Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Podsumowanie

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Streszczenie

Ta praca ocenia różne metodologie badania wpływu małocząsteczkowych inhibitorów biofilmu, takich jak D-aminokwasy, na rozwój i odporność biofilmów Bacillus subtilis. Po pierwsze, przedstawiono metody, które selekcjonują inhibitory małocząsteczkowe z celami specyficznymi dla biofilmu w celu oddzielenia wpływu inhibitorów małocząsteczkowych na wzrost planktonu od ich wpływu na tworzenie biofilmu. Następnie skupiamy się na tym, jak warunki inokulacji wpływają na wrażliwość wielokomórkowych, pływających kultur B. subtilis na inhibitory małocząsteczkowe. Wyniki sugerują, że rozbieżności w zgłaszanym działaniu takich inhibitorów, jak D-aminokwasy, wynikają z niespójnych warunków przed hodowlą. Ponadto opisano niedawno opracowany protokół służący do oceny wpływu leczenia małymi cząsteczkami na oporność biofilmu na substancje przeciwbakteryjne. Na koniec przedstawiono techniki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu analizy trójwymiarowego układu przestrzennego komórek i otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej w biofilmie B. subtilis. SEM ułatwia wgląd w trójwymiarową architekturę biofilmu i teksturę matrycy. Połączenie opisanych tutaj metod może znacznie pomóc w badaniach nad rozwojem biofilmu w obecności i bez inhibitorów biofilmu oraz rzucić światło na mechanizm działania tych inhibitorów.

Wprowadzenie

Wielokomórkowe społeczności bakteryjne odgrywają znaczącą rolę w naturalnym i antropogenicznym środowisku i mogą być korzystne lub wysoce szkodliwe. Te wielokomórkowe kolonie są znane jako biofilmy, w których poszczególne komórki są osadzone w samodzielnie wytwarzanej zewnątrzkomórkowej matrycy substancji polimerowych (EPS). EPS silnie przylega komórki do powierzchni, którą kolonizują. Służą jako tarcza przed siłami mechanicznymi i chemicznymi oraz tworzą bliski kontakt między sąsiednimi komórkami, ułatwiając komunikację komórkową¹. Biofilm może być postrzegany jako zróżnicowana społeczność, w której komórki wykorzystują wysoce regulowane, zaaranżowane procesy do koordynowania swoich działań w społeczności, a także między gatunkami^2-5. Przejście od planktonicznego, wolno żyjącego trybu wzrostu do stanu biofilmu jest często związane z procesami rozwojowymi. Dobrym przykładem jest Gram-dodatnia bakteria glebowa Bacillus subtilis, dlatego nieudomowiony szczep służy jako solidny organizm modelowy do badania etapów rozwojowych prowadzących do tworzenia biofilmu. W tej bakterii ruchliwe komórki organizują się w wyraźne struktury wielokomórkowe, które wykonują wyspecjalizowane zadania⁴. Jedna grupa komórek, producenci macierzy, wydzielają egzopolisacharydy⁶, białko amyloidowe TasA^7,8 i białko hydrofobowości powierzchniowej BslA^9,10; wszystkie z nich uczestniczą w montażu EPS^11-13.

Biorąc pod uwagę obfitość biofilmów w naturalnych i antropogenicznych niszach oraz przypuszczalne śmiertelne szkody, jakie mogą spowodować, istnieje pilna potrzeba znalezienia sposobów na zapobieganie ich powstawaniu. Inhibitory małocząsteczkowe mogą pomóc w odkryciu nowych szlaków regulacyjnych, enzymów i białek strukturalnych zaangażowanych w tworzenie biofilmu, a tym samym przyczynić się do uzyskania wglądu w złożone procesy tworzenia społeczności wielokomórkowych. Ponieważ B. subtilis jest dobrze zbadanym modelem tworzenia biofilmu^14,15, może być wykorzystany do oceny działania różnych inhibitorów biofilmu. W badaniu przeanalizowano cztery podstawowe metody, które są kluczowe dla oceny odpowiedzi biofilmów na inhibitory małocząsteczkowe. Po pierwsze, aby zapewnić, że inhibitory te mają cel specyficzny dla biofilmu, kluczowe znaczenie ma oddzielenie wpływu na wzrost planktonu od wpływu na tworzenie biofilmu. Większość środków przeciwbakteryjnych celuje w komórki w fazie wzrostu planktonu, ale cząsteczki, które celują w biofilm, są rzadkie. Dodatkowo, ponieważ cząsteczki, które nie wpływają na wzrost planktonu, nie są toksyczne, mogą zmniejszać presję selekcyjną faworyzującą mutanty oporne na antybiotyki¹⁶. Na przykład, gdy biofilmy są traktowane D-aminokwasami lub niektórymi innymi cząsteczkami zakłócającymi ścianę komórkową, są one albo zaburzone, albo rozłożone, ale inhibitory te tylko nieznacznie wpływają na wzrost planktonu^12,17. W przeciwieństwie do tego, wiele antybiotyków dramatycznie upośledza wzrost planktonu, z niewielkim lub żadnym wpływem na tworzenie biofilmu¹⁷.

