Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54624

⸱

22 grudnia 2016

 ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Streszczenie

Transdukcja-transplantacja to szybki i skuteczny sposób modelowania ludzkich nowotworów hematologicznych u myszy. Technika ta powoduje ekspresję interesującego genu w komórkach krwiotwórczych i może być wykorzystana do badania roli genu w prawidłowej i/lub złośliwej hematopoezie. Protokół ten zawiera szczegółowy opis sposobu wykonywania transdukcji-przeszczepu przy użyciu mutacji kalretykuliny (CALR) niedawno zidentyfikowanych w nowotworze mieloproliferacyjnym (MPN) jako przykładzie. W tym protokole całe komórki szpiku kostnego od myszy dawców leczonych 5-flurouracylem (5-FU) są transdukowane zmutowanym CALR kodującym retrowirusa i przeszczepiane do śmiertelnie napromieniowanych gospodarzy syngenicznych. Komórki dawcy wykazujące ekspresję zmutowanego CALR są oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Przeszczepione myszy rozwijają fenotyp MPN, w tym podwyższone płytki krwi obwodowej, ekspansję megakariocytów w szpiku kostnym i zwłóknienie szpiku kostnego. Przedstawiamy krok po kroku, jak wygenerować retrowirusa, obliczyć miano wirusa, transdukować całe komórki szpiku kostnego i przeszczepić napromieniowanym myszom biorcy.

Wprowadzenie

Transdukcja-transplantacja jest użyteczną metodą modelowania nowotworów hematologicznych u myszy. Technika ta była szczególnie cenna w badaniu nowotworów złośliwych szpiku od czasu pierwszego wykazania, że ektopowa ekspresja BCR-ABL1 może wiernie odtworzyć przewlekłą białaczkę szpikową u myszy1. Technika ta ułatwiła następnie szeroko zakrojone badania zmutowanego nowotworu mieloproliferacyjnego (MPN) JAK2V617F i MPLW515K/L.

MPN to grupa nowotworów hematologicznych charakteryzujących się nadprodukcją dojrzałych komórek szpikowych i zwłóknieniem szpiku kostnego. Choroby te na ogół powstają w wyniku klonalnej ekspansji hematopoetycznej komórki macierzystej, która nabyła mutację somatyczną w Jak2, MPL lub CALR. Modele transdukcyjno-transplantacyjne JAK2V617F i MPLW515K/L wykazują cechy kliniczne czerwienicy prawdziwej i zwłóknienia szpiku 2-5. Ostatnio wygenerowano również mysi model MPN z mutacją kalretykuliny za pomocą metody transdukcji-przeszczepu6. U tych myszy rozwija się choroba podobna do małopłytkowości ze zwiększoną liczbą płytek krwi, zwiększoną liczbą megakariocytów i zwłóknieniem szpiku kostnego. Łącznie modele te dały nie tylko możliwość uzyskania wglądu w molekularną patogenezę MPN, ale także możliwość opracowywania i badania środków terapeutycznych w warunkach przedklinicznych.

Ten manuskrypt zawiera szczegółowy opis metodologii transdukcji-transplantacji, ze szczególnym uwzględnieniem mutacji CALRdel52. Technika ta polega na przeszczepieniu transdukowanych retrowirusowo komórek szpiku kostnego wykazujących ekspresję zmutowanego konstruktu do napromieniowanych myszy syngenicznych biorców.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Wszystkie zabiegi wykonywano w znieczuleniu izofluranem i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie.

