Artykuł metodologiczny

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

DOI:

10.3791/54587

⸱

23 października 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zielone białko fluorescencyjne (GFP) i jego warianty są szeroko stosowanymi narzędziami do badania lokalizacji białek i dynamiki zdarzeń, takich jak przebudowa cytoszkieletu i transport pęcherzykowy w żywych komórkach. Metodologie ilościowe wykorzystujące chimeryczne fuzje GFP zostały opracowane dla wielu zastosowań; jednak GFP jest nieco odporny na proteolizę, dlatego jego fluorescencja utrzymuje się w lizosomie/wakuoli, co może utrudniać ilościowe określenie transportu ładunku w szlaku endocytarnym. Alternatywna metoda ilościowego określania endocytozy i zdarzeń transportu po endocytarach wykorzystuje superekliptyczną pHluorinę, wrażliwy na pH wariant GFP, który jest wygaszany w środowisku kwaśnym. Chimeryczna fuzja pHluoryny z cytoplazmatycznym ogonem transbłonowych białek ładunkowych powoduje tłumienie fluorescencji po włączeniu ładunku do ciał wielopęcherzykowych (MVB) i dostarczeniu do światła lizosomu/wakuoli. W ten sposób wygaszanie fluorescencji wakuolarnej ułatwia ilościowe określenie endocytozy i wczesnych zdarzeń w szlaku endocytarnym. W artykule opisano metody wykorzystujące ładunki znakowane pHluoryną do ilościowego oznaczania endocytozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a także testy populacyjne z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Handel pęcherzykowy odgrywa ważną rolę w utrzymaniu tożsamości i funkcji organelli w komórkach eukariotycznych i jest kluczowym mechanizmem regulującym skład białek i błon poszczególnych kompartmentów komórkowych. Na błonie plazmatycznej fuzja pęcherzyków egzocytarnych dostarcza nowe białka i błony na powierzchnię komórki, podczas gdy pęcherzyki generowane przez endocytozę usuwają błonę i białka z powierzchni w celu późniejszego recyklingu lub skierowania do lizosomu. Dlatego endocytoza jest ważna dla pobierania składników odżywczych i odpowiedzi na środowisko zewnątrzkomórkowe. Egzocytoza i endocytoza są zrównoważone, aby regulować powierzchnię błony plazmatycznej i umożliwić obrót uszkodzonych białek.

Badania na komórkach drożdży i ssaków zidentyfikowały dużą liczbę białek zaangażowanych w endocytozę, a także wiele szlaków endocytarnych, które promują internalizację określonych ładunków lub działają w odpowiedzi na różne warunki środowiskowe. Najlepiej zbadanym szlakiem jest endocytoza za pośrednictwem klatryny (CME), w której klatryna i cytozolowe białka pomocnicze łączą się w strukturę płaszcza, aby ustabilizować powstający pęcherzyk endocytarny. Eksperymenty na pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae dostarczyły kluczowych informacji na temat dynamiki i kolejności rekrutacji wielu białek endocytarnych1-3. Warto zauważyć, że maszyneria CME jest wysoce konserwatywna w drodze ewolucji, tak że większość białek związanych z CME w drożdżach ma ludzkie ortologi; W związku z tym pączkujące drożdże są ważnym narzędziem do zrozumienia mechanizmów endocytozy, które są konserwatywne u wyższych eukariontów. Na przykład badania z użyciem drożdży pączkujących wykazały, że tworzenie i dojrzewanie struktur CME (określanych jako korowe łaty aktynowe u drożdży) obejmuje sekwencyjną rekrutację wielu białek, zaczynając od klatryny i białek adaptorowych wiążących ładunek, a następnie rekrutację dodatkowych białek akcesoryjnych endocytarnych, aktywację polimeryzacji aktyny za pośrednictwem Arp2 / 3 i rekrutację białek zaangażowanych w rozszczepienie pęcherzyków1,2. Rekrutacja białek maszynowych CME do korowych łat aktynowych jest wysoce uporządkowanym i stereotypowym procesem, a dokładna kolejność rekrutacji dla wielu białek została ustalona w odniesieniu do innych składników maszynerii CME. Co ważne, ostatnie badania potwierdziły podobną kolejność rekrutacji białek CME w dołach pokrytych klatryną w komórkach ssaków4.

