Artykuł metodologiczny

Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny

DOI:

10.3791/54590

⸱

1 listopada 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwasy nukleinowe są powszechnymi analitami do oceny systemów biologicznych; jednak stronniczość wynikająca z manipulacji enzymatycznych może budzić niepokój. W tym miejscu opisano metodę bezznacznikowego wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą polianiliny. Ta czuła, ekonomiczna technologia czujników może rozróżniać różnice między pojedynczymi nukleotydami między cząsteczkami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie kwasów nukleinowych jest w centrum technologii diagnostycznych stosowanych w badaniach i klinice. Standardowe podejścia stosowane w tych technologiach opierają się na modyfikacji enzymatycznej, która może wprowadzać odchylenia i artefakty. Kluczowym elementem platform detekcyjnych nowej generacji będzie bezpośrednia detekcja molekularna, co pozwoli uniknąć konieczności amplifikacji lub etykietowania. Zaawansowane nanomateriały mogą zapewnić odpowiednie modalności chemiczne do realizacji czujników bez etykiet. Polimery sprzężone są idealne do wykrywania biologicznego, posiadają właściwości kompatybilne z biomolekułami i wykazują wysoką wrażliwość na zlokalizowane zmiany środowiskowe. W artykule przedstawiono metodę wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą elektroprzewodzącego polimeru polianiliny. Proste oligonukleotydy "sondowe" DNA komplementarne do docelowych kwasów nukleinowych są przyłączane elektrostatycznie do polimeru, tworząc system czujników, który może różnicować różnice między pojedynczymi nukleotydami w cząsteczkach docelowych. Poza specyficznym i bezstronnym charakterem tej technologii, jest ona wysoce opłacalna.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sprzężone polimery oferują wiele opcji dla czujników molekularnych. Obejmuje to reakcje fluorescencyjne, elektroniczne i kolorymetryczne1. Podjęto wiele wysiłków w celu włączenia sprzężonych polimerów do czujników kwasów nukleinowych. Jednak większość systemów wymaga detekcji wtórnej, co ogranicza możliwości wykrywania2. Niedawno informowaliśmy o platformie czujników opartych na sprzężonym polimerze zbudowanej na polianilinie (PANI), która wykorzystuje właściwości tego polimeru, tworząc system bez etykiet3. PANI jest silnie sprzężonym elektroaktywnie polimerem o właściwościach takich jak fluorescencja i rezystancja, które są odpowiednie do pomiaru układów biologicznych4. Ekscytony w strukturze nie są zlokalizowane, co prowadzi do ruchliwości ładunku dodatniego między podjednostkami monomerycznymi. Zapewnia to elastyczne rusztowanie ładunków dodatnich, które mogą wchodzić w interakcje z ujemnie naładowanym szkieletem DNA5,6. Co ważne, elektrostatycznie przyłączone DNA jest zorientowane w taki sposób, że zasady azotowe mogą uczestniczyć w parowaniu zasad. Asocjacja z DNA zmienia właściwości elektroniczne PANI, efekt, który może być wzmocniony przez promieniowanie UV (ryc. 1)3. Za pomocą tego systemu oligonukleotydy komplementarne do docelowych kwasów nukleinowych mogą być unieruchomione na PANI. Liczne badania wykazały, że po hybrydyzacji elektrostatycznie adsorbowane oligonukleotydy dysocjują od PANI lub innych matryc kationowych z powodu zmian konformacyjnych spowodowanych przejściem na dwuniciową strukturę DNA3,5,7.

W systemie czujników, w którym mocowanie sondy moduluje właściwości sprzężonego polimeru, zdarzenia hybrydyzacji mogą być transdukowane bez etykiet lub enzymatycznej modyfikacji sond lub docelowych kwasów nukleinowych. Polimery sprzężone oferują dużą elastyczność w metodach wykrywania, z których jedną jest fluorescencja. Dzięki monitorowaniu fluorescencji PANI można wykryć stężenia docelowych kwasów nukleinowych już od 10-11 M (10 pM)3. Detekcja jest szybka, zachodzi w ciągu 15 minut od hybrydyzacji i jest specyficzna tam, gdzie można różnicować pojedyncze niedopasowanie w cząsteczce docelowej3.