Po drugie, kluczowe jest ustanowienie spójnych i solidnych ram eksperymentalnych do badania wpływu małych cząsteczek. Zaobserwowaliśmy, że aktywny zakres stężeń inhibitorów małocząsteczkowych był wrażliwy na warunki przed hodowlą i na konfigurację eksperymentalną stosowaną do badania wpływu tych małocząsteczkowych inhibitorów. Różne doniesienia, szczególnie te dotyczące B. subtilis, ujawniły różnice w zakresie stężeń, w których D-aminokwasy hamują tworzenie błonek – pływających biofilmów bakteryjnych^12,17-19. Przedstawione wyniki sugerują, że za różnice w zakresie stężeń aktywnych odpowiadają następujące czynniki: warunki przed hodowlą (logarytmiczna^{faza wzrostu 12,17} w porównaniu z późno stacjonarną^{fazą wzrostu 20}), pożywka stosowana w warunkach przed hodowlą (bogata, nieokreślona [Luria Broth, LB] w porównaniu z zdefiniowaną [glutaminian sodu-glicerol, MSgg]), współczynnik inokulacji, a zwłaszcza usunięcie pożywki przed hodowlą przed inokulacją. Temperatura statycznego wzrostu błonki wykazała mniej istotną rolę w zakresie aktywności małocząsteczkowego inhibitora D-leucyny, reprezentatywnego D-aminokwasu użytego w tym badaniu.

Na koniec, gdy biofilmy zostaną potraktowane specyficznymi inhibitorami biofilmu, potrzebne są solidne i pouczające metody do scharakteryzowania wpływu tych inhibitorów na dostosowanie biofilmu. W tym miejscu szczegółowo opisano dwie metody niezależnego charakteryzowania działania inhibitorów drobnocząsteczkowych: (1) Wpływ na pojedyncze komórki w kolonii biofilmu i ich oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. Komórki w biofilmach są zazwyczaj bardziej odporne na antybiotyki w porównaniu z bakteriami wolno żyjącymi^21-23. Chociaż zjawisko to jest wieloczynnikowe, zdolność EPS do zmniejszania penetracji antybiotyków była często uważana za atrakcyjne wyjaśnienie²⁴. Metoda ta ocenia przeżywalność wcześniej utworzonych komórek biofilmu po ekspozycji na substancje przeciwbakteryjne. (2) Wpływ na architekturę kolonii biofilmu, od dużej do małej skali. Kolonie biofilmu charakteryzują się trójwymiarową strukturą i obecnością EPS. Wykorzystując skaningową mikroskopię elektronową, można wizualizować zmiany w morfologii komórki, strukturze kolonii biofilmu oraz architekturę i obfitość EPS od dużej (mm) do małej skali (μm).

