Pomiar postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu stwardnienia rozsianego

Mysi wirus zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) to neurotropowy jednoniciowy wirus RNA, który uporczywie infekuje mysi ośrodkowy układ nerwowy (OUN). U wrażliwych myszy zakażenie TMEV powoduje przewlekłą chorobę demielinizacyjną o podłożu immunologicznym, znaną jako choroba demielinizacyjna indukowana przez TMEV (TMEV-IDD). Eksperymentalne zakażenie myszy przebiega podobnie jak w postępujących postaciach stwardnienia rozsianego (SM). TMEV-IDD charakteryzuje się dwiema odrębnymi fazami: fazą ostrą i fazą przewlekłą. Ostra faza to łagodne, zwykle subkliniczne zapalenie mózgu^1,2. Druga, przewlekła faza, rozpoczynająca się około miesiąca po zakażeniu, polega na powoli postępującej niepełnosprawności charakteryzującej się demielinizacją, stanem zapalnym i uszkodzeniem aksonów^1,2. Osłabienie obserwowane u myszy wiąże się ze spastycznością, a czasami z silnymi skurczami tonicznymi.

Ponieważ obecnie nie ma leków łagodzących postępującą niepełnosprawność u pacjentów, badacze są szczególnie zainteresowani TMEV-IDD, który stanowi optymalny model zwierzęcy do monitorowania wpływu leków modyfikujących przebieg choroby. Jednak zarówno u myszy, jak i u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, monitorowanie postępu niepełnosprawności wymaga ciągłej obserwacji klinicznej przez dłuższy czas. U myszy długoterminowe monitorowanie postępu niepełnosprawności można przeprowadzić za pomocą testu wydajności Rotarod.

Test wydajności Rotarod to standardowy test behawioralny, który ocenia funkcje motoryczne, takie jak koordynacja, równowaga i zmęczenie u gryzoni. Myszy muszą utrzymywać równowagę na obracającym się pręcie, który obraca się pod ciągłym przyspieszeniem; Rejestrowane jest opóźnienie czasowe do upadku z tego pręta. Zwierzęta z dysfunkcją neurologiczną nie są w stanie utrzymać się na obracającym się pręcie tak długo, jak grupy kontrolne, i zwykle odpadają, gdy prędkość obrotowa przekracza ich zdolność motoryczną. Im większe upośledzenie neurologiczne mają zwierzęta, tym szybciej spadną z pręta i tym krótsze jest opóźnienie czasowe.

Przewaga testu Rotarod nad tradycyjnymi wizualnymi systemami punktacji polega na tym, że generuje on obiektywną, mierzalną zmienną - opóźnienie czasowe - która ostatecznie może być wykorzystana do analiz statystycznych w celu ilościowego określenia efektów terapii i procedur eksperymentalnych³.

W Laboratorium Neuroimmunologii (LONI) w Dartmouth, myszy są poddawane protokołowi adaptacyjnemu, gdzie są testowane przed zakażeniem TMEV w celu zapoznania ich z maszyną i oceny ich normalnej "wyjściowej" równowagi, koordynacji i kontroli motorycznej^4,5. Po ustaleniu linii bazowej i zakażeniu myszy TMEV są one testowane raz lub dwa razy w tygodniu przez okres kilku miesięcy. Właściwy protokół badania trwa średnio 150 dni, co pozwala na ocenę spadku równowagi, koordynacji i kontroli motorycznej w całym przebiegu choroby demielinizacyjnej.

Do tej pory w Dartmouth przetestowano kilkaset myszy TMEV-IDD i myszy leczonych pozorowanym pod kątem dysfunkcji neurologicznych. Myszy te otrzymały różne terapie immunomodulujące, ale żaden środek farmakologiczny nie okazał się skuteczny w łagodzeniu progresji niepełnosprawności^6,7. Niniejszy artykuł i związany z nim protokół opisują, jak scharakteryzować postępujące upośledzenie neurologiczne wykazywane przez myszy TMEV-IDD. W szczególności protokół zawiera zalecenia dotyczące określonych parametrów testowych, które uważa się za ogólnie odpowiednie do badania niepełnosprawności neurologicznej u myszy TMEV-IDD za pomocą testu Rotarod. Procedura ta stanowi punkt odniesienia, w stosunku do którego można ocenić (1) znaczenie tego modelu myszy dla postępującego stwardnienia rozsianego oraz (2) jego przydatność do testowania terapii mających na celu leczenie postępujących schorzeń neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Oczywiście, test wydajności Rotarod oraz obecnie zoptymalizowane parametry i protokół testowy są przydatne nie tylko w wykrywaniu postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu TMEV-IDD, ale są również przydatne w odkrywaniu upośledzeń w innych indukowanych przez wirusy i/lub genetycznych mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych.

