Artykuł metodologiczny

Symetryczne pośmiertne cięcie mózgu w bihemferze w celu zbadania zdrowych i patologicznych stanów mózgu u ludzi

DOI:

10.3791/54602

⸱

18 grudnia 2016

 ,  ,  , 
1Neuropathology Research, Biomedical Research Institute of New Jersey (BRInj), 2Department of Pathology, Atlantic Health System (AHS), Overlook Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zorganizowane procedury cięcia mózgu są konieczne, aby skorelować określone zjawiska neuropsychiatryczne z ostatecznymi diagnozami neuropatologicznymi. Cięcia mózgu są wykonywane w różny sposób w zależności od różnych kliniczno-akademickich okoliczności. Protokół ten opisuje symetryczną procedurę dwupółkulowego cięcia mózgu w celu zbadania różnic półkulowych w patologiach ludzkiego mózgu oraz maksymalizacji obecnych i przyszłych technik biomolekularnych/neuroobrazowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuropatolodzy czasami czują się onieśmieleni ilością wiedzy potrzebnej do wygenerowania ostatecznych diagnoz dla złożonych zjawisk neuropsychiatrycznych opisywanych u tych pacjentów, dla których poproszono o autopsję mózgu. Chociaż postęp nauk biomedycznych i neuroobrazowania zrewolucjonizował dziedzinę neuropsychiatrii, wygenerował również mylącą ideę, że autopsje mózgu mają jedynie wartość potwierdzającą. Ta fałszywa idea doprowadziła do drastycznego zmniejszenia liczby autopsji, a w konsekwencji do zmniejszenia możliwości przeprowadzenia bardziej szczegółowych i rozległych badań neuropatologicznych, które są niezbędne do zrozumienia wielu normalnych i patologicznych aspektów ludzkiego mózgu, które są jeszcze nieznane. Tradycyjna metoda wnioskowania o korelacji między obserwowanymi zjawiskami neuropsychiatrycznymi i odpowiadająca im lokalizacja/charakterystyka ich możliwych korelatów neurohistologicznych nadal ma niezaprzeczalną wartość. W kontekście chorób neuropsychiatrycznych tradycyjna metoda kliniczno-patologiczna jest nadal najlepszą możliwą metodologią (i często jedyną dostępną) do łączenia unikalnych cech neuropsychiatrycznych z odpowiadającymi im substratami neuropatologicznymi, ponieważ opiera się ona w szczególności na bezpośredniej ocenie fizycznej tkanek mózgowych. Ocena pośmiertnych mózgów opiera się na procedurach wycinania mózgu, które różnią się w różnych ośrodkach neuropatologicznych. Wycinanie mózgu jest wykonywane w stosunkowo obszerny i systematyczny sposób w oparciu o różne kliniczne i akademickie sytuacje występujące w każdej instytucji. Bardziej anatomicznie inkluzywna i symetryczna metodologia dwupółkulowego cięcia mózgu powinna być przynajmniej stosowana do celów badawczych w ludzkiej neuropatologii w celu spójnego dogłębnego zbadania normalnych i patologicznych stanów ze specyfiką ludzkiego mózgu (tj. specjalizacją półkulową i lateralizacją dla określonych funkcji). Taka metoda zapewniłaby bardziej wszechstronny zbiór neuropatologicznie dobrze scharakteryzowanych mózgów, dostępnych dla obecnych i przyszłych technik biotechnologicznych i neuroobrazowania. Opisujemy symetryczną procedurę dwupółkulowego cięcia mózgu do badania różnic półkulowych w patologiach ludzkiego mózgu oraz do stosowania z obecnymi, a także przyszłymi technikami biomolekularnego / neuroobrazowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuropatolodzy mają przywilej naukowy, honor intelektualny i obowiązek diagnostyczny do oceny ludzkich mózgów. Przez wiele dziesięcioleci podejmowano szczegółowe opisy kliniczne chorób mózgu i podejmowano znaczne wysiłki w celu zindywidualizowania ich możliwych neurohistologicznych korelatów w ludzkich mózgach pośmiertnych. Historycznie rzecz biorąc, wysiłki te reprezentowały najbardziej produktywną metodę, dzięki której nauki medyczne, a w szczególności neurologia, rozwijały się w epoce nowożytnej. Dzięki wcześniejszym wybitnym neuropatologom i ich poświęceniu, determinacji, nauce i zadziwiającej zdolności do rozróżniania normalnych i nieprawidłowych tkanek mózgowych (często przy użyciu bardzo prymitywnych narzędzi), możemy teraz badać i celować w choroby takie jak choroba Alzheimera-Perusiniego (niesprawiedliwie nazywana tylko chorobą Alzheimera; APD/AD)1, choroba Parkinsona (PD)2, choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD)3, choroba Lou-Gehriga/stwardnienie zanikowe boczne (ALS)4 i choroba Guam5, by wymienić tylko kilka.