Protokół

1. Ocena wpływu inhibitorów małych cząsteczek na tworzenie kolonii błonek i biofilmu

1. Przygotować 2x roztwór określonego podłoża MSgg²⁵ indukującego biofilm bez sześciowodnego chlorku wapnia i chlorku żelaza(III). Po sterylizacji filtra dodaj chlorek wapnia. Pożywka jest gotowa do użycia bezpośrednio lub może być przechowywana w temperaturze 4 °C w ciemności.
2. Przygotować 1x rozcieńczenie MSgg w dniu eksperymentu.
   1. Rozcieńczyć 2x pożywkę MSgg do 1x sterylną wodą destylowaną (błonki) lub sterylnym 3% gorącym (80 °C) agarem (biofilmy) i dodać sześciowodny chlorek żelaza(III) do końcowego stężenia 50 μM (błonki) lub 250 μM (biofilmy). Dodaj antybiotyki lub inhibitory drobnocząsteczkowe do pożądanego stężenia i dobrze wymieszaj. Na przykład, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mM D-leucyny w 30 ml w celu utworzenia błonek lub biofilmów, dodaj 196,6 μl roztworu podstawowego D-leucyny o stężeniu 76,3 mM (10 mg/ml).
      UWAGA: Ostateczny skład 1x MSgg jest opisany w Tabeli 1. W porównaniu z oryginalną recepturą²⁵, pożywka zawierała 50 μg/ml treoniny, a stężenie żelaza do hodowli kolonii biofilmu na stałym podłożu MSgg zostało zwiększone 2,5 raza w celu optymalizacji morfologii pomarszczonej kolonii.
3. Po zestaleniu agaru należy wysuszyć stałe płytki MSgg w kapturze biologicznym przez 30-45 minut przed inokulacją.
4. Aby wybrać specyficzne inhibitory, które zakłócają mechanizmy tworzenia błonki (ryc. 1), należy wykluczyć, że zastosowane stężenia wpływają na wzrost planktonowy i statyczny.
   1. Określić wzrost planktonu (wzrost gęstości optycznej w czasie w ciekłej kulturze) na prostej krzywej wzrostu, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm co godzinę aż do stacjonarnej fazy wzrostu.
   2. Aby potwierdzić, że zmierzone zmętnienie kultury reprezentuje liczbę żywych komórek, należy określić liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) komórek w fazie wzrostu planktonu z kultury wstrząsającej po kilku punktach czasowych.
   3. W celu oceny wpływu inhibitorów małocząsteczkowych na statyczny wzrost błonki, należy pobrać komórki pod koniec 3-dniowej inkubacji w temperaturze 23 °C z 24-dołkowego dołka do hodowli komórkowej, zaszczepić w tych samych warunkach, jak opisano w sekcjach 1.7-1.9 i oznaczyć CFU. Do tej kontroli należy użyć szczepu z niedoborem błonki, który nie ma operonów kodujących składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (tj. B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
      UWAGA: Szczep ten jest zdolny do wzrostu w warunkach statycznych, ale w przeciwieństwie do dzikiego typu tworzącego błonkę, ma niedobór zdolności do unoszenia się na granicy faz ciecz-powietrze, gdzie wzrost jest korzystny ze względu na zwiększony poziom tlenu²⁶. Tak więc, ten szczep z niedoborem macierzy zewnątrzkomórkowej i błonki jest zalecanym szczepem referencyjnym do oceny wzrostu w warunkach statycznych.
      UWAGA: Dla konkretnego przykładu niekanonicznego D-aminokwasu D-leucyny opisanego poniżej, wykluczono wpływ na planktonowy i statyczny wzrost w stężeniach, które zakłócały tworzenie się błonek^12,17. Metody określania wzrostu planktonowego i statycznego opisano szczegółowo¹⁷.

