Artykuł metodologiczny

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

17.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54601

⸱

2 listopada 2016

1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

W tym artykule

Podsumowanie

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Streszczenie

Dendryty neuronów dopaminergicznych odbierają i przekazują sygnały synaptyczne, wspierają wsteczną propagację potencjału czynnościowego i uwalnianie neuroprzekaźników. Zrozumienie tych podstawowych funkcji rzuci światło na transfer informacji w tych neuronach. Dendrytyczne nagrania patch-clamp dają możliwość bezpośredniego zbadania właściwości elektrycznych dendrytów i leżących pod nimi kanałów jonowych bramkowanych napięciem. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne dla pipet do łatania ze względu na ich małą średnicę. W tym raporcie opisano krok po kroku procedurę zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminergicznych w ostrych wycinkach. Pomiary elektrofizjologiczne są połączone z odtworzeniem morfologii komórki post hoc. Udane eksperymenty polegają na lepszym przygotowaniu plastrów, roztworów i pipet, odpowiednim dostosowaniu optyki i stabilności pipety w kontakcie z zarejestrowaną strukturą. Standardowe zasady zapisu somatycznego patch-clamp są stosowane do dendrytów, ale z łagodniejszym podejściem do pipety. Te wszechstronne techniki można zastosować w celu odpowiedzi na różne pytania dotyczące właściwości pobudliwych dendrytów.

Wprowadzenie

Neurony otrzymują informacje synaptyczne głównie na swoich dendrytach. Pobudzające i hamujące sygnały synaptyczne rozprzestrzeniają się z miejsca ich wytwarzania do miejsca integracji, gdzie potencjały czynnościowe (AP) są wywoływane jako sygnał wyjściowy. Na ich drodze na potencjały synaptyczne wpływa zarówno budowa dendrytów, jak i interakcja między pasywnymi i aktywnymi właściwościami błony. Połączenie tych bardzo zmiennych parametrów poszerza moc obliczeniową neuronów 1,2. Jednak mała średnica dendrytów utrudnia jednak badanie ich właściwości elektrycznych. Ciągły rozwój techniki patch-clamp 3, optyki 4 i udoskonalenie metod przygotowania plastrów 5 w ciągu ostatnich dziesięcioleci umożliwiły zapisy z bardzo cienkich (0,7 - 3 μm Ø) dendrytów 6,7. Metody te były i nadal są powszechnie stosowane do badania pobudliwości dendrytów w różnych neuronach8. Bezpośrednie zapisy dendrytyczne są niezbędne do określenia rozkładu 9-19 i różnic we właściwościach funkcjonalnych 20-22 kanałów jonowych w różnych przedziałach neuronalnych. Dane te są niezbędnym uzupełnieniem rozkładów kanałów jonowych wykrywanych za pomocą immunohistochemii w połączeniu z mikroskopią świetlną i elektronową 23,24. Podwójne zapisy somatodendrytyczne zostały zaimplementowane w celu zbadania propagacji potencjałów czynnościowych 9,13-15,21,22,25-27 i rozprzestrzeniania potencjałów synaptycznych 13,16,18 wzdłuż domeny somatodendrytycznej neuronów, uzyskania szczegółowych modeli pasywnych 28-30 i zbadania czasowej rozdzielczości integracji neuronalnej 31.

Istota (SN) to obszar znajdujący się w śródmózgowiu, zaangażowany w kilka funkcji, takich jak kontrola ruchu, kodowanie nagrody i nawykowe zachowania. Spadek dopaminy spowodowany specyficzną utratą neuronów dopaminergicznych (DA) w SN jest związany z zaburzeniami motorycznymi obserwowanymi u pacjentów cierpiących na chorobę Parkinsona 32. Obwód nikralny składa się z dwóch głównych typów komórek: neuronów dopaminergicznych i GABA-ergicznych. Co ciekawe, neurony te mają kilka specyficznych cech, które odróżniają je od innych neuronów. Akson dużej części neuronów DA i niektórych neuronów GABA pochodzi z miejsca dendrytycznego, co wskazuje, że altówka dendrytyczna jest niejednorodna (dendryty zawierające aksony i pozbawione aksonów) 25,26,33. Morfologia tych neuronów kontrastuje zatem z typową organizacją neuronów, w której przekazywanie informacji odbywa się zgodnie z prawem dynamicznej polaryzacji emitowanym przez Cajala: począwszy od dendrytów, przez somę, aż do aksonu 34. Neurony DA są również znane z tego, że uwalniają dopaminę ze swoich dendrytów 35, generują aktywność pękającą 36 i plastyczność receptora NMDA 37. Analiza tych zjawisk jest nieuchwytna bez bezpośrednich nagrań z miejsca, w którym są one inicjowane. Aby uzyskać wgląd w związek między dokładną lokalizacją i funkcjonalnymi właściwościami kanałów jonowych a ich rolą w pobudliwości dendrytycznej i przekazywaniu informacji w neuronach nikralnych, metodą z wyboru są bezpośrednie zapisy dendrytyczne.

Ten raport opisuje szczegółową procedurę, która może być użyta do uzyskania pojedynczych i podwójnych nagrań patch-clamp z dendrytów neuronów nigralnych i odpowiedniego znakowania biocytyny post hoc. Podstawowe zasady łatania błony somatycznej i dendrytycznej są bardzo podobne. W praktyce jednak nagrania ze stanowisk dendrytycznych wymagają specyficznej optymalizacji w porównaniu do nagrań somatycznych. Udane nagrania dendrytyczne zależą od jakości plastrów, optymalnego dopasowania optyki, delikatnego podejścia pipety krosowej i stabilności zapisów.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne są zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi, Dyrektywami UE dotyczącymi ochrony zwierząt oraz wytycznymi Federacji Europejskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Standardowy sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF; Tabela 1)
    1. Do przygotowania świeżego roztworu należy użyć soli o wysokiej czystości 38 i czystych szklanych zlewek uprzednio przepłukanych podwójnie destylowaną wodą. Do przygotowania wszystkich roztworów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych używaj wysokiej jakości wody podwójnie destylowanej.
    2. Weź zlewkę o pojemności 2 l, aby rozpuścić NaHCO3 w 500 ml wody, a drugą rozpuścić inne sole, aby zapobiec wytrącaniu się jonów dwuwartościowych 39 zgodnie z tabelą 1. Systematycznie czyść szpatułkę wodą podwójnie destylowaną i osusz ją przed zażyciem soli. Użyj mieszadła magnetycznego do homogenizacji rozpuszczenia. Dodać roztwory z obu zlewek do odpowiedniej kolby miarowej i doprowadzić do odpowiedniej objętości.
    3. Upewnij się, że końcowy roztwór zewnątrzkomórkowy jest całkowicie przezroczysty i bez śladów wytrącania się.
    4. Mieszaninę gazów składającą się z 95% O2 i 5% CO2 (gaz karbogeniczny) nanieść za pomocą szklanej świecy mikrofiltracyjnej (Ø 13 mm) 20 - 30 minut przed perfuzją plastrów 38,40. Dokładnie kontroluj osmolarność (2 - 3 kolejne pomiary) ACSF za pomocą osmometru (optymalny zakres: 314 - 325 mOsmol/L). Pozostały roztwór po przygotowaniu przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 dni.
  2. Roztwór do cięcia (sacharoza-ACSF; Tabela 2) 5,13
    1. Przygotuj 3 l świeżego roztworu. Użyj 1 litra do przygotowania plastrów mózgu z jednego zwierzęcia. Pozostały roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 dni.
      UWAGA: Wysokie stężenia Mg2 + i niskie Ca2 + są stosowane w celu zmniejszenia transmisji synaptycznej i zastąpienia niektórych NaCl sacharozą w celu zachowania tkanki 5,40.
  3. Roztwory wewnątrzkomórkowe
    1. Przygotować wcześniej 100 ml roztworu do zapisu z podwójnymi całymi komórkami (Tabela 3).
    2. Dołącz siarczan metylu 13,15,21, aby uzyskać dobre odzyskiwanie morfologii komórek. Dodaj biocytynę (0,1 - 0,4%), aby następnie zbadać morfologię neuronu. Dołącz barwnik fluorescencyjny (np. Alexa 594 lub sulforodamina 101 41), aby śledzić rozszerzanie dendrytów podczas nagrywania (opcjonalnie).
    3. Przygotować wcześniej 100 ml roztworu elektrody do zapisów podłączonych do ogniw (Tabela 4). W tym przypadku roztworem wewnętrznym jest roztwór o wysokiej zawartości K+ przeznaczony do izolowania makroskopowego prądu kationowego aktywowanego hiperpolaryzacją (Ih) i zawiera blokery dla innych kanałów jonowych bramkowanych napięciem.
    4. Roztwory wewnątrzkomórkowe należy przechowywać w 2 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C. Używać nowej porcji dla każdej nowej sesji nagraniowej. Sprawdź dokładnie osmolarność każdej rozmrożonej podwielokrotności za pomocą osmometru. Weź nową podwielokrotność, jeśli osmolarność nie odpowiada wartości początkowej.
    5. Przenieść roztwór z podwielokrotności do strzykawki o pojemności 3 ml, na której umieszczono sterylny filtr strzykawkowy 0,22 μm. Podczas sesji nagraniowej należy trzymać strzykawkę na lodzie, aby ograniczyć degradację zawartych w niej związków (ATP, GTP lub fosfokreatyny).

