Artykuł metodologiczny

Charakterystyka fenotypowa makrofagów z nerki szczura za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/54599

⸱

18 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół analizy fenotypowej i ilościowej makrofagów rezydentnych z nerek szczurów za pomocą cytometrii przepływowej. Powstałe w ten sposób wybarwione komórki mogą być również wykorzystane do innych zastosowań, w tym do sortowania komórek, analizy ekspresji genów lub badań funkcjonalnych, zwiększając w ten sposób informacje uzyskane w modelu eksperymentalnym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje coraz więcej dowodów sugerujących ważną rolę stanu zapalnego, a następnie makrofagów w rozwoju i postępie choroby nerek. Makrofagi to niejednorodne komórki, które są zaangażowane w uszkodzenie nerek. Makrofagi można podzielić na dwa różne fenotypy: klasycznie aktywowane makrofagi (makrofagi M1), które uwalniają cytokiny prozapalne i sprzyjają zwłóknieniu; i alternatywnie aktywowane makrofagi (makrofagi M2), które są związane z funkcjami immunoregulacyjnymi i przebudowy tkanek. Te fenotypy makrofagów muszą być rozróżniane i analizowane w celu określenia ich udziału w uszkodzeniu nerek. Istnieje jednak niewiele badań przedstawiających spójne informacje fenotypowe i funkcjonalne na temat podtypów makrofagów w modelach zapalnych chorób nerek, zwłaszcza u szczurów. Fakt ten może być związany z ograniczonymi markerami makrofagów stosowanymi u szczurów, w przeciwieństwie do myszy. W związku z tym konieczne są nowe strategie, aby w wiarygodny sposób określić ilościowo i scharakteryzować zawartość nerek w tych naciekających komórkach. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje protokół trawienia nerek oraz dalszą analizę fenotypową i ilościową makrofagów z nerek szczurów za pomocą cytometrii przepływowej. Krótko mówiąc, nerki inkubowano z kolagenazą, a całkowite makrofagi zidentyfikowano na podstawie podwójnej obecności CD45 (wspólny antygen leukocytów) i CD68 (marker makrofagów PAN) w żywych komórkach. Następnie nastąpiło barwienie powierzchni CD86 (marker M1) i CD163 (marker M2). Makrofagi otrzewnowe szczurów zastosowano jako kontrolę pozytywną do wykrywania markerów makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej. Nasz protokół skutkował niską śmiertelnością komórkową i umożliwił scharakteryzowanie różnych wewnątrzkomórkowych i powierzchniowych markerów białkowych, ograniczając w ten sposób utratę integralności komórkowej obserwowaną w innych protokołach. Co więcej, procedura ta pozwala na wykorzystanie makrofagów do dalszych technik, w tym m.in. sortowania komórek i badań mRNA czy ekspresji białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba nerek jest globalnym problemem zdrowotnym, o zwiększonej częstości występowania i związanym z podwyższoną zachorowalnością i śmiertelnością1. Jednym z najważniejszych mechanizmów biorących udział w progresji i rozwoju uszkodzenia nerek jest stan zapalny, wywoływany głównie przez makrofagi. Makrofagi odgrywają kluczową rolę w wielu chorobach zapalnych, w tym w zaburzeniach nerek2. W związku z tym odnotowano podwyższoną obecność naciekających makrofagów w biopsjach od pacjentów z ostrym uszkodzeniem nerek (AKI) lub przewlekłą chorobą nerek (PChN)3,4. Ostatnie badania sugerują, że długoterminowy wynik choroby nerek może być kontrolowany przez makrofagi5,6. W odpowiedzi na lokalne mikrośrodowisko makrofagi mogą różnicować się w różne fenotypy, które pełnią różne funkcje biologiczne7. Ustalono dwa dobrze zróżnicowane fenotypy makrofagów: makrofagi aktywowane klasycznie (makrofagi M1) i alternatywnie aktywowane makrofagi (M2)8. Makrofagi M1 sprzyjają stanom zapalnym, podczas gdy makrofagi M2 pełnią rolę przeciwzapalną i biorą udział w naprawie tkanek9. W związku z tym niezbędna jest lepsza wiedza na temat heterogeniczności makrofagów, aby zrozumieć ich regulację i wkład w patologię nerek oraz opracować nowatorskie podejścia terapeutyczne.