Rysunek 1. Przegląd koncepcyjny w celu identyfikacji solidnego układu doświadczalnego do oceny specyficznego hamowania tworzenia się biofilmu. Kryteria wyboru inhibitorów małocząsteczkowych, które wskazują na specyficzną interferencję z tworzeniem biofilmu bez wyraźnego wpływu na wzrost planktonu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Usunąć B. subtilis z wywaru o temperaturze -80 °C (kultura LB 10 9 komórek/ml zamrożona w 20% glicerolu), aby wyizolować pojedyncze kolonie na płytce agarowej LB-1,5% za pomocą sterylnej końcówki lub aplikatora.
6. Rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C.
7. ETAP KRYTYCZNY: Aby uzyskać silne hamowanie błonki przez niekanoniczne D-aminokwasy, takie jak D-leucyna, hoduj pojedynczą kolonię pobraną z płytki agarowej LB-1,5% w 3 ml bulionu LB w temperaturze 37 °C przez 4 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem (prędkość wytrząsania 200 obr./min). Zastąp bulion LB pożywką MSgg indukującą biofilm przed inokulacją, odwirowując 1,5 ml kultury starterowej przez 4 minuty przy 6,000 x g, ostrożnie usuwając supernatant i ponownie zawieszając osad w 1,5 ml pożywki MSgg. Resztę kultury można wyrzucić.
   Ważne: Aby zapewnić solidność systemu, gęstość optyczna przemytej kultury starterowej przy 600 nm (OD₆₀₀) powinna wynosić od 0,6 do 1.
8. Podczas wzrostu kultury starterowej należy przygotować 12-dołkową płytkę wielodaniową do hodowli komórkowych zawierającą 3 ml pożywki MSgg bez lub z zakresem stężeń inhibitora drobnocząsteczkowego (np. 0,3, 0,5, 1 mM D-leucyny¹⁷). Aby wykluczyć efekty krawędziowe, rozłóż rozmieszczenie różnych stężeń na płytce wielotalerzowej. Alternatywnie można użyć 24-dołkowych płytek wielodaniowych do hodowli komórkowych zawierających 1,5 ml pożywki MSgg.
9. Zaszczepić studzienki na wielotalerzowej 12-dołkowej kulturze komórkowej 3 μl przemytej kultury starterowej (rozcieńczenie 1:1 000).
   UWAGA: Można zastosować niższy współczynnik rozcieńczenia, tj. 1:500. Skraca to czas rozwoju błonek.
10. Błonki należy hodować w temperaturze 23 °C w warunkach statycznych przez trzy dni. W tym czasie nie należy przesuwać błonek, ponieważ może to wpłynąć na ostateczną morfologię powierzchni błonki.
11. Rób zdjęcia za pomocą lornetki i jednorodnej ekspozycji błyskawic. Alternatywnie zrób zdjęcie błonek za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości. Aby uniknąć artefaktów spowodowanych niespójnymi kątami światła i cieniami, rób zdjęcia z góry z aparatem zamocowanym na statywie i używaj miękkiego i dużego źródła światła pod kątem 45° z obu stron.
    UWAGA: Alternatywną metodą badania wielokomórkowości B. subtilis jest test kolonii biofilmu na stałym, indukującym biofilm pożywce MSgg. Podobnie jak błonki, test ten umożliwia badanie procesów czasoprzestrzennych. Po określeniu zakresu aktywnego inhibitorów małocząsteczkowych można badać ich wpływ na tworzenie kolonii biofilmu.
12. Aby wyhodować kolonie biofilmu, symetrycznie umieść 1,5 μl niemytej kultury wstępnej (krok 1.7) na wysuszonej płytce agarowej MSgg 1,5% za pomocą szablonu — 4 krople na szalkę Petriego o średnicy 8,5 cm. Pozwól, aby krople przyciągnęły się do płytki przed ich przeniesieniem.
    UWAGA: Szablon pomaga uzyskać równomierne rozmieszczenie kolonii biofilmu w obszarze, w którym rosną komórki. Aby przygotować szablon, narysuj całkowity obszar wzrostu w oryginalnych skalach, podziel go na równe sektory i zaznacz środek. W przypadku okrągłej szalki Petriego o średnicy 8,5 cm przypisuje to 14^cm2 jednej kolonii biofilmu.
13. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez trzy dni. W tym czasie rozwijają się kolonie biofilmu, które tworzą trójwymiarową, pomarszczoną strukturę.
14. Zrób zdjęcia jak w kroku 1.11.

2. Test odporności na etanol

1. Hoduj biofilmy zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.7 i 1.12-1.14.
2. Po 68 godzinach wzrostu w temperaturze 30 °C należy przeciąć kolonie biofilmu na dwie równe części za pomocą żyletki i szablonu.

