Artykuł metodologiczny

Test oparty na CFSE do badania migracji komórek dendrytycznych skóry myszy do drenujących węzłów chłonnych podczas zakażenia Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54620

⸱

9 października 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology (MTC), Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano test na myszach do śledzenia migracji komórek ze skóry do drenującego węzła chłonnego, który umożliwia scharakteryzowanie komórek dendrytycznych skóry zmobilizowanych do węzła chłonnego po zakażeniu opuszki stopy Bacille Calmette-Guérin.

Streszczenie

Komórki dendrytyczne (DC) są ważne dla inicjowania odpowiedzi immunologicznej, częściowo dzięki ich zdolności do pozyskiwania i transportu antygenu do drenującego węzła chłonnego (DLN). Mobilizacja DC do DLN jest złożona i pozostaje do pełnego wyjaśnienia podczas infekcji. W niniejszym dokumencie opisano zastosowanie innowacyjnego, prostego testu, który opiera się na estrze sukcynimidylu dioctanu fluorochromu 5 i 6-karboksyfluoresceiny (CFSE) w celu śledzenia migracji DC podczas zakażenia opuszki stopy Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) u myszy C57BL/6. Test ten umożliwia scharakteryzowanie subpopulacji DC skóry, które aktywnie przemieszczają się do drenującego, podkolanowego LN w odpowiedzi na BCG. Protokół ten wywodzi się z modelu BCG, w którym migrujące skórne DC zidentyfikowano za pomocą cytometrii przepływowej. Test jest przyjazny dla badania i identyfikacji DC lub innych komórek, które są domem dla LN podkolanowego po inokulacji drobnoustrojów, ich metabolitów lub innych bodźców zapalnych w opuszkach stopy, a w konsekwencji do badania czynników regulujących migrację tych komórek.

Wprowadzenie

DC zlokalizowane na powierzchni ciała wyczuwają mikroby lub ich produkty, a robiąc to, mobilizują się za pośrednictwem naczyń limfatycznych do drenującego LN (DLN) 1,2. Ta relokacja jest potrzebna do transportu antygenu drobnoustrojowego do DLN, a w konsekwencji do pobudzenia odpowiedzi immunologicznej na inwazyjny drobnoustroj. Rzeczywiście, blokada lub niepowodzenie migracji DC z zakażonej tkanki do DLN wycisza odpowiedź limfocytów T 3-5. W związku z tym testy zaprojektowane do śledzenia migracji na poziomie pojedynczej komórki są przydatne, aby pomóc w przypisaniu funkcji migracyjnej do danego podzbioru DC.

Istnieje duża ilość danych na temat mobilizacji DC skóry do DLN. To ostatnie odpowiada za dużą część wiedzy na temat migracji DC z miejsc objętych stanem zapalnym lub zainfekowanych 2. Nie jest to zaskakujące, ponieważ skórka jest domem dla dużej populacji DC i jest bardzo dostępną powierzchnią do eksperymentów na myszy laboratoryjnej. W związku z tym opracowano kilka technik oceny migracji mysich DC ze skóry do DLN 2. Malowanie skóry metodą FITC jest zdecydowanie najczęściej stosowanym podejściem. W tym teście fluorochrom-5-izotiocyjanian fluorochromu (FITC) przygotowuje się w mieszaninie z acetonem i kontaktowym środkiem drażniącym. Koktajl ten nakłada się na depilowaną lub ogoloną skórę, a nagromadzenie komórek znakowanych FITC jest z kolei analizowane w DLN. Migrację można również badać poprzez wstrzykiwanie w skórę nano- lub mikrocząstek znakowanych fluorochromem, co umożliwia śledzenie komórek fagocytarnych, które zinternalizowały cząsteczki fluorescencyjne w skórze. Naczynia limfatyczne mogą być również kaniulowane w celu bezpośredniego usunięcia migrujących DC z limfy. Jest to jednak wyzwanie techniczne, zwłaszcza u myszy. Czynnikiem ograniczającym jest również liczba DC uzyskanych do późniejszej analizy.