1. Generacja retrowirusa ekotropowego

  1. Przygotuj wysokiej jakości plazmidy o stężeniu co najmniej 1 μg/μl za pomocą dostępnego w handlu zestawu maxi-prep lub oczyszczania chlorkiem cezu.
    nuta: Należą do nich wektor szkieletowy MSCV kodujący interesujący nas gen (w tym przypadku CALR7,8) i marker z wyboru (GFP, Neo itp.), a także ekotropowy plazmid pakujący, kodujący gag-pol-env (określany tutaj jako plazmid).
  2. Rozmrozić i rozmnożyć komórki 293T o niskim pasażu w DMEM uzupełnione 10% FBS i L-glutaminą z penicyliną / streptomycyną (D10). Płytka 5 x 106 komórek w 10 cm naczyniu poddanym działaniu kultur tkankowych w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Rozwiń komórki 293T w hodowli. W dniu poprzedzającym transfekcję przemyć komórki, dodając 1 ml PBS i odessać supernatant do kolby próżniowej.
  4. Aby trypsynizować komórki, dodaj 2 ml 0,05% trypsyny i inkubuj naczynia w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 2 - 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Aby zatrzymać trypsynizację, dodaj 3 ml D10 do naczynia i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki przy 400 x g przez 10 min.
  6. Odessać supernatant do kolby próżniowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml D10.
  7. Policz komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.
  8. Wysiewaj 2 x 106 komórek na szalkę do trzech 10-centymetrowych szalek poddanych kulturze tkankowej na każdego wytworzonego wirusa.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, nie należy dopuścić do przekroczenia przez komórki 30-50% konfluencji w czasie transfekcji, w przeciwnym razie można uzyskać słabą wydajność wirusa.
  9. Bezpośrednio przed transfekcją odessać pożywkę do kolby próżniowej i zastąpić 5 ml świeżej pożywki D10.
  10. Na każde 10 cm szalki Petriego, która ma być transfekowana, należy przygotować indywidualną sterylną probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml.
  11. Odpipetować 760 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdej probówki do mikrowirówki, a następnie ostrożnie dodać 40 μl odczynnika do transfekcji bezpośrednio do pożywki. Inkubować probówki w kapturze do hodowli tkankowej w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  12. Dodaj 30 μg wektora MSCV z interesującym genem (15 μg w przypadku stosowania pustego wektora), a także 5 μg plazmidu do każdej odpowiedniej probówki i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli tkankowych przez dodatkowe 15 minut.
    nuta: Mniejsze wektory mają zwykle wyższą wydajność wirusa.
  13. Ostrożnie dodać całkowitą objętość każdej reakcji (około 800 μl) kroplami do odpowiedniej 10 cm szalki Petriego i delikatnie przechylić szalkę z boku na bok, aby wymieszać. Z powrotem komórki do nawilżonego inkubatora do hodowli tkankowych.
  14. Po 8-godzinnej lub nocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli tkankowych odessać pożywkę do kolby próżniowej i delikatnie zastąpić 10 ml świeżej witaminy D10.
  15. Po 48 godzinach od transfekcji zebrać supernatant do strzykawki o pojemności 35 ml i przefiltrować przez membranę 0,45 μm w celu usunięcia resztek komórek.
  16. OPCJONALNIE: Umieścić 10 ml świeżej witaminy D10 z powrotem na komórkach 293T, a dodatkowy wirus może zostać pobrany po 72 godzinach od transfekcji.
  17. Komórki 293T należy wyrzucić do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne, gdy nie zbiera się dodatkowego wirusa.
  18. Podwielokrotność supernatantu wirusa rozdzielić na objętości do jednorazowego użytku (na przykład 1 ml w przypadku miana wirusa lub 6,5 ml w przypadku zakażenia BM). Wirus błyskawicznego zamrożenia z użyciem ciekłego azotu i przechowywać wirusa w temperaturze -80 °C.
    nuta: Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania, ponieważ znacznie zmniejszają one miano wirusa.