Oprócz CME, wiele typów komórek posiada jeden lub więcej niezależnych od klatryny szlaków endocytarnych (CIE), które polegają na alternatywnych mechanizmach sprzyjających tworzeniu pęcherzyków i internalizacji z błony plazmatycznej5-7. U drożdży niedawno zidentyfikowaliśmy szlak CIE, który wykorzystuje małą GTPazę Rho1 i jej aktywujący czynnik wymiany nukleotydów guaninowych (GEF), Rom18,9. Rho1 aktywuje forminę Bni1 w celu promowania polimeryzacji aktyny10,11, która jest wymagana w tej postaci endocytozy niezależnej od klatryny u drożdży12. Co więcej, rodzina białek α-aresztyny rekrutuje ligazę ubikwityny Rsp5 w celu promowania ubikwitynacji ładunku i późniejszej internalizacji przez CME13-17, a także promuje internalizację ładunku za pośrednictwem szlaku CIE, prawdopodobnie poprzez bezpośrednią interakcję z białkami zaangażowanymi w CIE18. W komórkach ssaków istnieje również wiele szlaków CIE, w tym szlaki niezależne od klatryny i fagocytarne, które opierają się na ortologu Rho1, RhoA9,19. Rola RhoA w CIE u ssaków jest słabo poznana; w związku z tym badania na pączkujących drożdżach mogą dostarczyć dodatkowych informacji mechanistycznych, które mają zastosowanie do CIE u ssaków.

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń endocytarnych może dostarczyć ważnych informacji na temat ról określonych białek w regulacji endocytozy i może ujawnić wpływ mutacji na internalizację ładunku lub progresję przez szlak endocytarny. W tym celu można wykorzystać metody biochemiczne do monitorowania wychwytu ligandów lub do pomiaru szybkości degradacji białek ładunku endocytarnego. W żywych komórkach fuzja białka zielonej fluorescencji (GFP) i jego wariantów z ładunkami będącymi przedmiotem zainteresowania umożliwia bezpośrednią wizualizację transportu ładunków. Jednak ładunki znakowane GFP mają ograniczone zastosowanie do ilościowego oznaczania endocytozy, ponieważ GFP jest odporny na degradację w lizosomie (lub wakuoli w drożdżach). Co więcej, fluorescencja GFP jest tylko częściowo wrażliwa na zmiany pH i pozostaje wykrywalna w świetle wakuoli20,21. W związku z tym fluorescencja znacznika GFP utrzymuje się w wakuoli długo po degradacji pozostałej części ładunku, a kwantyfikacja intensywności ładunku na podstawie całych komórek może być niedokładna ze względu na długotrwałą fluorescencję GFP w wakuoli.

Aby przezwyciężyć wady wakuolarnej fluorescencji GFP, poprzednio użyliśmy superekliptycznej pHluorin, wrażliwej na pH odmiany GFP, która fluoryzuje jasno przy neutralnym pH, ale traci fluorescencję w kwaśnym środowisku, takim jak światło wakuoli/lizosomu20,22,23. Umieszczenie znacznika pHluorin na ogonie cytoplazmatycznym ładunków endocytarnych umożliwia wizualizację ładunków na błonie plazmatycznej i na wczesnych endosomach, gdzie znacznik pHluorin pozostaje wystawiony na działanie cytoplazmy (ryc. 1A). W miarę dojrzewania wczesnych endosomów, endosomalny kompleks sortujący wymagany do transportu (ESCRT) pakuje zlokalizowane na powierzchni ładunki w pęcherzyki, które pączkują w świetle endosomu, tworząc ciała wielopęcherzykowe (MVB)24. W przypadku ładunków, które zostały włączone do wewnętrznych pęcherzyków MVB, znacznik pHluorin jest skierowany w stronę światła pęcherzyka. Wewnętrzne pęcherzyki MVB są zakwaszone; w ten sposób ładunki znakowane pHluoryną tracą fluorescencję na wczesnych endosomach, gdy dojrzewają do MVB20. Późniejsze połączenie MVB z wakuolą dostarcza zawartość światła MVB do degradacji, a znaczniki pHluorin pozostają stłumione w kwaśnym środowisku światła wakuoli.