Pomimo wielu wcześniejszych badań nad migracją DC do skóry, nadal brakuje informacji na temat mobilizacji DC skóry do DLN po szczepieniu Bacille Calmette-Guérin (BCG), żywym, atenuowanym szczepem Mycobacterium bovis używanym do szczepień przeciwko M. tuberculosis. BCG jest zaszczepiany w skórze, powodując ograniczoną infekcję, która wyzwala odpowiedź limfocytów T pomocniczych typu 1. Zarówno subpopulacje DC, które mobilizują się do DLN ze skóry zakażonej BCG, jak i czynniki regulujące ich migrację podczas tego procesu nie są w pełni poznane. W związku z powyższym opracowano prostą, ale nowatorską metodę, w której ester sukcynimidylowy dioctanu fluorochromu 5 i 6-karboksyfluoresceiny (CFSE) jest wstrzykiwany in situ w celu śledzenia migracji DC do DLN 3. Myszom C57BL/6 wstrzykuje się inokulum BCG w tylną opuszkę łapy, a dzień przed uśmierceniem zwierzętom wstrzykuje się w tę samą opuszkę stopy o wysokim stężeniu CFSE. Dwadzieścia cztery godziny później zwierzęta są uśmiercane, a drenujący LN podkolanowy (pLN) usuwany i przygotowywany do cytometrii przepływowej. Test ten umożliwia identyfikację komórek, które migrują w ciągu nocy ze skóry opuszki stopy do DLN (ryc. 1).

Ponadto, myszy ukierunkowane na geny mogą być używane do identyfikacji czynników wymaganych do mobilizacji komórek do DLN. Korzystając z tego testu, autorzy tego raportu odkryli wcześniej, że EpCAMo niskiej zawartości CD11bo wysokiej migracji DC skóry transportuje BCG do DLN w procesie regulowanym przez receptor interleukiny-1 i wewnątrzkomórkową cząsteczkę adaptorową MyD88 3. Protokół dla tego testu migracji opartego na CFSE, który wywodzi się z powyższego raportu Bollampalli i wsp.3 w którym zastosowano cytometrię przepływową do wykrywania i analizy migrujących skórnych DC jest opisana w niniejszym dokumencie. Omówiono zalety i wady tego testu.

Protokół

UWAGA: Myszy C67BL/6 zostały użyte do eksperymentów pokazanych w tym manuskrypcie. Zwierzęta te były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów w ośrodku dla zwierząt MTC, Karolinska Institutet, Sztokholm, Szwecja. Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i wytycznymi Szwedzkiej Rady Rolnictwa, Szwedzkiej Agencji Ochrony Zwierząt i Karolinska Institutet. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Radę Etyki Zwierząt w Sztokholmie Północnym.

1. Przygotowanie zapasów i magazynowanie CFSE

  1. Przygotować 5 mM zapasu estru sukcynimidylowego dioctanu 5- i 6-karboksyfluoresceiny (CFSE) w dimetylosulfotlenku. Wir. Dozować 100 μl porcji do sterylnych mikroprobówek z nakrętką o pojemności 0,5 ml. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.

2. Myszy

  1. Używaj wsobnych samców lub samic myszy w wieku od 8 do 12 tygodni. Preferowane są zwierzęta dopasowane pod względem płci i wieku. Upewnij się, że niezbędne pozwolenia etyczne dla zwierząt są na miejscu przed rozpoczęciem eksperymentów.

3. Unieruchomienie zwierząt za pomocą znieczulenia gazem izofluranowym

  1. Załadować jednostkę anestezjologiczną izofluranem. Napełnić strzykawkę ze szkła gazoszczelnego o pojemności 10 ml izofluranem. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Połącz strzykawkę i wlot płynu z dołączoną rurką i przesuwaj popychacz do przodu, aż płyn w rurce łączącej będzie widocznie gotowy do wejścia do waporyzatora.
    UWAGA: Nie przechowywać izofluranu w strzykawce, gdy nie jest używany.
  2. Znieczulać zwierzęta izofluranem w komorze indukcyjnej, przy przepływie powietrza utrzymywanym na poziomie około 400 - 500 ml/min i stężeniu izofluranu na poziomie 3,5%.
    UWAGA: Urządzenie nie będzie działać bez przepływu powietrza.
  3. Gdy zwierzęta zasną, przekręć kran na jednostce anestezjologicznej, aby skierować gaz izofluran do części maski. Sprawdź, czy element maski jest nienaruszony, aby uniknąć wycieku gazu. Przepływ powietrza może być utrzymywany na poziomie 400 ml/min, alternatywnie zmniejszany do 200 ml/min. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 2,6%.
    UWAGA: Efekt znieczulenia można zwiększyć i/lub zmniejszyć, dostosowując natężenie przepływu.