Zarówno modele mysie, jak i szczurze były szeroko stosowane do zrozumienia molekularnego i komórkowego mechanizmu związanego z uszkodzeniem nerek10. Istnieją jednak znaczne różnice w różnych markerach stosowanych do identyfikacji fenotypów makrofagów między tymi gryzoniami. W związku z tym kilka mysich markerów, takich jak F4/80 lub Ly6C, nie jest stosowanych u szczurów, co ogranicza ekstrapolację wyników między tymi gatunkami. Co więcej, istnieje ograniczona liczba markerów opisujących fenotypy makrofagów u szczurów, co wyjaśnia rzadkie badania analizujące heterogeniczność makrofagów u tych zwierząt w porównaniu z myszami. Dlatego konieczne są nowe strategie charakterystyki podzbiorów makrofagów, aby zrozumieć rolę makrofagów w modelach chorób nerek u szczurów.

Ten manuskrypt opisuje protokół analizy fenotypowej i ilościowej makrofagów z nerek szczurów za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta może być dalej stosowana w kilku testach, w tym sortowaniu komórek i badaniach ekspresji mRNA lub białek, aby umożliwić dogłębną charakterystykę roli makrofagów w chorobie nerek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został zatwierdzony przez lokalne Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania zgodnie z Dyrektywą Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE i Krajowymi Wytycznymi 53/2013.

1. Przygotowanie odczynników i roztworów

  1. Przygotuj wszystkie odczynniki i roztwory w sterylnych warunkach i użyj pod okapem z przepływem laminarnym. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj bufor barwiący (2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w 1x PBS firmy Dulbecco).
  3. Przygotuj roztwór kolagenazy, dodając 0,5 mg kolagenazy do każdego ml soli fizjologicznej.
  4. Przygotować roztwór znieczulający ketaminy/ksylazyny (2:1 v/v).

2. Perfuzja i ekstrakcja nerek

  1. Znieczulenie szczurów przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (75 mg/12 mg/kg masy ciała). Ostrożnie uszczypnij mały fałd skóry, aby sprawdzić, czy zwierzę jest wystarczająco znieczulone. Następnie zakryj oczy maścią weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Uwaga: W tym teście wykorzystuje się 4-miesięczne szczury Wistar.
  2. Gdy szczur zostanie całkowicie znieczulony, połóż go na stole operacyjnym w pozycji leżącej.
  3. Nałóż 70% etanolu na brzuch.
  4. Wykonaj centralne nacięcie przez skórę brzucha i otrzewną, od łona do klatki piersiowej, aby odsłonić jamy opłucnej i brzusznej.
  5. Wstrzyknąć roztwór soli fizjologicznej (0,9%) do aorty brzusznej w celu perfuzji nerek za pomocą systemu perfuzyjnego, aż cała krew zostanie usunięta z nerek. Przetnij aortę na poziomie brzucha, aby pomóc uwolnić krew.
  6. Usuń obie nerki od szczura, wycinając wnękę nerki (żyła nerkowa, tętnica i moczowód). Aby zdecapsulować nerkę, należy przycisnąć palcami krawędź nerki, ostrożnie oddzielając kapsułkę11.
  7. Umieść nerkę w zrównoważonym roztworze soli Hanksa.

3. Trawienie nerek i zawieszenie komórek

  1. Pokrój połowę nerki nożyczkami na małe kawałki i włóż je do probówki o pojemności 1,5 ml.
    Uwaga: Wszystkie poniższe stężenia oblicza się dla 1 próbki (1/2 nerki szczura).
  2. Dodać 1 ml roztworu kolagenazy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Mieszać przez odwrócenie co 5 minut, aby upewnić się, że roztwór kolagenazy dotrze do całej tkanki.
  3. Zebrać roztwór i przepuścić go przez sitko (40 μm) za pomocą tłoka, a następnie ponownie zawiesić w 10 ml buforu barwiącego.
  4. Wirować przy 400 x g przez 15 min.
  5. Ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu lizującego ACK (chlorek amonu-potasu). Po 1 min 30 s w temperaturze pokojowej dodać 10 ml buforu barwiącego, aby zatrzymać reakcję.
  6. Wirować przy 400 x g przez 10 min.
  7. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu barwiącego (1 ml) i przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka (30 μm).
  8. Policz liczbę komórek za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego na hemocytometrze i dodaj 2 miliony komórek do probówki o pojemności 1,5 ml w celu barwienia.

