Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

15.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54612

⸱

9 października 2016

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science, 2Electron Microscopy Unit, Weizmann Institute of Science

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Streszczenie

Ta praca ocenia różne metodologie badania wpływu małocząsteczkowych inhibitorów biofilmu, takich jak D-aminokwasy, na rozwój i odporność biofilmów Bacillus subtilis. Po pierwsze, przedstawiono metody, które selekcjonują inhibitory małocząsteczkowe z celami specyficznymi dla biofilmu w celu oddzielenia wpływu inhibitorów małocząsteczkowych na wzrost planktonu od ich wpływu na tworzenie biofilmu. Następnie skupiamy się na tym, jak warunki inokulacji wpływają na wrażliwość wielokomórkowych, pływających kultur B. subtilis na inhibitory małocząsteczkowe. Wyniki sugerują, że rozbieżności w zgłaszanym działaniu takich inhibitorów, jak D-aminokwasy, wynikają z niespójnych warunków przed hodowlą. Ponadto opisano niedawno opracowany protokół służący do oceny wpływu leczenia małymi cząsteczkami na oporność biofilmu na substancje przeciwbakteryjne. Na koniec przedstawiono techniki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu analizy trójwymiarowego układu przestrzennego komórek i otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej w biofilmie B. subtilis. SEM ułatwia wgląd w trójwymiarową architekturę biofilmu i teksturę matrycy. Połączenie opisanych tutaj metod może znacznie pomóc w badaniach nad rozwojem biofilmu w obecności i bez inhibitorów biofilmu oraz rzucić światło na mechanizm działania tych inhibitorów.

Wprowadzenie

Wielokomórkowe społeczności bakteryjne odgrywają znaczącą rolę w naturalnym i antropogenicznym środowisku i mogą być korzystne lub wysoce szkodliwe. Te wielokomórkowe kolonie są znane jako biofilmy, w których poszczególne komórki są osadzone w samodzielnie wytwarzanej zewnątrzkomórkowej matrycy substancji polimerowych (EPS). EPS silnie przylega komórki do powierzchni, którą kolonizują. Służą jako tarcza przed siłami mechanicznymi i chemicznymi oraz tworzą bliski kontakt między sąsiednimi komórkami, ułatwiając komunikację komórkową1. Biofilm może być postrzegany jako zróżnicowana społeczność, w której komórki wykorzystują wysoce regulowane, zaaranżowane procesy do koordynowania swoich działań w społeczności, a także między gatunkami2-5. Przejście od planktonicznego, wolno żyjącego trybu wzrostu do stanu biofilmu jest często związane z procesami rozwojowymi. Dobrym przykładem jest Gram-dodatnia bakteria glebowa Bacillus subtilis, dlatego nieudomowiony szczep służy jako solidny organizm modelowy do badania etapów rozwojowych prowadzących do tworzenia biofilmu. W tej bakterii ruchliwe komórki organizują się w wyraźne struktury wielokomórkowe, które wykonują wyspecjalizowane zadania4. Jedna grupa komórek, producenci macierzy, wydzielają egzopolisacharydy6, białko amyloidowe TasA7,8 i białko hydrofobowości powierzchniowej BslA9,10; wszystkie z nich uczestniczą w montażu EPS11-13.