4. Zastrzyki BCG i rekonwalescencja

  1. Potwierdź wizualnie i wykonaj testy, takie jak test odruchu szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że myszy są unieruchomione/śpią na masce izofrubranowej przed wykonaniem zastrzyków.
  2. Zaszczepić w tylnej opuszki łapy, 1 x 106 Jednostki tworzące kolonie Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) w 30 μl PBS za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę 29 G x 1/2 cala.
    UWAGA: Wytwarzanie zapasów prątków jest pokrótce opisane w pierwotnym opisie tej procedury 3 oraz w bardzo szczegółowym miejscu w innym miejscu 6. BCG jest również łatwo dostępny ze źródeł komercyjnych. Autorzy zalecają, aby BCG był poddawany sonikowi impulsowemu lub przepuszczany przez strzykawkę w celu rozbicia grudek przed jego zaszczepieniem myszom. BCG jest tutaj powtarzany jako bodziec mikrobiologiczny, biorąc pod uwagę jego zastosowanie w pierwotnym opisie tego protokołu 3, ale autorzy z pewnością zachęcają do testowania innych bodźców mikrobiologicznych.
  3. Wykonaj tę samą procedurę, którą opisano powyżej, dla wstrzyknięcia PBS myszom kontrolnym.
  4. Należy monitorować zwierzęta po wstrzyknięciu, aby potwierdzić, że rekonwalescencja po znieczuleniu przebiega pomyślnie i że zwierzęta mogą podeprzeć się na wstrzykniętej tylnej opuszki stopy.

5. Zastrzyki CFSE

  1. Przygotowanie CFSE do wstrzyknięć:
    1. Rozmrozić fiolkę z 5 mM roztworem podstawowym CFSE w temperaturze od -80 °C. Rozcieńczyć CFSE 10-krotnie w PBS. Roztwór należy dokładnie zawiesić przed napełnieniem strzykawki w celu przygotowania do wstrzyknięcia.
  2. Wstrzyknięcie i odzyskiwanie CFSE:
    1. Powtórz procedurę znieczulania zwierząt opisaną w sekcji 3. Wstrzyknąć 20 μl 0,5 mM CFSE w tylną opuszkę stopy, która wcześniej otrzymała BCG lub PBS.
      UWAGA: Wstrzyknięcie CFSE powinno być wykonane dzień przed (24 godziny) planowaną datą uśmiercenia.

6. Chirurgiczne usunięcie węzła chłonnego podkolanowego (pLN)

UWAGA: Na tym etapie zachęca się do używania wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych i ich wielokrotnego odkażania w 70% etanolu.

  1. Poddaj myszy eutanazji. Spryskaj zwierzę 70% etanolem. Przygwoźdź zwierzę w pozycji grzbietowej, na desce do sekcji.
    UWAGA: Autorzy mogą zalecić eutanazję poprzez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Ostrożnie wykonaj pionowe nacięcie w tylnej części uda. Oczyść mięśnie i tłuszcz za pomocą nożyczek i pęsety, aby odsłonić, a następnie wyciąć pLN znajdujący się głęboko w woreczku tłuszczowym, w zagłębieniu kolana.
  3. Przenieść pLN do 0,5 ml sterylnego PBS na lodzie.

7. Generowanie zawiesiny jednokomórkowej z pLN

  1. Homogenizować pLN przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów umieszczone na 6-dołkowej płytce zawierającej 5 ml PBS lub buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (PBS zawierający 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1 mM azydku sodu). Homogenizować przez sitko za pomocą tylnej części strzykawki o pojemności 3 ml.
    UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  2. Przemyć sitko kolejnymi 5 ml buforu PBS lub FACS, zebrać materiał do probówki o pojemności 15 ml i granulować komórki pod ciśnieniem 277 x g (1 200 obr./min, R = 172 mm) przez 5 minut, 4 °C. Alternatywnie, homogenizować pLN bezpośrednio w probówkach do mikrowirówek za pomocą homogenizatorów polipropylenowych.
  3. W zależności od wielkości osadu, zawiesić zawiesinę pLN w odpowiedniej objętości buforu PBS lub FACS, np. 200 - 1 000 μl. Użyj komory zliczającej, aby określić ilościowo całkowitą liczbę komórek uzyskaną z każdej zawiesiny LN. Użyj błękitu trypanowego, aby wykluczyć martwe/umierające komórki.

8. Barwienie komórek i cytometria przepływowa

  1. Przenieś 1 - 10 x 106 komórek do 5 ml okrągłodennych probówek polistyrenowych. Przemyć buforem FACS i osadem przez odwirowanie przy 277 x g (1 200 obr./min, R= 172 mm) przez 5 min, 4 °C.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 - 100 μl koktajlu przeciwciał (patrz markery komórek dendrytycznych [DC] używane do barwienia powierzchni, tabela materiałów) zawierającego 0,5 - 1 μg anty-mysiego CD16 / CD32 (w celu zablokowania niespecyficznych oddziaływań, w których pośredniczy Fc) w buforze FACS przez 30 - 45 minut, na lodzie. Chronić próbki przed światłem.
  3. Po inkubacji przepłukać komórki buforem FACS i osadem przez odwirowanie przy 277 x g (1 200 obr./min, R = 172 mm) przez 5 minut, 4 °C.
  4. Zawieś komórki w 50 - 100 μl buforu FACS. Pozyskaj dane na cytometrze przepływowym 7-10.
    UWAGA: W celu uzyskania doskonałych recenzji na temat cytometrii przepływowej odsyłamy czytelnika do następujących publikacji, które przekazują zarówno teoretyczne, jak i praktyczne informacje na temat tej metody.