Zaawansowane techniki neuroobrazowania, takie jak tomografia komputerowa wysokiej rozdzielczości (np. wielosekcyjna spiralna tomografia komputerowa; Angiografia CT), funkcjonalne i morfologiczne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (tj. fMRI, rezonans magnetyczny dyfuzyjny, traktografia-rezonans magnetyczny itp.), pozytonowa tomografia emisyjna (PET), obrazowanie oparte na ultradźwiękach i inne, z pewnością zmieniły nasze ogólne podejście do diagnozowania i leczenia pacjentów neurologicznych i psychiatrycznych. Niemniej jednak, chociaż techniki neuroobrazowania są w stanie uwidocznić mózg osoby za życia, nie dają one w danym momencie możliwości bezpośredniej analizy wysoce skomplikowanych struktur komórkowych i subkomórkowych komórek, takich jak neurony; lub do wizualizacji, oznaczania i ilościowego określania określonych typów zmian wewnątrzkomórkowych; lub precyzyjnie wskazać ich lokalizację neuroanatomiczną lub subregionalną na obwodowych i podobwodowych poziomach anatomicznych. Na przykład techniki neuroobrazowania nie są w stanie zidentyfikować ani zlokalizować ciał Lewy'ego (LB) w pigmentowanych neuronach istoty czarnej (SN), powszechnej cechy patologicznej związanej z chorobą Parkinsona, lub splątków neurofibrylarnych (NFT) w korze śródwęchowej, klasycznej cechy choroby Alzheimera i innych patologii mózgu. Badania neuropatologiczne w połączeniu z zaawansowaną mikroskopią cyfrową są nadal niezastąpione w celu uzyskania szczegółowych korelacji kliniczno-patologicznych, a tym samym ostatecznej diagnozy.

Ze względu na szczególne anatomiczno-funkcjonalne właściwości ludzkiego mózgu, a zwłaszcza jego anatomiczną lokalizację (czyli wewnątrz czaszki, naturalny system ochronny, który nie pozwala na bezpośrednie zbadanie jego zawartości), wprowadzenie technik neuroobrazowania in vivo niezwykle pomogło klinicystom i badaczom znaleźć wstępne odpowiedzi na niektóre z tajemnic tej złożonej tkanki. Nie ma jednak metodologii klinicznej ani neuroobrazowania, która mogłaby zastąpić wyjątkową możliwość bezpośredniej analizy tkanki mózgowej podczas autopsji. Tylko zorganizowane gromadzenie, zachowanie i kategoryzacja ludzkich mózgów może pozwolić na bezpośrednie i systematyczne badania komórek neuronalnych i nieneuronalnych, ich subkomórkowych składników, wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych zmian patologicznych oraz wszelkiego rodzaju nieprawidłowości wewnątrz mózgu w celu potwierdzenia, modyfikacji lub przedefiniowania diagnoz klinicznych i odkrycia nowych korelacji kliniczno-patologicznych. Jednym z oczywistych ograniczeń dotyczących oceny mózgu podczas sekcji zwłok jest fakt, że procedura ta jest metodologią przekrojową. Zawsze będzie istniało opóźnienie między trwającym procesem neuropatologicznym (objawiającym się klinicznie lub nie) a szansą, jeśli taka istnieje, na zdefiniowanie go na poziomie neurohistologicznym. Wynika to głównie z niezdolności ludzkiego mózgu do samoregeneracji. Obecnie nie jest możliwe uzyskanie tkanki mózgowej in vivo bez spowodowania trwałego uszkodzenia. W związku z tym nie jest możliwa długotrwała i neuropatologiczna ocena tego samego mózgu/osoby. Jednak ustandaryzowane procedury bankowania mózgu i zwiększona świadomość na temat dawstwa mózgu wśród ogółu społeczeństwa mogą znacznie przyczynić się do rozwiązania problemów związanych z czasem autopsji mózgu poprzez konsekwentne zwiększanie liczby przypadków do zebrania i analizy. W ten sposób można uzyskać bardziej odpowiednią liczbę mózgów pośmiertnych, aby zdefiniować stałe wzorce patologicznego pochodzenia i progresji dla każdego konkretnego rodzaju uszkodzenia mózgu związanego z każdą chorobą mózgu człowieka. Wymagałoby to dawstwa i pobrania jak największej liczby mózgów od pacjentów dotkniętych jakimkolwiek zaburzeniem neuropsychiatrycznym, a także od zdrowych osób z grupy kontrolnej w każdym wieku. Jedną z możliwych metod może być pobranie jak największej liczby mózgów pośmiertnych z ogólnych i specjalistycznych ośrodków medycznych jako standardowa rutyna. Potrzeba dawstwa mózgu została niedawno wyrażona przez tych, którzy badają demencję i normalne starzeniesię6. Ta sama konieczność powinna być wyrażona przez całą dziedzinę neuropsychiatrii.