Ten artykuł zawiera szczegółowe opisy ilościowych testów endocytarnych z użyciem ładunków z cytoplazmatycznymi znacznikami pHluorin w drożdżach. Szczepy wykazujące ekspresję ładunków znakowanych pHluoryną mogą być stosowane w testach kinetycznych i/lub końcowych, w zależności od właściwości i zachowania transportowego określonego ładunku. Ponadto niektóre ładunki znakowane pHluoryną są podatne na wysokoprzepustowe metody analizy, w tym cytometrię przepływową. Co ważne, znacznik pHluorin jest wszechstronnym narzędziem do badania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach, umożliwiając ilościowe określenie endocytozy i porównanie funkcji endocytarnej w szczepach typu dzikiego i zmutowanych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rozwiązania i media

  1. Przygotuj następujące zapasy, podłoża i płyty:
    1. Aby przygotować 10x YNB rozpuść 67 g drożdżowej bazy azotowej pozbawionej aminokwasów w 1 L wody. Sterylizować przez filtrację przez filtr nitrocelulozowy 0,22 μm.
    2. Przygotuj pożywkę YNB używając 1x YNB (z 10x bulionu) z 2% dekstrozą (ze sterylnego 50% w/v bulionu) i 1x mieszanki aminokwasów / składników odżywczych (ze 100x bulionu, patrz krok 1.1.4). W przypadku selekcji plazmidu pomiń poszczególne aminokwasy lub składniki odżywcze w razie potrzeby. W celu indukcji ekspresji Mup1 należy dodatkowo pominąć metioninę w mieszaninie aminokwasów i składników odżywczych.
    3. Przygotuj płytki YNB używając 1x YNB (z 10x bulionu), 2% dekstrozy (ze sterylnego 50% w/v bulionu), 0,7 g/L mieszanki aminokwasów/składników odżywczych (patrz krok 1.1.5) i 2,5% agaru. Przygotować podłoże płytkowe przez autoklawowanie 25 g agaru i 0,7 g mieszaniny aminokwasów i składników odżywczych na 860 ml wody. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury 55 °C, a następnie dodać 100 ml 10x YNB i 40 ml 50% glukozy. Wlać talerze (około 30 ml pożywki na 10 cm naczynia), pozostawić pożywkę do zestalenia się w temperaturze pokojowej i przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować 100 x roztwór podstawowy aminokwasów/składników odżywczych (dla płynnego podłoża), rozpuszczając w 100 ml wody dejonizowanej: po 0,1 g L-metioniny, po 0,3 g L-leucyny i L-lizyny oraz po 0,2 g L-histydyny, L-tryptofanu, adeniny i uracylu (inne aminokwasy i składniki odżywcze mogą być włączone w razie potrzeby dla określonych szczepów). W razie potrzeby użyj delikatnego ciepła do rozpuszczenia i wysterylizuj przez filtr nitrocelulozowy 0,45 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. W celu selekcji plazmidu należy w razie potrzeby przygotować roztwory podstawowe pozbawione określonych składników.
    5. Przygotuj mieszaninę aminokwasów i składników odżywczych (na płytki), łącząc następujące elementy: 0,5 g adeniny, 4 g L-leucyny i po 2 g L-histydyny, L-lizyny, L-metioniny, L-tryptofanu, L-tyrozyny i uracylu. Zmiel moździerzem i tłuczkiem i przechowuj w sposób chroniony przed światłem. Do selekcji plazmidów należy w razie potrzeby przygotować mieszaniny pozbawione określonych składników i użyć 0,7 g mieszaniny aminokwasów na litr pożywki płytkowej (patrz krok 1.1.3).
  2. Przygotować szkiełka 8-dołkowe do mikroskopii, pokrywając powierzchnię szkiełka konkanawaliną A (ConA). Do każdej studzienki szkiełka komorowego dodać 25 μl 2 mg/ml ConA rozpuszczonego w wodzie. Za pomocą końcówki pipety rozprowadź ConA na dolnej powierzchni studzienki, a następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 4-8 godzin. Najlepiej używać szkiełek komorowych w ciągu 24 godzin od nałożenia powłoki ConA.
  3. Wygeneruj szczepy drożdży z fuzjami GFP lub pHluorin w ramie z ładunkiem endocytarnym będącym przedmiotem zainteresowania, stosując metodę integracji opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) opisaną w Longtine i wsp. oraz Goldstein i McCusker25,26.
    UWAGA: Plazmidy zawierające kasety znakujące pHluorynę z genami oporności na kanamycynę (KANMX6) i nourseotrycynę (NATMX4) zostały opisane wcześniej20.
    1. Amplifikować kasety GFP lub pHluorin zawierające markery wybieralne ze starterami zawierającymi dodatkowe sekwencje specyficzne dla miejsca integracji genomowej20,25.
    2. Przekształć otrzymany produkt PCR w pożądany szczep drożdży przy użyciu metody octanu litu27.
    3. Wybrać do integracji kasety poprzez hodowanie komórek na płytkach YPD zawierających odpowiedni lek. Aby przygotować płytki, w autoklawie 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu, 0,1 g tryptofanu i 25 g agaru w 960 ml wody. Przed rozlaniem płytek należy pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury 55 °C, a następnie dodać 40 ml 50% glukozy i G418 do końcowego stężenia 200 μg/ml w przypadku selekcji KANMX6 lub nourseotrycynę do końcowego stężenia 100 μg/ml w przypadku selekcji NATMX4.
    4. Potwierdzić integrację znacznika GFP lub pHluorin w poszczególnych koloniach za pomocą PCR i/lub Western blot przy użyciu przeciwciał anty-GFP, a także poprzez wykrycie znakowanego białka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej20,
      UWAGA: Specyficzne szczepy drożdży i plazmidy użyte w tym badaniu są wymienione odpowiednio w tabelach 1 i 2.