Wyniki

Test migracji oparty na CFSE (Rycina 1) został wykorzystany wraz z cytometrią przepływową do wykrywania i charakterystyki komórek znakowanych CFSE, które pojawiają się w pLN po infekcji BCG w poduszce stopy. Znaczna część znakowania CFSE w pLN występuje na komórkach MHC-IIhigh i CD11c+/low (Rycina 2A), co jest zgodne z migracją komórek DC skóry do skórnego DLN 11. Zarówno częstotliwość, jak i całkowita liczba znakowanych CFSE komórek MHC-IIhigh CD11c+/low są zwiększone w pLN myszy zainfekowanych BCG w porównaniu z kontrolami wstrzykniętymi PBS (Rycina 2B-C), co sugeruje, że BCG nasila relokację tych komórek do DLN. Ponieważ test ten mierzy migrację w okresie 24-godzinnym, możliwe było ustalenie, że komórki DC skóry nadal napływają do DLN 5 dni po infekcji (Rycina 2C). Przedłuża to migrację DC w obecnym modelu znacznie poza ramy czasowe wstępnej aktywacji antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ w pLN 3. Ponadto migrujące komórki DC skóry wykazują podwyższone poziomy cząsteczek kostymulujących CD80 i CD86 (Rycina 2D). Jest to zgodne z wcześniejszymi obserwacjami z kultur eksplantów skóry i malowania skóry FITC 11, co wspiera koncepcję, że migrujące komórki DC są komórkami aktywowanymi. Co istotne, zarówno rezydentne w LN komórki DC (komórki MHC-II+ CD11chigh), jak i plazmacytoidalne komórki DC (komórki MHC-IIlow CD11clow PDCA-1+), które dostają się do zapalnych LN poprzez żyłki wysokomiąższowe, a nie naczynia limfatyczne doprowadzające 12, były ujemne pod kątem CFSE (Rycina 2EF), co sugeruje, że znakowanie CFSE miało miejsce głównie w poduszce stopy.

Biorąc pod uwagę, że komórki MHC-IIhigh CD11c+/low reprezentują nie jedną, lecz wiele subpopulacji DC 13, do panelu barwienia przeciwciałami stosowanego w detekcji cytometrycznej (Tabela materiałów) włączono dodatkowe markery powierzchniowe CD103, EpCAM (CD326) oraz CD11b, aby dokładniej scharakteryzować populację migrujących DC (Rycina 3). W ten sposób zidentyfikowano subpopulację komórek EpCAMlow CD11bhigh jako główny podzbiór migrujących DC skóry w odpowiedzi na zakażenie BCG (Rycina 3).

Przedstawione tutaj dane z cytometrii przepływowej zostały pozyskane przy użyciu cytometru przepływowego wyposażonego w 4 lasery (488, 532, 640 i 405 nm). Dane przeanalizowano za pomocą oprogramowania do analizy komórek. Do skutecznego wykrywania markerów wspomnianych w powyższych badaniach, a także innych markerów w innych typach komórek, można zastosować inne wielokolorowe cytometry przepływowe niż ten określony w Tabeli materiałów. Do wykonania opisanego tutaj protokołu niezbędny jest cytometr zdolny do wykrywania 6 różnych fluorochromów. Co ważne, określono klony każdego użytego przeciwciała (Tabela materiałów). Należy rozważyć wybór koniugatu fluorochromu, ponieważ może on zależeć od laserów i kanałów detekcji dostępnego cytometru przepływowego. Podobnie, przeciwciała wymagają miareczkowania w celu ustalenia najodpowiedniejszych rozcieńczeń do barwienia.

Częstotliwości populacji w próbkach wstrzykniętych BCG oraz PBS zostały przedstawione na wykresach i wraz z całkowitą liczbą komórek wykorzystane do obliczenia bezwzględnej liczby zdefiniowanych, bramkowanych podgrup komórek dendrytycznych (DCs). Istotność różnic między średnimi grup danych analizowano za pomocą testu t Studenta lub analizy ANOVA, w zależności od potrzeb, przyjmując wartość graniczną p < 0.05. Wartości odstające wykluczono z analizy na podstawie testu Grubbsa.