2. Produkcja i napełnianie pipety z plastrem

  1. Ciągnąc
    1. Użyj poziomego ściągacza elektrod i grubościennych rurek ze szkła borokrzemianowego. W przypadku nagrań z całych komórek i dołączonych do komórek należy użyć średnicy zewnętrznej 2 mm / średnicy wewnętrznej 1 mm. Upewnij się, że szklana rurka jest absolutnie czysta 38.
    2. Jeśli tak nie jest, najpierw zanurz szklane kapilary w rozpuszczalniku organicznym (np. etanolu), a następnie w wodzie podwójnie destylowanej. Krótko podgrzej zakończenia kapilarne za pomocą palnika Bunsena. Alternatywnie można zamówić rurki szklane umyte i podgrzane bezpośrednio u producenta (patrz Lista materiałów).
    3. W przypadku podwójnych zapisów somatodendrytycznych należy upewnić się, że rezystancja pipet somatycznych wynosi od 6 do 10 MΩ 6,11 oraz od 8 do 19 MΩ dla pipet dendrytycznych po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym (tabela 3). Standaryzacja rezystancji pipet dla nagrań podłączonych do komórek do rezystancji 10 MΩ, aby osiągnąć porównywalne wyniki wzdłuż domeny somatodendrytycznej neuronu 16,18,42,43.
    4. Przygotuj świeże pipety przed każdą sesją nagraniową (codziennie) lub bezpośrednio przed łataniem i używaj ich 5 - 8 godzin po ich wyprodukowaniu 39. Pipety należy przechowywać w zakrytym szklanym pojemniku, aby chronić je przed kurzem i zatkaniem końcówki.
  2. polerowanie
    1. Sprawdź i wypoleruj termicznie każdą końcówkę pipety za pomocą mikrokuźni, aby uzyskać lepsze uszczelnienie z membraną. Przed użyciem mikrokuźni rozpuść mały kawałek szkła na platynowym włóknie grzewczym. Codziennie wymieniaj tę szklaną powłokę na włókno platynowe, aby zapewnić stałość (Peter Jonas, komunikacja osobista).
      UWAGA: Pipety używane do nagrań z ogniwami mogą być powlekane przed etapem polerowania termicznego w celu zmniejszenia szumów tła. Powłokę można uzyskać za pomocą środka izolacyjnego, takiego jak stopiony wosk dentystyczny 22,44 lub elastomer silikonowy39.

3. Przygotowanie plastrów mózgu

  1. Używaj zdrowych szczurów Wistar w wieku od 16 do 19 dni. Nie używaj zwierząt niezdrowych lub cierpiących na hipotermię lub odwodnienie. Przed przystąpieniem do przygotowania plastrów należy trzymać zwierzę w bezpiecznym i cichym miejscu. Unikaj przebywania innych zwierząt w pomieszczeniu podczas przygotowywania zwierzęcia. Delikatnie manipuluj zwierzętami.
  2. Wlać sacharozę-ACSF do dwóch zlewek polipropylenowych (PP) o pojemności 400 ml i umieścić je w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 45 minut. Wymieszać roztwór, aby uzyskać jednorodny lodowaty płyn/zamrożony roztwór i umieścić zlewki na lodzie. Roztwór sacharozy-ACSF należy nasycić gazem karbogenicznym za pomocą świecy mikrofiltra (Ø 13 mm) w każdej zlewce PP.
  3. Przygotuj krajalnicę i komorę rezerwową
    1. Używaj wysokiej jakości krajalnicy do tkanek o wyjątkowo niskich wibracjach pionowych 5,38, aby w jak największym stopniu zminimalizować uszkodzenia powierzchownych warstw plastrów. Napraw świeżą i całą żyletkę na krajalnicy.
    2. Używaj nowej żyletki do każdej sesji strzyżenia. Unikaj zginania żyletki. Nie usuwaj filmu tłuszczowego z powierzchni żyletki (Josef Bischofberger, komunikacja osobista).
    3. Jeśli to możliwe, sprawdź wibracje pionowe za pomocą sondy wibracyjnej dostarczonej przez producenta. Alternatywnie użyj niestandardowej sondy wibracyjnej 5. Zmniejsz drgania pionowe ostrza tak, aby były jak najbardziej zbliżone do 0 μm.
    4. Przygotować 150 ml komory rezerwowej 45,46 na plastry, jak pokazano na str. 201 w ref. 39. Wlej standardowy ACSF do komory rezerwowej i umieść go w łaźni wodnej. Zasilić roztwór komory rezerwowej karbogenem za pomocą świecy mikrofiltracyjnej (Ø 6 mm). Upewnij się, że pęcherzyki karbogenu są tak małe, jak to możliwe.
      UWAGA: Buduj nową komorę rezerwową co 2-3 miesiące, aby utrzymać stałą jakość plastrów.
  4. Pokrój plastry
    1. W cichym pomieszczeniu, w którym eksperymentator nie jest niepokojony ani zestresowany, odetnij zwierzę nożyczkami chirurgicznymi (długość 150 mm) na poziomie rdzenia szyjnego.
    2. Przeciąć skórę na czubku głowy zwierzęcia w kierunku od nosa do ogona za pomocą skalpela i usunąć ją na boki. Odetnij czubek czaszki od ogona do nosowej części głowy cienkimi nożyczkami i usuń obie części czaszki z boku. Wyjąć mózg cienką szpatułką i ostrożnie wrzucić go do zlewki PP zawierającej lodowatą (0 - 4 °C) sacharozę-ACSF zrównoważoną karbogenem 38,
      UWAGA: Ta sekwencja kroków musi być wykonana tak szybko, jak to możliwe, ale także skrupulatnie (<<1 min, około 40 s).
    3. Trzymaj mózg w roztworze zlewki PP przez ~ 2 do 5 minut. Dostosuj ciśnienie karbogenu, aby uniknąć ruchów mózgu. Wymień świecę mikrofiltra, jeśli pęcherzyki karbogenu są zbyt duże, na nową.
    4. Umieść mózg na 9 cm szalce Petriego, w której wewnętrzne dno pokryte jest warstwą Sylgarda 38 o grubości ~0,5 cm. Przygotuj tę szalkę Petriego z wyprzedzeniem.
    5. Otocz mózg lodowatą sacharozą-ACSF. Upewnij się, że jakaś faza ciekła roztworu sacharozy ACSF zanurza się w mózgu. W przypadku plastrów koronalnych odetnij przednią część mózgu w płaszczyźnie koronalnej skalpelem lub żyletką. Usuń móżdżek za pomocą cięcia koronalnego.
    6. Nałóż klej cyjanoakrylowy na tackę na próbki (powierzchnia ~1 cm2). Wklej blok mózgu tak, aby część czołowa była skierowana w stronę etapu krojenia. Ostrożnie wlej sacharozę-ACSF na wierzch wklejonego mózgu za pomocą dużego otworu szklanej pipety Pasteura, a następnie powoli zanurz komorę tnącą krajalnicy. Manewruj tacą na próbki tak, aby powierzchnia cięcia (tj. pierwsza tkanka, która uderzy w ostrze) była brzuszną powierzchnią mózgu 40.
    7. Nanosić karbogen za pomocą zakrzywionej szklanej świecy mikrofiltracyjnej (Ø 6 mm) do komory tnącej (opcjonalnie).
    8. Wyreguluj żyletkę pod kątem ~15° w stosunku do płaszczyzny poziomej 5. Wytnij koronalne plastry mózgu o wielkości ~ 500 μm w kierunku ogonowym do nosa przed dotarciem do istoty czarnej. Zmniejsz grubość, aby wyciąć plastry o grubości 300 - 350 μm zawierające interesujący Cię obszar.
    9. Oddziel plastry od bloku tkanki za pomocą bardzo cienkiej igły perfuzyjnej przymocowanej do strzykawki równolegle do krawędzi żyletki. Zgiąć igłę tak, aby między igłą a strzykawką znajdował się kąt 90°. Upewnij się, że nie jest wywierany nacisk na żyletkę podczas wyjmowania plastra z bloku tkanki.
  5. Przechowuj plastry
    1. Przenieść plastry za pomocą największego otworu szklanej pipety Pasteura (przymocowanej do bańki) do komory rezerwowej. Po przeniesieniu wszystkich plastrów do komory rezerwowej (Christoph Schmidt-Hieber, komunikacja osobista) należy doprowadzić temperaturę łaźni wodnej do 34 °C na 0,5 - 1 godzinę.
    2. Po tym okresie wyłącz łaźnię wodną i utrzymuj plastry w temperaturze pokojowej. Wyreguluj ciśnienie karbogenu, aby uniknąć ruchów plastrów w komorze rezerwowej. Trzymaj plasterki przez kolejne 10 do 20 minut przed rozpoczęciem nagrywania.
    3. Wyczyść sprzęt i świece mikrofiltra ostrożnie, ale dokładnie, wodą podwójnie destylowaną pod koniec procedury krojenia.