Rysunek 2. Przykładowy projekt eksperymentalny do oceny odporności komórek kolonii biofilmu na czynniki sterylizujące. (A) Szablon stosowany do równomiernego rozmieszczenia kolonii biofilmu na szalce Petriego oraz do cięcia. (B) Obrazy z góry przedstawiające niepoddanego działaniu biofilmu typu dzikiego hodowanego przez 68 godzin na stałym, określonym pożywce MSgg indukującej biofilm w temperaturze 30 °C. Powiększenie pokazuje, w jaki sposób kolonia biofilmu może zostać przecięta na dwie równe połowy. (C) Dwie równe połówki biofilmu są traktowane jednakowo (kontrola, PBS) lub PBS lub środkiem sterylizującym i przetwarzane zgodnie z opisem. Podziałka: 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Ostrożnie podnieść każdą połówkę kolonii biofilmu z płytki agarowej za pomocą małej szpatułki i przenieść ją do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). W razie potrzeby zeskrobać pozostałe komórki z płytki i przenieść je również do probówki do mikrowirówki.
   UWAGA: Druga połowa kolonii biofilmu jest traktowana w różny sposób, w zależności od tego, czy jest to kontrola, czy badanie odporności na czynniki sterylizujące.
4. Do celów kontrolnych należy inkubować drugą połowę kolonii biofilmu w 500 μl PBS, jak w kroku 2.3. Aby ocenić odporność na środki sterylizujące, należy przenieść drugą połowę kolonii biofilmu do 500 μl 50% (v/v) etanolu.
   UWAGA: Można stosować alternatywne środki sterylizujące, takie jak podchloryn sodu. Dla wszystkich stosowanych środków sterylizujących należy określić stężenie aktywne i czas inkubacji we wstępnym doświadczeniu.
5. Inkubować kolonie biofilmu przez 10 minut na stole w temperaturze pokojowej.
6. Odwirować kolonie biofilmu przez 5 minut przy 18 000 x g i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Dodać 300 μl PBS.
7. Sonikuj komórki łagodnie (amplituda 10%, puls 5 sekund) za pomocą mikrokońcówki sonikatora.
   UWAGA: Energia sonikacji musi być wystarczająca do oddzielenia agregatów biofilmu. Jednak zbyt ostra sonikacja może spowodować lizę komórek. Potwierdzić z wyprzedzeniem za pomocą mikroskopii świetlnej, że użyta energia sonikacji nie powoduje lizy komórek i że wszystkie agregaty są rozpuszczone.
8. Dodać 700 μl PBS do końcowej objętości 1 ml. Wykonać seryjne rozcieńczenie (do ^10-7) w PBS i rozprowadzić 100 μl 3 rozcieńczeń na płytce agarowej LB-1,5% za pomocą sterylnych kulek szklanych.
   UWAGA: Optymalne rozcieńczenia do posiewu powinny zostać określone we wstępnym doświadczeniu, ponieważ zależy to od ilości komórek w kolonii biofilmu będącej przedmiotem zainteresowania i wskaźnika przeżycia komórek w odpowiedzi na środek sterylizujący.
9. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 30 °C, policzyć jtk i oznaczyć jtk/ml. Na podstawie końcowej jtk/ml każdej połowy kolonii biofilmu oblicz odsetek osób, które przeżyły.
   UWAGA: Podczas wykonywania i analizowania zgodnie z opisem, dwie połówki kolonii biofilmu kontrolnego i nietraktowana etanolem połowa kolonii biofilmu niepoddanego działaniu etanolu powinny wykazywać różnice poniżej 10% w liczbie komórek żywotnych, weryfikując odpowiednio symetrię lub odporność kolonii. Alternatywnie, wyniki można przedstawić w całkowitej liczbie CFU. Liczba komórek w kontrolnej i niepoddanej działaniu biofilmu kolonii powinna pozostać w tym samym rzędzie wielkości. W przeciwieństwie do tego, oczekuje się, że liczba komórek w połowie kolonii biofilmu poddanego działaniu etanolu poddanej działaniu biofilmu poddanego działaniu etanolu spadnie o co najmniej dwa rzędy wielkości, aby stwierdzić zwiększoną wrażliwość na środek sterylizujący.