Wszystkie prace ze zwierzętami wykorzystują protokoły sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Geisel School of Medicine w Dartmouth.

1. Model myszy

1. Indukcja choroby demielinizacyjnej wywołanej TMEV
   1. Przenieś klatki zawierające 4- do 6-tygodniowe samice myszy SJL/JHan ze stojaka do wygodnego miejsca pracy. Oznacz myszy (np. kolczykiem lub dziurkaczem w uchu), aby umożliwić indywidualną ocenę choroby klinicznej i histologicznej.
   2. Pobrać 30 μl materiału infekującego TMEV (2 x 10⁶ jednostek tworzących płytkę nazębną; PFU) w PBS do strzykawki insulinowej i igły o rozmiarze 29G.
   3. Przygotuj aparat do znieczulenia gazem: sprawdź system, aby upewnić się, że na czas trwania zabiegu jest odpowiednia ilość tlenu i izofluranu.
   4. Włączyć przepływomierz na 1 l/min. Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej i uszczelnić górę. Włącz waporyzator na 3,5% i monitoruj zwierzę aż do leżenia.
   5. Wyjmij zwierzę z komory i przetestuj mysz, ściskając podnóżek, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie. Brak reakcji na silne uszczypnięcie świadczy o odpowiednim znieczuleniu.
   6. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia 70% alkoholem izopropylowym.
   7. Wstrzyknąć 30 μl materiału infekującego TMEV do prawej półkuli mózgowej za pomocą wstrzyknięcia z wolnej ręki (ryc. 1). Miejsce wstrzyknięcia znajduje się mniej więcej w połowie drogi między linią oka a linią ucha i tuż poza linią środkową.
   8. Przywróć mysz do klatki trzymania, gdy jest w pełni czujna i mobilna (zwykle 3-5 minut).
   9. Myszy należy poddać eutanazji przez wykrwawienie lub perfuzję serca od 3 do 6 miesięcy po zakażeniu TMEV, w zależności od szybkości rozwoju choroby.

2. Analiza Rotarod

1. Aparat Rotarod
   1. Przetestuj myszy przed zakażeniem TMEV, aby zapoznać je z maszyną i ocenić ich normalną równowagę wyjściową, koordynację i kontrolę motoryczną.
   2. Rozpocznij protokół adaptacyjny w ciągu -5 dni po infekcji (dpi; tj. 5 dni przed zakażeniem TMEV).
   3. Pozwól myszom zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut przed badaniem Rotarod, aby umożliwić im dostosowanie się do środowiska.
   4. Upewnij się, że zarówno jednostka Rotarod, jak i komputer są podłączone i połączone ze sobą (Rysunek 2).
   5. Wstępnie ustaw Rotarod z parametrami protokołu treningowego -5 dpi, jak opisano w Tabeli 1.
   6. Zapisz plik roboczy z datą i danymi identyfikacyjnymi.
   7. Przenieś klatkę zawierającą drużynę, która ma zostać przetestowana, ze stojaka na stół przylegający do Rotarodu. Myszy są zwykle testowane w oddziałach po 4 osoby.
   8. Podnieś mysz za ogon i połóż ją na pręcie, odwróconą tyłem do operatora. Powtórz od drugiej do czwartej myszy. Jeśli mysz upadnie lub podskoczy, umieść ją z powrotem na swoim pasie na Rotarodzie, aż wszystkie myszy znajdą się na swoich pozycjach. Zignoruj, jeśli jakiekolwiek myszy odwrócą się twarzą do operatora.
   9. Po załadowaniu wszystkich myszy naciśnij przycisk "Enter", aby rozpocząć eksperyment. Obserwuj, jak timery uruchamiają się automatycznie, a obroty na minutę (obr./min) są wyświetlane dla każdego toru.
      1. Gdy każde zwierzę spada z pręta, zapisuj prędkość pręta w momencie upadku, a także czas, w którym zwierzę pozostawało na pręcie. Pręt będzie się obracał, dopóki ostatnie zwierzę nie spadnie z zespołu pręta.
   10. Po tym, jak wszystkie myszy upadną, użyj chusteczki, aby usunąć kał i mocz z pręta. Obecność moczu i kału może wpływać na zdolność myszy do chwytania pręta.
       1. Po 3-minutowym odpoczynku daj myszom drugą, a następnie trzecią próbę. Maksymalny czas pojedynczej próby wynosi 240 sek. Wykonaj łącznie 3 badania kliniczne w ciągu każdego dnia testowego.
   11. Umieść myszy z powrotem w klatce domowej i z powrotem do stojaka. Pod koniec sesji eksperymentalnej wyczyść Rotarod wodą z mydłem, aby usunąć cały kał z maszyny.
   12. Wytrzyj płytkę podstawy do czysta etanolem 70%. Spryskaj całą maszynę dwutlenkiem chloru w celu dezynfekcji.
   13. W dniach - 4, - 3, - 2 i - 1 pi, należy wstępnie ustawić Rotarod z odpowiednimi parametrami protokołu treningowego, jak opisano w Tabeli 1, i powtórzyć kroki od 2.1.2 do 2.1.12.
   14. Po uzyskaniu podstawowych miar należy zainfekować myszy TMEV. Zezwól na 6-dniowy okres odzyskiwania liczby pi.