2. Test punktu końcowego dla fluorescencji w stanie ustalonym konstytutywnie zinternalizowanego ładunku endocytarnego

  1. Zaszczepić komórki (~ 3 małe kolonie) w 5 ml pożywki YNB pozbawionej aminokwasów lub składników odżywczych, zgodnie z wymaganiami do utrzymania plazmidu (jeśli dotyczy). Hoduj komórki przez 16-24 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym w temperaturze 30 °C, z wytrząsaniem 250 obr./min. Alternatywnie, umieść ~1-2 mm kolonię komórek na płytce YNB pozbawionej aminokwasów lub składników odżywczych do selekcji plazmidów i hoduj komórki przez noc w temperaturze 30 °C.
  2. Zmierzyć gęstość (OD600) każdej nocnej hodowli za pomocą spektrofotometru. Przygotować 5 ml rozcieńczenia o stężeniu 0,35-0,4 OD600/ml w pożywce YNB pozbawionej aminokwasów lub składników odżywczych do utrzymania plazmidu i hodować przez około 3 godziny w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem. Jeśli używasz komórek z prążkami na talerzu, pomiń ten krok i przejdź do kroku 2.4 (patrz poniżej).
  3. Zmierz gęstość (OD600) komórek, która powinna teraz wynosić od 0,6 do 1,0 OD600/ml. Przenieś 1,5 ml kultury do probówki do mikrofuge i osadzaj komórki z prędkością 8 000 obr./min (6 800 x g) przez 2 min. Usuń 1 475 μl supernatantu.
  4. Przynieś komórki do mikroskopu fluorescencyjnego. Przed obrazowaniem każdej próbki należy przygotować szkiełko poprzez ponowne zawieszenie komórek w pozostałym podłożu i umieścić 3 μl zawiesiny komórek pod szkiełkiem nakrywkowym. Alternatywnie, należy przygotować szkiełka z 8-dołkową komorą, jak opisano poniżej w protokole 3, używając pożywki YNB odpowiedniej do selekcji plazmidu. Idealnie, komórki obrazu z soczewką obiektywu olejowego o aperturze numerycznej (NA) 100x, 1,4 lub wyższej, kamerą 12- lub 16-bitową oraz filtrami wzbudzenia/emisji zoptymalizowanymi pod kątem fluorescencji GFP.
    UWAGA: W przypadku korzystania z komórek wyhodowanych przez smugi na płytce, należy przygotować szkiełko, umieszczając 3 μl świeżego podłoża YNB na szkiełku nakrywkowym. Za pomocą końcówki pipety zebrać małą kolonię komórek z płytki, rozproszyć komórki w pożywce YNB i zamontować powstałą zawiesinę na szkiełku podstawowym bezpośrednio przed obrazowaniem.
  5. Zobrazuj 4-6 losowych pól komórek dla każdego warunku, używając tych samych parametrów akwizycji (tj. zestawów filtrów i czasu ekspozycji) dla wszystkich obrazów w eksperymencie.
    UWAGA: Zebranie obrazu jasnego pola lub obrazu DIC dla każdego pola może być pomocne w przypadku komórek, w których sygnał pHluorin jest wygaszany w przedziałach MVB i wakuolarnych.
  6. Określ ilościowo intensywność fluorescencji co najmniej 30-50 komórek dla każdego stanu (patrz protokół 5).