4. Podwójne zapisy somatyczne i somatodendryczne w neuronach nigralnych i archiwizacji biocytyny

  1. Postępuj zgodnie z opisami montażu zestawu zacisku krosowego dla warstw podanymi w The Axon Guide i w Refs. 39,40,47. Informacje dotyczące bardziej podstawowych aspektów łatania znajdują się w Ref. 48.
  2. Przygotuj komorę nagraniową
    1. Umieścić 1 - 2 ml podwójnie destylowanej wody w komorze nagrywania. Sprawdź, czy nie jest nieszczelny. Umieść komorę nagrywania na przesuwanym stole x-y.
    2. Wprowadzić standardowy ACSF przez nieprzepuszczalny dla tlenu system rurek perfuzyjnych (politetrafluoroetylen) do komory rejestracyjnej. Ustabilizować przepływ perfuzji w komorze z szybkością 4 - 5 ml min-1. Długość rurki łączącej zlewkę zawierającą ACSF z komorą zapisu powinna być jak najkrótsza (1 m).
    3. Wybierz wycinek mózgu z komory rezerwowej i przenieś go do komory zapisu, korzystając z największego otworu szklanej pipety Pasteura. Przykryj plasterek platynowym pierścieniem, aby zakotwiczyć go na dnie komory nagraniowej, jak pokazano na s. 201 w ref. 39. Użyj płaskiego platynowego pierścienia (Ø 1,5 cm) i przyklej do niego równoległe nylonowe nici (rozstaw >2 mm).
  3. Dostosuj i zoptymalizuj optykę
    1. Wizualizacja wycinków za pomocą mikroskopii wideo w podczerwieni (IR) 4,47,49,50. Wyreguluj oświetlenie Köhler 51 i zoptymalizuj optykę kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) 51 lub oświetlenie ukośne (kontrast gradientowy Dodt - DGC) 52,53. Więcej szczegółów na temat tej procedury znajduje się w Refs. Rozdział 40,49.
    2. Sprawdź jakość plasterka. Trzymaj tylko plastry o gładkich i równych powierzchniach, które nie są zbyt mocno skontrastowane i mają tylko małe, rozproszone kratery.
    3. Napełnij 2 świeże i nieużywane pipety plastrowe roztworem wewnątrzkomórkowym (Tabela 3). Za pomocą probówki o pojemności 0,5 ml zawierającej roztwór pipety należy napełnić końcówkę pipety metodą kapilarną. Aby przyspieszyć napełnianie końcówek pipet bez filamentu, należy przyłożyć podciśnienie do końca pipety za pomocą rurki dołączonej do strzykawki.
  4. Umieść pipety nad powierzchnią plastra
    1. Sprawdź obecność powłoki chlorkowej na srebrnych drutach (elektroda referencyjna do kąpieli i elektroda krosowa; szczegółowe informacje można znaleźć w Przewodniku i odnośnikach do systemu Axon. 39,54).
    2. Wkładaj pipety kolejno do uchwytów na pipety i stosuj nadciśnienie (~70 mbar) za pomocą obwodu rurki łączącego uchwyt pipety, kran trójdrożny i manometr 40. Opuścić pipetę do kąpieli komory nagrywającej.
    3. Sprawdź, czy wartość ciśnienia na manometrze jest stała przez ~1 - 2 min. Jeśli ciśnienie spada, sprawdź rurki lub pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym wewnątrz uchwytu pipety.
    4. Umieść końcówkę pipety na środku monitora wideo i upewnij się, że nie jest zasłonięta. Upewnij się, że końcówka pipety nie porusza się podczas wywierania lub zwalniania nacisku na pipetę.
    5. Sprawdź, czy końcówka pipety nie jest dryftowana i czy nie ma drgań, rysując mały krzyżyk na środku monitora dokładnie w miejscu, w którym znajduje się końcówka pipety i obserwuj przez 5 minut możliwe ruchy końcówki.
    6. Zastosuj krok napięcia (5 mV), aby monitorować rezystancję pipety na oscyloskopie. Ustaw potencjał podtrzymania wzmacniacza patch-clamp na 0 mV. Anuluj potencjał przesunięcia pipety w taki sposób, aby prąd pipety DC wskazywał zero na mierniku wzmacniacza 39,51.
    7. Przesuń pipety w dół do plastra i utrzymuj je nad powierzchnią.
  5. Wybierz i załataj neuron długimi dendrytami
    1. W istocie czarnej wybierz zdrowy neuron z długimi dendrytami, który można śledzić na dużą odległość w przybliżeniu w tej samej płaszczyźnie (ryc. 1A i 1B) za pomocą kontrastu gradientowego IR-Dodt (IR-DGC). Wybierz gładki i jednorodny korpus komórki. Należy unikać dwóch silnie kontrastujących komórek na powierzchni wycinka (rysunek 1C i 1D), ponieważ trudno jest się włamać i zachować stabilne warunki nagrywania w czasie (stabilna rezystancja szeregowa). Wybierz neurony, które mają somę 10 - 30 μm pod powierzchnią warstwy.
    2. Przesuń elektrodę somatyczną blisko somy (40 - 50 μm odległości), a elektrodę dendrytyczną blisko dendrytu w tej samej odległości. Użyj 2-krotnego powiększenia (czterokrotny zmieniacz), aby wybrać i załatać część dendrytu. Uzyskaj na monitorze powiększenie bezwzględne 2 100X bez powiększenia (1X) i 5 500X z powiększeniem 2X.
    3. Nieznacznie zmniejszyć ciśnienie pipety somatycznej o 10 mbar. W razie potrzeby wyreguluj ciśnienie w pipetach dendrytycznych i somatycznych, aby uniknąć przemieszczenia struktury komórkowej (somy i dendrytu) w plastrze.
    4. Umieść pipetę dendrytyczną blisko membrany, aby zobaczyć małe wgłębienia. Zwolnij nacisk na końcówkę pipety i załataj dendryt, kontrolując opór pipety. W idealnych warunkach wystarczy bardzo niewielkie ssanie, aby uzyskać dobre uszczelnienie.
    5. Pipetę dendrytyczną należy przechowywać w trybie podłączonym do ogniwa. Przesuń pipetę somatyczną w pobliże błony somatycznej i załataj błonę somatyczną. Upewnij się, że uzyskano wysoką rezystancję uszczelnienia przed pęknięciem błony komórkowej (> 1 GΩ) 39. Nieznacznie odsuń obie pipety od membrany o kilka μm, aby uniknąć deformacji korpusu komórki i dendrytu.
    6. W przypadku obu pipet należy maksymalnie zmniejszyć amplitudę stanów przejściowych pojemności pipety na szczycie kroku prądu, używając impulsu napięciowego o dużym wzmocnieniu i niewielkim filtrowaniu 51 oraz oscyloskopu. Wejdź w tryb całej komórki za pomocą pipety dendrytycznej, a następnie pipety somatycznej.
    7. Wyeliminuj stany przejściowe pojemności całego ogniwa i skompensuj rezystancję szeregową. Monitoruj i dokumentuj opór dostępu na początku eksperymentu i regularnie w jego trakcie. Jeśli rezystancja szeregowa jest zbyt wysoka (>50 MΩ), spróbuj ponownie użyć innej pipety.
    8. Zdjęcia w podczerwieni IR-DGC (Rysunek 1A i 1B) można zbierać za pomocą drukarki graficznej wideo 25, chwytacza klatek lub aparatu cyfrowego przy dużych i małych powiększeniach.
      UWAGA: Obrzęk neuronów podczas zapisu (ryc. 1E i 1F) obserwuje się sporadycznie, ale rzadko, gdy osmolarność i pH roztworów są prawidłowo dostosowane 39.
    9. Uzyskaj podwójne zapisy somatyczne całych komórek (soma - soma) przy użyciu tej samej procedury (ryc. 2A).
  6. Nakładaj kolejno długie (kilkaset ms) narastające kroki prądu depolaryzacyjnego za pomocą pipety somatycznej i dendrytycznej, aby wywołać AP (ryc. 2B, 3C i 3D). Zapisz uzyskany potencjał jednocześnie w pipecie dendrytycznej i somatycznej.
  7. Zbadanie propagacji sztucznych pobudzających potencjałów postsynaptycznych (aEPSP) w neuronach dopaminergicznych
    1. Utwórz przebieg wzbudzającego prądu postsynaptycznego (EPSC) do wstrzyknięcia jako polecenie prądu podczas nagrań z podwójnym prądem cęgowym (rysunki 4A i 4B). Aby to zrobić, zbuduj podwójną funkcję wykładniczą z wartościami amplitudy i przebiegu czasu odpowiadającymi wartościom rzeczywistym zmierzonym dla EPSC w neuronach będących przedmiotem zainteresowania 55. Dokładnie kontroluj częstotliwość próbkowania skonstruowanego EPSC i wstrzykniętego kształtu fali EPSC, aby zachować oryginalny przebieg czasu.
      Uwaga: Przed zastosowaniem kształtu fali w prawdziwym neuronie, przetestuj go za pomocą komórki modelowej.
    2. Sekwencyjnie wstrzykiwać przebieg za pomocą pipety dendrytycznej i somatycznej i jednocześnie rejestrować wynikowe potencjały zarówno dla pipet somatycznych, jak i dendrytycznych. Regularnie sprawdzaj, czy pipety nie są zniekształcone.
  8. Zakończenie nagrywania z neuronu
    1. Zrób zdjęcie IR-DGC w małym powiększeniu (obiektyw: 5X lub 10X), aby udokumentować położenie neuronu w wycinku i elektrodach.
    2. Powoli i delikatnie wyjmuj kolejno pipety dendrytyczne i somatyczne z błony neuronalnej, aby utworzyć plamy na zewnątrz za pomocą obu pipet. Wyjąć pipetę, wykonując sekwencję ruchów bocznych i skierowanych w górę 38. Na początku powinny być krótkie, a następnie stopniowo zwiększać długość. Taka konfiguracja zapisu sprzyja prawidłowemu zamknięciu błony komórkowej.
    3. Monitoruj spadek prądów pojemnościowych (wzrost rezystancji dostępu) w odpowiedzi na impuls napięcia 5 mV w zacisku napięciowym podczas wyjmowania pipety.
    4. Po uszczelnieniu membrany wokół końcówki pipety należy ją całkowicie wyjąć z komory zapisu. Wyjmij obiektyw z wanny. Trzymaj plaster w komorze rejestracyjnej przez 15 - 20 minut w standardowym ACSF, aby umożliwić zrównoważenie biocytyny (z roztworu wewnątrzkomórkowego) w zarejestrowanym neuronie.
    5. Delikatnie przenieś plasterek za pomocą dużego otworu pipety Pasteura do bursztynowej (brązowej) szklanej butelki o pojemności 25 ml zawierającej standardowy ACSF. Zamknąć butelkę nakrętką. Patrz paragraf 6, aby zapoznać się z etapem fiksacji.

