tkankę fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym, delikatnie wstrząsając przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.
      3. Umyć próbki trzy razy po 10 minut w PBST.
  3. Zastąp PBST 500 μl roztworu barwiącego DAPI. Aby oznaczyć F-aktynę, dodaj falloidynę sprzężoną z barwnikiem fluorescencyjnym do roztworu barwiącego DAPI. Po 15 minutach nutacji w ciemności myj chusteczkę raz przez 10 minut PBST.
    UWAGA: Znakowanie F-aktyną można przeprowadzić niezależnie od barwienia DAPI.
  4. Na ostatnim etapie sekcji przenieś tkankę z powrotem do szklanego naczynia wypełnionego PBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Za pomocą dwóch par kleszczy odetnij haczyki do ust.
    1. Oddziel mózgi, które zostaną użyte do ilościowego określenia inwazyjności, od EAD poprzez przecięcie łodygi wzrokowej, ponieważ przerośnięte EAD może utrudnić analizę.
  5. Umieść kroplę podłoża montażowego (15 μl dla szkiełka nakrywkowego 22 mm x 22 mm) na szkiełku obiektywowym. Za pomocą końcówek kleszczy rozprowadź podłoże cienką warstwą. Przenieść EAD, mózgi lub kompleksy EAD/mózg do podłoża mocującego za pomocą mikropipety P20.
  6. Użyj końcówek kleszczy lub pręta wolframowego, aby rozprowadzić tkankę i wyprostować VNC na szkiełku.
  7. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas montażu, należy najpierw przyłożyć jedną krawędź szkiełka nakrywkowego do podłoża montażowego, a następnie powoli opuścić na podłoże montażowe za pomocą kleszczy. Użyj małych kawałków bibuły filtracyjnej lub chusteczki higienicznej, aby wchłonąć nadmiar materiału montażowego wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: Podłoże montażowe DABCO/Polis (alkohol winylowy) 4-88 twardnieje w temperaturze 4 °C w ciągu godziny. Szkiełka można przechowywać przez wiele miesięcy w temperaturze 4 °C.

5. Obrazowanie konfokalne

  1. Uzyskuj pojedyncze sekcje i stosy konfokalne za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy olejowe 20X, 40X i 60X.
  2. Zapobiegaj nasyceniu pikseli. Użyj tych samych parametrów akwizycji obrazu, w tym rozdzielczości obrazu, mocy wejściowej lasera, wzmocnienia, przesunięcia, uśredniania klatek, rozmiaru kroku w serii Z i zachowaj te ustawienia dla wszystkich genotypów, aby umożliwić porównanie intensywności pikseli między różnymi genotypami 21,22.
    UWAGA: Aby zobrazować kompleks EAD/mózg, wygeneruj maksymalne projekcje i zszyj odpowiednie, sąsiednie obrazy. Aby uzyskać ostateczny obraz przygotowany, użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu końcowego do montażu paneli oraz do regulacji jasności i kontrastu.

6. Kwantyfikacja inwazyjności nowotworów

  1. Zdefiniuj system punktacji, który scharakteryzuje różne poziomy inwazyjności guza, biorąc pod uwagę przestrzenny wzorzec inwazji i ilość komórek GFP-dodatnich rozprzestrzeniających się do mózgu i VNC. Przygotuj arkusze oceny do dokumentacji (rysunek 3A).
  2. Na jednym szkiełku podstawowym zamontować co najmniej 80 nienaruszonych mózgów dla każdego genotypu, używając 40 μl podłoża mocującego na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm.
    1. Aby umożliwić bezstronną ocenę, poproś neutralną stronę o anonimizację slajdów, tak aby procedura punktacji była bezstronna. Oceniaj anonimowe slajdy przez dwóch członków laboratorium niezależnie. Genotypy należy ujawnić dopiero po zakończeniu liczenia.
  3. Oceń stopień złośliwości poprzez ślepą ocenę zamontowanych mózgów pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w zestaw filtrów GFP. Użyj markera, aby oznaczyć mózgi, które zostały już obejrzane, aby uniknąć podwójnego liczenia (Rysunek 3B).
  4. Oblicz odsetek mózgów należących do każdej ze zdefiniowanych kategorii inwazyjnych na genotyp. Określ istotność statystyczną za pomocą testu chi-kwadrat (rysunek 3C).

