Kwasy nukleinowe są powszechnymi analitami do oceny systemów biologicznych; jednak stronniczość wynikająca z manipulacji enzymatycznych może budzić niepokój. W tym miejscu opisano metodę bezznacznikowego wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą polianiliny. Ta czuła, ekonomiczna technologia czujników może rozróżniać różnice między pojedynczymi nukleotydami między cząsteczkami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykrywanie kwasów nukleinowych jest w centrum technologii diagnostycznych stosowanych w badaniach i klinice. Standardowe podejścia stosowane w tych technologiach opierają się na modyfikacji enzymatycznej, która może wprowadzać odchylenia i artefakty. Kluczowym elementem platform detekcyjnych nowej generacji będzie bezpośrednia detekcja molekularna, co pozwoli uniknąć konieczności amplifikacji lub etykietowania. Zaawansowane nanomateriały mogą zapewnić odpowiednie modalności chemiczne do realizacji czujników bez etykiet. Polimery sprzężone są idealne do wykrywania biologicznego, posiadają właściwości kompatybilne z biomolekułami i wykazują wysoką wrażliwość na zlokalizowane zmiany środowiskowe. W artykule przedstawiono metodę wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą elektroprzewodzącego polimeru polianiliny. Proste oligonukleotydy "sondowe" DNA komplementarne do docelowych kwasów nukleinowych są przyłączane elektrostatycznie do polimeru, tworząc system czujników, który może różnicować różnice między pojedynczymi nukleotydami w cząsteczkach docelowych. Poza specyficznym i bezstronnym charakterem tej technologii, jest ona wysoce opłacalna.
Wprowadzenie
Sprzężone polimery oferują wiele opcji dla czujników molekularnych. Obejmuje to reakcje fluorescencyjne, elektroniczne i kolorymetryczne1. Podjęto wiele wysiłków w celu włączenia sprzężonych polimerów do czujników kwasów nukleinowych. Jednak większość systemów wymaga detekcji wtórnej, co ogranicza możliwości wykrywania2. Niedawno informowaliśmy o platformie czujników opartych na sprzężonym polimerze zbudowanej na polianilinie (PANI), która wykorzystuje właściwości tego polimeru, tworząc system bez etykiet3. PANI jest silnie sprzężonym elektroaktywnie polimerem o właściwościach takich jak fluorescencja i rezystancja, które są odpowiedni....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przetwarzalna synteza PANI
- W kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml rozpuścić całkowicie anilinę (1 ml, 11 mmol) w 60 ml chloroformu. Mieszać przy 600 obr./min przez 5 minut i schłodzić do 0-5 °C z lodem. Zwykle zajmuje to 15-20 minut (rysunek 2A).
- Dodać dodecylobenzenosulfonian sodu (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) do roztworu aniliny w kolbie okrągłodennej, mieszając z prędkością 600 obr./min.
- Rozpuścić nadsiarczan amonu (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) w 20 ml wody i dodawać go kroplami przez 30 minut, aby uniknąć przegrzania reakcji.
- Przeprowadzać reakcję w temperaturze 0-5 °C przez 24 godziny i pozostawić do osią....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 2A przedstawia układ reakcyjny na początku procesu polimeryzacji, i.e., przed dodaniem APS. Tworzenie miceli jest pierwszym etapem procesu reakcji – synteza PANI zachodzi na granicy fazy micelarnej. Rysunek 2B pokazuje mleczną zawiesinę po 5 min. 30 min po dodaniu APS roztwór zmienia kolor na lekko brązowy. Rysunek 2C przedstawia zmianę barwy związaną z tworzeniem się oligomerów. Rysunek 2D pokazuje ciemn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Czujnik kwasów nukleinowych oparty na PANIE wymaga solubilizacji polimeru w wodzie w celu interakcji z DNA i RNA. Dyspersja PANI w wodzie odbywa się za pomocą środków powierzchniowo czynnych, tworząc micele, jak wcześniej opisano8. Oprócz stosowanych tutaj NaDBS do syntezy przetwarzalnego PANI9,10 można również stosować inne anionowe środki powierzchniowo czynne, takie jak ester dodecylowy kwasu 4-sulfoftalowego, niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak etoksylowany nonylofenol lub kationow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Prace były wspierane przez University of Southern Mississippi College of Science and Technology oraz Mississippi College of Science and Technology oraz program Mississippi INBRE (nagroda numer P204M103476 od National Institute of General Medical Science).
Podziękowania
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Anilina | Fisher Naukowy | A7401-500 | ACS, płynne, chłodzone |
| Peroksydisiarczan amonu | Fisher Scientific | A682-500 | ACS, krystaliczne |
| Dodecylobenzenosulfonian sodu | Pfaltz & Bauer | D56340 | 95% solidny |
| Chloroform | Fisher Naukowy | MCX 10601 | ciecz |
| Startery DNA | MWG operon | n/a | niestandardowa sekwencja DNA ~20 Mikropłytka bps |
| Amerykański Naukowiec | 1402-9800 | 96 Cóż, polipropylen, ponieważ nie reaguje z chloroformem | |
| Folia samoprzylepna do mikropłytek | USA Scientific | 2920-0000 | Zmniejsza zanieczyszczenie od studni do studni, rozlewanie próbek i parowanie |
| Szklana osłona mikroskopu | Fisher Scientific | 12-544-D | PANI powlekane na naświetlanym promieniowaniem UV szkle nakrywkowym |
| Środek sieciujący UV | UVP | HL-2000 | Energia: X100 μ J/cm2; Czas: 2 min |
| Piec do hybrydyzacji | VWR | 01014705 T | Temperatura: 400 ° C; z bujaniem przez 15 min |
| Aparatura szklana | Fisher Scientific | Kolba okrągłodenna z trzema szyjkami do reakcji; lejek do zakraplania, korki, skraplacz, rozdzielacz | |
| Mikroskop | Leica Microsystems | Leica IMC S80 | Powiększenie 20x; Pseudo kolor 536 nm; Ekspozycja 86 ms; Zysk 1,0x; Czytnik mikropłytek Gamma 1.6 |
| Urządzenia molekularne | Numer katalogowy: 89429-536 |
Bibliografia
- Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
- Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