Biorąc pod uwagę obfitość biofilmów w naturalnych i antropogenicznych niszach oraz przypuszczalne śmiertelne szkody, jakie mogą spowodować, istnieje pilna potrzeba znalezienia sposobów na zapobieganie ich powstawaniu. Inhibitory małocząsteczkowe mogą pomóc w odkryciu nowych szlaków regulacyjnych, enzymów i białek strukturalnych zaangażowanych w tworzenie biofilmu, a tym samym przyczynić się do uzyskania wglądu w złożone procesy tworzenia społeczności wielokomórkowych. Ponieważ B. subtilis jest dobrze zbadanym modelem tworzenia biofilmu14,15, może być wykorzystany do oceny działania różnych inhibitorów biofilmu. W badaniu przeanalizowano cztery podstawowe metody, które są kluczowe dla oceny odpowiedzi biofilmów na inhibitory małocząsteczkowe. Po pierwsze, aby zapewnić, że inhibitory te mają cel specyficzny dla biofilmu, kluczowe znaczenie ma oddzielenie wpływu na wzrost planktonu od wpływu na tworzenie biofilmu. Większość środków przeciwbakteryjnych celuje w komórki w fazie wzrostu planktonu, ale cząsteczki, które celują w biofilm, są rzadkie. Dodatkowo, ponieważ cząsteczki, które nie wpływają na wzrost planktonu, nie są toksyczne, mogą zmniejszać presję selekcyjną faworyzującą mutanty oporne na antybiotyki16. Na przykład, gdy biofilmy są traktowane D-aminokwasami lub niektórymi innymi cząsteczkami zakłócającymi ścianę komórkową, są one albo zaburzone, albo rozłożone, ale inhibitory te tylko nieznacznie wpływają na wzrost planktonu12,17. W przeciwieństwie do tego, wiele antybiotyków dramatycznie upośledza wzrost planktonu, z niewielkim lub żadnym wpływem na tworzenie biofilmu17.

Po drugie, kluczowe jest ustanowienie spójnych i solidnych ram eksperymentalnych do badania wpływu małych cząsteczek. Zaobserwowaliśmy, że aktywny zakres stężeń inhibitorów małocząsteczkowych był wrażliwy na warunki przed hodowlą i na konfigurację eksperymentalną stosowaną do badania wpływu tych małocząsteczkowych inhibitorów. Różne doniesienia, szczególnie te dotyczące B. subtilis, ujawniły różnice w zakresie stężeń, w których D-aminokwasy hamują tworzenie błonek – pływających biofilmów bakteryjnych12,17-19. Przedstawione wyniki sugerują, że za różnice w zakresie stężeń aktywnych odpowiadają następujące czynniki: warunki przed hodowlą (logarytmicznafaza wzrostu 12,17 w porównaniu z późno stacjonarnąfazą wzrostu 20), pożywka stosowana w warunkach przed hodowlą (bogata, nieokreślona [Luria Broth, LB] w porównaniu z zdefiniowaną [glutaminian sodu-glicerol, MSgg]), współczynnik inokulacji, a zwłaszcza usunięcie pożywki przed hodowlą przed inokulacją. Temperatura statycznego wzrostu błonki wykazała mniej istotną rolę w zakresie aktywności małocząsteczkowego inhibitora D-leucyny, reprezentatywnego D-aminokwasu użytego w tym badaniu.

Na koniec, gdy biofilmy zostaną potraktowane specyficznymi inhibitorami biofilmu, potrzebne są solidne i pouczające metody do scharakteryzowania wpływu tych inhibitorów na dostosowanie biofilmu. W tym miejscu szczegółowo opisano dwie metody niezależnego charakteryzowania działania inhibitorów drobnocząsteczkowych: (1) Wpływ na pojedyncze komórki w kolonii biofilmu i ich oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. Komórki w biofilmach są zazwyczaj bardziej odporne na antybiotyki w porównaniu z bakteriami wolno żyjącymi21-23. Chociaż zjawisko to jest wieloczynnikowe, zdolność EPS do zmniejszania penetracji antybiotyków była często uważana za atrakcyjne wyjaśnienie24. Metoda ta ocenia przeżywalność wcześniej utworzonych komórek biofilmu po ekspozycji na substancje przeciwbakteryjne. (2) Wpływ na architekturę kolonii biofilmu, od dużej do małej skali. Kolonie biofilmu charakteryzują się trójwymiarową strukturą i obecnością EPS. Wykorzystując skaningową mikroskopię elektronową, można wizualizować zmiany w morfologii komórki, strukturze kolonii biofilmu oraz architekturę i obfitość EPS od dużej (mm) do małej skali (μm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ocena wpływu inhibitorów małocząsteczkowych na tworzenie kolonii błony pellikularnej i biofilmu