5. Nagrania dołączone do komórek

  1. Wybierz neuron z dendrytem rozciągającym się na dużą odległość w tej samej płaszczyźnie. Upewnij się, że interesujący nas dendryt może być śledzony do dobrze zdefiniowanej somy.
  2. Napełnij pipetę z plastrem roztworem elektrody (Tabela 4). Zaprojektuj rozwiązanie rejestrujące interesujący prąd w konfiguracji przyłączonej do komórki, uwzględniając określone środki farmakologiczne w celu zablokowania innych kanałów jonowych.
  3. Załataj dendryt w trybie dołączonym do komórki
    1. Zwizualizuj część dendrytu i podejdź do pipety do kodowania za pomocą manipulatora. Dostosuj ciśnienie na końcówce pipety, sprawdzając manometr (70 - 80 mbar), aby uniknąć przemieszczenia dendrytu. Załataj dendryt zgodnie z opisem w 4.5.4.
    2. Nagraj kilka zdjęć IR-DGC (Rysunek 5A). Staraj się uzyskać jak największą rezystancję uszczelnienia (>1 GΩ 39), najlepiej między 3 a 10 GΩ dla nagrań podłączonych do ogniw 18 (Rysunek 5B). Odsuń pipetę od membrany o kilka μm, aby uniknąć deformacji dendrytu.
    3. Obserwuj prądy czynnościowe w trybie przyłączonym do komórki, odzwierciedlające spontaniczne potencjały czynnościowe neuronów nikralnych. Uzupełnij ACSF blokerami kanałów Ca2+ i Na+ (odpowiednio CdCl2 i TTX), aby stłumić prądy działania.
    4. Zastosuj 2-sekundowy krok napięcia -90 mV od potencjału podtrzymania 0 mV do łatki, aby wywołać Ih (Rysunek 5C). Należy pamiętać, że potencjał pipety i spoczynkowy potencjał membranowy są połączone szeregowo w konfiguracji podłączonej do ogniwa 56. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z przewodnikiem po systemie Axon i ref. 39.
    5. Regularnie sprawdzaj, czy pipeta nie jest znoszona.
    6. Pod koniec nagrania rozerwij łatkę, aby przejść w tryb całej komórki i natychmiast wykonaj odczyt potencjału błony. Wycofać pipetę zgodnie z opisem w sekcjach 4.8.2 i 4.8.3, aby uzyskać łatkę na zewnątrz.
  4. Zapis z odpowiedniej somy w trybie całej komórki
    1. Spójrz wzdłuż dendrytu i zlokalizuj odpowiednią somę. Użyj pipety o wysokiej rezystancji (5 - 10 MΩ) 6,14,57 wypełnionej roztworem wewnątrzkomórkowym na bazie K+ (Tabela 3). Zastosuj krótkie ssanie (podciśnienie) do końcówki pipety, aby rozerwać membranę i przejść w tryb całej komórki.
    2. Sprawdź tożsamość neuronu w zacisku prądowym, stosując długie etapy prądu hiper- i depolaryzującego (ryc. 5D) i pozwól biocytynie dyfundować wzdłuż dendrytów. Zastosuj krótkie kroki prądu depolaryzującego, aby zobrazować przebieg czasu AP.
    3. Po ≤10 minutach wyjąć pipetę w celu uzyskania łatki na zewnątrz, jak opisano w sekcjach 4.8.2 - 4.8.3. Delikatnie przenieś plasterek za pomocą dużego otworu pipety Pasteura do butelki ze szkła oranżowego o pojemności 25 ml zawierającej standardowy ACSF. Zamknąć butelkę nakrętką.
    4. Alternatywnie, najpierw uzyskaj somatyczną całą komórkę za pomocą roztworu pipety zawierającego dodatkowo barwnik fluorescencyjny. Pozwól na dyfuzję barwnika i wybierz część dendrytu 26. Za pomocą drugiej pipety załataj dendryt w trybie dołączonym do ogniwa. Użyj mikroskopu konfokalnego, jeśli jest dostępny, aby poprawić wizualizację znakowanego fluorescencyjnie dendrytu 14,22.
    5. Wykonaj zapisy dendrytyczne w konfiguracji outside-out, alternatywnie lub dodatkowo do nagrań dołączonych do komórki 10,22. Zobacz przykład prądów bramkowanych napięciem zarejestrowanych z łaty zewnętrznej na zewnątrz na rysunku 5E i 5F.

6. Znakowanie biocytyny neuronów nigralnych

  1. Utrwalenie tkanki
    1. Jeśli to możliwe, należy używać oddzielnych pomieszczeń do rejestrowania warstw/przetwarzania histochemicznego38.
    2. Utrwal plastry, zastępując ACSF 4% paraformaldehydem w 0,1 M roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS, pH = 7,4) za pomocą pipety Pasteura. Zawsze używaj świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego (<< 1 tygodniu).
      UWAGA: Używaj odpowiednich rękawic ręcznych i kaptura chemicznego umieszczonego w laboratorium histologicznym do manipulowania paraformaldehydem ze względu na jego toksyczność. Przeczytaj kartę charakterystyki tego niebezpiecznego produktu przed użyciem i sprawdź przepisy dotyczące bezpieczeństwa chemicznego (dyrektywa w sprawie substancji niebezpiecznych (67/548/EWG) Komisji Europejskiej), ponieważ uważa się, że proszek ten wywołuje raka. Inne szczegóły znajdują się w Ref. 58.
    3. Ułóż plastry w temperaturze 4 °C na noc. Należy unikać zanieczyszczenia zestawu zacisków krosowych lub jakiegokolwiek sprzętu używanego do elektrofizjologii paraformaldehydem.
    4. Po utrwaleniu należy zastąpić roztwór utrwalający PBS. Użyj innych pipet Pasteura do usunięcia roztworu utrwalającego i nałożenia PBS. Przechowywać plastry w PBS w temperaturze 4 °C przed dalszą obróbką (1 - 2 tygodnie). W takim przypadku należy wymieniać PBS dwa razy w tygodniu. Używaj zawsze świeżo przygotowanego PBS (<< 1 tygodnia życia).
  2. Barwienie tkanki
    1. Przygotuj 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej do etapów barwienia. Do przenoszenia plastrów używaj czystego sprzętu. Opłucz plastry 3 x 5 min przy użyciu świeżego PBS.
    2. Zastosować Fluoresceinę Avidin DCS (Avidin D, klasa sortera komórek; 1 μL fluoresceiny / ml Triton X-100) i 0,3% Triton X-100 w PBS w temperaturze 4 °C przez noc. Chroń plastry przed światłem przez cały czas barwienia. Jako alternatywę dla fluorescencji, oznacz neurony za pomocą 3,3'-diaminobenzydyny do analizy mikroskopowej światłem lub elektronów 21,58.
      UWAGA: Triton X-100 jest niebezpieczny. Przeczytaj kartę charakterystyki i dyrektywy Komisji UE przed użyciem tej substancji.
    3. Przepłukać 3 x 30 minut PBS, a następnie PB (bufor fosforanowy, aby uniknąć tworzenia się kryształów na powierzchni plastru).
  3. Zamontuj plastry na standardowych szkiełkach podstawowych. Ostrożnie przykryj plastry podłożem do osadzania. Unikaj pęcherzyków powietrza w medium do zatapiania. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe, aby całkowicie przykryć plasterek. Wysusz szkiełka na powietrzu przez noc przed wizualizacją ich pod mikroskopem.
  4. Przechowuj oznaczone plastry w temperaturze 4 °C po wizualizacji. Przydatne sztuczki dotyczące procedur histochemicznych znajdują się w Refs. Lokal mieszkalny 58,59.
  5. Sprzęt używany do histologii i elektrofizjologii należy czyścić oddzielnie. Nie mieszaj ze sobą sprzętu histologicznego i elektrofizjologicznego.