4. Barwienie komórek i analiza cytometrii przepływowej

  1. Odwirować komórki przy 100 x g przez 5 min.
  2. Zawiesić osad w 100 μl surowicy szczurzej (rozcieńczonej w stosunku 1:100) na 10 minut w temperaturze 4 °C w celu zablokowania receptorów Fc.
  3. Przemyć dodając 1 ml buforu barwiącego i odwirować 100 x g przez 5 min.
  4. Wymieszać przeciwciała do barwienia powierzchni komórek w 100 μl buforu barwiącego dla każdego warunku: CD45 APC-Cy7 (1:100), CD163 A647 (4:100) i roztwór do wykrywania żywych komórek (3:1,000).
  5. Zawiesić osad komórkowy w mieszaninie przeciwciał na 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  6. Przemyć, dodając 1 ml buforu barwiącego i odwirować przy 100 x g przez 5 minut. Powtórzyć ten krok.
  7. Dodać 600 μl roztworu utrwalającego/przepuszczalnego przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  8. Przemyć 2 razy 1 ml buforu do przepuszczania/przemywania i odwirować przy 170 x g przez 5 min.
  9. Dodaj przeciwciało CD68 FITC (35:1,000) do barwienia wewnątrzkomórkowego do 100 μl buforu permeabilizacji/płukania dla każdego stanu.
  10. Zawiesić osad w roztworze przeciwciała CD68 i inkubować przez 50 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  11. Przemyć 1 ml buforu do przepuszczania/przemywania i odwirowywać przy 170 x g przez 5 min.
  12. Zawiesić osad w 100 μl buforu do przemywania permeabilizacji/przemywać, dodać przeciwciało CD86PE (35:1 000) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  13. Przemyć przez dodanie 1 ml buforu do przepuszczania i odwirowywać przy 100 x g przez 5 min.
  14. Ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu do przepuszczania/przemywania i przekazać go do probówki do cytometrii przepływowej.
  15. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Określ barwienie CD45 w żywych komórkach bramkowanych w oknie światła rozproszonego bocznego/światła rozproszonego do przodu (SSC/FSC). W drugim kroku przeanalizuj ekspresję CD86 i CD163 w komórkach CD68 +.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeanalizowaliśmy niejednorodność makrofagów w eksperymentalnym modelu zapalnym uszkodzenia nerek związanego ze zwiększoną obecnością naciekających makrofagów w nerkach. W tym modelu uszkodzenie nerek było indukowane przez podawanie aldosteronu (1 mg-1 kg-1dzień) plus soli (NaCl 1%) w wodzie pitnej przez 3 tygodnie u szczurów rasy Wistar, jak wcześniej opisano12.

Harmonogram naszych eksperymentó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi to heterogenne komórki, które odgrywają ważną rolę w różnych chorobach zapalnych, w tym zaburzeniach nerek. Rośnie zainteresowanie charakterystyką podzbiorów makrofagów w chorobie nerek, ponieważ każda subpopulacja makrofagów przyczynia się w inny sposób do rozwoju uszkodzenia nerek, jak stwierdzono w kłębuszkowym zapaleniu nerek, nefropatii cukrzycowej i raku nerki14-16. We wczesnych stadiach ostrego uszkodzenia nerek obserwuje się dominację makrofagów M1, które sprzyjają martwicy kanalików i zapale...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty od FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 i PI14/00883), Hiszpańskiego Towarzystwa Miażdżycy, Hiszpańskiego Towarzystwa Nefrologicznego i Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) dla Juana Antonio Moreno. FIS/FEDER finansuje PI14/00386 i Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica do Jesús Egido. Fundaciòn conchita rabago do melanii guerrero hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) do Alfonso Rubio Navarro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Okap z przepływem laminarnymSzybszylub równoważny sprzęt
WirówkaHettichLub równoważny sprzęt
Cytometr przepływowy (FACSAria)BD Biosciences
Surowica bydlęcapłodu BioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
KolagenazaSigma-Aldrich12/1/9001
ACK Bufor lizyzującyThermo Fisher ScientificA10492-01
Sitka do cytometrii przepływowejBD Biosciences340626
Sitka do komórek FalconThermo Fisher Scientific352340
Probówki do cytometrii przepływowejFalcon3520525 ml Polistyrenowa probówka okrągłodenna
Probówki wirówkoweCorning centristar430791
Kąpiel wodnaMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 ° C
Roztwór utrwalający/permeabilizacyjny lub bufor permeabilizacyjny/płuczącyBD Biosciences554714
Rompum (ksylazyna)Bayerlub równoważny
Ketalar (Ketamina)PfizerLub równoważny
zrównoważony roztwór soli HanksaSigma-AldrichH8264-500ML
Roztwór soli Braun
Anty-CD45 (klon: OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Rozcieńczony 1:100
Anty-CD68 (klon: ED1) FITCBio-RADMCA341FRozcieńczony 35:1,000
anty-CD86 (klon: 24F) PEBiolegend200307Rozcieńczony 35:1,000
anty-CD163 (klon: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RRozcieńczony 4:100
Żywa/martwa plama Sondy molekularneL34955rozcieńczone w stosunku 3:1,000
622415

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946(2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fenotypowanie makrofag wtrawienie nerekbarwienie CD45 CD68markery CD86 CD163makrofagi nerkowe szczuraklasyfikacja M1 M2barwienie powierzchniowe kom rekkontrola makrofag w otrzewnowychanaliza zapalenia nerek

Powiązane artykuły