  1. Przygotuj 2-krotny roztwór zdefiniowanej pożywki MSgg indukującej tworzenie biofilmu25 bez chlorku wapnia i heksahydratu chlorku żelaza(III). Po sterylizacji przez filtr należy dodać chlorek wapnia. Pożywka jest gotowa do bezpośredniego użycia lub może być przechowywana w 4 °C w ciemności.
  2. Przygotuj 1-krotne rozcieńczenie MSgg w dniu przeprowadzenia eksperymentu.
    1. Rozcień pożywkę 2x MSgg do stężenia 1x za pomocą sterylnej wody destylowanej (biofilmy) lub sterylnego 3% gorącego (80 °C) agar (biofilmy) i dodać sześciowodny chlorek żelaza(III) do stężenia końcowego wynoszącego 50 μM (błonie) lub 250 µM (biofilmy). Dodać antybiotyki lub inhibitory małocząsteczkowe do pożądanego stężenia i dokładnie wymieszać. Na przykład, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mM D-leucyny w 30 ml w celu wytworzenia błon pellicle lub biofilmów, należy dodać 196.6 µl roztworu zapasowego D-leucyny o stężeniu 76,3 mM (10 mg/ml).
      UWAGA: Końcowy skład pożywki 1x MSgg opisano w Tabela 1W porównaniu z oryginalną recepturą25, pożywka zawierała 50 µg/ml stężenie treoniny oraz żelaza niezbędne do wzrostu kolonii biofilmu na stałym podłożu MSgg zwiększono 2,5-krotnie, aby zoptymalizować pomarszczoną morfologię kolonii.
  3. Po zestaleniu agaru wysuszyć stałe płytki MSgg w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 30–45 min przed inokulacją.
  4. Aby wybrać specyficzne inhibitory zakłócające mechanizmy tworzenia się pellikuli (Rycina 1), wykluczając wpływ zastosowanych stężeń na wzrost planktoniczny oraz statyczny.
    1. Wyznaczyć wzrost planktoniczny (wzrost gęstości optycznej w czasie w hodowli płynnej) w prostej krzywej wzrostu, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm co godzinę aż do wystąpienia stacjonarnej fazy wzrostu.
    2. Aby potwierdzić, że zmierzona mętność hodowli odpowiada liczbie żywych komórek, należy oznaczyć liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) komórek w fazie wzrostu planktonicznego z hodowli wytrząsanej w kilku punktach czasowych.
    3. Aby ocenić wpływ inhibitorów małocząsteczkowych na wzrost statycznej pelikuli, należy zebrać komórki po 3-dniowej inkubacji w 23 °C z dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej, zaszczepionej w tych samych warunkach, które opisano w sekcjach 1.7-1.9, i wyznacz liczbę CFU. W przypadku tej kontroli należy użyć szczepu niezdolnego do tworzenia błony (pellicle), któremu brakuje operonów kodujących składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (t. j., B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
      UWAGA: Szczep ten jest zdolny do wzrostu w warunkach statycznych, lecz w przeciwieństwie do dzikiego typu tworzącego błonę (pellicle), wykazuje niedobór zdolności do wypływania na granicę fazy ciecz-powietrze, gdzie wzrost jest sprzyjany ze względu na wyższy poziom tlenu.26Zatem ten szczep z deficytem macierzy zewnątrzkomórkowej i błony pellicle jest rekomendowanym szczepem referencyjnym do oceny wzrostu w warunkach statycznych.
      UWAGA: W przypadku konkretnego przykładu niekanonicznego D-aminokwasu – D-leucyny opisanego poniżej – wykluczono wpływ na wzrost planktoniczny i stacjonarny przy stężeniach, które zakłócały tworzenie się pellikli12,17Metody określania wzrostu planktonicznego i statycznego zostały opisane szczegółowo.17.