Produkcja czujników PANI-sensor jest prosta. Można wytworzyć PANI o wysokiej masie cząsteczkowej, która jest dobrze zdyspergowana w wodzie, przy użyciu standardowych procedur syntezy obejmujących monomer aniliny, środek powierzchniowo czynny i kontrolowane dodawanie utleniacza. Wydajność może być bardzo wysoka, a nieprzereagowany utleniacz usuwany przez mycie wodą, co zapewnia brak dalszego wzrostu PANI. Asocjacja sondy PANI-probe zachodzi spontanicznie po zmieszaniu, a tworzenie kompleksu jest wzmocnione przez łagodną ekspozycję na promieniowanie UV. Hybrydyzację można przeprowadzić natychmiast, a zmiany we fluorescencji PANI oznaczyć po krótkiej inkubacji. Prostota tej technologii sprawia, że jest ona łatwo dostępna dla wielu laboratoriów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przetwarzalna synteza PANI

  1. W kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml rozpuścić całkowicie anilinę (1 ml, 11 mmol) w 60 ml chloroformu. Mieszać przy 600 obr./min przez 5 minut i schłodzić do 0-5 °C z lodem. Zwykle zajmuje to 15-20 minut (rysunek 2A).
  2. Dodać dodecylobenzenosulfonian sodu (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) do roztworu aniliny w kolbie okrągłodennej, mieszając z prędkością 600 obr./min.
  3. Rozpuścić nadsiarczan amonu (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) w 20 ml wody i dodawać go kroplami przez 30 minut, aby uniknąć przegrzania reakcji.
  4. Przeprowadzać reakcję w temperaturze 0-5 °C przez 24 godziny i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej przez kolejne 24 godziny.
  5. Obserwuj, że mieszanina reakcyjna początkowo zmienia kolor na mlecznobiały po 15 minutach, następnie ciemnobrązowy po 2 godzinach, a ostatecznie na ciemnozielony po 24 godzinach (rysunek 2B-F).
  6. Przefiltrować roztwór PANI-NaDBS za pomocą lejka Buchnera. Zmieszać z 80 ml chloroformu i 120 ml wody w rozdzielaczu (Rysunek 2G).
  7. Inkubować roztwór przez 24 godziny w temperaturze pokojowej i zebrać ciemnozieloną PANI z rozdzielacza, pozostawiając nieprzereagowane NaDBS i APS w wodnym supernatanicie.

2. Mieszanie sondy PANI i naświetlanie UV

  1. Rozcieńczyć roztwór PANI 10x chloroformem-wodą (1:3 v/v) i zmieszać 200 μl rozcieńczonego PANI z 6,4 μmol oligonukleotydów sondy DNA, delikatnie kołysząc przez 15 minut w probówce do mikrofuge.
  2. Napromieniać roztwór PANI-DNA promieniowaniem UV o stężeniu 1 200 μJ/cm2 w urządzeniu sieciującym przez 2 minuty. Bardzo ważne jest, aby ekspozycja na promieniowanie UV była ograniczona do wskazanej ilości. Przedłużona ekspozycja na promieniowanie UV upośledza zmianę fluorescencji w PANI, prawdopodobnie z powodu kowalencyjnego sieciowania PANI i DNA.
  3. Kompleksy peletów przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 6 minut i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Ponownie wypluj i ponownie zawieś w PBS.

3. Hybrydyzacja sondy PANI-probe

  1. Dodać 8 μl 100 μM komplementarnych oligonukleotydów DNA lub docelowych kwasów nukleinowych do 200 μl kompleksów sondy PANI.
  2. Przeprowadzić hybrydyzację przez kołysanie mieszaniny roztworu przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
  3. Kompleksy PANI osadzać przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 6 minut. Przemyć PBS i ponownie zawiesić w wodzie.

4. Pomiar fluorescencji w stanie ustalonym emisji

  1. Dodać PANI z różnych zabiegów do 96-dołkowej mikropłytki i zmierzyć fluorescencję emisyjną w zakresie 270-850 nm przez wzbudzenie przy 250 nm. Szczyt emisji dla PANI powinien być obserwowany około 500 nm.