7. Wizualizacja post hoc neuronów wypełnionych biocytyną

  1. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować morfologię odzyskanych neuronów.
    1. Z grubsza zlokalizuj znakowany fluorescencyjnie neuron w plasterku z epifluorescencją. Zbadaj dendrytyczną altanę neuronów i zlokalizuj akson i pęcherzyk aksonalny (2 - 4 μm Ø) za pomocą obiektywu 10x lub 20x. Udokumentuj przebieg aksonu.
    2. Przełącz się na mikroskop konfokalny i wybierz diodę laserową 488 nm, aby wzbudzić fluoresceinę zawartą w znakowanym neuronie. Podążaj za przedłużeniem aksonu i dendrytów w osi z.
    3. Rejestruj kolejne obrazy, aby uzyskać stos z dla całej komórki. Dostosuj rozdzielczość osi z (odległość między kolejnymi obrazami) do 0,5 - 1 μm. Zbieraj obrazy konfokalne komórki przy użyciu małego (obiektyw 10X) i wysokiego (obiektyw 60X, zanurzenie w oleju) powiększenia.
    4. Otwórz plik obrazu neuronu uzyskany za pomocą mikroskopu konfokalnego za pomocą oprogramowania do obrazowania (ImageJ) 60. Porównaj obraz z projekcji z z obrazem IR-DGC na oko, aby zlokalizować dokładne położenie pipet z plastrami podczas zapisu elektrofizjologicznego (rysunki 1, 2A, 3A, 4A, 5A i 5E).
    5. Określ morfometrię znakowanych neuronów: zmierz odległość akson - soma, odległości między pipetami rejestrującymi wzdłuż domeny somatodendrytycznej oraz między pipetą dendrytyczną a aksonem za pomocą funkcji "Zmierz" w ImageJ.
    6. Zrekonstruuj niektóre neurony za pomocą NeuronJ (ImageJ), Imaris29 lub Neuromantic 61.

8. Analiza danych elektrofizjologicznych

  1. Użyj pakietu oprogramowania powiązanego ze wzmacniaczem, aby ogólnie przeanalizować dane (np. Clampfit) lub bezpośrednio innego oprogramowania do analizy danych, takiego jak Stimfit, oprogramowanie open source 62,63, jak w naszej ostatniej publikacji 13 lub na przykład WinWCP.

Wyniki

Opisany powyżej protokół ma na celu ułatwienie gromadzenia danych przy użyciu rejestracji metodą patch-clamp z dendrytów. Technika ta, w połączeniu z histochemią post hoc, pomaga w uzyskaniu wglądu w mechanizmy wielu sygnałów elektrycznych powstających w dendrytach lub rozprzestrzeniających się do ich wnętrza. Bezpośredni dostęp do dendrytów za pomocą pipet patch jest trudny, jednak szczególna uwaga poświęcona kilku aspektom metodologicznym pozwoli zwiększyć skuteczność rejestracji. Badacz posiadający wystarczające doświadczenie w stabilnej rejestracji somatycznej może spodziewać się uzyskania uszczelnień o wysokiej rezystancji (GΩ) i pomyślnego zakończenia eksperymentów w większości prób. Z jednej preparatyki można zebrać od jednej do dwóch wysokiej jakości rejestracji dendrytycznych.

Dostępność wysokiej jakości skrawków mózgu zawierających zdrowe somata i dendryty jest warunkiem wstępnym dostępu do tych subtelnych struktur (Rycina 1). Kryteriami wyboru tych neuronów są gładka i jednorodna powierzchnia w obrębie całej komórki oraz soma i dendryty o niskim kontraście przy obserwacji z optymalnie ustawioną optyką (Rycina 1A oraz 1B). Wybieranie neuronów o zbyt silnym kontraście zazwyczaj prowadzi do niestabilnych rejestracji (Rycina 1C oraz 1C). Należy zatem unikać takich neuronów.

W porównaniu do innych neuronów, dopaminergiczne (DA) neurony istoty czarnej wykazują specyficzne cechy morfologiczne i elektrofizjologiczne. Cechy te, zwykle oceniane za pomocą pojedynczej pipety somatycznej, można zaobserwować również w rejestracjach somatycznych podwójnych (Rycina 2) oraz somatodendrytycznych (Rycina 3). Długie wstrzyknięcia prądu hiperpolaryzującego wywołują prostowanie potencjału błonowego nazywane „sag” (Ryciny 2B i 5D). Akson wywodzi się w większości przypadków z miejsca dendrytycznego, co zidentyfikowano przy użyciu kryteriów komplementarnych 13,25,26, co wskazuje, że przedział dendrytyczny w tych neuronach jest heterogenny (Rycina 3A - 3B). W konsekwencji przedział, w którym jako pierwszy obserwowany jest potencjał czynnościowy (AP), odpowiada przedziałowi, z którego wyłania się akson (Rycina 3C - 3D) 13,25,26. Akson jest zazwyczaj zakończony pęcherzykiem aksonalnym (bleb) powstałym w wyniku przecięcia aksonu podczas krojenia tkanek 64, jednak struktura ta nie jest wykrywana systematycznie.

Wyraźny spadek (sag) obserwowany w neuronach DA istoty czarnej po aktywacji Ih sugeruje wysoką ekspresję podjednostek HCN. Aby określić wpływ Ih na integrację sygnałów synaptycznych, podczas podwójnych rejestracji somatodendrytycznych 55 generowano i wstrzykiwano za pomocą elektrody rejestrującej w dendrycie przebiegi prądów typu synaptycznego (EPSC) (Rysunek 4). Kinetyka tych symulowanych EPSCs opierała się na stałych czasowych narastania i zaniku rzeczywistych spontanicznych EPSCs. Powstały aEPSP rejestrowano za pomocą elektrody somatycznej. Aplikacja do kąpieli blokera Ih ZD 7288 zwiększyła czas trwania aEPSP, co wskazuje na udział Ih w przebiegu czasowym sygnałów synaptycznych (Rysunek 4B). ZD 7288 zniosło również prostowanie potencjału błonowego, potwierdzając, że sag wynika z aktywacji Ih (Rysunek 4C). Wyniki uzyskane przy użyciu symulowanych EPSPs mogą być skorelowane z eksperymentami z wykorzystaniem elektrycznie wywołanych EPSPs 65. Aby zmapować dokładny rozkład kanałów w domenie somatodendrytycznej neuronów DA, zastosowano rejestracje w konfiguracji cell-attached (Rysunek 5). Wysoka rezystancja uszczelnienia (>> 1 GΩ) jest absolutnie niezbędna dla rejestracji cell-attached (Rysunek 5B). W dendrytach neuronów DA Ih aktywuje się powoli przy długich hiperpolaryzujących skokach napięcia, a stan stacjonarny prądu jest osiągany po setkach ms (Rysunek 5C), co wykazano wcześniej 66. Obserwacja ta wskazuje, że kanały HCN wykazujące ekspresję w dendrytach neuronów DA posiadają inne podjednostki w porównaniu do tych w neuronach piramidalnych lub innych typach komórek 10,16,66. Ponieważ rozkład kanałów w przedziale dendrytycznym może być niejednorodny, a sam przedział dendrytyczny jest heterogeniczny, tożsamość dendrytu (dendryt z aksonem lub bez aksonu) ujawnia się poprzez porównanie obrazu IR-DGC z obrazem konfokalnym po barwieniu biocytyną (Rysunek 3A i B). Odtworzenie morfologii komórki jest zatem niezbędne zarówno dla podwójnych rejestracji somatodendrytycznych, jak i dla rejestracji cell-attached poprzez późniejsze somatyczne rejestracje whole-cell.