2. Określ względne miano wirusa za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Rozmrozić komórki 3T3 i utrzymać w D10. Hodować komórki w 10-centymetrowym naczyniu poddanym działaniu hodowli tkankowej w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Wykonać miano wirusa w trzech egzemplarzach. Aby przygotować komórki, należy je przemyć, dodając 1 ml PBS i odessać supernatant do kolby próżniowej.
  3. Aby trypsynizować komórki, dodaj 2 ml 0,05% trypsyny i inkubuj naczynia w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Aby zatrzymać trypsynizację, dodaj 3 ml D10 do naczynia i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki przy 400 x g przez 10 min.
  5. Odessać supernatant do kolby próżniowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml D10.
  6. Policz komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.
  7. Komórki 3T3 należy wysiać w gęstości 1 x 105 komórek na piętnaście 60-milimetrowych szalek poddanych kulturze tkankowej i inkubować przez noc.
  8. Przygotować rozcieńczenia 1:3, 1:10, 1:30 i 1:100 rozmrożonego supernatantu wirusowego za pomocą D10 w sumie w 1 ml. Dołącz również kontrolę wolną od wirusów.
  9. Odessać pożywkę z komórek 3T3 do kolby próżniowej i zastąpić 4 ml D10.
  10. Na komórki 3T3 nałożyć rozcieńczenia supernatantu wirusa i dodać polibren do końcowego stężenia 8 μg/ml do każdej płytki. Inkubować przez 48 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  11. Określ względne miano wirusa za pomocą cytometrii przepływowej:
    1. Aby przepłukać komórki, należy zassać pożywkę do kolby próżniowej i dodać 5 ml PBS.
    2. Zassać PBS do kolby próżniowej. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 - 5 minut, aby oderwać komórki od naczynia.
    3. Dodać 3 ml D10 i pipetować w górę i w dół, aby odłączyć pozostałe komórki od płytki. Przenieść komórki do probówki FACS i odwirować przy 400 x g przez 10 minut.
    4. Zdekantować supernatant i przepłukać komórki 3 ml PBS. Odwirować przy 400 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant. Zawiesić w 200 μl PBS.
    5. Uruchom komórki na cytometrze przepływowym9. Zbierz od 20 000 do 30 000 zdarzeń w bramce aktywnej komórki (określonej przez FSC w porównaniu z SSC) i oblicz procent komórek GFP+ i GFP-.
      nuta: Miano wirusa uważa się za dopuszczalne, gdy rozcieńczenie supernatantu wirusa w stosunku 1:30 daje co najmniej 50% komórek GFP+ 3T3. Jeśli w wyniku tego rozcieńczenia uzyskasz mniej niż 50% komórek GFP+, można uzyskać nieoptymalne wyniki transdukcji. Obliczenia mające na celu określenie miana wirusa zostały zaadaptowane z Limon et al., Blood (1997)9.
    6. Aby określić względne miano wirusa, należy użyć równania: miano wirusa = jednostki tworzące cząstki (PFU)/ml = [(Liczba komórek 3T3 × częstość komórek GFP+) / Objętość supernatantu (ml)] × Współczynnik rozcieńczenia.