Z wyżej wymienionych i innych powodów, konieczna jest aktualizacja trwających procedur cięcia mózgu. Co więcej, procedury wycinania mózgu powinny być powszechnie ustandaryzowane w różnych ośrodkach badawczych neuropatomorfologii na całym świecie, biorąc również pod uwagę możliwość zastosowania obecnych i przyszłych technik biotechnologicznych w celu lepszego zbadania i, miejmy nadzieję, ostatecznego zrozumienia przyczyn i mechanizmów chorób mózgu u ludzi.

Tutaj, głównie w celach badawczych, opisujemy symetryczną metodologię pośmiertnego cięcia mózgu u ludzi. Ta procedura polega na pobraniu większej liczby obszarów mózgu niż zwykle i zarówno z półkuli mózgowej, jak i móżdżku. Symetryczna procedura dwupółkulowego cięcia mózgu będzie znacznie lepiej pasować do naszej obecnej wiedzy na temat ludzkiej neuroanatomii, neurochemii i neurofizjologii. Metoda ta daje również możliwość neuropatologicznej analizy unikalnych cech ludzkiego mózgu, takich jak specjalizacja półkulowa i lateralizacja, które są związane z wyższymi funkcjami poznawczymi i niepoznawczymi typowymi lub wyłącznie występującymi u naszego gatunku. Obecnie nie wiadomo, czy istnieją specyficzne związki patogenetyczne między specjalizacją/lateralizacją półkuli a określonymi typami uszkodzeń mózgu, czy też szczególne neuropsychiatryczne zdarzenie patogenetyczne jest początkowo, powszechnie lub wyłącznie związane z określoną półkulą i funkcją. Opisując tę symetryczną procedurę cięcia mózgu, staramy się zaproponować zaktualizowaną metodę sekcji ludzkiego mózgu, która może pomóc w lepszym zrozumieniu normalnych i patologicznych warunków w wysoce wyspecjalizowanej tkance, jaką jest mózg. Metoda ta uwzględnia również te aspekty półkuli morfofunkcjonalnej, które występują tylko u ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury z udziałem pośmiertnych tkanek ludzkich zostały poddane przeglądowi przez instytucjonalną komisję rewizyjną i zwolnione na mocy 45 CFR (Kodeks Przepisów Federalnych).

UWAGA: Protokół opisuje symetryczną procedurę dwupółkulowego cięcia mózgu w celu pośmiertnej oceny mózgu, sfinalizowaną dla badań neuropatologicznych u ludzi. Szczegółowe opisy aparatów, przyrządów, materiałów i materiałów niezbędnych do wykonania cięcia ludzkiego mózgu nie będą zawierane. Materiały i materiały do sekcji mózgu są wybierane według uznania pojedynczego badacza i opierają się na narzędziach autopsyjnych dozwolonych lub zatwierdzonych w każdej instytucji badawczej. Minimalny zestaw narzędzi i materiałów wymaganych do tej procedury jest opisany w Tabeli Materiał/Wyposażenie. Szczegółowe procedury cięcia i środki ostrożności w przypadku podejrzenia zakaźnych chorób mózgu, takich jak CJD u ludzi, wykraczają poza cele tego manuskryptu i są dostępne w innych źródłach7.

1. Symetryczne dwupółkulowe cięcie mózgu

Uwaga: Upewnij się, że mózg otrzymał niezbędne utrwalenie tkanek (przy użyciu, na przykład, neutralnie buforowanej 10% formaliny) przez okres dwóch do trzech tygodni, w zależności od warunków okołokątnych, metabolicznych (tj. pH) i zachowania tkanek (tj. temperatury). Jednak w badaniach korelacji obrazowo-patologicznej sugerowano dłuższy okres fiksacji (>5,4 tygodnia)8.

  1. Umieść mózg na płaskiej powierzchni przodem do badacza, z biegunami czołowymi skierowanymi w przeciwnym kierunku w stosunku do badacza.
  2. Umieść mózg w taki sposób, aby umożliwić pełną i wyraźną wizualizację wszystkich zakrętów korowych i bruzd całego mózgu (ryc. 1a).
  3. Najpierw zwróć uwagę na anomalie opon mózgowo-rdzeniowych, makroskopowe asymetrie półkulowe (możliwe wskaźniki ogniskowych, płatowych lub uogólnionych zjawisk atrofii półkulowej), makroskopowe zmiany tissutalne (tj. guzy lub przepuklina), wrodzone wady rozwojowe, nieprawidłowości naczyń i wszelkie inne możliwe nieprawidłowości lub nietypowe prezentacje powierzchni mózgu.
    UWAGA: Szczegółowe opisy dotyczące oceny ludzkiego mózgu można znaleźć w dostępnych na rynku podręcznikach neuropatologii i podręcznikach autopsji9,10.