Obrazy mikroskopowe metodą IR-DGC, komórki w kontraście interferencyjnym z różnicowym, paski skali 10 μm.
Rysunek 1. Wizualizacja somy i dendrytów proksymalnych neuronów dopaminergicznych istoty czarnej za pomocą wideomikroskopii w podczerwieni. (A) Obraz IR-DGC neuronu DA istoty czarnej przedstawiający somę, dendryt proksymalny oraz pipety somatyczną i dendrytyczną. W tym zdrowym neuronie pomyślnie przeprowadzono podwójną rejestrację somatodendrytyczną. Zwróć uwagę na niski kontrast i gładką powierzchnię w całej domenie somatodendrytycznej komórki. (B) Kolejny przykład zdrowego neuronu DA. (C) Neuron DA z bardziej chropowatą i nierówną powierzchnią oraz silniejszym kontrastem. Mimo uzyskania podwójnej rejestracji, stabilność była suboptymalna, a czas trwania rejestracji krótki (~ 15 min) z powodu stopniowego wzrostu oporności dostępowej w obu pipetach. (D) Drugi przykład neuronu DA wykazującego silnie kontrastową somę i dendryt proksymalny. W tym przypadku krótko po przejściu w tryb whole-cell zaobserwowano silny wzrost oporności dostępowej. Próba zmniejszenia oporności dostępowej za pomocą podciśnienia zakończyła się niepowodzeniem. Neurony na panelach C i D mogły zostać uszkodzone podczas procedury krojenia i powinny być pomijane w eksperymentach. (E) Jednoczesna podwójna rejestracja somatyczna w zdrowym neuronie DA na początku rejestracji. (F) Ten sam neuron co na panelu E z obrzękiem ciała komórki po ~17 min. Zwróć uwagę na całkowity brak kontrastu, kulisty wygląd somy oraz obecność dużego jądra, które nie jest widoczne w zdrowych neuronach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat mikroskopii w podczerwieni z kontrastem różnicowym (IR-DGC) i neurofizjologii; aktywność neuronu z przebiegami prądu i napięcia wskazującymi odpowiedzi na stymulację elektryczną.
Rycina 2. Symultaniczne podwójne rejestrowanie somatyczne z neuronu DA. (A) Obraz IR-DGC podczas podwójnego rejestrowania somatycznego z neuronu DA. (B) Hiperpolaryzujące i depolaryzujące wstrzyknięcia prądu o czasie trwania 1 s (-160 do 80 pA, przyrost 80 pA) oraz odpowiadające im zmiany napięcia rejestrowane symultanicznie obiema pipetami patch. Zauważalny jest efekt ugięcia (sag) w przebiegu napięcia przy długim skoku prądu hiperpolaryzującego oraz silna hiperpolaryzacja następcza po potencjale czynnościowym (AP) podczas impulsu prądu depolaryzującego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza sygnalizacji neuronalnej; mikroskopia, znakowanie biocytyną, wykresy elektrofizjologiczne, dendryt-soma.
Rycina 3. Podwójna rejestracja somatodendrytyczna w neuronie DA. (A) Obraz IR-DGC neuronu DA. Odległość między pipetą dendrytyczną a somatyczną wynosi 29 µm. (B) Obraz z projekcją osi Z z mikroskopu konfokalnego neuronu z panelu A, znakowanego awidyną sprzężoną z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Podczas rejestracji neuron został wypełniony biocytyną. Akson wychodził z proksymalnego dendrytu w pobliżu somy, co wskazano strzałką. (C) Symultaniczna podwójna somatodendrytyczna rejestracja napięcia typu whole-cell z neuronu z panelu A. AP zarejestrowany w somie (czarne ślady napięcia) i dendrycie (czerwone ślady napięcia) w odpowiedzi na 1 s skokową iniekcję prądu za pomocą pipety somatycznej (lewo; czarny ślad prądu) i alternatywnie dendrytycznej (prawo; czerwony ślad prądu). (D) Somatyczne i dendrytyczne AP przedstawione w powiększonej skali czasu. Przy iniekcji prądu somatycznej lub dendrytycznej somatyczne AP (czarne) wyprzedzało dendrytyczne AP (czerwone). Opóźnienie między AP w tym neuronie wynosiło odpowiednio 120 µs i 210 µs przy iniekcji prądu somatycznej i dendrytycznej. Opóźnienia mierzono przy połowie maksymalnej amplitudy AP podczas fazy wzrostowej AP. AP jest obserwowany najpierw w przedziale, w pobliżu którego wyłania się akson, co potwierdza wcześniejsze obserwacje 25,26. W tym przypadku rejestracja dendrytyczna jest wykonywana z dendrytu pozbawionego aksonu. Przykład rejestracji z dendrytu posiadającego akson znajduje się w ref. 13 (na ich Ryc. 1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment elektrofizjologiczny; iniekcja dendrytyczna, rejestracja somatyczna, wykres odpowiedzi somy; patch-clamp.
Rysunek 4. Propagacja sztucznych EPSP wzdłuż osi somatodendrytycznej neuronów DA. (A) Obraz IR-DGC neuronu DA. Odległość między pipetą dendrytyczną a somatyczną wynosi 45 µm. Obie pipety patch znajdują się w trybie rejestracji whole-cell current-clamp. (B) Prąd zarejestrowany pipetą dendrytyczną w trybie current-clamp i wykorzystany do generowania sztucznego EPSP (góra). Prąd jest uzyskiwany poprzez iniekcję przebiegu przypominającego EPSC (τrise = 0.6 ms; τdecay = 3 ms; amplituda = 100 pA) za pomocą dendrytycznej pipety rejestrującej 55. Na dole przedstawiono propagowane aEPSP zarejestrowane w somie w warunkach kontrolnych (czarny) oraz po aplikacji do kąpieli blokera Ih ZD7288 (30 µM; ślad czerwony). Każdy ślad napięcia jest średnią z 40 pojedynczych pomiarów. Zauważalny jest znaczny wzrost czasu trwania EPSP w obecności ZD7288, co wskazuje na wkład Ih w przebieg czasowy EPSP. (C) Ślady napięcia zarejestrowane z somy w warunkach kontrolnych (czarny) oraz po aplikacji 30 µM ZD 7288 (czerwony) w odpowiedzi na długi (30 pA; 1 s) hiperpolaryzujący skok prądowy. Zauważalny jest brak prostowania potencjału błony (sag) po zablokowaniu Ih. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment elektrofizjologiczny: rejestracje w konfiguracji voltage clamp dendrytów; schematy przedstawiają dane odpowiedzi prądowej.
Rycina 5. Obecność Ih w dendrytach neuronu DA. (A) Obraz IR-DGC neuronu DA i pipety na dendrycie proksymalnym. (B) Prądy pojemnościowe i prądy upływu podczas skoku napięcia 5 mV w konfiguracji cell-attached. W tym przykładzie rezystancja uszczelnienia wynosiła 5 GΩ. (C) Hiperpolaryzujący skok napięcia (90 mV; góra) z potencjału błonowego 0 mV wywołał powolną aktywację Ih. Ślad prądowy został odwrócony i dopasowany do funkcji pojedynczej wykładniczej, co dało stałą czasową τ = 632 ms. (D) Odpowiedzi napięciowe somy rejestrowanej w konfiguracji whole-cell (panel A) na 1 s hiper- i depolaryzujące impulsy prądowe (-160 do 120 pA, przyrost 40 pA). Somatyczna rejestracja whole-cell została przeprowadzona po rejestracji cell-attached. Zauważalny jest brak potencjałów czynnościowych (APs) ze względu na zewnątrzkomórkową aplikację TTX i Cd2+ w celu stłumienia spontanicznego wyładowywania podczas rejestracji cell-attached. Te blokery napięciowo zależnych prądów Na+ i Ca2+ dodano w celu stłumienia prądów potencjału czynnościowego. Panele A - D pochodzą z tego samego neuronu. (E) Obraz IR-DIC innego neuronu DA i pipety dendrytycznej. (F) Napięciowo zależne prądy aktywowane impulsem testowym do 0 mV po 50 ms prepulsie przy -120 mV w patchu outside-out wyciętym z dendrytu proksymalnego neuronu z panelu E. Potencjał holdingowy -80 mV. Zauważalna jest zależna od czasu inaktywacja prądu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Substancjag/molStężeniena 1 L
NaCl58.443125 mM7.305 g
NaHCO384.00725 mM2.100 g
KCl74.5512.5 mM0.186 g
NaH2PO4137.991.25 mM0.172 g
glukoza198.1725 mM4.95 g
MgCl21 M (roztwór)1 mM1 mL
CaCl21 M (roztwór)2 mM2 mL
Osmolalność: ~ 310 mOsmol/L (zakres optymalny: 314 – 325 mOsmol/L), pH = 7.4

Tabela 1: Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF).