3. Transdukcja komórek szpiku kostnego dawcy

  1. Aby przygotować myszy dawcy do pobrania szpiku kostnego (BM), najpierw znieczulij myszy za pomocą parownika izofluranu z natężeniem przepływu 5% połączonego dodatkowego tlenu o stężeniu 1 l/min. Stopa szczyptająca, aby ocenić reakcję.
    nuta: Myszy dawcy (w wieku poniżej 8 tygodni) powinny być przygotowane na 5 dni przed pobraniem szpiku kostnego (8 dni przed przeszczepem). Jedna mysz dawca dostarczy wystarczającą ilość komórek dla co najmniej 2 biorców.
  2. Wstrzyknąć 150 mg/kg 5-fluorouracylu (5-FU) przez wstrzyknięcie zaoczodołowe znieczulonym myszom za pomocą igły 27 G × 1/2".
    ostrożność! 5-FU przeciwnowotworowy środek chemioterapeutyczny. Z 5-FU należy zawsze obchodzić się w certyfikowanym okapie oparowym lub kanałowej szafie bezpieczeństwa biologicznego. Skonsultuj się z laboratorium instytucji i komitetem ds. bezpieczeństwa zwierząt, aby określić odpowiednie oznakowanie myszy leczonych 5-FU.
    1. Ustaw znieczuloną mysz na boku i utrzymuj się zarówno kciukiem, jak i palcem wskazującym tak, aby oko lekko wystawało z głowy.
    2. Zaczynając od igły bocznie do kości przyśrodkowej i ze skosem skierowanym do góry, wbić igłę pod kątem 45° w kierunku przyśrodkowym i zatrzymać, gdy igła zostanie włożona do połowy. Powoli wstrzyknąć komórki i ostrożnie wyjąć igłę.
      nuta: Jeśli ta technika jest wykonywana prawidłowo, oko powinno się lekko cofnąć i nie powinien być odczuwalny żaden opór po wprowadzeniu igły.
    3. Zbadaj mysz pod kątem oznak obrażeń, takich jak obrzęk lub krwawienie.
  3. Szpik kostny należy pobrać 5 dni po leczeniu 5-FU (3 dni przed przeszczepem).
    1. Znieczulenie myszy za pomocą parownika izofluranu z natężeniem przepływu 5% połączonego dodatkowego tlenu o stężeniu 1 l/min. Uszczypnij stopę, aby ocenić reakcję.
    2. Ofiaruj mysz przez zwichnięcie szyjki macicy. Wysterylizuj mysz, spryskując obficie 70% EtOH, aż futro stanie się mokre.
    3. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w skórze i odetnij powięź od mięśni nóg. Następnie odetnij nogę od myszy, odcinając kość udową w biodrze i kość piszczelową w kostce.
    4. Zegnij nogę w kształt litery "L" i oddziel każdą kość nogi, przecinając staw kolanowy nożyczkami preparacyjnymi.
    5. Aby usunąć chrząstkę na dystalnych końcach każdej kości nogi, użyj nożyczek preparujących, aby delikatnie zeskrobać mięsień w kierunku jednego końca kości nogi, aż chrząstka zostanie odłączona.
    6. Za pomocą strzykawki z igłą o wymiarach 27 G x 1/2 cala przepłukać każdą kość nogi PBS uzupełnionym 2% FBS przez nylonową membranę 100 μM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Płucz kość, aż kość zmieni kolor na biały, aby zmaksymalizować liczbę zebranych komórek.
    7. Za pomocą tłoka strzykawki rozgnieść komórki przez membranę nylonową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Powtórz z drugą nogą myszy.
  4. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g i odrzucić supernatant. Zawiesić BM w 5 ml buforu chlorku amonu i potasu (ACK) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować komórki na lodzie przez 10 minut.
  5. Napełnij probówkę PBS, aby zatrzymać lizę komórek. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g i odrzucić supernatant. Powtórz etap lizy, jeśli osad BM ma czerwony kolor.
  6. Zawiesić ponownie w 5 ml PBS i policzyć komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.
  7. Zawieś komórki przy 2 x 106 komórkach na m za pomocą 2x koktajlu pre-stim, który zawiera DMEM uzupełniony o 20% FBS, L-glutaminę, penicylinę/streptomycynę, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) i SCF (112 ng / ml). Płytka 2 ml na studzienkę w płytkach 6-dołkowych.
  8. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. Dodać 2 ml supernatantu wirusa do każdej studzienki zawierającej komórki BM i dodać polibren (8 μg/ml). Obracać płytki w temperaturze 30 °C przez 90 minut w temperaturze 1 500 x g, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze kultur tkankowych na noc.
  10. Zawiesinę komórek pipetować do stożkowych probówek i wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g, nie wyrzucać płytki. Zawieś komórki w 2 ml świeżego koktajlu 2x pre-stim na dołek i wróć do oryginalnych dołków.
  11. Wykonaj drugą spinokulację, powtarzając kroki 3.7-3.9.