2. Sekwencja protokołu

  1. Bieguny czołowe należy odsunąć od badacza, z powierzchownymi aspektami półkul (kresomózgowie) skierowanymi w stronę badacza. Zrób tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta badawczego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej (ryc. 1a - c).
  2. Oznacz przed- i postcentralne zakręty korowe za pomocą tuszu lub kolorowych igieł przed przecięciem mózgu (ryc. 1b).
    UWAGA: Ta procedura ułatwia szybsze rozpoznanie motorycznej i somatosensorycznej pierwotnej kory mózgowej po przecięciu.
  3. Obróć mózg o 180 stopni, trzymając go skierowany w tym samym kierunku (tj. bieguny czołowe skierowane od badacza). Dokładnie sprawdź podstawę mózgu. Zwróć szczególną uwagę na stan układu naczyniowo-mózgowego (tj. tętnic podstawnych i kręgowych oraz koła Willisa) oraz nerwów czaszkowych na ich poziomach wyjściowych/wejściowych pnia mózgu. Ze szczególną ostrożnością należy obchodzić się z opuszkami i drogami węchowymi, aby uniknąć uszkodzenia tkanki węchowej ze względu na ich ekstremalną kruchość.
    1. Zrób tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta naukowego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej i pnia mózgu.
  4. Zwrócony twarzą do podstawy mózgu i za pomocą skalpela przetnij pień mózgu poprzecznie na poziomie górnej części mostu (jak najbliżej podstawy mózgu). Dokładnie sprawdź SN (tj. pod kątem bladości)11 i innych sąsiednich struktur12. Zwróć uwagę, być może za pomocą urządzenia do nagrywania dźwięku, na każdy nietypowy wygląd mózgu w porównaniu z normalnym mózgiem13.
  5. Ponownie obróć mózg o 180 stopni i za pomocą ostrego noża oddziel dwie półkule, przecinając ciało modzelowate centralnie przez przyśrodkową szczelinę podłużną i podążając w kierunku czołowo-potylicznym. Sprawdź każdą stronę każdej półkuli pod kątem możliwych anomalii (np. powiększeń komór, wad rozwojowych, zmiękczenia tkanek, guzów itp.)13. Zobacz rysunek 2a.
    1. Zrób tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta naukowego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej. Zwróć uwagę na każdą niezwykłą cechę mózgu w porównaniu z normalnym mózgiem.
  6. Umieść dwie półkule płasko, leżąc na ich środkowych aspektach, z płatami czołowymi skierowanymi od badacza, jak pokazano na rysunku 2b. Ułóż je w taki sposób, aby ich środki się stykały (również w przypadku wyraźnej asymetrii półsfery).
  7. Za pomocą ostrego noża ręcznie przetnij obie półkule mózgowe, zaczynając od biegunów czołowych i przesuwając się w kierunku biegunów potylicznych na całej długości półkul. Uzyskaj dwie serie bloków tkanki mózgowej o grubości 1 cm (około 18 płyt na każdą półkulę).
  8. Umieść płyty mózgowe w anatomicznie zorganizowanej sekwencji (kierunek czołowo-potyliczny) na oddzielnej płaskiej powierzchni. Użyj białej powierzchni z wydrukowaną na niej linijką, aby uzyskać lepszy kontrast podczas fotografowania. Przedstaw dwie serie płyt mózgowych w anatomicznie symetryczny sposób (kierunek czołowo-potyliczny), upewniając się, że ich powierzchnie czołowe są widoczne do bezpośredniego wglądu wzrokowego i fotografii cyfrowej (ryc. 3a). Używaj powierzchni tnących z nadrukowanymi siatkami milimetrowymi po obu stronach, aby dokładniej zlokalizować struktury mózgu, rozmiary i możliwe nieprawidłowości.
    1. Zrób tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta naukowego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej. Rób notatki (prawdopodobnie za pomocą urządzenia do nagrywania dźwięku) na temat każdego nietypowego aspektu mózgu w porównaniu z normalnym mózgiem.
  9. Za pomocą ostrego skalpela ręcznie wypreparuj mniejsze prostokątne bloki tkanki mózgowej dla każdego ustalonego obszaru mózgu. Postępuj zgodnie z proponowanym schematem zbierania regionów mózgowych opisanym w Tabeli 1.
    1. Umieść każdy blok tkanki w oddzielnie oznaczonych histokassetach.
      UWAGA: Każdy blok tkanki mózgowej musi zostać przycięty tak, aby pasował, w jak największym stopniu, do standardowej maksymalnej objętości histokassy (30 x 20 x 4 mm3).
    2. Oznacz histokassety za pomocą kodu deidentyfikującego dla każdego przypadku i używając specyficznych identyfikatorów neuroanatomicznych (nie używaj losowych liter lub cyfr dla różnych mózgów; raczej zawsze używaj tych samych regionalnych nazw anatomicznych lub odpowiadających im liczb, jak pokazano w Tabeli 1). Twórz kody deidentyfikujące, na przykład generując liczby losowe lub półlosowe dla każdego przypadku (np. BRC 130, gdzie B pozostaje dla Mózgu, R pozostaje dla Zasobu, C pozostaje dla Centrum, a 130 to postępujący akcesor lub AD160001, gdzie AD oznacza "badanie choroby Alzheimera", 16 to rok, w którym przeprowadzono autopsję (2016), i 0001 numer egzemplarza postępowego akcesji).
      UWAGA: Ten krok jest bardzo pomocny dla przyszłych badaczy; zachowaj legendę i określ półkulę (L = lewa półkula, R = prawa półkula). Użyj dwóch różnych kolorów histokasset, ustalając określony kolor dla każdej półkuli.
    3. Wykonaj tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta naukowego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej. Zwróć uwagę na każdą niezwykłą cechę mózgu w porównaniu z normalnym mózgiem.
  10. Zrób cyfrowe zdjęcia (tyle, ile jest to konieczne lub pożądane) całego przeciętego mózgu i związanych z nim histokasset.
  11. Dziurkowanie (np. za pomocą Accu-punch) małych kawałków tkanki w celu ekstrakcji DNA i analiz genetycznych. Użyj stempla o średnicy 2 - 5 mm.
    UWAGA: Ze względu na wysoką zawartość materiału genomowego móżdżek jest preferowanym wyborem; Jednak każdy inny region jest w porządku.
  12. Ponownie zanurz wszystkie histokassety zawierające bloki tkanki mózgowej w tym samym rodzaju roztworu utrwalającego (np. 10% neutralnie buforowanej formalinie), jaki był poprzednio stosowany, aż do następnego etapu przetwarzania tkanki.
  13. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami przetwarzania tkanek utrwalonych w ludzkim formalinie14.