Tabela 1: Parametry Rotarod w protokołach treningowych i eksperymentalnych.

2. Protokół Eksperymentalny Rotarod
   1. Na +7 dpi wstępnie ustaw Rotarod z odpowiednimi parametrami protokołu eksperymentalnego, jak opisano w Tabeli 1. Powtórz kroki od 2.1.2 do 2.1.10.
   2. Pod koniec próby #3 zważ każdą mysz i zanotuj masę ciała na karcie danych. Wyczyść i zdezynfekuj Rotarod zgodnie z krokami 2.1.11 i 2.1.12.
   3. Testuj myszy dwa razy w tygodniu przez kolejne 6 tygodni, jak opisano powyżej. Po 6 tygodniach (w których myszy prawdopodobnie osiągnęły fazę plateau)^8,9 testuj myszy raz w tygodniu według tego samego protokołu eksperymentalnego. Sam protokół badania trwa średnio 150 dni, w zależności od konkretnego przebiegu choroby.
3. Neurologiczny Indeks Funkcjonalny
   1. Wyeksportuj surowe dane do pliku arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj wyniki.
   2. Wyrazić dane jako czas pracy (rysunek 3A): jest to normalny czas pracy powiększony o pasywny czas obrotu pomniejszony o czas opóźnienia obrotu (tabela 2)¹⁰. Obliczyć średni czas trwania trzech prób w ciągu dnia.
   3. Wyraź dane jako neurologiczny indeks funkcjonalny (NFI; Rysunek 3B).
      1. Oblicz podstawowy próg wydajności każdej myszy z osobna. Podstawowy próg osiągów wyznacza się jako średnią wszystkich czasów pracy od dnia + 15 do + 45 pi^6,7.
      2. Oblicz NFI jako średnią trzech ostatnich średnich czasów działania podzieloną przez podstawowy próg wydajności tej konkretnej myszy^6,7,<br /> UWAGA: Jeśli testowane czasy działania myszy w dniu + 72, + 76 i + 79 pi wynoszą 55 sekund, 45 sekund i 50 sekund, a czas odniesienia dla tej samej myszy wynosił 135 sekund, NFI dla tej myszy w rozdzielczości +79 dpi wyniesie [(45+50+55)/3]/135 lub 0,37.
   4. Wyraż dane jako skorygowany NFI (adjNFI; Rysunek 3C): korygować dane NFI o wartość populacji dla pojedynczego eksperymentu.
      1. Oblicza się adjNFI, dzieląc wartość NFI przez średnią NFI uzyskaną przez grupę pozorowaną w tym konkretnym dniu.

Tabela 2: Definicje parametrów Rotarod przyjęte do ilościowego określenia upośledzenia neurologicznego.

Celem tego reprezentatywnego eksperymentu było porównanie niepełnosprawności neurologicznej wywołanej przez szczep Daniels (DA) i szczep BeAn TMEV. Na potrzeby niniejszego badania grupa 32 samic myszy SJL została zakażona wewnątrzczaszkowo TMEV, szczepem DA (n = 16) lub szczepem BeAn (n = 16), a ich objawy kliniczne były monitorowane w czasie. Dodatkowa grupa 20 myszy była leczona pozorowanym (tj. roztwór soli fizjologicznej wstrzykiwano doczaszkowo) i służyła jako zdrowa grupa kontrolna.