3. Przygotowanie próbki kolonii biofilmu do skaningowej mikroskopii elektronowej

1. Hoduj kolonie biofilmu zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.7 i 1.12-1.14.
2. Przygotować świeżą partię 2% (v/v) aldehydu glutarowego, 3% (v/v) roztworu paraformaldehydu w 100 mM kakodylanu sodu, 5 mM buforu chlorku wapnia, pH 7,3. Przygotować 5 ml utrwalacza na każdą szalkę Petriego o średnicy 8,5 cm.
   UWAGA: Aldehyd glutarowy i paraformaldehyd są niebezpieczne. Obchodzić się z nimi za pomocą sprzętu ochronnego wewnątrz kaptura chemicznego. Wyrzuć roztwory i zanieczyszczone materiały do odpadów niebezpiecznych.
3. Ostrożnie dodać utrwalacz do kolonii biofilmu, nie dozując go bezpośrednio na biofilmy.
   UWAGA: Ze względu na hydrofobowy charakter kolonii biofilmu, kolonie powoli odrywają się od agaru i zaczynają unosić się na wodzie.
4. Ostrożnie uszczelnij płytki paskiem Parafilmu. Inkubować na wytrząsarce obrotowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść płytki do temperatury 4 °C na noc.
5. Następnego dnia ostrożnie usuń płyn za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej.
6. Ostrożnie dodać 10 ml 100 mM kakodylanu sodu, 5 mM buforu chlorku wapnia, aby przepłukać biofilm i inkubować przez 5 minut. Delikatnie usunąć płyn szklaną pipetą Pasteura z rogu płytki, aby uniknąć uszkodzenia biofilmu, i dodać świeży roztwór myjący, delikatnie pipetując. Powtórz ten krok raz.
7. W celu odwodnienia kolonii biofilmu należy postępować zgodnie z następującymi krokami: 2x 5 min w ddH₂O; 2x 20 min w 30% etanolu; 2x 20 min w 50% etanolu; 2x 20 min w 70% etanolu; 2x 20 min w 96% etanolu; 2x 30 min w 100% etanolu.
   1. Dodać 15 ml płynu na każdą szalkę Petriego o średnicy 8,5 cm w każdym etapie i ostrożnie usunąć płyn po każdej inkubacji.
8. Do suszenia próbek z etanolu należy użyć jednej z dwóch różnych metod.
   1. Do suszenia na powietrzu z etanolu:
      1. Pokrój celulozową bibułę filtracyjną (średnica 9 cm) na ćwiartki. Na krótko zanurz jedną czwartą w 100% etanolu, a następnie ostrożnie przenieś na nią jedną pływającą kolonię biofilmu. Umieść mokrą bibułę filtracyjną na szalce Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną. Przykryj szalkę Petriego i pozostaw kolonie biofilmu do wyschnięcia przez noc w kapturze chemicznym.
   2. Dla suszenia w punkcie krytycznym (CP) przy użyciu dwutlenku węgla (CO₂ ) jako płynu przejściowego:
      1. Napełnij 75% komory suszarki w punkcie krytycznym 100% etanolem. Przenieść próbki do uchwytu, a każda próbka do osobnej komory. W razie potrzeby pokrój biofilm nożyczkami na mniejsze kawałki. Pozostawić próbki zanurzone w etanolu podczas całego obchodzenia się z alkoholem etylowym. Następnie przenieś uchwyt do komory i szczelnie zamknij komorę.
      2. Schłodzić komorę do temperatury 7 °C i rozpocząć mieszanie. Całkowicie napełnij komorę ciekłym CO₂ . Podczas 7-minutowego czasu inkubacji pozwól, aby etanol zmieszał się z CO₂ . Następnie wylej 25% roztworu.
         UWAGA: Nie opróżniaj komory poniżej poziomu sample.
      3. Powtórz krok 3.8.2.2 cztery razy.
      4. Powtórzyć krok 3.8.2.2 pięć razy z czasem inkubacji wynoszącym tylko 5 minut. Na koniec etanol powinien zostać całkowicie zastąpiony przez CO₂ .
      5. Podczas ostatniej rundy opróżnij tylko 5% komory. Wyłącz mieszanie i chłodzenie. Rozpocząć podgrzewanie komory do 42 °C. W temperaturze 31,1 °C i ciśnieniu 73,9 bar ciekły CO₂ osiąga punkt krytyczny, stan, w którym faza gazowa ma taką samą gęstość jak faza ciekła rozpuszczalnika²⁷. Gdy temperatura osiągnie 42 °C, inkubować przez 10 minut. W temperaturze 42 °C CO₂ w komorze występuje jako gaz nadkrytyczny.
         UWAGA: Stale sprawdzaj ciśnienie w komorze. Ciśnienie nie powinno przekraczać 120 bar w temperaturze 42 °C.
      6. Zacznij powoli uwalniać gaz przy ciągłym ogrzewaniu. Utrzymuje to próbki w fazie gazowej_CO2 i zapobiega deformacji morfologii próbki pod wpływem napięcia powierzchniowego cieczy. Ustaw przepływomierz na 5 l/h, precyzyjnie dostrajając zawór dozujący sterujący przepływomierzem. Poczekaj, aż całe ciśnienie w komorze zostanie zwolnione. Teraz otwórz komorę i ostrożnie wyjmij próbki z uchwytu.
9. Pokryj kikut mikroskopii elektronowej taśmą węglową. Za pomocą pęsety ostrożnie przenieś kolonie biofilmu na kikut. Połącz każdą kolonię z króćcem, dodając cienki mostek z taśmy węglowej, która ma kluczowe znaczenie dla eliminacji ładunku pod wiązką elektronów. Na tym etapie należy obchodzić się z koloniami biofilmu ostrożnie, ponieważ są one bardzo delikatne. Próbki należy przechowywać w eksykatorze przez co najmniej 24 godziny lub do czasu badania.
10. W dniu badania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego napylać kolonie biofilmu przez 2 minuty pod kątem 60° w napylarce złoto-palladowej. Powtórz ten krok dwukrotnie i obróć próbki o 120° pomiędzy nimi. Na koniec napyl próbki raz na 3 minuty od góry. Cienka warstwa złota i palladu o długości 20 nm poprawia przewodność i zwiększa kontrast próbki do obrazowania w SEM.
11. Przechowywać próbki w eksykatorze, aby uniknąć ponownego uwodnienia próbki²⁸ do czasu obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego^29,30.