3. Specjalne podejście: naprzemienne zamrożone i stałe symetryczne cięcie bihemsfery

UWAGA: Protokół symetrycznego dwupółkulowego cięcia mózgu opisany w sekcji 2 oferuje możliwość wycinania fragmentów tkanek z nieustalonych, świeżych mózgów (jeśli są dostępne) w ten sam systematyczny i symetryczny sposób.

  1. Umieść cały świeży mózg do góry nogami (najlepiej na półkulistej powierzchni z tworzywa sztucznego przypominającej miskę) na 8 - 10 minut w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aby stwardnieć tkankę mózgową bez powodowania uszkodzeń biochemicznych i ułatwić ręczne cięcie.
  2. Za pomocą ostrego noża przeciąć obie półkule na przemian i po kolei, postępując zgodnie z protokołem cięcia mózgu opisanym w sekcji 2, ale zamrozić i przymocować co drugą płytę (z obu półkul i wzdłuż czołowo-potylicznego kierunku anatomicznego).
    1. W tym momencie nie próbuj przecinać każdego obszaru mózgu, jak opisano w Tabeli 1. Wytnij określone świeże obszary mózgu tylko wtedy, gdy jest to wymagane do natychmiastowej ekstrakcji RNA lub białka (tj. do badań genomicznych lub proteomicznych)15.
  3. Po pokrojeniu natychmiast zamroź, oznacz i ponumeruj każdą świeżą tkankę. Rób cyfrowe zdjęcia całej serii płyt; zapakuj każdą płytę w jedną plastikową torbę; zebrać płyty do oddzielnego pojemnika tylko na jeden mózg; i przechowywać pojemnik w dedykowanej zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Zamrażarka powinna być dedykowana wyłącznie ludzkiej tkance mózgowej. Dopiero później pojedyncze zamrożone obszary mózgu zostaną wycięte, zgodnie z wymaganiami dla każdego konkretnego eksperymentu.
  4. Zanurzyć każdy inny fragment tkanki wybrany do utrwalenia (10% neutralnie buforowanej formaliny lub innego utrwalacza) w oddzielnych torebkach zawierających wystarczającą objętość utrwalacza (stosunek 3/1 objętości utrwalacza do bloku tkankowego). Oznacz każdą torbę, numerując je kolejno zgodnie z sekwencją czołowo-potyliczną. Zamknij każdą torbę, zrób zdjęcia cyfrowe i przechowuj je w plastikowym pojemniku.
  5. Otwórz worki zawierające utrwalacz po 2 tygodniach utrwalenia tkanki i przeciąć każdy obszar mózgu, jak opisano w Tabeli 1.