3. Test kinetyczny do ilościowego oznaczania endocytozy ładunków, które podlegają regulowanej endocytozie

  1. Zaszczepić 2-3 kolonie komórek drożdży (około 2 mm średnicy na kolonię) w 5 ml pożywki YNB pozbawionej metioniny i dodatkowych aminokwasów lub składników odżywczych w celu utrzymania selekcji plazmidów. Hoduj kultury przez 16-24 godziny w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.
    UWAGA: W tym artykule protokoły badania regulowanych białek ładunku endocytarnego będą wykorzystywać permeazę metioniny, Mup1. Inne ładunki, które podlegają regulowanej endocytozie, również nadają się do znakowania pHluorin (na przykład permeaza uracylu Fur4, która gromadzi się na błonie plazmatycznej pod nieobecność uracylu i internalizuje się w odpowiedzi na zewnętrznie stosowany uracyl); W odniesieniu do tych ładunków warunki dotyczące podłoża powinny zostać zmodyfikowane w celu odzwierciedlenia szczególnych warunków wyrażenia, indukcji i internalizacji dla tego ładunku.
  2. Zmierz gęstość (OD600) każdej nocnej hodowli około 3 godziny przed obrazowaniem. Przygotować rozcieńczenie 5 ml przy 0,35-0,4 OD600/ml w pożywce YNB pozbawionej metioniny i dodatkowych aminokwasów lub składników odżywczych do utrzymania plazmidu i rosnąć w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.
  3. Wstępnie wyrównać temperaturę 30 °C w komorze środowiskowej mikroskopu lub podgrzewanym stoliku mikroskopu do temperatury 30 °C podczas 3-godzinnej inkubacji zgodnie z krokiem 3.2.
  4. Przenieść 1 ml kultury komórkowej do probówki do mikrofuge, a następnie granulować komórki z prędkością 8 000 obr./min (6 800 x g) przez 2 minuty. Usunąć 975 μl supernatantu.
  5. Przygotować 8-dołkowe szkiełko z dnem wypełnionym ConA do obrazowania (protokół 1.2).
  6. Do każdej studzienki dodać 200 μl pożywki YNB pozbawionej metioniny oraz dodatkowe aminokwasy lub składniki odżywcze do selekcji plazmidów. Zawiesić osad komórkowy z kroku 3.4 w pozostałym supernatancie i wrzucić 2,5 μl zawiesiny komórek do środka każdej studzienki. Rozproszyć komórki na powierzchni studzienki, pipetując w górę iw dół, i pozwól komórkom osiąść na 5-10 minut.
  7. Umieścić szkiełko komory na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym w temperaturze 30 °C (patrz krok 3.3). Zlokalizuj pole komórek za pomocą oświetlenia w jasnym polu.
  8. Dodać 50 μl pożywki YNB zawierającej 100 μg/ml metioniny (wstępnie podgrzanej do 30 °C) do 200 μl pożywki w studzience, aby uzyskać końcowe stężenie metioniny wynoszące 20 μg/ml. Unikać zakłócania pożywki w studzience, aby zapobiec unoszeniu się komórek z dna.
  9. Pozwól komórkom zrównoważyć się przez 2 minuty przed rozpoczęciem obrazowania. Bezpośrednio przed wykonaniem pierwszego zdjęcia ustaw mikroskop na żądaną płaszczyznę ogniskowej (zazwyczaj najlepiej sprawdza się równikowa płaszczyzna ogniskowa).
  10. Rejestruj obrazy GFP i jasnego pola (lub DIC) w odstępach 5-minutowych przez 45-60 minut, używając identycznych parametrów akwizycji dla wszystkich obrazów w szeregu czasowym (na przykład obiektyw zanurzeniowy 100X 1,4 NA i czas akwizycji 500 ms przy użyciu filtra GFP, czas akwizycji 100 ms przy użyciu filtra DIC).
    UWAGA: Jeśli stolik mikroskopu i oprogramowanie do obrazowania nie pozwalają na automatyczną korekcję dryfu płaszczyzny ogniskowej, może być konieczne ręczne ponowne ustawienie ostrości przed każdym punktem czasowym obrazowania. Co więcej, czasy akwizycji będą się różnić w zależności od mikroskopu ze względu na różnice w oświetleniu i filtrach, a optymalne warunki należy określić ręcznie przed rozpoczęciem eksperymentu. Jeżeli stosuje się ładunek endocytarny inny niż Mup1, może być konieczna modyfikacja czasu pozyskania i odstępów między obrazowaniem, a także czasu trwania eksperymentu, aby odzwierciedlić kinetykę internalizacji tego ładunku.
  11. Określ ilościowo intensywność fluorescencji poszczególnych komórek w każdym punkcie czasowym (patrz protokół 5) i wyraź wartości jako procent początkowej intensywności pierwszego obrazu.