Wyniki

Test błonki jest jedną z metod badania wysoce regulowanych i dynamicznych procesów wielokomórkowości B. subtilis. Poza tym test błonki nadaje się do testowania szeregu warunków przed starterem lub stężeń małych cząsteczek na pojedynczej płytce wielodaniowej z hodowlą komórkową w jednym eksperymencie. Jednak tworzenie się błonki B. subtilis jest wrażliwe na warunki poprzedzające hodowlę (np. pożywkę wzrostową kultury wstępnej i jej fazę wzrostu), współczynnik inokulacji i usunięcie pożywki przed...

Dyskusja

Bacillus subtilis tworzy wytrzymałe i wysoce ustrukturyzowane biofilmy zarówno w cieczach (błonki), jak i na podłożu stałym (kolonie). W związku z tym służy jako idealny organizm modelowy do scharakteryzowania sposobu działania określonych inhibitorów biofilmu. Na pożywkach stałych komórki tworzą struktury wielokomórkowe o charakterystycznych cechach, które nie są widoczne w błonkach, takich jak zmarszczki promieniujące od środka do krawędzi. Tak więc błonki i kolonie są uzupełniającymi się systemami do badania ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rosół Luria, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
fosforan potasu dwuzasadowy	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
sześciowodny chlorek magnezu	Merck, 203,30 g/mol	1.05833.0250
chlorek wapnia bezwodny	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
czterowodny chlorek manganu(II)	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
chlorek żelaza(III) sześciowodny	Sigma, 270.30 g/mies.)	F2877-500G
chlorek bezwodny	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
chlorowodorek tiaminy	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-tryptofan	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-fenyloalanina	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-treonina	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
glicerol bezwodny	Bio-Lab Itd	712022300
Sole monosodowe kwasu L-glutaminowego (hydrat )	Sigma, 169.11 g/mol	G1626-1KG
D-leucyna	Sigma, 169.11 g/mol	855448-10G
bezwodny	Żyletka Gadot	830000054
okrągłej celulozy	Eddison NA
		16220
paraformaldehyd	EMS, 16% w wodzie	15710
kakodylan sodu	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
2-hydrat chlorku wapnia	Merck, 147,02 g/mol
aluminiowy uchwyt	aluminiowy EMS, głowica szczelinowa	75230
taśma klejąca węglowa	EMS	77825-12
Wytrząsarka 37 & deg; C	Wirówka New Brunswick Scientific Innowa42	NA
	Wirówka stołowa Eppendorf 5424	NA
Cyfrowy sonifier, model 250, używany z dwustopniowym	Microtip Branson	NA
30 ° C	Inkubator	Binder NA
23 ° C	Binder	NA
System filtracyjny, 500 ml, polistyren	Cornig Incorporated	NA
Wytrząsarka obrotowa - Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Napylarka rozpryskowa	Edwards	NA
CPD 030 Suszarka do punktów krytycznych	BAL-TEC	NA
Środowiskowy skaningowy mikroskop elektronowy	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA