Pomiar postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu stwardnienia rozsianego

Summary

Zoptymalizowany protokół testowy jest przedstawiony w tym artykule dla testu wydajności Rotarod, używanego do pomiaru postępującej niepełnosprawności neurologicznej u myszy zakażonych TMEV.

Abstract

Po zakażeniu śródmózgowym wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV), u podatnych myszy SJL rozwija się przewlekła, postępująca choroba demielinizacyjna, z cechami klinicznymi podobnymi do postępujących postaci stwardnienia rozsianego (MS). Myszy wykazują postępującą niepełnosprawność z utratą funkcji motorycznych i czuciowych, co można ocenić za pomocą wielu aparatów i protokołów. Wśród nich test wydajności Rotarod jest bardzo powszechnym testem behawioralnym, którego zaletą jest to, że zapewnia obiektywne pomiary, ale często stosuje się go przy założeniu, że jest prosty i prosty. W przeciwieństwie do wizualnych systemów punktacji stosowanych w niektórych modelach stwardnienia rozsianego, które są wysoce subiektywne, test Rotarod generuje obiektywną, mierzalną, ciągłą zmienną (tj. długość czasu), co pozwala na niemal idealną zgodność między oceniającymi. Niezawodność międzylaboratoryjną można jednak osiągnąć tylko wtedy, gdy różne parametry testowe zostaną powtórzone. W tym manuskrypcie zalecenia dotyczące konkretnych parametrów testowych, takich jak rozmiar, prędkość i przyspieszenie pręta; ilość czasu szkolenia zwierząt; i przetwarzania danych, są prezentowane na potrzeby testu Rotarod.

Introduction

Mysi wirus zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) to neurotropowy jednoniciowy wirus RNA, który uporczywie infekuje mysi ośrodkowy układ nerwowy (OUN). U wrażliwych myszy zakażenie TMEV powoduje przewlekłą chorobę demielinizacyjną o podłożu immunologicznym, znaną jako choroba demielinizacyjna indukowana przez TMEV (TMEV-IDD). Eksperymentalne zakażenie myszy przebiega podobnie jak w postępujących postaciach stwardnienia rozsianego (SM). TMEV-IDD charakteryzuje się dwiema odrębnymi fazami: fazą ostrą i fazą przewlekłą. Ostra faza to łagodne, zwykle subkliniczne zapalenie mózgu^1,2. Druga, przewlekła faza, rozpoczynająca się około miesiąca po zakażeniu, polega na powoli postępującej niepełnosprawności charakteryzującej się demielinizacją, stanem zapalnym i uszkodzeniem aksonów^1,2. Osłabienie obserwowane u myszy wiąże się ze spastycznością, a czasami z silnymi skurczami tonicznymi.

Ponieważ obecnie nie ma leków łagodzących postępującą niepełnosprawność u pacjentów, badacze są szczególnie zainteresowani TMEV-IDD, który stanowi optymalny model zwierzęcy do monitorowania wpływu leków modyfikujących przebieg choroby. Jednak zarówno u myszy, jak i u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, monitorowanie postępu niepełnosprawności wymaga ciągłej obserwacji klinicznej przez dłuższy czas. U myszy długoterminowe monitorowanie postępu niepełnosprawności można przeprowadzić za pomocą testu wydajności Rotarod.

Test wydajności Rotarod to standardowy test behawioralny, który ocenia funkcje motoryczne, takie jak koordynacja, równowaga i zmęczenie u gryzoni. Myszy muszą utrzymywać równowagę na obracającym się pręcie, który obraca się pod ciągłym przyspieszeniem; Rejestrowane jest opóźnienie czasowe do upadku z tego pręta. Zwierzęta z dysfunkcją neurologiczną nie są w stanie utrzymać się na obracającym się pręcie tak długo, jak grupy kontrolne, i zwykle odpadają, gdy prędkość obrotowa przekracza ich zdolność motoryczną. Im większe upośledzenie neurologiczne mają zwierzęta, tym szybciej spadną z pręta i tym krótsze jest opóźnienie czasowe.

Przewaga testu Rotarod nad tradycyjnymi wizualnymi systemami punktacji polega na tym, że generuje on obiektywną, mierzalną zmienną - opóźnienie czasowe - która ostatecznie może być wykorzystana do analiz statystycznych w celu ilościowego określenia efektów terapii i procedur eksperymentalnych³.

W Laboratorium Neuroimmunologii (LONI) w Dartmouth, myszy są poddawane protokołowi adaptacyjnemu, gdzie są testowane przed zakażeniem TMEV w celu zapoznania ich z maszyną i oceny ich normalnej "wyjściowej" równowagi, koordynacji i kontroli motorycznej^4,5. Po ustaleniu linii bazowej i zakażeniu myszy TMEV są one testowane raz lub dwa razy w tygodniu przez okres kilku miesięcy. Właściwy protokół badania trwa średnio 150 dni, co pozwala na ocenę spadku równowagi, koordynacji i kontroli motorycznej w całym przebiegu choroby demielinizacyjnej.

Do tej pory w Dartmouth przetestowano kilkaset myszy TMEV-IDD i myszy leczonych pozorowanym pod kątem dysfunkcji neurologicznych. Myszy te otrzymały różne terapie immunomodulujące, ale żaden środek farmakologiczny nie okazał się skuteczny w łagodzeniu progresji niepełnosprawności^6,7. Niniejszy artykuł i związany z nim protokół opisują, jak scharakteryzować postępujące upośledzenie neurologiczne wykazywane przez myszy TMEV-IDD. W szczególności protokół zawiera zalecenia dotyczące określonych parametrów testowych, które uważa się za ogólnie odpowiednie do badania niepełnosprawności neurologicznej u myszy TMEV-IDD za pomocą testu Rotarod. Procedura ta stanowi punkt odniesienia, w stosunku do którego można ocenić (1) znaczenie tego modelu myszy dla postępującego stwardnienia rozsianego oraz (2) jego przydatność do testowania terapii mających na celu leczenie postępujących schorzeń neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Oczywiście, test wydajności Rotarod oraz obecnie zoptymalizowane parametry i protokół testowy są przydatne nie tylko w wykrywaniu postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu TMEV-IDD, ale są również przydatne w odkrywaniu upośledzeń w innych indukowanych przez wirusy i/lub genetycznych mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych.

Protocol

Wszystkie prace ze zwierzętami wykorzystują protokoły sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Geisel School of Medicine w Dartmouth.

1. Model myszy

1. Indukcja choroby demielinizacyjnej wywołanej TMEV
   1. Przenieś klatki zawierające 4- do 6-tygodniowe samice myszy SJL/JHan ze stojaka do wygodnego miejsca pracy. Oznacz myszy (np. kolczykiem lub dziurkaczem w uchu), aby umożliwić indywidualną ocenę choroby klinicznej i histologicznej.
   2. Pobrać 30 μl materiału infekującego TMEV (2 x 10⁶ jednostek tworzących płytkę nazębną; PFU) w PBS do strzykawki insulinowej i igły o rozmiarze 29G.
   3. Przygotuj aparat do znieczulenia gazem: sprawdź system, aby upewnić się, że na czas trwania zabiegu jest odpowiednia ilość tlenu i izofluranu.
   4. Włączyć przepływomierz na 1 l/min. Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej i uszczelnić górę. Włącz waporyzator na 3,5% i monitoruj zwierzę aż do leżenia.
   5. Wyjmij zwierzę z komory i przetestuj mysz, ściskając podnóżek, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie. Brak reakcji na silne uszczypnięcie świadczy o odpowiednim znieczuleniu.
   6. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia 70% alkoholem izopropylowym.
   7. Wstrzyknąć 30 μl materiału infekującego TMEV do prawej półkuli mózgowej za pomocą wstrzyknięcia z wolnej ręki (ryc. 1). Miejsce wstrzyknięcia znajduje się mniej więcej w połowie drogi między linią oka a linią ucha i tuż poza linią środkową.
   8. Przywróć mysz do klatki trzymania, gdy jest w pełni czujna i mobilna (zwykle 3-5 minut).
   9. Myszy należy poddać eutanazji przez wykrwawienie lub perfuzję serca od 3 do 6 miesięcy po zakażeniu TMEV, w zależności od szybkości rozwoju choroby.