Schemat eksperymentu na myszach C57BL/6; iniekcja BCG i CFSE; cytometria przepływowa; badanie immunologiczne.
Rycina 1. Schemat: Model infekcji podeswy BCG i test migracji oparty na CFSE. BCG jest inokulowane w podeswę tylnej łapy myszy C57BL/6. W różnych punktach czasowych po infekcji, oraz 24 hr przed uśmierceniem zwierząt, fluorochrom CFSE jest wstrzykiwany do tej samej podeswy, która wcześniej otrzymała BCG. Odizolowany zostaje drenujący węzeł chłonny podkolanowy, a komórki znakowane CFSE są charakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometrii przepływowej; dane dla MHC-II, CD11c, CFSE; efekt BCG; wykres ekspresji CD80/CD86.
Rycina 2. Migrujące komórki dendrytyczne (DCs) skóry stanowią główną populację przemieszczającą się do DLN po zakażeniu podeszwy stopy BCG. Myszy C57BL/6 zainfekowano 1 x 106 CFU BCG w podeszwie stopy. Na dwadzieścia cztery godziny przed uśmierceniem zwierzęta wstrzyknięto 0,5 mM CFSE w tę samą podeszwę stopy. Pobrano węzły chłonne (LN) podszyjkowe, homogenizowano je do zawiesin jednokomórkowych i poddano cytometrii przepływowej. W przypadku pomiarów wykonanych 1 dzień po podaniu BCG, CFSE wstrzyknięto 2 h po BCG. (A i B) Wykresy zebra pokazujące przeważającą ekspresję CFSE na komórkach MHCIIhigh i CD11c+/low w pLN drenażowym dla BCG 3 dni po zakażeniu. (C) Częstość i całkowita liczba komórek MHCIIhigh CD11c+/low znakowanych CFSE w pLN myszy po wstrzyknięciu BCG i PBS przedstawiono na wykresach w różnych punktach czasowych. (D) Średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla CD80 i CD86 określono dla skórnych DCs CFSE+ oraz CFSEneg MHC-IIhigh CD11c+/low w pLN 3 dni po zakażeniu BCG. (E) Ekspresję CFSE w obrębie skórnych DCs (MHC-IIhigh CD11c+/low), DCs rezydujących w LN (MHC-II+ CD11chigh) oraz (F) plazmacytoidalnych DCs (MHC-IIlow CD11clow PDCA-1+) określono za pomocą cytometrii przepływowej 3 dni po podaniu BCG. W każdym doświadczeniu wykorzystano co najmniej 5 myszy w grupach zainfekowanych BCG i 3 w grupach kontrolnych po wstrzyknięciu PBS. Słupki oznaczają błąd standardowy średniej. Całkowita liczba komórek znakowanych CFSE w każdym podzbiorze została podana w Bollampalli et al., PLoS Pathog 2015, 11:e1005206 3. * Oznacza różnice statystycznie istotne między grupą zainfekowaną BCG a kontrolą PBS. Przedstawiono jeden z dwóch niezależnych eksperymentów. Rycina zaadaptowana z Bollampalli et al., PLoS Pathog. 2015, 11:e1005206 3, za zgodą wydawcy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Schemat cytometrii przepływowej komórek dendrytycznych; markery CD103, CD11b, EpCAM; wykres odpowiedzi immunologicznej na BCG.
Rycina 3. DC EpCAMlow CD11bhigh stanowią główną subpopulację komórek dendrytycznych skóry migrujących do DLN po infekcji BCG w stopie. Myszy C57BL/6 otrzymały wtryśnięte BCG i CFSE, analogicznie jak na Rycynie 2. (A) Wykresy typu zebra przedstawiające zastosowaną strategię bramkowania (panel górny) oraz częstotliwość występowania komórek CFSE+ w każdej zdefiniowanej subpopulacji w różnych punktach czasowych po infekcji BCG (panele dolne). Częstotliwości w każdej subpopulacji mogą się różnić w zależności od czasu po infekcji. Po 3 dniach od podania BCG można spodziewać się znalezienia około 0,2% komórek MHC-IIhigh CD11c+/low wśród wszystkich komórek LN. Z tej grupy około 6% stanowią komórki CD103+. W subpopulacjach znajdujących się w bramce MHC-IIhigh CD103negative można znaleźć około 42% komórek CD11bhigh EpCAMlow, 27% komórek CD11blow EpCAMlow oraz 7% LCs. (B) Przedstawiono całkowitą liczbę komórek CFSE+ w każdej zdefiniowanej subpopulacji w różnych punktach czasowych po infekcji BCG. W każdym doświadczeniu wykorzystano co najmniej 5 myszy dla grup zainfekowanych BCG i 3 dla kontroli PBS. Słupki oznaczają błąd standardowy średniej. * Oznacza różnice istotne statystycznie w stosunku do kontroli wstrzykniętych PBS. Przedstawiono jedno z trzech niezależnych doświadczeń. Rycina przedrukowana z Bollampalli et al., PLoS Pathog 2015, 11:e1005206 3, za zgodą wydawcy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

noDC to wyspecjalizowane komórki prezentujące antygen, które mogą reagować na wyzwanie mikrobiologiczne na powierzchni ciała, pozyskując antygen drobnoustrojowy i migrując do DLN przez limfę. Tam DC prezentują ten antygen limfocytom T w sposób, który napędza pierwotne odpowiedzi limfocytów T. Proces migracji DC z tkanki do DLN jest zatem bardzo ważny dla zrozumienia, w jaki sposób inicjowana jest produktywna odpowiedź limfocytów T. Metody pomiaru migracji DC są zatem bardzo przydatne w rozwijaniu powyższego.