Substancjag/molStężeniedla 1 L
NaCl58.44387 mM5,084 g
NaHCO3384.00725 mM2,1001 g
KCl7.5512,5 mM0,18637 g
NaH2PO4137.991,25 mM0,17248 g
MgCl221 M (roztwór)7 mM7 mL
glukoza198.1710 mM1,9817 g
sacharoza342.2975 mM25,672 g
CaCl221 M (roztwór)0,5 mM0,5 ml
Osmolalność: ~ 326 mOsmol/L, pH = 7,4

Tabela 2: Roztwór sacharozy-ACSF do przygotowania skrawków.

Substancjag/molStężeniena 100 ml
KMeSO4150.2120 mM1,8024 g
KCl74.5620 mM0,14912 g
MgCl221 M (roztwór)2 mM200 µl
Na2ATP551.12 mM0,1102 g
Na2GTP523.2 0,5 mM0,02661 g
Na2-Fosfokreatyna255.15 mM0,1275 g
EGTA380.40,1 mM3,803 mg
Hepes238.3110 mM0,23831 g
Biocytyna1 mg/ml0,1 g
Osmolarność: ~ 302 mOsmol/L, pH = 7,2 skorygowane za pomocą KOH

Tabela 3: Roztwór wewnątrzkomórkowy do rejestracji podwójnej.

Substancjag/molStężeniena 100 mL
KCl74.56120 mM0,8947 g
CaCl221 M (roztwór)2 mM200 µl
MgCl₂21 M (roztwór)1 mM100 µl
HEPES238.3110 mM0.23831
TEA-Cl165.720 mM0,3314 g
4-AP94.115 mM0,04705 g
BaCl22244.261 mM0,02443 g
CdCl22183.320,02 mM0,3666 mg
TTX1 mM200 nM20 µl
Osmolalność: ~ 290 mOsmol/L, skorygowana D-glukozą (Ref. 16); pH = 7,4

Tabela 4: Roztwór do elektrod dla rejestracji w konfiguracji cell-attached.

Dyskusja

W tym raporcie opisano krok po kroku protokół implementacji podwójnych zapisów somatodendrytycznych całych komórek i lokalnych zapisów dendrytycznych. Jest przydatny odpowiednio do określania wpływu kanałów jonowych (tj. Ih) na przebieg w czasie potencjałów postsynaptycznych i mapowania rozmieszczenia kanału jonowego (Ih) wzdłuż domeny somatodendrytycznej neuronów nikralnych DA. Uzyskane pomiary elektrofizjologiczne są łączone z histochemią post hoc w celu odtworzenia morfologii komórki. Procedura została zastosowana do zbadania neuronów DA zlokalizowanych w istocie czarnej, ale można ją uogólnić na sąsiednie neurony GABA nigralne, neurony DA w brzusznym obszarze nakrywki lub inne neurony śródmózgowia. Wszystkie kroki można również wykonać, aby zbadać inne kanały jonowe wyrażone w dendrytach neuronów nikralnych bez istotnych modyfikacji. Wizualizacja post hoc jest szczególnie istotna w przypadku neuronów z dendrytami zawierającymi aksony, takich jak neurony nigralne 25,26, interneurony hipokampa orektowa-pęcherzyka 21 lub niektóre neurony piramidowe CA1 67. Co ciekawe, neurony posiadające tę cechę wydają się być bardziej powszechne niż się powszechnie uważa 67. Analiza morfologiczna ujawnia również dokładne położenie elektrod i aksonu. Wykrywanie tych ostatnich można zoptymalizować poprzez znakowanie białek ulegających ekspresji w początkowym segmencie aksonu (kanały bramkowane napięciem Na+ lub Ankyryna G) za pomocą immunohistochemii 68,69.

Wiarygodność danych zebranych za pomocą zapisów dendrytycznych i późniejszego znakowania neuronów niezmiennie zależy od jakości wycinka. W związku z tym należy dołożyć wszelkich starań, aby zachować żywotność komórek w tkance. Osiąga się to dzięki delikatnemu obchodzeniu się ze zdrowymi zwierzętami, wysokiej jakości narzędziom i odczynnikom, wystarczającemu natlenieniu tkanki i lodowatym temperaturom podczas przygotowywania plastrów. Stabilne warunki zapisu zależą od selekcji zdrowych neuronów. W trybie całej komórki rezystancja szeregowa powinna być początkowo jak najniższa i utrzymywana na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu. Stabilność nagrań jest dodatkowo uzależniona od wysokiej jakości manipulatorów pozbawionych dryfu i wibracji. Zakłócenia te można zmniejszyć, optymalizując stabilność pipety: sprawdzając połączenie z uchwytem pipety i stołem głównym, kontrolując, czy kable mikromanipulatora są luźne, unikając nagłych zmian temperatury lub ruchu stolika oraz sprawdzając mechanizm manipulatora. W przypadku podwójnych zapisów siarczan metylu 13,15,21 został zawarty w roztworze wewnątrzkomórkowym, ale alternatywnie można zastosować glukonian 9,14,25 . Jednak główny anion może zmieniać potencjał błony 70,71 i niektóre prądy zależne od napięcia 72. Roztwór wewnątrzkomórkowy może być uzupełniony o ATP, GTP i fosfokreatynę w celu zachowania fizjologicznych funkcji neuronów. Dodatkowo, dodanie barwnika fluorescencyjnego do roztworu pipety (np. Alexa 594 lub Sulforodamine 101 41) w celu wizualizacji dendrytów podczas zapisu somatycznego może być przydatne na przykład do zastosowania ciśnienia (ryc. 7 w odnośniku 41) lub pipety stymulującej elektryczność. Roztwór pipet do nagrań podłączonych do komórek zawiera wysokie stężenie K+ i nie zawiera Na+ do rejestrowania dużych Ih. Warto zauważyć, że stosunek stężeń Na+/K+ wpływa na amplitudę prądu 10, potencjał odwrócenia prądu 11 i bramkowanie Ih 73. Alternatywnie, Ih może być również nagrywany za pomocą out-outs 10. Jednak w tej konfiguracji zapisu środowisko wewnątrzkomórkowe w pobliżu kanałów może być zaburzone. W związku z tym różnice w zależnej od napięcia aktywacji Ih obserwuje się przy porównywaniu prądów uzyskanych za pomocą łat dołączonych do ogniw i wyjść zewnętrznych 10. Obrzęk neuronów występuje sporadycznie podczas rejestracji patch-clamp i często wynika z różnych przyczyn, takich jak niska jakość wody, silna nierównowaga osmolarności lub pH między roztworami wewnątrz- i zewnątrzkomórkowymi 39 lub błędy w składzie roztworów. Jakość zapisów elektrofizjologicznych ma bezpośredni wpływ na jakość morfologii odzyskanych neuronów. Pipety somatyczne o wysokiej rezystancji są używane do podwójnych zapisów (6 - 10 MΩ, jak w Refs. 6,11) oraz dla pojedynczych zapisów somatycznych po zapisach przyłączonych do komórek w celu zminimalizowania rozcieńczenia środowiska wewnątrzkomórkowego 14. Zapis somatyczny całej komórki następujący po zapisie dołączonym do komórki jest zatem krótki (< 10 minut). Plamy na zewnątrz zarówno z pipet somatycznych, jak i dendrytycznych są niezbędne do prawidłowego zamknięcia błony komórkowej i późniejszego przywrócenia morfologii komórki. Oprócz struktury komórki, dla zarejestrowanych neuronów można określić zawartość neurochemiczną 59,74. Na przykład wewnątrzkomórkowa hydroksylaza tyrozynowa białka może być znakowana immunologicznie w celu jednoznacznej identyfikacji neuronów DA 13.

Neurony DA są skoncentrowane głównie w SN pars compacta, ze znacznie mniejszą gęstością obecną w SN pars reticulata, gdzie są mieszane z większą liczbą neuronów GABA 75. Podczas gdy ciało komórkowe neuronów DA jest często większe niż neuronów GABA, wizualna identyfikacja tych komórek za pomocą wideomikroskopii IR jest niepewna i częściowo utrudniona przez nieprzezroczystość pars compacta. Aby obejść te ograniczenia, wstępna selekcja neuronów DA może być ułatwiona dzięki zastosowaniu transgenicznych myszy wykazujących ekspresję markera fluorescencyjnego w określonej populacji neuronów (TH 65 lub DAT dla neuronów DA, dla neuronów GABA) i oświetlenie epifluorescencyjne. Alternatywnie, barwnik fluorescencyjny może być dodany do roztworu elektrody somatycznej, aby ułatwić wizualizację dendrytów. Zwiększoną rozdzielczość komórki fluorescencyjnej zapewnia konfokalna 14,22,30 soczewka wirującego dysku Nipkowa lub mikroskopia dwufotonowa7 w połączeniu z IR-DGC 6. DGC ma kilka zalet w porównaniu z DIC. Po pierwsze, ponieważ pryzmaty DIC nie są wymagane, obraz IR-DGC można nałożyć na obraz fluorescencyjny 49,52,53,76. Po drugie, DGC można łączyć z fotostymulacją i optogenetyką 77.