2. Analiza Rotarod

1. Aparat Rotarod
   1. Przetestuj myszy przed zakażeniem TMEV, aby zapoznać je z maszyną i ocenić ich normalną równowagę wyjściową, koordynację i kontrolę motoryczną.
   2. Rozpocznij protokół adaptacyjny w ciągu -5 dni po infekcji (dpi; tj. 5 dni przed zakażeniem TMEV).
   3. Pozwól myszom zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut przed badaniem Rotarod, aby umożliwić im dostosowanie się do środowiska.
   4. Upewnij się, że zarówno jednostka Rotarod, jak i komputer są podłączone i połączone ze sobą (Rysunek 2).
   5. Wstępnie ustaw Rotarod z parametrami protokołu treningowego -5 dpi, jak opisano w Tabeli 1.
   6. Zapisz plik roboczy z datą i danymi identyfikacyjnymi.
   7. Przenieś klatkę zawierającą drużynę, która ma zostać przetestowana, ze stojaka na stół przylegający do Rotarodu. Myszy są zwykle testowane w oddziałach po 4 osoby.
   8. Podnieś mysz za ogon i połóż ją na pręcie, odwróconą tyłem do operatora. Powtórz od drugiej do czwartej myszy. Jeśli mysz upadnie lub podskoczy, umieść ją z powrotem na swoim pasie na Rotarodzie, aż wszystkie myszy znajdą się na swoich pozycjach. Zignoruj, jeśli jakiekolwiek myszy odwrócą się twarzą do operatora.
   9. Po załadowaniu wszystkich myszy naciśnij przycisk "Enter", aby rozpocząć eksperyment. Obserwuj, jak timery uruchamiają się automatycznie, a obroty na minutę (obr./min) są wyświetlane dla każdego toru.
      1. Gdy każde zwierzę spada z pręta, zapisuj prędkość pręta w momencie upadku, a także czas, w którym zwierzę pozostawało na pręcie. Pręt będzie się obracał, dopóki ostatnie zwierzę nie spadnie z zespołu pręta.
   10. Po tym, jak wszystkie myszy upadną, użyj chusteczki, aby usunąć kał i mocz z pręta. Obecność moczu i kału może wpływać na zdolność myszy do chwytania pręta.
       1. Po 3-minutowym odpoczynku daj myszom drugą, a następnie trzecią próbę. Maksymalny czas pojedynczej próby wynosi 240 sek. Wykonaj łącznie 3 badania kliniczne w ciągu każdego dnia testowego.
   11. Umieść myszy z powrotem w klatce domowej i z powrotem do stojaka. Pod koniec sesji eksperymentalnej wyczyść Rotarod wodą z mydłem, aby usunąć cały kał z maszyny.
   12. Wytrzyj płytkę podstawy do czysta etanolem 70%. Spryskaj całą maszynę dwutlenkiem chloru w celu dezynfekcji.
   13. W dniach - 4, - 3, - 2 i - 1 pi, należy wstępnie ustawić Rotarod z odpowiednimi parametrami protokołu treningowego, jak opisano w Tabeli 1, i powtórzyć kroki od 2.1.2 do 2.1.12.
   14. Po uzyskaniu podstawowych miar należy zainfekować myszy TMEV. Zezwól na 6-dniowy okres odzyskiwania liczby pi.

Protokół	Dzień testowy	Częstotliwość	Prędkość początkowa (obr./min)	Maksymalna prędkość (rpm)	przyspieszenie	Prób	Informatyka (ITI)
					(obr./min/sek)	(N x s)	(min)
Trening	- 5 d.p.i	1/dzień	1	12	01/03	Czas trwania: 3x240 sekund	3
	- 4 d.p.i	1/dzień	1	13	01/03	Czas trwania: 3x240 sekund	3
	- 3 d.p.i	1/dzień	1	14	01/03	Czas trwania: 3x240 sekund	3
	- 2; - 1 d.p.i	1/dzień	5	Rozdział 40	01/03	Czas trwania: 3x240 sekund	3
Eksperymentalny	Od +7 do +50 s.p.i	2/tydzień	5	Rozdział 40	05/30	Czas trwania: 3x240 sekund	3
	Od +51 do +150 s.p.i	1/tydzień	5	Rozdział 40	05/30	Czas trwania: 3x240 sekund	3

Tabela 1: Parametry Rotarod w protokołach treningowych i eksperymentalnych.