Do zbadania migracji DC skóry do DLN wykorzystano model mysi po zakażeniu BCG, żywą szczepionką, która jest wstrzykiwana klinicznie w skórę. W linii BCG jest wstrzykiwany w tylną poduszkę stopy, aby naśladować tę skórną drogę szczepienia. Opracowano prosty test, który w konsekwencji został włączony do tego modelu w celu zbadania migracji subpopulacji DC skóry z miejsca inokulacji BCG w skórze opuszki stopy do drenującego pLN. Protokół ten polega na wstrzyknięciu fluorochromu CFSE do tej samej opuszki stopy, która wcześniej otrzymała BCG, a następnie wyizolowaniu drenującego pLN 24 godziny później w celu przeanalizowania obecności komórek znakowanych CFSE za pomocą cytometrii przepływowej. Chociaż nie jest to opisane w protokole, LN z tej konfiguracji można również przygotować do analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zbadania procesów migracji, takich jak pozycjonowanie komórek migrujących w LN 3. Ponadto podobne wyniki dotyczące migracji DC skóry wywołanej przez BCG uzyskano przy użyciu zarówno BCG Pasteur 1173P2 3 , jak i BCG SSI 1331 14.

CFSE jest powszechnie stosowany do znakowania komórek in vitro i śledzenia takich znakowanych komórek in vivo po transferach komórkowych 15. Jednak w obecnym protokole był używany do bezpośredniego oznaczania komórek skóry in situ. Molekularne podstawy znakowania CFSE są podobne do FITC, który jest również barwnikiem fluorescencyjnym reagującym z aminami. CFSE jest jednak preferowany w stosunku do FITC do koniugacji, ponieważ tworzy bardzo stabilne wiązania karboksyamidowe 16. Ponadto CFSE jest wysoce przepuszczalny dla błon i pasywnie dyfunduje do komórek. Po wejściu do środka tworzy wewnątrzkomórkowe koniugaty aminowe (fluorescencyjne), które są zatrzymywane w znakowanej komórce 15.

Opracowany przez autorów test migracji oparty na CFSE umożliwia identyfikację komórek przemieszczających się ze skóry do DLN w ciągu 24 godzin w odpowiedzi na BCG. W ten sposób mierzy ostrą migrację w określonych ramach czasowych i pozwala zbadać zdolność różnych, wstrzykniętych bodźców do wywoływania migracji. Test ten różni się od klasycznej techniki malowania skóry FITC, która mierzy skumulowane zdarzenie migracji wywołane przez skórne, miejscowe zastosowanie środka uczulającego na kontakt. W związku z tym test migracji oparty na CFSE można zastosować do identyfikacji migrujących DC skóry lub innych komórek, które są domem dla pLN po wstrzyknięciu drobnoustrojów, produktów mikrobiologicznych lub innych bodźców zapalnych w opuszkę stopy. Rzeczywiście, wykazano, że zarówno neutrofile, jak i limfocyty T γ:δ przemieszczają się ze skóry do DLN w odpowiedzi na BCG 17,18. W rzeczywistości test został niedawno wykorzystany w warunkach koinfekcji, aby pokazać, że infekcja nicieniami zlokalizowana w jelitach może wyciszyć migrację DC skóry wywołaną przez BCG do DLN 14.

Migracja DC jest często oceniana w okresie od 24 do 72 godzin w malowaniu skóry FITC, ponieważ DC oznaczone FITC są trudne do wykrycia 4 do 5 dni po malowaniu 19. Utrata sygnału CFSE na oznakowanych DC nie stanowi problemu w przedstawionym tutaj teście, ponieważ analiza migracji została ograniczona do 24 godzin; Powodem tego było to, że autorzy chcieli dokładnie zbadać wydarzenia migracyjne "z dnia na dzień". Innych zainteresowanych tym testem zachęca się jednak do zbadania wcześniejszych lub nawet późniejszych punktów czasowych dla śledzenia opartego na CFSE. Ponadto, ponieważ CFSE jest wprowadzany przez wstrzyknięcie, może być podawany w dowolnym określonym czasie. Ta elastyczność pozwoliła autorom ocenić migrację DC między 5 a 6 dniem po zakażeniu BCG (Figura 2C) 3. Wstrzyknięcie CFSE może potencjalnie ograniczyć typy komórek dostępne in situ dla reakcji znakowania. Na przykład komórki Langerhansa (LC), które są DC znajdującymi się w górnej warstwie skóry, naskórku, słabo migrują w odpowiedzi na BCG w teście migracji opartym na CFSE (ryc. 3) 3. Jednak podczas malowania skóry FITC DC umieszczone w skórze właściwej, warstwie poniżej naskórka, są łatwo znakowane i migrują do DLN szybciej niż LC 20,21. Sugeruje to, że komórki mogą zostać znakowane fluorochromem bez konieczności lokalizacji w warstwie skóry, w której nakładany jest roztwór znakujący.