Test wydajności Rotarod został wykorzystany do oceny postępu choroby przewlekłej u myszy zakażonych TMEV i kontrolnych pozorowanych. Myszy były indywidualnie znakowane uszami i poddawane protokołowi adaptacyjnemu codziennie w tygodniu poprzedzającym wstrzyknięcie TMEV, a następnie właściwemu protokołowi testowemu, który trwał 125 dni. Dla każdego dnia testowego czas pracy, zdefiniowany jako czas, przez jaki mysz pozostawała na pręcie, był przechowywany indywidualnie dla każdej myszy jako średnia z 3 prób przeprowadzonych w tym dniu. Dane Rotarod są również wyrażane jako NFI i jako fikcyjnie znormalizowane adjNFI.

Jak pokazano na rysunku 3A, zakażenie TMEV negatywnie wpłynęło na czas pracy myszy. Dwukierunkowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami ujawniła istotny wpływ infekcji TMEV (F = 56,76, p < 0,0001), a także istotny wpływ czasu (F = 3,26, p < 0,0001) i interakcji czas-leczenie (F = 8,065, p< 0,0001). Następujący test wielokrotnych porównań Dunnetta wykazał, że obie grupy myszy zakażonych TMEV miały znacznie niższe wartości NFI niż myszy pozorowane (p ≤ 0,01; Rysunek 3B). Różnica była istotna statystycznie, począwszy od dnia + 61 pi do końca obserwacji (ryc. 3B). Nie stwierdzono różnicy między progresją niepełnosprawności u myszy zakażonych szczepem BeAn i myszy zakażonych szczepem DA we wszystkich punktach czasowych (p > 0,5; Rysunek 3C).

Rycina 1: Wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe. Aby wykonać wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe, mysz jest znieczulana gazem i unieruchomiona na twardej powierzchni. Do 30 μl jest bezpiecznie wstrzykiwanych do mózgu myszy. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się mniej więcej w połowie drogi między linią oka a linią ucha i tuż przy linii środkowej. Igła o wadze 30 G bezpośrednio przebija czaszkę, a strzykawka insulinowa jest wygodnie używana, aby zapobiec zbyt głębokiemu wsuwaniu się igły w mózg. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Aparat Rotarod. Test Rotarod jest standardowym testem neurobehawioralnym, w którym myszy są szkolone do biegania na obracającym się pręcie i mierzy się, jak długo mogą pozostać na pręcie, gdy powoli przyspiesza. Pręt jest zawieszony nad podłogą klatki, a myszy naturalnie starają się pozostać na pręcie, aby uniknąć upadku na ziemię. Upadek z pręta na podstawę instrumentu nie powoduje obrażeń u myszy. A) Standardowy aparat Rotarod składa się z pręta napędzanego silnikiem o stałych lub przyspieszających prędkościach. B) Panele dzielą wędkę na osobne tory, z których każdy jest dostosowany do konkretnego zwierzęcia. Podczas każdej próby można przebadać łącznie 4 myszy. C) Pręt ma 1,18 cala. (około 3 cm) średnicy, a jego powierzchnia jest radełkowana, co pozwala myszom na lepszy chwyt. Upadek myszy jest precyzyjnie śledzony przez wiązkę zdjęć, która automatycznie rejestruje ilość czasu spędzonego na pręcie. Dane eksperymentalne są rejestrowane w komputerze po tym, jak wszystkie myszy spadną z pręta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Test wydajności Rotarod u myszy zakażonych TMEV i kontrolnych pozorowanych. Test Rotarod został przeprowadzony w celu zmierzenia funkcji motorycznych myszy pozorowanych, zakażonych DA i zakażonych BeAn. Oprócz czasu pracy (s) (A), dane Rotarod zostały również wyrażone jako wskaźnik funkcji neurologicznych (NFI) (B) i fikcyjnie znormalizowany skorygowany NFI (adjNFI) (C). Opóźnienie spadku spowodowane rozpędzającym się Rotarodem mierzono w trzech próbach dziennie. Dane prezentowane są jako błąd średni ± standardowym średniej (SEM). Niebieskie kółko, n = 16 myszy zakażonych BeAn; czerwone kwadraty, n = 16 myszy zakażonych DA; czarne trójkąty, n = 20 kontrolnych potraktowanych pozorem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.