Ocena celu biofilmu; schemat blokowy oceny inhibicji i cytotoksyczności; analiza inhibitora.
Rycina 1. Koncepcyjny przegląd procesu identyfikacji optymalnego układu eksperymentalnego do oceny specyficznego hamowania tworzenia biofilmu. Kryteria wyboru inhibitorów małocząsteczkowych wskazujących na specyficzne zakłócanie tworzenia biofilmu bez wyraźnego wpływu na wzrost planktoniczny. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Wysiać B. subtilis z zapasu przechowywanego w -80 °C (kultura LB o stężeniu 109 komórek/ml zamrożona w 20% glicerolu) w celu wyizolowania pojedynczych kolonii na płytce z agarem LB-1,5% za pomocą sterylnej końcówki lub aplikatora.
  2. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.
  3. KROK KRYTYCZNY: Aby uzyskać silne hamowanie tworzenia błony (pellicle) przez niekanoniczne D-aminokwasy, takie jak D-leucyna, pojedynczą kolonię pobraną z płytki z agarem LB-1,5% hodować w 3 ml bulionu LB w temperaturze 37 °C przez 4 h w inkubatorze wytrząsowym (prędkość wytrząsania 20 rpm). Przed inokulacją zastąpić bulion LB indukującym biofilm medium MSgg poprzez odwirowanie 1,5 ml kultury startowej przez 4 min przy 6,00 x g, ostrożne usunięcie supernatantu i resuspensję osadu w 1,5 ml medium MSgg. Pozostałą część kultury można usunąć.
    Ważne: Aby zapewnić powtarzalność systemu, gęstość optyczna przy 600 nm (OD60) wypłukanej kultury startowej powinna wynosić od 0,6 do 1.
  4. Podczas wzrostu kultury startowej przygotować 12-dołkową wielodołkową płytkę do hodowli komórkowych zawierającą 3 ml medium MSgg bez inhibitora lub z zakresem stężeń inhibitora małocząsteczkowego (np. 0,3, 0,5, 1 mM D-leucyny17). Aby wykluczyć efekt brzeżny, rozmieścić różne stężenia w różnych miejscach płytki. Alternatywnie można użyć 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych zawierających 1,5 ml medium MSgg.
  5. Zaszczepić dołki 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowych 3 µl wypłukanej kultury startowej (rozcieńczenie 1:1 0).
    UWAGA: Można zastosować niższe rozcieńczenie, tj. 1:50. Skraca to czas rozwoju błon.
  6. Hodować błony w temperaturze 23 °C w warunkach statycznych przez trzy dni. W tym czasie nie wolno przesuwać płytek, ponieważ może to wpłynąć na końcową morfologię powierzchni błony.
  7. Wykonać zdjęcia przy użyciu binokulara i jednorodnej ekspozycji światła. Alternatywnie można sfotografować błony za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości. Aby uniknąć artefaktów spowodowanych niejednolitymi kątami oświetlenia i cieniami, wykonywać zdjęcia z góry, z kamerą zamocowaną na statywie, używając miękkiego i dużego źródła światła pod kątem 45° z obu stron.
    UWAGA: Alternatywną metodą badania wielokomórkowości B. subtilis jest test kolonii biofilmu na stałym, indukującym biofilm medium MSgg. Podobnie jak w przypadku błon, test ten pozwala na badanie procesów spatiotemporalnych. Po ustaleniu czynnego zakresu inhibitorów małocząsteczkowych można badać ich wpływ na tworzenie kolonii biofilmu.
  8. Aby wyhodować kolonie biofilmu, symetrycznie nanosić 1,5 µl niewypłukanej prekultury (Krok 1.7) na wysuszoną płytkę z agarem MSgg 1,5% przy pomocy szablonu — 4 krople na płytkę Petriego o średnicy 8,5 cm. Pozostawić krople do czasu ich adsorpcji na płytce przed ich przesunięciem.
    UWAGA: Szablon pomaga uzyskać równomierny rozkład kolonii biofilmu w obszarze wzrostu komórek. Aby przygotować szablon, narysować całkowity obszar wzrostu w oryginalnej skali, podzielić go na równe sektory i zaznaczyć środek. Dla okrągłej płytki Petriego o średnicy 8,5 cm przypisuje to 14 cm2 na jedną kolonię biofilmu.
  9. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez trzy dni. W tym czasie rozwijają się kolonie biofilmu, tworząc trójwymiarową, pomarszczoną strukturę.
  10. Wykonać zdjęcia zgodnie z opisem w kroku 1.1.

2. Test oporności na etanol

  1. Hodować biofilmy zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.7 oraz 1.12-1.14.
  2. Po 68 hr wzrostu w temperaturze 30 °C, przeciąć kolonie biofilmu na dwie równe części za pomocą żyletki i szablonu.

Konfiguracja eksperymentu wzrostu biofilmu, kolonia bakteryjna na agarze, wirowanie, sonikacja, proces rozcieńczania.
Rysunek 2. Przykład projektu eksperymentalnego służącego do oceny odporności komórek kolonii biofilmu na środki sterylizujące. (A) Szablon wykorzystywany do równomiernego rozmieszczenia kolonii biofilmu na szalce Petriego oraz do wycinania. (B) Zdjęcia z góry nieleczonego biofilmu typu dzikiego, hodowanego przez 68 h na stałej, zdefiniowanej pożywce MSgg indukującej tworzenie biofilmu w 30 °CPowiększenie pokazuje, w jaki sposób kolonię biofilmu można przeciąć na dwie równe połowy.CDwie równe połowy biofilmu są traktowane w ten sam sposób (kontrola, PBS) lub odpowiednio PBS lub środkiem sterylizującym, a następnie przetwarzane zgodnie z opisem. Skala: 1 cm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Ostrożnie podnieś każdą połowę kolonii biofilmu z płytki agarowej za pomocą małej szpatułki i przenieś ją do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 50 µl soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). W razie potrzeby zeskrob pozostałe komórki z płytki i również przenieś je do probówki do mikrowirówki.
    UWAGA: Drugą połowę kolonii biofilmu traktuje się odmiennie, w zależności od tego, czy służy ona jako kontrola, czy do badania odporności na środki sterylizujące.
  2. W przypadku kontroli inkubuj drugą połowę kolonii biofilmu w 50 µl PBS, analogicznie jak w kroku 2.3. Aby ocenić odporność na środki sterylizujące, przenieś drugą połowę kolonii biofilmu do 50 µl 50% (v/v) etanolu.
    UWAGA: Można zastosować alternatywne środki sterylizujące, takie jak podchloryn sodu. Dla wszystkich stosowanych środków sterylizujących należy określić stężenie czynne oraz czas inkubacji w eksperymencie wstępnym.
  3. Inkubuj kolonie biofilmu przez 10 min na blacie w temperaturze pokojowej.
  4. Wiruj kolonie biofilmu przez 5 min przy 18 0 x g i ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety. Dodaj 30 µl PBS.
  5. Poddaj komórki łagodnej sonikacji (amplituda 10%, impuls 5 s) za pomocą mikrokońcówki sonikatora.
    UWAGA: Energia sonikacji musi być wystarczająca do rozdzielenia agregatów biofilmu. Jednak zbyt intensywna sonikacja może doprowadzić do lizy komórek. Potwierdź wcześniej za pomocą mikroskopii świetlnej, że zastosowana energia sonikacji nie powoduje lizy komórek i że wszystkie agregaty zostały rozpuszczone.
  6. Dodaj 70 µl PBS do uzyskania końcowej objętości 1 ml. Wykonaj rozcieńczenia seryjne (do 10-7) w PBS i wysew 100 µl z trzech rozcieńczeń na płytkę z agarem LB-1,5%, używając sterylnych szklanych kulek.
    UWAGA: Optymalne rozcieńczenia do wysewu należy określić w eksperymencie wstępnym, ponieważ zależy to od liczby komórek w badanej kolonii biofilmu oraz przeżywalności komórek w odpowiedzi na środek sterylizujący.
  7. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 30 °C, przelicz CFU i wyznacz wartość CFU/ml. Na podstawie końcowego wyniku CFU/ml dla każdej z połówek kolonii biofilmu oblicz procent przeżywalności.
    UWAGA: Przy przeprowadzeniu i analizie zgodnie z opisem, dwie połowy kontrolnej kolonii biofilmu oraz połowa nieleczona i połowa traktowana etanolem z nieleczonej kolonii biofilmu powinny wykazać różnice w liczbie żywych komórek poniżej 10%, co potwierdza odpowiednio symetrię lub odporność kolonii. Alternatywnie wyniki można przedstawić jako całkowitą liczbę CFU. Liczba komórek w kontrolnej i nieleczonej kolonii biofilmu powinna pozostać w tym samym rzędzie wielkości. W przeciwieństwie do tego, oczekuje się, że liczba komórek w połowie traktowanej etanolem z kolonii biofilmu leczonej cząsteczką o małej masie spadnie o co najmniej dwa rzędy wielkości, co pozwoli stwierdzić zwiększoną wrażliwość na środek sterylizujący.

3. Przygotowanie próbek kolonii biofilmu do skaningowej mikroskopii elektronowej

  1. Hodować kolonie biofilmu zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.7 oraz 1.12-1.14.
  2. Przygotować świeżą partię 2% (v/v) glutaraldehydu oraz 3% (v/v) roztworu paraformaldehydu w buforze 10 mM kakodylanu sodu i 5 mM chlorku wapnia o pH 7,3. Przygotować 5 ml utrwalacza dla każdej szalki Petriego o średnicy 8,5 cm.
    OSTROŻNIE: Glutaraldehyd i paraformaldehyd są substancjami niebezpiecznymi. Należy obchodzić się z nimi przy użyciu sprzętu ochronnego wewnątrz wyciągu chemicznego. Roztwory i zanieczyszczone materiały należy zutylizować jako odpady niebezpieczne.
  3. Ostrożnie dodać utrwalacz do kolonii biofilmu, nie dozując go bezpośrednio na powierzchnię biofilmu.
    UWAGA: Ze względu na hydrofobowy charakter kolonii biofilmu, kolonie powoli odrywają się od agaru i zaczynają pływać.
  4. Szalki szczelnie zamknąć paskiem Parafilmu. Inkubować na wstrząsarku rotacyjnym przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść szalki do temperatury 4 °C na noc.
  5. Następnego dnia ostrożnie usunąć ciecz za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej.
  6. Ostrożnie dodać 10 ml buforu 10 mM kakodylanu sodu i 5 mM chlorku wapnia, aby wypłukać biofilm, i inkubować przez 5 min. Ostrożnie usunąć ciecz pipetą Pasteura z narożnika szalki, aby uniknąć uszkodzenia biofilmu, i dodać świeży roztwór płuczący, delikatnie pipetując. Powtórzyć ten krok raz.
  7. W celu odwodnienia kolonii biofilmu przeprowadzić następujące etapy: 2x 5 min w ddH2O; 2x 20 min w 30% etanolu; 2x 20 min w 50% etanolu; 2x 20 min w 70% etanolu; 2x 20 min w 96% etanolu; 2x 30 min w 10% etanolu.
    1. W każdym kroku dodać 15 ml cieczy dla każdej szalki Petriego o średnicy 8,5 cm i ostrożnie usunąć ciecz po każdej inkubacji.
  8. Zastosować jedną z dwóch różnych metod suszenia próbek z etanolu.
    1. W przypadku suszenia powietrznego z etanolu:
      1. Wyciąć papier filtracyjny celulozowy (średnica 9 cm) na ćwiartki. Krótko zanurzyć jedną ćwiartkę w 10% etanolu, a następnie ostrożnie przenieść na nią jedną pływającą kolonię biofilmu. Umieścić mokry papier filtracyjny w szalce Petriego wyłożonej papierem filtracyjnym. Przykryć szalkę Petriego i pozostawić kolonie biofilmu do wyschnięcia na noc w wyciągu chemicznym.
    2. W przypadku suszenia w punkcie krytycznym (CP) z wykorzystaniem dwutlenku węgla (CO2) jako płynu przejściowego:
      1. Wypełnić 75% komory urządzenia do suszenia w punkcie krytycznym 10% etanolem. Przenieść próbki do uchwytu, każdą próbkę do oddzielnej komory. W razie potrzeby przeciąć biofilm nożyczkami na mniejsze kawałki. Próbki powinny pozostawać zanurzone w etanolu podczas wszystkich czynności. Następnie przenieść uchwyt do komory i szczelnie ją zamknąć.
      2. Schłodzić komorę do 7 °C i rozpocząć mieszanie. Wypełnić komorę całkowicie ciekłym CO2. Podczas 7-minutowego czasu inkubacji pozwolić etanolowi zmieszać się z CO2. Następnie usunąć 25% roztworu.
        UWAGA: Nie opróżniać komory poniżej poziomu próbki.
      3. Powtórzyć krok 3.8.2.2 cztery razy.
      4. Powtórzyć krok 3.8.2.2 pięć razy, stosując czas inkubacji wynoszący tylko 5 min. Ostatecznie etanol powinien zostać całkowicie zastąpiony przez CO2.
      5. Podczas ostatniej serii opróżnić tylko 5% komory. Wyłączyć mieszanie i chłodzenie. Rozpocząć ogrzewanie komory do 42 °C. W temperaturze 31,1 °C i pod ciśnieniem 73,9 bar ciekły CO2 osiąga swój punkt krytyczny, czyli stan, w którym faza gazowa ma taką samą gęstość jak faza ciekła rozpuszczalnika27. Po osiągnięciu temperatury 42 °C inkubować przez 10 min. W temperaturze 42 °C CO2 w komorze występuje jako gaz nadkrytyczny.
        UWAGA: Stale kontrolować ciśnienie w komorze. Ciśnienie nie powinno przekroczyć 120 bar w temperaturze 42 °C.
      6. Zacząć powoli uwalniać gaz przy ciągłym ogrzewaniu. Pozwala to utrzymać próbki w fazie gazowej CO2 i zapobiega deformacji morfologii próbki wskutek napięcia powierzchniowego cieczy. Ustawić przepływomierz na 5 L/h poprzez precyzyjną regulację zaworu dozującego sterującego przepływomierzem. Czekać, aż całe ciśnienie w komorze zostanie uwolnione. Teraz otworzyć komorę i ostrożnie wyjąć próbki z uchwytu.
  9. Pokryć podkład do mikroskopii elektronowej taśmą węglową. Za pomocą pęsety ostrożnie przenieść kolonie biofilmu na podkład. Połączyć każdą kolonię z podkładem, dodając cienki mostek z taśmy węglowej, co jest kluczowe dla eliminacji ładunków pod wiązką elektronów. Na tym etapie należy obchodzić się z koloniami biofilmu ostrożnie, ponieważ są one bardzo kruche. Przechowywać próbki w deskryka-torze przez co najmniej 24 h lub do czasu badania.
  10. W dniu badania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego napylić kolonie biofilmu przez 2 min pod kątem 60° w napylarce złoto-palladowej. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, obracając próbki o 120° pomiędzy cyklami. Na koniec napylić próbki raz przez 3 min od góry. Cienka warstwa złota i palladu o grubości 20 nm poprawia przewodność i zwiększa kontrast próbki podczas obrazowania w SEM.
  11. Przechowywać próbki w deskryka-torze, aby uniknąć rehydratacji próbki28 aż do momentu obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego29,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test tworzenia błony (pellicle assay) jest jedną z metod badania ściśle regulowanych i dynamicznych procesów wielokomórkowości B. subtilis. Ponadto test ten nadaje się do badania szeregu warunków przedstartowych lub stężeń małych cząsteczek w pojedynczej wielooddzielczej płytce do hodowli komórkowej w ramach jednego eksperymentu. Jednak tworzenie błony przez B. subtilis jest wrażliwe na warunki prekultury (np. pożywkę wzrostową prekultury i jej fazę wzrostu), stosunek szczepienia oraz usunięcie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Bacillus subtilis tworzy wytrzymałe i wysoce ustrukturyzowane biofilmy zarówno w cieczach (błonki), jak i na podłożu stałym (kolonie). W związku z tym służy jako idealny organizm modelowy do scharakteryzowania sposobu działania określonych inhibitorów biofilmu. Na pożywkach stałych komórki tworzą struktury wielokomórkowe o charakterystycznych cechach, które nie są widoczne w błonkach, takich jak zmarszczki promieniujące od środka do krawędzi. Tak więc błonki i kolonie są uzupełniającymi się systemami do badania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Obrazowanie mikroskopem elektronowym zostało przeprowadzone w Jednostce Mikroskopii Elektronowej Instytutu Naukowego Weizmanna, częściowo wspieranej przez Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. Badania te były również wspierane przez grant ISF I-CORE 152/1, Pana i Panią Dan Kane, Panią Lois Rosen, przez grant badawczy Yeda-Sela, przez Larson Charitable Foundation, przez Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, przez grant Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research, przez grant Ministerstwa Zdrowia na alternatywne metody badawcze, oraz przez Francusko-Izraelski Program Współpracy - Majmonide-Izrael Badawczy. IKG jest laureatem Katedry Rozwoju Kariery Rowland and Sylvia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rosół Luria, LennoxDifco240230
Bacto AgarDifco214010
Fosforan potasu jednozasadowy Sigma, 136,09 g/molP0662-500G
fosforan potasu dwuzasadowy Fisher Scientific, 174,18 g/molBP363-1
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowyFisher Scientific, 209,27 g/molBP308-500
sześciowodny chlorek magnezu Merck, 203,30 g/mol 1.05833.0250
chlorek wapnia bezwodnyJ.T. Baker, 110.98 g/mol1311-01
czterowodny chlorek manganu(II)Sigma, 197.91 g/mol31422-250G-R
chlorek żelaza(III) sześciowodny Sigma, 270.30 g/mies.)F2877-500G
chlorek bezwodny Acros Organics, 136,29 g/mol424592500
chlorowodorek tiaminySigma, 337,27 g/molT1270-100G
L-tryptofanFisher Scientific, 204,1 g/molBP395-100
L-fenyloalaninaSigma, 165,19 g/molP5482-100G
L-treoninaSigma, 119,12 g/molT8625-100G
glicerol bezwodnyBio-Lab Itd712022300
Sole monosodowe kwasu L-glutaminowego (hydrat )Sigma, 169.11 g/molG1626-1KG
D-leucynaSigma, 169.11 g/mol855448-10G
bezwodnyŻyletka Gadot830000054
okrągłej celulozyEddison NA
16220
paraformaldehyd EMS, 16% w wodzie15710
kakodylan soduMerck, 214,05 g/mol 8.2067
2-hydrat chlorku wapniaMerck, 147,02 g/mol 
aluminiowy uchwytaluminiowy EMS, głowica szczelinowa75230
taśma klejąca węglowaEMS77825-12
Wytrząsarka 37 & deg; CWirówka New Brunswick Scientific Innowa42NA
Wirówka stołowa Eppendorf 5424NA
Cyfrowy sonifier, model 250, używany z dwustopniowymMicrotip BransonNA
30 ° CInkubatorBinder NA
23 ° CBinderNA
System filtracyjny, 500 ml, polistyrenCornig IncorporatedNA
Wytrząsarka obrotowa - Orbitron Rotatory IIBoekelNA
S150 Napylarka rozpryskowa EdwardsNA
CPD 030 Suszarka do punktów krytycznychBAL-TECNA
Środowiskowy skaningowy mikroskop elektronowyXL30 ESEM FEG Philips (FEI)NA
etanol Bibuła filtracyjna z Whatman, 90 mm 1001-090 aldehyd glutarowy EMS (nauka o mikokopii elektronowej), 25% w wodzie 1172113 inkubatorem

Bibliografia

  1. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  2. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
  3. Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 55, 165-199 (2001).
  4. Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
  5. Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
  6. Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
  7. Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
  8. Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
  9. Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
  10. Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
  11. Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
  12. Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
  13. Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
  14. Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
  15. Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
  16. Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
  17. Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
  18. Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613(2015).
  19. Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
  20. Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
  21. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  22. Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
  23. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
  24. Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
  25. Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
  26. Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
  27. Bray, D. Methods in Biotechnology. 13, Humana Press Inc. 235-243 (2000).
  28. Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, Formatex Research Center. 248-255 (2010).
  29. Hayat, M. A. Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, Van Nostrand Reinhold Company. (1976).
  30. Schatten, H. Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , Cambridge University Press. (2013).
  31. Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
  32. Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
  33. Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
  34. Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
  35. Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
  36. Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
  37. Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
  38. Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031(2016).
  39. Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796(2012).
  40. Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
  41. Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, Woodhead Publishing. (2009).
  42. Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806(2012).
  43. Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
  44. Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol Bioeng. 100, 1-18 (2008).
  45. Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
  46. Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
  47. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
  48. Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
  49. Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
  50. Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
  51. Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
  52. Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
  53. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biofilmy Bacillus subtilismałocząsteczkowe inhibitorytworzenie biofilmuskaningowa mikroskopia elektronowatworzenie błony (pellicle)analiza CFUoporność na etanolpodłoże MSggmacierz zewnątrzkomórkowa
Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.