Jako model zakażenia BCG, ucho myszy zapewnia w dobrej wierze śródskórną drogę inokulacji, która jest bardziej zgodna z klinicznym podawaniem BCG jako szczepionki przeciw gruźlicy. Z drugiej strony wstrzyknięcie opuszki stopy jest prawdopodobnie kombinacją drogi śródskórnej i podskórnej. To powiedziawszy, wymaga umiejętności i szkolenia, aby prawidłowo i powtarzalnie dostarczyć BCG do skóry właściwej 22, więc w praktyce klinicznej nie zawsze może być podawany naprawdę śródskórnie, ale raczej podskórnie lub kombinację obu. Jako miejsce szczepienia, podnóżek ma dwie bardzo wyraźne zalety w stosunku do ucha, o których warto wspomnieć. Po pierwsze, odpowiedź immunologiczna jest skoncentrowana na drenującym pLN po wstrzyknięciu opuszki stopy, co ułatwia badanie odpowiedzi. Autorzy tego raportu stwierdzili, że pLN jest pierwszym i głównym LN odprowadzającym wodę z podnóżka 3. Inni sugerowali drenaż podzielony między LN podkolanowy i podbiodrowy po wstrzyknięciu niebieskiego 23 Evana. Niemniej jednak, jeśli chodzi o ucho, u myszy występuje więcej niż jedna DLN ucha i mogą one nie być regularnie obecne lub łatwe do zlokalizowania 24. To ostatnie wyraźnie wprowadza odpowiedzialność w badaniach mających na celu zbadanie odpowiedzi w DLN. Po drugie, do opuszki stopy można wprowadzić większe objętości (10 - 50 μl) w porównaniu z uchem. To z kolei minimalizuje ryzyko wprowadzenia poważnych zmian w przepływie limfy i konieczności pracy z bardzo małymi objętościami iniekcji, co samo w sobie stanowi problem, jeśli chodzi o inokulację dużych ilości prątków. W uchu, w którym objętość iniekcji musi być niewielka (1-10 μl), nawet 5 μl może zmienić przepływ limfy i potencjalnie w niekontrolowany sposób wtłoczyć większą ilość wstrzykiwanego materiału bezpośrednio do DLN. Dlatego ważne jest, aby uwzględnić objętość wtrysków. Jest to szczególnie ważne w eksperymentach dotyczących udziału komórek w przenoszeniu bakterii do LN. W modelu podnóżka BCG część BCG mogła osiągnąć DLN przy braku transportu komórkowego. Opiera się to na obserwacji, że nadal można wykryć BCG w DLN myszy, u których migracja komórek z opuszki stopy została całkowicie zlikwidowana przez miejscowe wstrzyknięcie toksyny krztuścowej 3. To, czy jest to wskazówka, że BCG może mieć bezpośredni dostęp do limfy i dotrzeć do DLN w sposób naprawdę wolny od komórek, pozostaje do ustalenia, ponieważ nie można wykluczyć, że prątki w tym przypadku miały dostęp do limfy siłą wstrzykniętej objętości.