7. Izolacja RNA, obróbka DNaza i kontrola jakości

UWAGA: Wszystkie odczynniki (roztwory, tworzywa sztuczne) użyte w poniższych krokach powinny być wolne od aktywności RNazy. Zawsze noś rękawice i używaj kaptura chemicznego do pracy z rozpuszczalnikami organicznymi.

  1. Przenieś czysty EAD z powlekaną końcówką do mikropipety P20 do probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Pozwól tkance opaść na dno probówki, ostrożnie usuń PBS i zastąp go 100 μl odczynnikiem do lizy RNA (wystarczającym do 140 EAD).
  3. Lizuj tkankę przez wirowanie. Na tym etapie próbki mogą być głęboko zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przetworzone przy użyciu standardowego protokołu izolacji RNA.
    UWAGA: Próbki podobnych genotypów z wielu rund preparacyjnych można jednorazowo połączyć w odczynniku do lizy RNA.
  4. Wypełnić objętość próbki do 0,9 ml odczynnikiem do lizy RNA. Dodać 0,2 ml chloroformu i energicznie mieszać próbki przez 15-20 sek.
  5. Po 2-3 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieść bezbarwną górną górną fazę wodną zawierającą RNA do świeżej probówki bez zakłócania interfazy. Trzymaj się z dala od interfazy, ponieważ zawiera ona białka i genomowe DNA.
    UWAGA: Odzyskana objętość powinna wynosić około 60% objętości odczynnika do lizy RNA użytego do homogenizacji.
  7. Wytrącić RNA, dodając 0,5 ml alkoholu izopropylowego. Wirować i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  8. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Odrzucić supernatant i przemyć osad RNA jednorazowo 600 μl 75% etanolu. Po krótkim wirowaniu i odwirowaniu (10 000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C) wyrzuć cały etanol i pozostaw osad RNA do wyschnięcia na powietrzu przez 5-10 minut, umieszczając otwartą probówkę na czystej chusteczce.
    UWAGA: Osad RNA może być widoczny jako mały nieprzezroczysty/biały pasek na dnie probówki lub niewidoczny. Pozostałe krople etanolu można ostrożnie usunąć za pomocą końcówki do mikropipet P10.
  10. Rozpuść RNA w 50 μl wody uzdatnionej DEPC, kilkakrotnie przepuszczając roztwór przez końcówkę pipety.
  11. Aby zminimalizować zanieczyszczenie genomowym DNA, należy potraktować całkowite RNA DNazą, dodając 50 μl mieszaniny zawierającej 1 μl DNazy (2 U/μl) i 10 μl 10-krotnego buforu DNazy w wodzie uzdatnionej DEPC. Wiruj i zakręć w dół.
  12. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym przez 30–40 minut. Po inkubacji dodać 100 μl wody uzdatnionej DEPC do każdej próbki.
  13. Aby dezaktywować aktywność enzymatyczną i oczyścić RNA z DNazy, dodać 200 μl roztworu fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1), wirować przez 1 minutę i odwirować próbki przy 10 000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną zawierającą RNA do świeżej probówki. Dodać równą objętość (200 μl) chloroformu, wymieszać i powtórzyć etap wirowania od góry.
  15. Ostrożnie zebrać górną fazę i wytrącić RNA, dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 przygotowanym w DEPCH2Oi 2,5 objętości 100% etanolu. Dokładnie wymieszać przez wirowanie.
    UWAGA: Dodanie 0,5 μl glikogenu (20 μg/μl) do mieszanki strącającej pomaga uwidocznić osad RNA. Aby zminimalizować utratę RNA, należy używać silikonowanych, słabo wiążących probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml.
  16. Wytrącać RNA w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godz.
    UWAGA: Inkubację można przeprowadzić przez noc. Próbki można również umieszczać w temperaturze -80 °C.
  17. Osad RNA przez odwirowanie w stężeniu 10 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Umyć i wysuszyć osad zgodnie z opisem w ppkt 7.9.
  18. Rozpuść RNA w 10-15 μl wody uzdatnionej DEPC. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.
  19. Określić ilość i czystość RNA, mierząc OD przy 230 nm, 260 nm i 280 nm za pomocą spektrofotometru. Obliczyć stężenie RNA, stosując konwencję, że 1 OD przy 260 nm równa się 40 μg/ml RNA.