4. Histostain i immunohistochemia

UWAGA: Zestaw regionów mózgu wyciętych w oparciu o proponowany schemat (Tabela 1) jest wystarczający, aby spełnić większość, jeśli nie wszystkie, obecnie ustalonych, opartych na konsensusie kryteriów patologicznych dla AD16, PD17, otępienia z ciałami Lewy'ego (DLB)18, otępienia czołowo-skroniowego (FTD/MND)19, postępującego porażenia nadgałkowego (PSP)20, zaniku wieloukładowego (MSA)21, przewlekłej encefalopatii pourazowej (CTE)22, itp.

  1. Dla każdego obszaru mózgu i dla obu półkul należy wykonać następujący minimalny zestaw barwień histowarowych: Hematoksylina i eozyna (H&E), fiolet krezylowy (CV; jeśli planowane są na przykład ilościowe badania morfometryczne) i barwienie srebrem (jeśli potrzebne są analizy "eksploracyjne").
  2. Dla każdego regionu mózgu i dla obu półkul wykonaj następujący minimalny zestaw protokołów immunohistochemicznych: β-amyloid (βA), fosforylowany Tau (pTau), fosforylowany α-synukleina (pα-syn) i fosforylowany-TDP43 (pTDP43), zgodnie z opisem14.
    UWAGA: Całkowita liczba skrawków tkanek w celu oceny każdego mózgu zgodnie z tym protokołem wynosi 46 (jeśli dostępne są wszystkie obszary mózgu z obu półkul).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Długość protokołu

