Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zielone białko fluorescencyjne (GFP) i jego warianty są szeroko stosowanymi narzędziami do badania lokalizacji białek i dynamiki zdarzeń, takich jak przebudowa cytoszkieletu i transport pęcherzykowy w żywych komórkach. Metodologie ilościowe wykorzystujące chimeryczne fuzje GFP zostały opracowane dla wielu zastosowań; jednak GFP jest nieco odporny na proteolizę, dlatego jego fluorescencja utrzymuje się w lizosomie/wakuoli, co może utrudniać ilościowe określenie transportu ładunku w szlaku endocytarnym. Alternatywna metoda ilościowego określania endocytozy i zdarzeń transportu po endocytarach wykorzystuje superekliptyczną pHluorinę, wrażliwy na pH wariant GFP, który jest wygaszany w środowisku kwaśnym. Chimeryczna fuzja pHluoryny z cytoplazmatycznym ogonem transbłonowych białek ładunkowych powoduje tłumienie fluorescencji po włączeniu ładunku do ciał wielopęcherzykowych (MVB) i dostarczeniu do światła lizosomu/wakuoli. W ten sposób wygaszanie fluorescencji wakuolarnej ułatwia ilościowe określenie endocytozy i wczesnych zdarzeń w szlaku endocytarnym. W artykule opisano metody wykorzystujące ładunki znakowane pHluoryną do ilościowego oznaczania endocytozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a także testy populacyjne z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
Wprowadzenie
Handel pęcherzykowy odgrywa ważną rolę w utrzymaniu tożsamości i funkcji organelli w komórkach eukariotycznych i jest kluczowym mechanizmem regulującym skład białek i błon poszczególnych kompartmentów komórkowych. Na błonie plazmatycznej fuzja pęcherzyków egzocytarnych dostarcza nowe białka i błony na powierzchnię komórki, podczas gdy pęcherzyki generowane przez endocytozę usuwają błonę i białka z powierzchni w celu późniejszego recyklingu lub skierowania do lizosomu. Dlatego endocytoza jest ważna dla pobierania składników odżywczych i odpowiedzi na środowisko zewnątrzkomórkowe. Egzocytoza i endocytoza są zrównoważone, aby regulować powierzchnię błony plazmatycznej i ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Rozwiązania i media
- Przygotuj następujące zapasy, podłoża i płyty:
- Aby przygotować 10x YNB rozpuść 67 g drożdżowej bazy azotowej pozbawionej aminokwasów w 1 L wody. Sterylizować przez filtrację przez filtr nitrocelulozowy 0,22 μm.
- Przygotuj pożywkę YNB używając 1x YNB (z 10x bulionu) z 2% dekstrozą (ze sterylnego 50% w/v bulionu) i 1x mieszanki aminokwasów / składników odżywczych (ze 100x bulionu, patrz krok 1.1.4). W przypadku selekcji plazmidu pomiń poszczególne aminokwasy lub składniki odżywcze w razie potrzeby. W celu indukcji ekspresji Mup1 należy dodatkowo pominąć metioninę w mieszaninie aminokwasów i składników odżywczych.<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Lokalizacja w stanie stacjonarnym i kwantyfikacja konstytutywnie internalizowanego białka cargo endocytowego Ste3
Aby wykazać, że ładunki znakowane pHluoryną mogą być wykorzystywane do kwantyfikacji endocytozy w żywych komórkach, porównano lokalizację chimerycznych fuzji GFP i pHluoryny z cytoplazmatycznym końcem C-terminalnym Ste3, receptora feromonu czynnika a w drożdżach. Ste3 jest receptorem sprzężonym z bia.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zastosowania pHluorin do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w komórkach drożdży wykorzystują ładunki transbłonowe, w których znacznik fluorescencyjny jest połączony z cytoplazmatycznym ogonem białka (ryc. 1A). W przypadku opisanych tutaj testów, ładunki są jasno fluorescencyjne, gdy znacznik pHluorin jest wystawiony na działanie neutralnego środowiska, ale gasną, gdy znacznik pHluorin napotyka warunki kwaśne. W ten sposób ładunek endocytarny znakowany pHluoryną jest łatwo wykrywalny na cytoplaz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Gero Miesenböckowi i Timowi Ryanowi za podzielenie się cDNA pHluorin używanym do generowania odczynników w tym badaniu, Nathanowi Wrightowi, Joannie Poprawski i Lydii Nyasae za doskonałą pomoc techniczną, członkom laboratorium Wendland za pomocne dyskusje, oraz Michaelowi McCaffery'emu i Erin Pryce z Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) za porady i pomoc w mikroskopii i cytometrii przepływowej. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (dla B.W., GM60979) i National Science Foundation (dla B.W., MCB 1024818). K.W. otrzymał częściowe wsparcie z grantu szkoleniowego z National Institutes of Health (T32-GM007231). ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Adenina | Sigma | A8626-25G | Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Służy do przygotowania podłoża płytkowego |
| BD Difco Drożdże Azot Zasada (bez aminokwasów) | BD | 291920 | Służy do przygotowania pożywek płynnych i płytkowych |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Służy do powlekania komory Szkiełka |
| dekstrowe | Fisher | BP350-1 | Służy do przygotowywania pożywek płynnych i płytkowych |
| L-histydyny | Fisher BP382-100 | Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego | |
| L-Leucyna | Acros | 125121000 | Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego |
| L-Lizyna | Fisher | BP386-100 | Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego |
| L-Metioniny | Fisher | BP388-100 | Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego |
| L-Tryptofanu | Fisher | BP395-100 | Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego |
| L-Tyrozyna | Acros | 140641000 | Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8-dołkowy) | Thermo Scientific | 155411 | Zastosowanie do testów kinetycznych i końcowych internalizacji Mup1-pHluorin |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego |
| Mikroskop odwrócony Axiovert 200 | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-apochromatyczny obiektyw zanurzeniowy z olejkiem | Carl Zeiss | powinien mieć wartość 100X, 1.4NA lub nowszy | |
| Aparat Sensicam | Cooke Corporation | powinien mieć 12-bitowy lub wyższy zakres dynamiki | |
| X-Cite 120PC Q Źródło oświetlenia | Oprogramowanie Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Bibliografia
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