    UWAGA: Stosunek A260/280 "czystego" RNA wynosi 2,0, podczas gdy stosunek A260/230 powinien mieścić się w zakresie 2,0-2,2. Próbki RNA o stosunku A260/280 między 1,7 a 2,0 nadają się do dalszych zastosowań, takich jak synteza cDNA. W celu przygotowania bibliotek sekwencyjnych mRNA, jakość i ilość RNA powinna być sprawdzana za pomocą zautomatyzowanego systemu elektroforezy. Stosunek 28S/18S powinien wynosić powyżej 1,8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować potencjał techniki eyFLP-MARCM do generowania oznaczonych GFP plam zdefiniowanych genotypów u Drosophila EAD, indukowano trzy typy klonów: (1) kontrola wyrażająca tylko GFP, (2) nowotwory złośliwe wyrażające onkogenną formę małego białka G Ras (RasV12) na tle homozygotycznej utraty genu supresorowego guza (skryba1) oraz (3) przerastające, ale nieinwazyjne klony rasV12scrib1jnkDN, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki generowania mozaik genetycznych u Drosophila należą do najbardziej wyrafinowanych narzędzi do analizy i manipulowania funkcją genów 33. System eyFLP-MARCM okazał się skuteczny i wytrzymały, ponieważ umożliwia indukcję wizualnie oznaczonych, zdefiniowanych genetycznie klonów w sposób ograniczony przestrzennie, tj. w tkankach, w których aktywny jest wzmacniacz bezoczny 9,18. Jest to szczególnie ważne, gdy wiele zmian genetycznych jest połączonych w tych samych komór...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirkowi Bohmannowi, Katji Brückner i Istvanowi Ando za zapasy much i przeciwciała. Dziękujemy Markowi Jindrze i Colinowi Donohoe za komentarze do manuskryptu. Praca ta została wsparta nagrodą Sofja Kovalevskaja Award dla M.U. od Fundacji Alexandra von Humboldta oraz projektem DFG UH243/1-1 dla M.U. od Niemieckiej Fundacji Badawczej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarGewü rzmü hle, Eggenstein, Niemcy00262-0500Przepis na pokarm dla much: Przygotuj 20 l pokarmu na muchy ze 160 g agaru, 360 g drożdży, 200 g mąki sojowej, 1,6 kg żółtej mąki kukurydzianej, 1,2 l ekstraktu słodowego, 300 ml jasnego syropu kukurydzianego, 130 ml kwasu propionowego i 200 ml 15% nipaginy. Pokarm dla much powinien być gotowany przez 1 godzinę w temperaturze 85  °C.
Syrop kukurydzianyGrafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Niemcy01939
Kwas propionowyCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy6026.1
Reforma mąki kukurydzianejKontorGmbH, Zarrentin, Niemcy4010155063948
Ekstrakt słodowyCSM Deutschland GmbH, Brema, Niemcy728985
Mąka sojowaStockmeier Food GmbH, Herford, Niemcy1000246441010
DrożdżeWerner Ramspeck GmbH, Schwabach, Niemcy210099K
Metylo-4-benzoesan / NipaginSigma-Aldrich, Deisenhofen, NiemcyH5501Przygotuj 15% roztwór podstawowy z 70% EtOH
Fiolki z pokarmem dla much DrosophilaKisker Biotech, Steinfurt, Niemcy789008
Zatyczki do fiolekK-TK e.K., Retzstadt, Niemcy1002
Butelki na pokarm dla muchy DrosophilaGreiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy960177
Korki do butelekK-TK e.K., Retzstadt, Niemcy1002 S
Poli(alkohol winylowy) 4-88/[-CH2CHOH-]nSigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy81381Przepis na podłoże montażowe: Rozpuść 6 g poli(alkoholu winylowego) 4-88 w 39  ml Millipore H2O, 6 ml 1 M Tris (pH 8,5) i 12,5 ml glicerolu. Mieszać przez noc w temperaturze 50  ° C i wirówka 20  min przy 5,000 obr./min. Dodaj DABCO do supernatantu, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5%. Przechowuj porcje na poziomie -20  °C.
1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan/ DABCO Sigma-Aldrich, Deisenhofen, NiemcyD2522
Triton X-100Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy9002-93-1
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami/ PBS137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 oraz 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 w Millipore H2O
PBST0,1% Triton X-100 w PBS
Paraformaldehyd / PFASigma-Aldrich, Deisenhofen, Niemcy158127Przepis utrwalacza 4% PFA: Rozpuścić 4  g PFA w 80 ml Millipore H2O na mieszadle magnetycznym podgrzanym do 55  °C. Dodawać kroplami 1 M NaOH, aż wszystkie cząstki PFA się rozpuszczą. Dodać 10 ml 10x PBS i dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 M HCl. Wymieszać w 100 &mikro; l Triton X-100 i napełnić Millipore H2O do 100 ml. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Unikać wielokrotnego rozmrażania. (UWAGA: PFA jest wysoce toksyczny. Przygotuj utrwalacz PFA w dygestorium. Nosić niezależny aparat oddechowy, rękawice i odzież. Unikać kontaktu ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi.)
Albumina surowicy bydlęcej / BSASigma-Aldrich, Deisenhofen, NiemcyA3059Przepis na roztwór blokujący: Rozpuść 0,3% BSA w PBST
Fluorescencyjnie znakowana falloidynaInvitrogen, Karlsruhe, Niemcy, Sondy molekularneA12379, A22283, A22284Roztwór podstawowy falloidyny: Rozpuść proszek (300 U) w 1,5 ml metanolu. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Do barwienia stosować w rozcieńczeniu 1:250 (A12379, A22283) i 1:100 (A22284) w PBST.
Dihydrochlord 4',6-dimidino-2-fenylindoldol/ DAPICarl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy6335Roztwór barwiący DAPI: Przygotować roztwór podstawowy 5 mg/ml w Millipore H2O i przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C. Stosowany w rozcieńczeniu 1:1 000 w PBST.