Czas poświęcony na pojedynczą symetryczną procedurę stałego cięcia mózgu w biefkuli szacowany jest na 1 godzinę (nie licząc czasu poświęconego na ustawienie stołu preparacyjnego, narzędzi i powierzchni do cięcia; etykietowanie; itp.). Szacuje się, że czas potrzebny na pojedynczą symetryczną dwupółkulową, naprzemiennie zamrożoną i utrwaloną procedurę cięcia mózgu zajmuje 2 godziny. Uzyskanie ostatecznej di...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda wycinania mózgu może być dostosowana do specyficznych potrzeb każdego laboratorium neuropatologicznego (na przykład poprzez zmniejszenie liczby regionów mózgu do oceny dla każdej półkuli), przy jednoczesnym zachowaniu procedury dwupółkulowego symetrycznego cięcia jako jednej z jej głównych cech. Ten proponowany protokół może być stosowany do rutynowych procedur (ośrodki neuropatologiczne zorientowane na badania) lub tylko wtedy, gdy jest to konieczne (specyficzne badania kliniczne). Może być selektywnie stosowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy tysiącom dawców mózgu, pacjentom, rodzinom i neurobiologom na całym świecie, którzy w ciągu ostatnich dwóch stuleci i dzięki swoim hojnym darom i wysiłkom intelektualnym pomogli odkryć, jak działa ludzki mózg, zrozumieć wyniszczające choroby mózgu i opracować ich metody leczenia. Szczególne podziękowania kierujemy do Pani Cecilii V. Feltis za redakcję i recenzję tego rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kopia podpisanej świadomej zgody na autopsję i oddanie mózgu do celów badawczych.
Szczegółowy wywiad kliniczny pacjenta, który powinien zawierać szczegółowy opis wszelkich objawów i oznak neurologicznych i psychiatrycznych.
Medyczne lub niemedyczne nagrania wideo, jeśli są dostępne (szczególnie przydatne w dziedzinie zaburzeń ruchowych). Najbliżsi krewni Wymagana jest zgoda.
Skale neuroobrazowania, neurofizjologii, neuropsychiatrii i oceny lub kliniczno-kliniczne.
Dane genetyczne i dane dotyczące historii rodziny. Przegląd raportów genetycznych, jeśli zdiagnozowano choroby neurogenetyczne.
Pojemnik histologicznyMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI64233-24
Kasety histologiczneVWR18000-142 (pomarańczowe)
Kasety histologiczneVWR18000-132 (granatowe)
Rękojeści noży i ostrza jednorazoweMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES62560-04
Długie ostrzaMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES62561-20
Rękojeści noży z jednorazowym ostrzemMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES72040-08
Ostrza skalpelaMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES72049-22
Accu-Punch 2 mmMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES69038-02 
Pojemniki styropianowe – SterylnaMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES64240-12
Deska sekcyjnaMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES63307-30
Roztwór formaliny, obojętnie buforowany, 10%Roztwór hematoksyliny Sigma-Aldrich
Gill nr 2Sigma-AldrichGHS280  SIGMA
Eozyna Y roztwór wodnySigma-AldrichHT1102128  SIGMA
anty-beta-amyloidCovance, Princeton, NJSIG-392201:500
anty-tauThermo Fisher ScientificMN10201:500
anty-alfa-synukleinaAbcamab277661:500
anty-fosfo-TDP43Cosmo Bio Co.TIP-PTD-P021:2000
Aparat cyfrowyDowolna
głowica Zgrzewarka impulsowa Grainger5ZZ35
HT501128,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braun, B., Stadlober-Degwerth, M., Hajak, G., Klunemann, H. H. 100th anniversary of Perusini's second case: patient RM and his kindred. Am. J. Alzheimers Dis. Other Demen. 25, 189-192 (2010).
  2. Jellinger, K. A. Neuropathology of sporadic Parkinson's disease: evaluation and changes of concepts. Mov Disord. 27, 8-30 (2012).
  3. Head, M. W. Human prion diseases: molecular, cellular and population biology. Neuropathology. 33, 221-236 (2013).
  4. Hirano, A. Neuropathology of ALS: an overview. Neurology. 47, S63-S66 (1996).
  5. Oyanagi, K., Wada, M. Neuropathology of parkinsonism-dementia complex and amyotrophic lateral sclerosis of Guam: an update. J. Neurol. 246 (Suppl 2), 19-27 (1999).
  6. Montine, T. J., et al. Recommendations of the Alzheimer's disease-related dementias conference. Neurology. 83, 851-860 (2014).
  7. Procedures for Brain Autopsy in Prion Diseases. , http://case.edu/med/pathology/centers/npdpsc/protocols-autopsy.html (2010).
  8. Yong-Hing, C. J., Obenaus, A., Stryker, R., Tong, K., Sarty, G. E. Magnetic resonance imaging and mathematical modeling of progressive formalin fixation of the human brain. Magn Reson Med. 54, 324-332 (2005).
  9. Love, S., Perry, A., Ironside, I., Budka, H. Greenfield's Neuropathology. , Ninth Edition - Two Volume Set, CRC Press. (2015).
  10. Davis, R. L., Robertson, D. M. Textbook of Neuropathology. , Third, Lippincott Williams and Wilkins. (1996).
  11. Dickson, D. W., et al. Neuropathological assessment of Parkinson's disease: refining the diagnostic criteria. Lancet Neurol. 8 (12), 1150-1157 (2009).
  12. Nieuwenhuys, R., Voogd, J., van Huijzen, C. The Human Central Nervous System: A Synopsis and Atlas. , 4th, Springer. (2008).
  13. Netter, F. H. Atlas of Human Anatomy. , Professional Edition, 6th Edition, Elsevier. (2005).
  14. Brown, R. W. Histologic Preparations: Common Problems and Their Solutions. , CAP Press. Northfield, Illinois. (2009).
  15. Durrenberger, P. F., et al. Effects of antemortem and postmortem variables on human brain mRNA quality: a BrainNet Europe study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 70-81 (2010).
  16. Hyman, B. T., et al. National Institute on Aging-Alzheimer's Association guidelines for the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 8, 1-13 (2012).
  17. Gelb, D. J., Oliver, E., Gilman, S. Diagnostic criteria for Parkinson disease. Arch Neurol. 56, 33-39 (1999).
  18. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB Consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
  19. Cairns, N. J., et al. Neuropathologic diagnostic and nosologic criteria for frontotemporal lobar degeneration: consensus of the Consortium for Frontotemporal Lobar Degeneration. Acta Neuropathol. 114, 5-22 (2007).
  20. Litvan, I., et al. Validity and reliability of the preliminary NINDS neuropathologic criteria for progressive supranuclear palsy and related disorders. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55, 97-105 (1996).