2. Protokół Eksperymentalny Rotarod
   1. Na +7 dpi wstępnie ustaw Rotarod z odpowiednimi parametrami protokołu eksperymentalnego, jak opisano w Tabeli 1. Powtórz kroki od 2.1.2 do 2.1.10.
   2. Pod koniec próby #3 zważ każdą mysz i zanotuj masę ciała na karcie danych. Wyczyść i zdezynfekuj Rotarod zgodnie z krokami 2.1.11 i 2.1.12.
   3. Testuj myszy dwa razy w tygodniu przez kolejne 6 tygodni, jak opisano powyżej. Po 6 tygodniach (w których myszy prawdopodobnie osiągnęły fazę plateau)^8,9 testuj myszy raz w tygodniu według tego samego protokołu eksperymentalnego. Sam protokół badania trwa średnio 150 dni, w zależności od konkretnego przebiegu choroby.
3. Neurologiczny Indeks Funkcjonalny
   1. Wyeksportuj surowe dane do pliku arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj wyniki.
   2. Wyrazić dane jako czas pracy (rysunek 3A): jest to normalny czas pracy powiększony o pasywny czas obrotu pomniejszony o czas opóźnienia obrotu (tabela 2)¹⁰. Obliczyć średni czas trwania trzech prób w ciągu dnia.
   3. Wyraź dane jako neurologiczny indeks funkcjonalny (NFI; Rysunek 3B).
      1. Oblicz podstawowy próg wydajności każdej myszy z osobna. Podstawowy próg osiągów wyznacza się jako średnią wszystkich czasów pracy od dnia + 15 do + 45 pi^6,7.
      2. Oblicz NFI jako średnią trzech ostatnich średnich czasów działania podzieloną przez podstawowy próg wydajności tej konkretnej myszy^6,7,<br /> UWAGA: Jeśli testowane czasy działania myszy w dniu + 72, + 76 i + 79 pi wynoszą 55 sekund, 45 sekund i 50 sekund, a czas odniesienia dla tej samej myszy wynosił 135 sekund, NFI dla tej myszy w rozdzielczości +79 dpi wyniesie [(45+50+55)/3]/135 lub 0,37.
   4. Wyraż dane jako skorygowany NFI (adjNFI; Rysunek 3C): korygować dane NFI o wartość populacji dla pojedynczego eksperymentu.
      1. Oblicza się adjNFI, dzieląc wartość NFI przez średnią NFI uzyskaną przez grupę pozorowaną w tym konkretnym dniu.

termin	definicja
Normalny czas pracy	Całkowity czas, w którym mysz aktywnie biega na obracającym się pręcie, tj. opóźnienie do spadku.
Pasywny czas obrotu	Czas, przez jaki mysz pozostawała na pręcie w trybie pasywnego obracania.
Czas opóźnienia obrotu	Czas, przez jaki mysz pozostaje na pręcie w trybie pasywnego obrotu
Pasywny tryb rotacji	Gdy mysz chwyta pręt i obraca się bez konieczności poruszania się.
Łączny czas trwania sesji	Łączny czas, przez jaki mysz pozostaje na obracającym się pręcie podczas sesji.
Wydajność wyjściowa	Sprawność silnika przed uszkodzeniem oceniana w celu określenia minimalnego progu wydajności.
Wskaźnik funkcji neurologicznych (NFI)	Indeks kliniczny, który porównuje wydajność motoryczną każdej myszy, tj. czas pracy, w dowolnym momencie z jej szczytową wydajnością.
Skorygowany wskaźnik funkcji neurologicznych (adjNFI)	Gdy proces normalizacji jest stosowany w celu skorygowania danych NFI o wartość populacji dla pojedynczego eksperymentu.
Wartość populacji	Średnia wartość NFI uzyskana przez grupę leczoną pozorem w określonym dniu.

Tabela 2: Definicje parametrów Rotarod przyjęte do ilościowego określenia upośledzenia neurologicznego.

Results

Celem tego reprezentatywnego eksperymentu było porównanie niepełnosprawności neurologicznej wywołanej przez szczep Daniels (DA) i szczep BeAn TMEV. Na potrzeby niniejszego badania grupa 32 samic myszy SJL została zakażona wewnątrzczaszkowo TMEV, szczepem DA (n = 16) lub szczepem BeAn (n = 16), a ich objawy kliniczne były monitorowane w czasie. Dodatkowa grupa 20 myszy była leczona pozorowanym (tj. roztwór soli fizjologicznej wstrzykiwano doczaszkowo) i służyła jako zdrowa grupa k...

Discussion

Pomimo pewnych ograniczeń, test wydajności Rotarod stanowi ważne narzędzie do oceny funkcji motorycznych i dysfunkcji w TMEV-IDD, a także wpływu interwencji farmakologicznych na postęp niepełnosprawności u myszy.

Test Rotarod został po raz pierwszy opisany w 1957 roku jako narzędzie do pomiaru deficytów neurologicznych u gryzoni1^. Gryzonie muszą chodzić na obracającym się pręcie, ze zwiększającą się prędkością obrotową i starać się unikać upadku na ziemię. Opóźnienie do upadku jest ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myszy SJL/JCrHsd w wieku od 4 do 6 tygodni	Envigo	#052
Zapas
Waporyzator izofluranu	Aparat Harvard	#340471
Strzykawki insulinowe U- 100 29 g x 0,5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4-pasmowy pręt Rota-Rod dla myszy z RS-232 i oprogramowaniem	Columbus Instruments	#0890M