4. Przeszczepianie komórek dawcy myszom biorcom

  1. Przygotować syngeniczne myszy biorcze do przeszczepu za pomocą napromieniania całego ciała dawką śmiertelną < 24 godziny przed wstrzyknięciem komórek BM.
    UWAGA: Dawka śmiertelna promieniowania dla myszy BALB/c wynosi zwykle 800-900 cGy i 1,000-1,200 cGy dla C57B/610. Dawkę dzieli się zazwyczaj na dwie sesje napromieniania w odstępach co najmniej 3-4 godzin.
  2. Kontynuując od kroku 3.11, należy pobrać transdukowane komórki dawcy z 6 płytek dołkowych, delikatnie pipetując supernatant do stożkowych probówek. Przemyć każdą studzienkę 1 ml PBS w celu zebrania pozostałych komórek i dodać do 50 ml stożkowych probówek.
  3. Dodać 0,5 ml 0,05% trypsyny do studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 5 minut.
  4. Dodać 1 ml D10 do studzienek i odłączyć pozostałe komórki za pomocą delikatnego pipetowania. Dodać komórki do odpowiednich probówek z kroku 4.2 i osadzać przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g.
  5. Przemyć komórki PBS i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g. Zawiesić ponownie w 5 ml PBS i zliczyć komórki za pomocą hemocytometru przez wykluczenie błękitu trypanowego.
    UWAGA: Jeśli wektor ma znacznik GFP, określ ilościowo procent komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometru przepływowego.
  6. Zawiesić 5 x 105 - 2 x 106 komórek w 50 - 100 μl PBS do wstrzyknięcia myszom.
  7. Wstrzyknij komórki za pomocą wstrzyknięcia zaorbitalnego znieczulonym myszom za pomocą sterylnej igły 27 G x 1/2".
    nuta: Inne techniki iniekcji obejmują żyłę ogonową, śledzionę lub kość udową.
    1. Znieczulij mysz za pomocą izofluranu i uszczypnij stopę, aby ocenić reakcję.
    2. Ustaw mysz na boku i unieruchamiaj się zarówno kciukiem, jak i palcem wskazującym tak, aby oko lekko wystawało z głowy.
    3. Ze skosem skierowanym do góry, włóż igłę bocznie do kantu przyśrodkowego pod kątem 45°.
      nuta: Jeśli ta technika jest wykonywana prawidłowo, oko powinno się lekko cofnąć i nie powinien być odczuwalny żaden opór po wprowadzeniu igły.
    4. Zbadaj mysz pod kątem oznak obrażeń, takich jak obrzęk lub krwawienie.
      nuta: Po przeszczepie myszy będą miały niską morfologię krwi przez kilka tygodni, a więc są podatne na infekcje. Można zastosować profilaktykę antybiotykami lub stosowanie zakwaszonej wody.
  8. Miesiąc po przeszczepieniu należy zmierzyć % GFP we krwi obwodowej jako wskaźnik dla przeszczepionych komórek dawcy za pomocą cytometrii przepływowej.
    nuta: Sama GFP nie może decydować o powodzeniu wszczepienia komórek. Transdukcja wirusa mogła się nie powieść, ale mogło dojść do wszczepienia. W tym przypadku nie wykryto by komórek GFP+, ale wszczepienie przeszczepionych komórek zakończyło się sukcesem.
    1. Weź 10 μl krwi obwodowej, nakłuwając żyłę odpiszczelową nogi strzykawką 21 G x 1 1/2" i dodaj ją do 100 mM EDTA w PBS, aby zapobiec krzepnięciu.
    2. Dodać 1 ml ACK do krwi i lizować na lodzie przez 10 min. Komórki osadu przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 min.
    3. Odessać supernatant do kolby próżniowej i dodać 1 ml PBS uzupełnionego 2% FBS w celu zatrzymania lizy. Komórki osadu przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 min.
    4. Odessać supernatant do kolby próżniowej i zawiesić osad w 100 μl PBS uzupełnionym 2% FBS.
    5. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym i zbierz 300 000 zdarzeń w bramce żywej komórki (określone przez FSC w porównaniu z SSC) i oblicz procent komórek GFP+ i GFP- 9.
  9. Dodatkowo po 1 miesiącu od przeszczepu wykonaj pełną morfologię krwi (CBC) za pomocą automatycznego analizatora hematologicznegoweterynaryjnego 18 w celu monitorowania postępu choroby.
    nuta: Kontynuuj monitorowanie choroby za pomocą % GFP we krwi obwodowej i morfologii krwi co miesiąc.
  10. Aby zakończyć eksperyment, znieczul mysz za pomocą izofluranu i uszczypnij stopę, aby ocenić reakcję. Ofiaruj mysz przez zwichnięcie szyjki macicy i pobierz śledzionę i szpik kostny do histopatologii.