Mysie przeciwciało anty-H2Kurucz i wsp., 2003Stosowane w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Wielka Brytania715-175-151Stosowane w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze blokującym
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy11295-10
Szklane naczynie na zarodki (30  mm)Thermo Scientific, Schwerte, NiemcyE90
Igły wolframoweFine Science Tools, Heidelberg, Niemcy10130-20
Niklowany uchwyt na szpilkiFine Science Tools, Heidelberg, Niemcy26018-17
Szkiełka mikroskopoweVWR, Darmstadt, Niemcy631-1553
Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm (#1 Menzel-Glä ser)VWR, Darmstadt, Niemcy631-1336
Szkiełka nakrywkowe 24 x 50 mm (0,13-0,16  mm)Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy1076371
Chusteczki precyzyjne Kimtech ScienceThermo Scientific, Schwerte, Niemcy06-677-70
Preparacyjny mikroskop stereoskopowyOlympus, Hamburg, NiemcySZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japonia)
Stereoskop fluorescencyjnyOlympus, Hamburg, NiemcySZX16 (SDF PLAPO 0,8X Japonia) z kamerąCCD DP72Wyposażony w zestaw filtrów wąskopasmowo-przepustowych niebieskich do wzbudzania GFP, innych fluorochromów pobudliwych na niebiesko (filtr wzbudzenia BP460-480 nm, filtr barierowy BA495-540 nm) oraz wąski zielony filtr barierowy wzbudzenia i długoprzepustowego dla RFP i innych fluorochromów pobudliwych na zielono (filtr wzbudzenia BP530-550, filtr barierowy BA575IF). Oprogramowanie: Olympus cellSens Standard 1.11.
Mikroskop konfokalnyOlympus, Hamburg, NiemcyFV1000Wyposażony w odwrócony mikroskop IX81. Cele: 20 razy; UPlan S-Apo (NA 0,85), 40 i razy; UPlanFL (NA 1.30) oraz 60& razy; UPlanApo (NA 1.35). Lasery: Laser UV Dioda LD405 (50  mW), Laser argonowy, wieloliniowy 457/(476)/ 488/515 (40  mW), żółto-zielona dioda laserowa LD560 (15  mW) i czerwoną diodą laserową 635 (20  mW). Oprogramowanie: Fluoview 2.1c Oprogramowanie
Inkubator z chłodzeniem DrosophilaEwald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Niemcy  Butelka Sanyo MIR553
SquirtVWR, Darmstadt, Niemcy215-8105
Mikser nutatorów BD Clay AdamsVWR, Darmstadt, Niemcy15172-203
Cyfrowa wytrząsarka kołysana ELMIVWR, Darmstadt, NiemcyDRS-12
5 PRIME Odczynnik do lizy izol-RNAVWR, Darmstadt, Niemcy2302700Protokół jest kompatybilny z innymi odczynnikami na bazie TRIzolu, np. , TRIreagent firmy Sigma (Cat. Nr.T9424), odczynnik TRIzol firmy Thermofisher (nr kat. 15596).
Pirowęglan dietylu / DEPCSigma-Aldrich, Deisenhofen, NiemcyD5758Rozcieńczyć DEPC 1:1,000 w miliporze H2O, mieszać przez noc i autoklawować.
UltraPure Phenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1)ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy15593-031
ChloroformMerck, Darmstadt, Niemcy102445
TURBO DNaza (2 U/&mikro; l)Thermo Scientific, Schwerte, NiemcyAM2238
Invitrogen UltraPure GlycogenThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy10-814-010
Trójwodny octan soduVWR, Darmstadt, Niemcy27652.232Przygotować 3 M roztwór octanu sodu z DEPC-H2O i dostosować pH do 5,2
2-PropanolMerck, Darmstadt, Niemcy
EtanolMerck, Darmstadt, Niemcy100983Przygotować 75% rozcieńczenie EtOH za pomocą DEPC-H2O.
Spektrofotometr UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000Thermo Scientific, Schwerte, NiemcyND-8000
Mikrowirówka Eppendorf (z chłodzeniem)Thermo Scientific, Schwerte, Niemcy5417R
Experion RNA StdSens Analysis KitBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Niemcy7007103
Zautomatyzowana stacja elektroforezy ExperionBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Niemcy7007010
SuperScript III Reverse TranscriptaseThermo Scientific, Schwerte, Niemcy18080044
Oligo d(T) PrimerIntegrated DNA Technologies, Leuven, BelgiaPrepare 100 µ M roztwory podstawowe w DEPC-H2O i przechowywać w temperaturze -20 ° C
dNTP MieszaninaTakara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, Francja4030Przechowuj porcje po 25 &mikro; l przy -20° C
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Niemcy1855195
iQ SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, Niemcy170-8882
Płytki PCR z twardą skorupą 96-dołkowe, cienkościenneBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, NiemcyHSP9601
Microseal 'B' FilmBio-Rad Laboratories GmbH, Mü nchen, NiemcyMSB1001
rp49 Starter do przoduIntegrated DNA Technologies, Leuven, Belgia5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 Podkład odwrotnyIntegrated DNA Technologies, Leuven, Belgia5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 Starter do przoduZintegrowane technologie DNA, Leuven, Belgia5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
mmp1 Podkład odwrotnyIntegrated DNA Technologies, Leuven, Belgia5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'
109634