4. Test końcowy do oznaczania ilościowego ładunków endocytarnych, które podlegają regulowanej endocytozie

  1. Przygotować komórki do obrazowania zgodnie z opisem w protokole 3 (kroki od 3.1 do 3.6).
  2. Zobrazuj 4-5 losowych pól komórek dla każdego stanu bezpośrednio przed dodaniem metioniny, używając zestawów filtrów jasnego pola i GFP.
  3. Dodać 50 μl pożywki YNB zawierającej 100 μg/ml metioniny (wstępnie podgrzanej do 30 °C) do 200 μl pożywki w studzience, aby uzyskać końcowe stężenie metioniny wynoszące 20 μg/ml. Unikać zakłócania pożywki w studzience, aby zapobiec unoszeniu się komórek z dna.
  4. Wyobraź sobie 4-5 losowych pól komórek 30 minut po dodaniu metioniny, używając tych samych parametrów akwizycji, co dla punktu czasowego 0 min (krok 4.2).
  5. Określ ilościowo intensywność fluorescencji co najmniej 30-50 komórek dla każdego punktu czasowego (patrz protokół 5). Wartości należy wyrazić jako procent Mup1-pHluorin zinternalizowanej po 30 minutach, korzystając ze wzoru: [Średnia intensywność po 0 min - Średnia intensywność po 30 min]/[Średnia intensywność po 0 min] x 100%.
    UWAGA: Możliwe jest jednoczesne wykonanie do ośmiu testów końcowych poprzez rozłożenie czasu rozpoczęcia każdego testu. Tabela 3 zawiera przykładowy przebieg pracy dla ośmiu jednoczesnych testów.

5. Analiza po przejęciu

  1. Eksportuj obrazy z oprogramowania do akwizycji w 16-bitowym formacie pliku z oznaczonym obrazem (format .tif lub .tiff).
    UWAGA: Inne formaty plików również mogą być odpowiednie i najlepiej powinny używać algorytmów kompresji bezstratnej. Obrazy 8-bitowe generalnie nie nadają się do celów kwantyfikacji.
  2. Otwórz pliki za pomocą oprogramowania ImageJ (dostępne bezpłatnie w opcji "Otwórz" w menu "Plik"). Użyj obrazu fluorescencji do oceny ilościowej, a obrazu jasnego pola/DIC jako odniesienia do identyfikacji lokalizacji komórek i wykluczenia martwych komórek (jeśli są obecne), które wydają się ciemniejsze niż żywe komórki, gdy są oglądane przez DIC i są autofluorescencyjne, gdy są oglądane z filtrami wzbudzenia/emisji GFP.
  3. Wykonaj odejmowanie tła na obrazie fluorescencyjnym. W przypadku obrazów z nierównym sygnałem tła użyj algorytmu "Odejmowanie tła" znajdującego się w "Menu Proces". Użyj ustawienia domyślnego (promień toczącej się kuli 50 pikseli), które jest zazwyczaj wystarczające do celów kwantyfikacji.
    UWAGA: Alternatywna metoda odejmowania tła dla obrazów z jednolitym tłem jest opisana w krokach 5.3.1.-5.3.2; Jednak powyższa metoda działa również w przypadku jednolitego tła.
    1. W przypadku obrazów z jednolitym tłem (tj. intensywność tła jest w przybliżeniu stała na wszystkich krawędziach i w środku obrazu), wykonaj ręczne odejmowanie tła. Kliknij przycisk "zaznaczenia odręczne" znajdujący się w głównym oknie ImageJ i wybierz 3-5 losowych regionów na obrazie, które nie zawierają komórek.
    2. Otwórz funkcję "Ustaw pomiary" znajdującą się w menu "Analizuj", wybierz parametr "Średnia wartość szarości" i zmierz wartości intensywności za pomocą funkcji "Zmierz" (znajdującej się również w menu "Analizuj"). Oblicz średnią wartość z 3-5 zmierzonych obszarów i odejmij od wszystkich kolejnych pomiarów na tym obrazie.
  4. W celu ilościowego określenia testów kinetycznych (protokół 3) wygeneruj pojedynczy, ułożony obraz dla szeregu czasowego. Otwórz obrazy fluorescencyjne z każdego punktu czasowego w porządku chronologicznym i wygeneruj stos za pomocą funkcji "Obrazy do ułożenia w stos" (znajdującej się w menu "Obraz", w podmenu Stosy).
  5. Obrysuj komórkę za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego, upewniając się, że obejmuje całą komórkę, ale jak najmniej obszaru poza komórką.
  6. Zmierz następujące parametry: "Obszar, Gęstość zintegrowana" i "Średnia wartość szarości". Wybierz parametry za pomocą funkcji "Ustaw pomiary", znajdującej się w menu "Analizuj".
    UWAGA: Gęstość zintegrowana odpowiada sumie intensywności wszystkich pikseli w wybranym regionie, a średnia wartość szarości odpowiada [Gęstość zintegrowana/obszar], która koryguje wartości intensywności dla rozmiaru komórki.
  7. Otwórz "Menedżera ROI" znajdującego się w menu "Analizuj", w podmenu "Narzędzia". W oknie Menedżera ROI kliknij przycisk "Dodaj", aby wprowadzić podświetlony region jako nowy obszar zainteresowania (ROI).
  8. Powtórz kroki od 5.4 do 5.6 dla pozostałych komórek na obrazie. Wyklucz wszelkie martwe komórki oceniane za pomocą jasnego pola/DIC i fluorescencji (martwe komórki wydają się ciemniejsze na obrazach DIC i mają autofluorescencyjny sygnał cytoplazmatyczny, gdy są oglądane z wzbudzeniem/emisją GFP; patrz rysunek 2F) oraz wszelkie komórki, które dotykają krawędzi obrazu. Zapisz wybrane ROI jako plik .zip, klikając przycisk "Więcej" w oknie "Menedżer ROI" i wyeksportuj wszystkie pomiary do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania do analizy statystycznej.
  9. W celu ilościowego określenia testów kinetycznych (protokół 3) należy nakreślić i zmierzyć komórkę od początkowego punktu czasowego, jak opisano w krokach 5.4 i 5.5. Użyj tego samego zwrotu z inwestycji do pomiaru wszystkich kolejnych punktów czasowych w eksperymencie.
  10. W przypadku testów punktów końcowych (protokoły 2 i 4) zmierz co najmniej 30-50 komórek dla każdego stanu. Wykonaj kwantyfikację dla co najmniej 2-3 obrazów i uwzględnij wszystkie komórki na każdym obrazie, które spełniają kryteria opisane w kroku 5.8 analizy.
  11. Oceń istotność statystyczną między próbkami za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya do analizy post hoc.