    nuta: Czas trwania eksperymentu jest subiektywny, a datę zakończenia należy ocenić na podstawie oczekiwanego fenotypu choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Technika transdukcji i transplantacji prowadzi do rekonstytucji krwiotwórczej myszy biorcy komórkami wykazującymi ekspresję interesującego genu. Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat modelu mysiego transdukcji i transplantacji w przypadku MPN z mutacją kalretikuliny. W skrócie, retrowirus wykazujący ekspresję CALRwt lub CALRdel52 jest wykorzystywany do zakażenia komórek szpiku kostnego (BM) od myszy dawcy szczepu C57B/6. Przetransdukowane komórki są przeszczepiane do napro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zawiera szczegółowy opis sposobu wykonywania przeszczepów szpiku kostnego u myszy w celu podsumowania podstawowej choroby podobnej do małopłytkowości z progresją do zwłóknienia szpiku z mutacją CALRdel52 jako czynnikiem powodującym chorobę. Pomyślne przeszczepienie komórek wykazujących ekspresję CALRdel52 powoduje zwiększenie liczby płytek krwi, ekspansję megakariocytów i zwłóknienie szpiku kostnego. Ponieważ przeszczep szpiku kostnego jest procesem wieloetapowym, ważne jest, aby zwrócić uwagę na etapy, w kt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez V Foundation Scholar (AGF) i MPN Research Foundation (AGF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cell Lines
DMEMCorningMT-10-013-CV
Komórki 293TATCCCRL-11268
Komórki 3T3ATCCCRL-1658
Plasmids
EcoPak, znany również jako pCL-EcoAddgene12371Retrowirusowe linie komórkowe, takie jak EcoPack 2-293, mogą być stosowane zamiast plazmidu EcoPak i standardowych komórek 293T. Dodatkowe plazmidy γ-retrowirusowe i plazmidy opakowaniowe są dostępne w Addgene i innych.
MSCV-IRES-GFP (MIG)addgene20672Dodatkowe plazmidy do transferu γ-retrowirusowego są dostępne w Addgene i innych.
Materiały eksploatacyjne
27 Igły G x 1/2"BD305620
Surowica bydlęcapłodu CorningMT-35-010-CV
Penicylina/streptomycyna/L-glutaminaCorningMT-30-009-CI
Trypsyna-EDTA (0,05%)CorningMT-25-052-CIMoże być domowej roboty
PBSCorningMT-21-031-CV
Naczynia 10 cmFisher172931
Probówki stożkowe 15 mlFisher12565268
Naczynia 60 mmFisher150288
PolybreneFisherNC9840454
5-FUFisherA13456-06
100 µ m sitka komórkoweFisher22363549
50 ml probówki stożkoweFisher12565270
6-dołkowa płytkaFisher130184
probówki FACSFisher14-959-5
0,45 μ m filtry strzykawkoweFisher0974061B
Opti-MEMGibco31985-070
Bufor ACKLonza10-548EMoże być domowej roboty
Rekombinowana mysia IL-3Peprotech213-13
Rekombinowana mysia IL-6Peprotech216-16
Rekombinowana mysia SCFPeprotech250-03
X-tremeGENE 9Roche6365809001Odczynnik do transfekcji
1,5 ml probówki wirówkoweUSA Scientific1615-5500
Equipment
Promiennik
Accuri C6
BD rentgenowski

Bibliografia

  1. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
  2. Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
  3. Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
  4. Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18(2006).
  5. Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
  6. Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
  7. Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  8. Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
  9. Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
  10. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
  11. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  12. Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
  13. Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
  14. Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
  15. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  16. Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
  17. Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. Myeloproliferative neoplasm animal models. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).
  18. Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mutacja kalretikulinyprzeszczep szpiku kostnegotransdukcja retrowirusowaekspresja GFPkom rki krwiotw rczeobliczanie miana wirusaleczenie 5 FUnapromieniowane myszy biorcy
Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.