5. Pomiar mikroskopii fluorescencyjnej hybrydowego dupleksu

  1. Ułóż warstwę PANI na szkiełku nakrywkowym ze szkła borokrzemianowego i schnij w temperaturze 40 °C przez 48 godzin.
  2. Dodać sondę (8 μl ze 100 μM) na wysuszoną folię PANI i naświetlać ją światłem UV (1 200 μJ/cm2) przez 2 minuty.
  3. Umyj folię sondy PANIE za pomocą PBS i susz w temperaturze 40 °C przez 48 godzin.
  4. Przeprowadzaj hybrydyzację przez 15 minut, dodając docelowe kwasy nukleinowe. Może to być próbka biologiczna lub kontrolny oligonukleotyd docelowy (8 μl ze 100 μM). Następnie wykonaj pranie PBS.
  5. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne w 40-krotnym powiększeniu, z filtrem długoprzepustowym 500 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2A przedstawia przebieg reakcji na początku procesu polimeryzacji, tj. przed dodaniem APS. Tworzenie miceli jest początkowym etapem procesu reakcji - synteza PANI zachodzi na granicy faz micelarnych. Rysunek 2B przedstawia mleczny roztwór: po 5 minutach. 30 minut po dodaniu APS reakcja zmienia kolor na lekko brązowy. Rysunek 2C przedstawia zmianę koloru związaną z powstawaniem oligomerów. Rysunek 2D pokaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czujnik kwasów nukleinowych oparty na PANIE wymaga solubilizacji polimeru w wodzie w celu interakcji z DNA i RNA. Dyspersja PANI w wodzie odbywa się za pomocą środków powierzchniowo czynnych, tworząc micele, jak wcześniej opisano8. Oprócz stosowanych tutaj NaDBS do syntezy przetwarzalnego PANI9,10 można również stosować inne anionowe środki powierzchniowo czynne, takie jak ester dodecylowy kwasu 4-sulfoftalowego, niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak etoksylowany nonylofenol lub kationow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace były wspierane przez University of Southern Mississippi College of Science and Technology oraz Mississippi College of Science and Technology oraz program Mississippi INBRE (nagroda numer P204M103476 od National Institute of General Medical Science).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anilina Fisher Naukowy A7401-500 ACS, płynne, chłodzone
Peroksydisiarczan amonuFisher Scientific A682-500 ACS, krystaliczne
Dodecylobenzenosulfonian soduPfaltz & Bauer D56340 95% solidny
ChloroformFisher Naukowy MCX 10601 ciecz
Startery DNAMWG operonn/aniestandardowa sekwencja DNA ~20  Mikropłytka bps
 Amerykański Naukowiec 1402-9800 96 Cóż, polipropylen, ponieważ nie reaguje z chloroformem
Folia samoprzylepna do mikropłytekUSA Scientific 2920-0000 Zmniejsza zanieczyszczenie od studni do studni, rozlewanie próbek i parowanie
Szklana osłona mikroskopuFisher Scientific 12-544-D PANI powlekane na naświetlanym promieniowaniem UV szkle nakrywkowym
Środek sieciujący UV UVP HL-2000 Energia: X100 μ J/cm2; Czas: 2 min
Piec do hybrydyzacjiVWR01014705 TTemperatura: 400  ° C; z bujaniem przez 15 min
Aparatura szklana Fisher ScientificKolba okrągłodenna z trzema szyjkami do reakcji; lejek do zakraplania, korki, skraplacz, rozdzielacz
MikroskopLeica Microsystems Leica IMC S80Powiększenie 20x; Pseudo kolor 536 nm; Ekspozycja 86 ms; Zysk 1,0x; Czytnik mikropłytek Gamma 1.6
Urządzenia molekularne Numer katalogowy: 89429-536

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
  2. Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
  4. Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).
  5. Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
  6. Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
  7. Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).
  8. Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
  9. John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
  10. El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
  11. Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
  12. Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
  13. Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
  14. Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
  15. Kadashchuk, A., et al. Localized trions in conjugated polymers. Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).
  16. Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
  17. Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Czujnik polianilinowydetekcja kwas w nukleotycznychbiosensor bezetykietowyhybrydyzacja sondy DNApomiar fluorescencjisieciowanie UVsynteza polimeruhybrydyzacja kwas w nukleotycznychmikroskopia fluorescencyjnaprzemywanie przez wirowanie

Powiązane artykuły