  21. Gilman, S., et al. Second consensus statement on the diagnosis of multiple system atrophy. Neurology. 71, 670-676 (2008).
  22. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
  23. Rahimi, J., Kovacs, G. G. Prevalence of mixed pathologies in the aging brain. Alzheimer's Res Ther. 6, 82(2014).
  24. Jellinger, K. A., Attems, J. Challenges of multimorbidity of the aging brain: a critical update. J. Neural. Transm. (Vienna). 122, 505-521 (2015).
  25. Crary, J. F., et al. Primary age-related tauopathy (PART): a common pathology associated with human aging. Acta Neuropathol. 128, 755-766 (2014).
  26. Kovacs, G. G., et al. Aging-related tau astrogliopathy (ARTAG): harmonized evaluation strategy. Acta Neuropathol. 131, 87-102 (2016).
  27. Nelson, P. T., et al. 34;New Old Pathologies": AD, PART, and Cerebral Age-Related TDP-43 With Sclerosis (CARTS). J Neuropathol Exp Neurol. 75 (6), 82-98 (2016).
  28. Tomlinson, B. E., Blessed, G., Roth, M. Observations on the brains of non-demented old people. J. Neurol. Sci. 7, 331-356 (1968).
  29. Katzman, R., et al. Clinical, pathological, and neurochemical changes in dementia: A subgroup with preserved mental status and numerous neocortical plaques. Ann. Neurol. 23, 138-144 (1988).
  30. Crystal, H., et al. Clinicopathologic studies in dementia: Nondemented subjects with pathologically confirmed Alzheimer's disease. Neurology. 38, 1682-1687 (1988).
  31. Knopman, D. S., et al. Neuropathology of cognitively normal elderly. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1087(2003).
  32. Troncoso, J. C., et al. Neuropathology in controls and demented subjects from the Baltimore Longitudinal Study of Aging. Neurobiol. Aging. 17, 365-371 (1996).
  33. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
  34. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  35. Frings, L., et al. Asymmetries of amyloid-β burden and neuronal dysfunction are positively correlated in Alzheimer's disease. Brain. 138 (Pt 10), 3089-3099 (2015).
  36. Leroy, F., et al. New human-specific brain landmark: the depth asymmetry of superior temporal sulcus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1208-1213 (2015).
  37. Fink, M., et al. Lateralization of the serotonin-1A receptor distribution in language areas revealed by PET. Neuroimage. 45 (2), 598-605 (2009).
  38. Miller, A. K. H., Alston, R. L., Mountjoy, C. Q., Corsellis, J. A. N. Automated differential cell counting on a sector of the normal human hippocampus: the influence of age. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 10, 123-142 (1984).
  39. Brettschneider, J., Del Tredici, K., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Spreading of pathology in neurodegenerative diseases: a focus on human studies. Nat. Rev. Neurosci. 16 (2), 109-120 (2015).
  40. Nolan, M., Troakes, C., King, A., Bodi, I., Al-Sarraj, S. Control tissue in brain banking: the importance of thorough neuropathological assessment. J. Neural. Transm. (Vienna). 12, (2015).
  41. Wilcock, G. K., Esiri, M. M. Asymmetry of pathology in Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 50 (10), 1384-1386 (1987).
  42. Janota, I., Mountjoy, C. Q. Asymmetry of pathology in Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 51 (7), 1011-1012 (1988).
  43. Stefanits, H., Budka, H., Kovacs, G. G. Asymmetry of neurodegenerative disease related pathologies: a cautionary note. Acta Neuropathol. 123 (3), 449-452 (2012).
  44. King, A., Bodi, I., Nolan, M., Troakes, C., Al-Sarraj, S. Assessment of the degree of asymmetry of pathological features in neurodegenerative diseases. What is the significance for brain banks? J Neural Transm. (Vienna). 122 (10), 1499-1508 (2015).
  45. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130, 813-831 (2005).
  46. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. APMIS. 120, 327-340 (2012).
  47. Erskine, D., Khundakar, A. A. Stereological approaches to dementia research using human brain tissue. J Chem Neuroanat. , (2016).
  48. Lees, A. J. Unresolved issues relating to the shaking palsy on the celebration of James Parkinson's 250th birthday. Mov. Disord. 22 (Suppl 17), S327-S334 (2007).
  49. Iacono, D., et al. Parkinson disease and incidental Lewy body disease: Just a question of time? Neurology. 85, 1670-1679 (2015).
  50. Geuna, S., Herrera-Rincon, C. Update on stereology for light microscopy. Cell Tissue Res. 360 (1), 5-12 (2015).
  51. Drummond, E. S., Nayak, S., Ueberheide, B., Wisniewski, T. Proteomic analysis of neurons microdissected from formalin-fixed, paraffin-embedded Alzheimer's disease brain tissue. Sci. Rep. 5, 15456(2015).
  52. Brickell, K. L., et al. Clinicopathological concordance and discordance in three monozygotic twin pairs with familial Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 78 (10), 1050-1055 (2007).
  53. Xiromerisiou, G., et al. Identical twins with Leucine rich repeat kinase type 2 mutations discordant for Parkinson's disease. Mov. Disord. 27 (10), 1323(2012).
  54. Iacono, D., et al. Neuropathologic assessment of dementia markers in identical and fraternal twins. Brain Pathol. 24 (4), 317-333 (2014).
  55. Iacono, D., et al. Same Ages, Same Genes: Same Brains, Same Pathologies?: Dementia Timings, Co-Occurring Brain Pathologies ApoE Genotypes in Identical and Fraternal Age-matched Twins at Autopsy. Alzheimer Dis. Assoc. Disord. , (2015).
  56. Rentería, M. E. Cerebral asymmetry: a quantitative, multifactorial, and plastic brain phenotype. Twin Res. Hum. Genet. 15 (3), 401-413 (2012).
  57. Bishop, D. V. Cerebral asymmetry and language development: cause, correlate, or consequence? Science. 340 (6138), (2013).
  58. Mendez, M. F., et al. Observation of social behavior in frontotemporal dementia. Am. J. Alzheimers Dis. Other Demen. 29 (3), 215-221 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obustronne przeci cie m zgupo miertna analiza m zguspecjalizacja p kulowabadanie neuropatologicznepobieranie region w m zgusekcja tkanki m zgowejkorelacja kliniczno patologicznatechniki neuroobrazowaniaprzekr j pnia m zguoddzielenie cia a modalitym corpus callosum

Powiązane artykuły