Praktycznym aspektem szczepień w uchu lub opuszkę stopy jest to, że zwierzęta muszą być odpowiednio unieruchomione, aby wstrzyknięcia były wykonywane prawidłowo i w powtarzalny sposób. Gaz izofluranowy jest opisany w obecnym protokole jako metoda krępowania zwierząt w ramach przygotowań do wstrzyknięć w opuszki stóp. Stosunkowo szybki czas indukcji i rekonwalescencji w przypadku znieczulenia za pośrednictwem izofluranu sprawia, że jest to popularna metoda, ale podobnie jak inne środki znieczulające, wpływa na fizjologię, co może zakłócać wyniki eksperymentalne 25. Rzeczywiście, zarówno lotne, jak i wstrzykiwane środki znieczulające zmniejszają przepływ limfy poprzez zniesienie dobrowolnych ruchów mięśni, zmniejszenie napięcia mięśniowego i zmniejszenie skurczu węzłów chłonnych 26. Ponadto u znieczulonych zwierząt odnotowano 5-krotne zmniejszenie migracji do DLN DC adoptywnie przenoszonych w opuszkach stóp 27. Biorąc pod uwagę powyższe, a także fakt, że procedury obchodzenia się ze zwierzęciem przed znieczuleniem mogą powodować większy stres u zwierząt niż samo wstrzyknięcie, które jest zarówno szybkie do podania, jak i nie wymaga etapu rekonwalescencji, należy rozważyć możliwość odpowiedniego krępowania zwierzęcia bez środków znieczulających. Unieruchamiacz myszy dostosowany do wstrzykiwań w opuszkę stopy, w którym zwierzę można szybko doprowadzić do unieruchomionej pozycji i zaszczepić w opuszkę stopy w ciągu 30 do 40 sekund, byłby idealny do wstrzyknięcia myszy w tylną poduszkę stopy bez zmiany innych aspektów jej fizjologii w tym procesie i byłby niezwykle przydatny w badaniach dotyczących migracji komórek przez limfatykę.

Podsumowując, raport ten podkreśla nowatorski protokół śledzenia DC skóry podczas ich mobilizacji do DLN przy użyciu testu, który monitoruje migrację w zdefiniowanym oknie 24-godzinnym. Ten test migracji oparty na CFSE umożliwia wykrywanie i analizę komórek migrujących za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano tutaj, a także za pomocą mikroskopii konfokalnej 3. Stanowi elastyczną platformę do badania różnych wstrzykiwanych bodźców i ich zdolności do wyzwalania migracji DC, a co ważne, może być wykorzystywany do śledzenia nie tylko DC, ale także innych populacji przemieszczających się ze skóry na DLN w różnych warunkach eksperymentalnych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Karolinska Institutet, grant projektowy od Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych VR (Dnr 2014-2794) oraz grant doktorski KID od Karolinska Institutet (All to A.G.R.). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IsofluraneBaxter1001936060
5- i 6-karboksyfluoresceinowy dioctan sukcynimidylu ester
(CFSE)		InvitrogenC1157
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF7524
Bacille Calmette-Gué rin (BCG)szczep Pasteur, we własnym
zakresie Roztwór błękitu trypanowegoSigmaT8154
EDTAW domu
Azydek soduSigmaS2002
PBSW domu
Filtrowana wodaW domu
Strzykawka BD Plastipak 3 ml BDMedyczne systemy chirurgiczne309658alternatywa: strzykawka 5 ml 
Płytki 6-dołkoweTPP92006
Probówki wirówkowe 15 mlTPP91015Probówki
z okrągłym dnem zBD Falcon3272948Polistyren
Univentor 400 Jednostka anestezjologicznaUniventor8323001
Monojet 3/10 mlMedicarrier888151114429 G x 1/2 cala
Sterylna jednostka filtrującaTPP99500membrana PES 
Homogenizator EPPI-PistillSchuett biotech3.200 512Wirówka polipropylenowa
Allegra X-30R BeckmanCoulterB01145
Bü rker komora liczącaVWR631-0920
0,5 ml nakrętka mikroprobówka Sarstedt72.730Polipropylen
1,5 ml Probówka do mikrowirówek EppendorfVWR700-5239Polipropylenowe
sitka do komórek 70 mikronówVWR734-0003
BD LSR-II, obsługiwany za pomocą oprogramowania FACSDivaBD BiosciencesWycofane. Dostępne są inne cytometry przepływowe, wymagane minimalne wykrywanie 6 fluorochromów
Oprogramowanie do analizy komórek FlowJoTree Star
przeciwciało<strong>klon<strong>Company 
MHC-II I-A/I-E M5/114.15.2BD Biosciences
CD11bM1/70BD Biosciences
CD11cHL3BD Biosciences
CD16/CD32 (blok Fc)2.4G2BD Biosciences
CD326/EpCAMG8.8Biolegend
CD1032E7Biolegend
CD8016-10A1Biolegend
CD86GL-1Biolegend
polipropylenu 5 ml Cytometr przepływowy

Bibliografia

  1. Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
  2. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  3. Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206(2015).
  4. Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
  5. Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
  6. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Jr Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11(2007).
  7. Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
  8. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
  9. Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1(2002).
  10. Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3(2001).
  11. Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
  12. Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
  13. Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
  14. Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
  15. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9(2009).
  16. Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
  17. Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
  18. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
  19. Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
  20. Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
  21. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
  22. Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
  23. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
  24. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
  25. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
  26. Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
  27. Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Migracja kom rek dendrytycznychtest CFSEwstrzykni cie w poduszk stopyw ze ch onny podkolanowycytometria przep ywowazaka enie BCGledzenie kom rekizolacja w z a ch onnegoprezentacja antygenu

Powiązane artykuły