6. Analiza populacyjna endocytozy Mup1-pHluorin za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Zaszczepić 2-3 kolonie komórek drożdży (około 2 mm średnicy na kolonię) w 0,5 ml pożywki YNB pozbawionej metioniny i dodatkowych aminokwasów lub składników odżywczych w celu utrzymania selekcji plazmidu. Hoduj komórki w probówkach okrągłodennych o pojemności 5 ml przez 16-24 godziny w temperaturze 30 °C na bębnie rolkowym.
  2. Dodać 1,5 ml pożywki YNB pozbawionej metioniny oraz dodatkowych aminokwasów lub składników odżywczych do utrzymania plazmidu i hodować w temperaturze 30 °C przez dodatkowe 3 godziny na bębnie rolkowym.
  3. Przenieść 1 ml komórek do każdej z dwóch probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml. Dodać 0,25 ml pożywki YNB -Met do pierwszej probówki (warunek -Met) i 0,25 ml pożywki YNB zawierającej 100 μg/ml metioniny do drugiej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie metioniny 20 μg/ml (warunek +Met). Inkubować komórki w temperaturze 30 °C przez 45 minut na bębnie rolkowym.
  4. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, wybierając rozproszenie do przodu (FS) jako miarę wielkości komórki i intensywność fluorescencji Mup1-pHluorin z filtra izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) jako miarę internalizacji ładunku.
  5. Użyj przycisków suwaków, aby dostosować napięcie kanałów FS i FITC, aby zoptymalizować wykrywanie dla zakresu rozmiarów i intensywności fluorescencji używanych komórek drożdży (w tych eksperymentach zastosowano ustawienia 50 V dla FS i 400 V dla FITC).
    UWAGA: Napięcie dla obu kanałów będzie się różnić w zależności od używanego cytometru przepływowego. Ten krok należy wykonać przed lub w trakcie 45-minutowego leczenia metioniną (krok 6.3).
  6. Zmierz FS i intensywność fluorescencji dla 10 000 komórek z każdego stanu, korzystając z ustawienia wysokiego natężenia przepływu. Wygeneruj wykres punktowy FS w zależności od intensywności fluorescencji: kliknij "dodaj wykres", wybierz FITC (oś x) i FS (oś y), a następnie narysuj wykres 1,000 punktów (oprogramowanie wyświetli wartości dla 1,000 komórek, mimo że zmierzono 10,000 komórek).
    UWAGA: Aby uzyskać maksymalną spójność, analizuj komórki 45-50 minut po dodaniu metioniny; W przypadku eksperymentów obejmujących dużą liczbę próbek, dodawanie metioniny należy rozłożyć w czasie, aby uwzględnić czas wymagany do analizy metodą cytometrii przepływowej.
  7. Uwzględnij warunki -Met i +Met dla komórek typu dzikiego (WT) jako kontrolkę. Korzystając z funkcji bramki, przypisz bramkę pionową przy użyciu warunku WT + Met, tak aby około 5% najjaśniejszych komórek przypadało na prawo od bramki. Użyj tego bramkowania dla wszystkich innych warunków w eksperymencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokalizacja w stanie ustalonym i kwantyfikacja konstytutywnie zinternalizowanego białka ładunku endocytarnego Ste3