Wadą przygotowania plastrów jest zachowanie integralności neuronów. Neurony DA rozciągają swoje dendryty w trzech płaszczyznach przestrzennych 78,79 i dlatego nie można całkowicie uniknąć obcięcia przedziału dendrytycznego w plasterkach 80. Wybór orientacji plastrów (czołowa, pozioma lub przystrzałkowa) jest kompromisem. Należy wziąć pod uwagę pochodzenie unerwienia i projekt eksperymentalny, aby wybrać właściwą orientację plastrów.

Bezpośrednie łatanie dendrytyczne jest techniką stosowaną do mapowania rozmieszczenia funkcjonalnych kanałów jonowych w różnych przedziałach komórek. Ponadto technika ta umożliwia określenie zmienności właściwości funkcjonalnych kanałów 20. Jako uzupełnienie, lokalizację i gęstość kanałów jonowych można ustalić za pomocą immunohistochemii na poziomie mikroskopii świetlnej i elektronicznej 17,23. Takie podejście daje również możliwość określenia gęstości kanałów w strukturach małego kalibru, które są niedostępne dla pipet z łatkami. Jednak kanały te mogą być w wyraźnym stanie funkcjonalnym 24 lub nawet nieaktywne w porównaniu z tymi nagranymi przy użyciu technik patch-clamp. Obie techniki są zatem niezbędne do uzyskania pełnego obrazu lokalizacji i właściwości kanałów jonowych w określonym regionie komórkowym 17. Wraz z rozwojem barwników wrażliwych na napięcie, obrazowanie napięciowe zostało wykorzystane do zbadania propagacji AP i EPSP w neuronach w wielu lokalizacjach 81. Jako alternatywa dla nagrań z podwójnym patch-clampem, podejście to można zastosować nawet w przypadku cienkich dendrytów, które nie są dostępne dla pipet krosowych, ale wymagają dokładnej kalibracji sygnału i uśrednienia.

Podczas gdy neurony DA w SN i brzusznym obszarze nakrywki są szeroko badane za pomocą zapisów somatycznych w kontekście fizjologicznym i patofizjologicznym, właściwości funkcjonalne ich dendrytów pozostają w dużej mierze nieznane w obu stanach. Łatanie z dendrytów zostało wdrożone dla neuronów dopaminy nigralnej przez kilka grup z powodzeniem 13,25,26 i pozostaje metodą z wyboru do analizy pobudliwych właściwości tych drobnych struktur subkomórkowych 8. Zapisy dendrytyczne stanowią kolejną okazję do zbadania skuteczności i plastyczności transmisji synaptycznej oraz plastyczności pobudliwości dendrytycznej 82,83.

Oświadczenia

Autor oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękuję dr Vincentowi Seutinowi za jego nieustanne wsparcie, Christelle Gillissen i Laurentowi Massotte za doskonałą pomoc techniczną, doktorom Jean Defourny i Sandrze Ormenese za porady dotyczące mikroskopu konfokalnego, dr Jacques'owi Destiné za podarowanie drugiego wzmacniacza Axopatch 200B, platformie GIGA-Imaging za udostępnienie mikroskopu konfokalnego i oprogramowania Imaris oraz dr Stephenowi Freemanowi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Praca ta została wsparta grantami z belgijskiego F.R.S. - FNRS (U.N002.13 i T.N0015.13) i opublikowana dzięki wsparciu Belgijskiej Fundacji Uniwersyteckiej (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Woda podwójnie destylowanaMilliporeSuper QRezystywność >14 MΩ cm, idealna 18,2 MΩ cm przy 25  ° C, filtrowane (0,22 &mikro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Świece mikrofiltracyjneRobuPorowatość o średnicy 3, 6 mm lub 13 mm
GiletteSuper Silver Narzędzia
preparacyjneBraun, Aesculap
KomoraWykonane na zamówienie
PP beckersVWR213-1725400 ml
Filtr strzykawkowyMerk MilliporeMillex - GV 0,22 i mikro; m
Klej cyjanoakrylowy UHU"Sekunden Kleber"płynny klej
Komora nagraniowa Luigs & Neumann Slice mini komora
Ściągacz do pipet poziomychSutter InstrumentsBrown-Flaming P-97
PipetyHilgenberg18075242 mm średn. śred.o.d./1 mm średnica wewnętrzna kapilary szklane, końcówki polerowane ogniowo, płukane
Wosk dentystycznyColtè ne/Whaledentpaski woskowe do tacek ortodontycznych
Platynowa siatkado zakotwiczania plastrów w komorze nagraniowej, wykonana na zamówienie z platynowym krążkiem
MicroforgeNarishigeMF-830do polerowania ogniowego końcówek do pipet
Siarczan metylu potasuMP Biomedicals215481
BiocytynaSondy molekularneB1592
ManometrGREISINGER elektronicznyGDH 13 AN
Mikroskop ZeissFS
Dodt Gradient ContrastLuigs &
Luigs & NeumannLN Mini 25
Frame grabberŹródło obrazowania DFG/USB2pro
KameraDAGE-MTINC-70
KondensorZeisso wysokiej aperturze numerycznej współpracujący
ObiektywZeissW Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR63-krotne powiększenie, duża odległość, wysoka apertura numeryczna 1.0 zanurzenie w wodzie obiektywny
Czterokrotny zmieniaczLuigs & Neumannmiędzy kamerą a mikroskopem
Czarno-biały monitor wideoSonySSM-175CE16-calowy, 850 linii telewizyjnych, analogowe
butelki na próbki, szkło bursztynowe, z nakrętkąVWR215-2409do przenoszenia plastrów z zestawu do sali histologicznej
Przewodnik AxonUrządzeniaKsiążka
Stimfithttps://github.com/neurodroid/stimfitAnaliza danych elektrofizjologicznych
ParaformaldehydSigma441244przed użyciem zapoznać się z KARTĄ CHARAKTERYSTYKI i Dyrektywą w sprawie substancji niebezpiecznych (UE) Płytka
do hodowli komórkowych WellwellGreiner-Bio-One662160do barwienia utrwalonych plastrów
Triton X-100Merk108643przed użyciem zapoznać się z KARTĄ CHARAKTERYSTYKI i dyrektywą w sprawie substancji niebezpiecznych (UE)
mysie przeciwciało monoklonalne anty-TH pierwotneImmunostar22941stężenie robocze: 1/1,000
kozie przeciwciało wtórne anty-myszy - Alexa Fluor 568Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-11031stężenie robocze: 1/500
Normalna surowica koziaDakoX0907
ProLong Diamond Anti-fadeSondy molekularne - Thermo Fisher ScientificP36961
Fluoresceina AvidinDCS Vector LabA-2011
Mikroskop konfokalnyOlympusFV1000
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJhttp://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/plugin do ImageJ
Imarishttp://www.bitplane.comRekonstrukcja neuronów wypełnionych biocytyną
Neuromantichttp://www.reading.ac.uk/neuromantic/Rekonstrukcja neuronów wypełnionych biocytyną
WinWCPhttp://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htmAnaliza danych elektrofizjologicznych
Krajalnica do tkanek z sondą wibracyjną Leica VT1200 parametry cięcia: prędkość 0,07, amplituda 1,40 Krajalnica do tkanek Dosaka DTK-1000 parametry cięcia: prędkość 4, częstotliwość 7 Żyletki rezerwowa Manipulatory Neumann Kondensor z olejem molekularne

Bibliografia

  1. London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  2. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  3. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
  4. Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
  5. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
  6. Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
  7. Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93(2015).
  8. Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
  9. Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
  10. Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
  11. Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  12. Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
  13. Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
  14. Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
  15. Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
  16. Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
  17. Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
  18. Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
  19. Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
  20. Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
  21. Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
  22. Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
  23. Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
  24. Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
  25. Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
  26. Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
  27. Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
  28. Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
  29. Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
  30. Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
  31. Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
  32. Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
  33. Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
  34. Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
  35. Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
  36. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  37. Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
  38. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  39. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
  40. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  41. Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
  42. Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
  43. Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50(2011).
  44. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
  45. Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
  46. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
  47. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  48. Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
  49. Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
  50. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  51. Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
  52. Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
  53. Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
  54. Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
  55. Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
  56. van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
  57. Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  58. Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  59. Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
  60. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  61. Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4(2012).
  62. Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
  63. Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
  64. Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
  65. Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
  66. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  67. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
  68. Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
  69. Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
  70. Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
  71. Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
  72. Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
  73. Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
  74. Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  75. Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  76. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
  77. Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
  78. Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
  79. Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
  80. van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54(2014).
  81. Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
  82. Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
  83. Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rejestracje dendrytycznenapięciowo zależne kanały jonowepomiary elektrofizjologiczneregeneracja post hocprzygotowanie skrawkówmikroskopia konfokalnadyfuzja biocytynyobrazowanie Z-stack
Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.