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
  2. Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).
  3. Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
  4. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  6. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  7. Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
  8. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  9. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  10. Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
  11. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).
  12. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).
  13. Turkel, N., et al. The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state. PLoS Genet. 9 (7), e1003627(2013).
  14. Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
  15. Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling. Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).
  16. Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling. Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).
  17. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting. Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  18. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127 (4), 851-860 (2000).
  19. Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans. Science. 265 (5173), 785-789 (1994).
  20. Külshammer, E., Uhlirova, M. The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).
  21. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  22. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  23. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).
  24. Külshammer, E., et al. Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy. Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).
  25. Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila. Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).
  26. Chatterjee, N., Bohmann, D. A versatile ΦC31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture. PloS One. 7 (4), e34063(2012).
  27. Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  28. Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
  29. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  30. Andersen, D. S., et al. The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth. Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).
  31. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).
  32. Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).
  33. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).
  34. Mirth, C. K., Shingleton, A. W. Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems. Front Endocrinol. 3 (49), (2012).
  35. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  36. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  37. Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster. Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).
  38. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. del Valle Rodrìguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
  41. Rynes, J., et al. Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis. Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).
  42. Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing. PLoS Genet. 10 (4), e1004287(2014).
  43. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  44. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. (94), (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Imaginal DiscGenetic MosaicsMARCM TechniqueFluorescent MicroscopyConfocal ImagingRNA IsolationTumor InvasivenessJNK SignalingHemocyte InfiltrationMMP1 Expression

Related Articles