Aby pokazać, że ładunki oznaczone pHluoryną mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczania endocytozy w żywych komórkach, porównano lokalizację chimerycznych fuzji GFP i pHluorin z cytoplazmatycznym C-końcowym ogonem Ste3, receptorem feromonu czynnika a u drożdży. Ste3 jest receptorem sprzężonym z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowania pHluorin do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w komórkach drożdży wykorzystują ładunki transbłonowe, w których znacznik fluorescencyjny jest połączony z cytoplazmatycznym ogonem białka (ryc. 1A). W przypadku opisanych tutaj testów, ładunki są jasno fluorescencyjne, gdy znacznik pHluorin jest wystawiony na działanie neutralnego środowiska, ale gasną, gdy znacznik pHluorin napotyka warunki kwaśne. W ten sposób ładunek endocytarny znakowany pHluoryną jest łatwo wykrywalny na cytoplaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Gero Miesenböckowi i Timowi Ryanowi za podzielenie się cDNA pHluorin używanym do generowania odczynników w tym badaniu, Nathanowi Wrightowi, Joannie Poprawski i Lydii Nyasae za doskonałą pomoc techniczną, członkom laboratorium Wendland za pomocne dyskusje, oraz Michaelowi McCaffery'emu i Erin Pryce z Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) za porady i pomoc w mikroskopii i cytometrii przepływowej. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (dla B.W., GM60979) i National Science Foundation (dla B.W., MCB 1024818). K.W. otrzymał częściowe wsparcie z grantu szkoleniowego z National Institutes of Health (T32-GM007231). Projekt A.F.O. został wsparty funduszami rozwojowymi z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Duquesne oraz grantem National Science Foundation CAREER 553143.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdeninaSigmaA8626-25GSłuży do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego
Bacto-agarFisherBP1423-2Służy do przygotowania podłoża płytkowego
BD Difco Drożdże Azot Zasada (bez aminokwasów)BD291920Służy do przygotowania pożywek płynnych i płytkowych
Concanavalin ASigmaC5275-5MGSłuży do powlekania komory Szkiełka
dekstroweFisherBP350-1Służy do przygotowywania pożywek płynnych i płytkowych
L-histydynyFisher BP382-100Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego
L-LeucynaAcros125121000Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego
L-LizynaFisherBP386-100Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego
L-MetioninyFisherBP388-100Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego
L-TryptofanuFisherBP395-100Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego
L-TyrozynaAcros140641000Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8-dołkowy)Thermo Scientific155411Zastosowanie do testów kinetycznych i końcowych internalizacji Mup1-pHluorin
UracilSigmaU0750-100GSłuży do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego
Mikroskop odwrócony Axiovert 200Carl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-apochromatyczny obiektyw zanurzeniowy z olejkiemCarl Zeisspowinien mieć wartość 100X, 1.4NA lub nowszy
Aparat SensicamCooke Corporationpowinien mieć 12-bitowy lub wyższy zakres dynamiki
X-Cite 120PC Q Źródło oświetleniaOprogramowanie Excelitas Technologies
Slidebook 5Intelligent Imaging Innovations
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
Obiektyw

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
  3. Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
  4. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).
  5. Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
  6. Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
  7. Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
  8. Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
  9. Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
  10. Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
  11. Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
  12. Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
  13. Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
  14. Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
  15. Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
  16. O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
  17. O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
  18. Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
  19. Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
  20. Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
  21. Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  24. Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
  25. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  26. Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
  27. Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
  28. Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
  29. Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
  30. Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
  31. Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
  32. Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
  33. Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
  34. Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
  35. Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
  36. Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
  37. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
  38. Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
  39. Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
  40. Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
  41. Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
  42. Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
  43. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
  44. Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

pHluorinEndocytosisFluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

Powiązane artykuły