Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54630

⸱

19 października 2016

 ,  ,  ,  , 
1Program in Translational Biomechanics, Institute of Translational Medicine and Therapeutics, University of Pennsylvania, 2Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 3Department of Physiology, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji aort od myszy i pomiaru ich modułu sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Streszczenie

Usztywnienie tętnic jest istotnym czynnikiem ryzyka i biomarkerem chorób sercowo-naczyniowych oraz cechą charakterystyczną starzenia się. Mikroskopia sił atomowych (AFM) jest wszechstronnym narzędziem analitycznym do charakteryzowania lepkosprężystych właściwości mechanicznych różnych materiałów, od twardych powierzchni (plastik, szkło, metal itp.) po komórki na dowolnym podłożu. Jest szeroko stosowany do pomiaru sztywności komórek, ale rzadziej używany do pomiaru sztywności aort. W tym artykule opiszemy procedury stosowania AFM w trybie kontaktowym do pomiaru modułu sprężystości ex vivo nieobciążonych tętnic myszy. Opisujemy naszą procedurę izolacji aort myszy, a następnie podajemy szczegółowe informacje do analizy AFM. Obejmuje to instrukcje krok po kroku dotyczące ustawiania wiązki laserowej, kalibracji stałej sprężystości i czułości ugięcia sondy AFM oraz pozyskiwania krzywych siły. Udostępniamy również szczegółowy protokół do analizy danych krzywych sił.

Wprowadzenie

Biomechaniczne właściwości tętnic są krytycznym wyznacznikiem chorób sercowo-naczyniowych (CVD) i starzenia się. Sztywność tętnic, główny czynnik ryzyka niezależny od cholesterolu i wskaźnik progresji CVD, zwiększa się wraz z uszkodzeniem naczyń krwionośnych, miażdżycą, wiekiem i cukrzycą1-8. Usztywnienie ścian tętnic wiąże się ze zwiększonym odróżnicowaniem, migracją i proliferacją komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych9-12. Ponadto zwiększona sztywność tętnic została powiązana ze zwiększoną adhezją makrofagów1, przepuszczalnością śródbłonka i transmigracją leukocytów13 oraz przebudową ścian naczyń14,15. W związku z tym terapie, które mogą zapobiegać usztywnieniu tętnic w CVD lub starzeniu się, mogą uzupełniać obecnie dostępne interwencje farmakologiczne, które leczą CVD poprzez obniżenie wysokiego poziomu cholesterolu we krwi.

AFM to potężne narzędzie analityczne używane do różnych zastosowań fizycznych i biologicznych. AFM jest coraz częściej stosowany do uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości i charakteryzowania właściwości biomechanicznych miękkich próbek biologicznych, takich jak tkanki i komórki1,2,10,16,17 z dużą dokładnością na poziomie nanoskali. Dużą zaletą AFM jest fakt, że może być stosowany z żywymi komórkami.

Ten artykuł opisuje naszą metodę pomiaru modułu sprężystości tętnic myszy ex vivo za pomocą AFM. Opisana metoda pokazuje, w jaki sposób 1) prawidłowo izolujemy tętnice mysie (aorta zstępująca i łuk aorty) oraz 2) mierzymy moduł sprężystości tych tkanek za pomocą AFM. Pomiary nieobciążonych modułów sprężystości w tętnicach mogą pomóc w wyjaśnieniu zmian w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które zachodzą w odpowiedzi na uszkodzenie naczyń krwionośnych, CVD i starzenie się.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Prace ze zwierzętami w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Pensylwanickiego. Metody zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.

1. Przygotowanie myszy i izolacja aorty

  1. Uśpić mysz, podając domięśniowo ketaminę (80 - 10 mg/kg), ksylazynę (8 - 10 mg/kg) oraz acepromazynę (1 - 2 mg/kg). Potwierdzić głębokość znieczulenia za pomocą testu uszczypnięcia ogona. Po pełnym uśpieniu myszy przeprowadzić eutanazję poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.
  2. Położyć mysz na plecach i przymocować ją do deski sekcyjnej. Oczyścić obszar brzucha za pomocą chusteczek nasączonych 70% (v/v) etanolem.
  3. Uszczypnąć skórę w linii środkowej i wykonać niewielkie nacięcie początkowe w obszarze brzucha za pomocą średnich nożyczek mikrochirurgicznych. Przytrzymując skórę pęsetą, użyć średnich nożyczek mikrochirurgicznych, aby rozciąć skórę i otrzewną od brzucha aż do mostka.
  4. Odciąć żebra po obu stronach za pomocą średnich nożyczek mikrochirurgicznych. Ostrożnie usunąć płuca i wątrobę za pomocą małych nożyczek mikrochirurgicznych, pozostawiając serce i aortę. Przenieść mysz wraz z deską sekcyjną pod mikroskop sekcyjny.
  5. Chwycić tkankę tłuszczową otaczającą aortę małą pęsetą i za pomocą małych nożyczek ostrożnie usunąć tłuszcz wokół aorty.
  6. Delikatnie uchwycić aortę pęsetą, wykonać jedno cięcie małymi nożyczkami mikrochirurgicznymi na początku aorty wstępującej oraz kolejne cięcie na końcu aorty zstępującej, tuż powyżej aorty brzusznej.
  7. Przenieść wypreparowaną aortę do szalki 60-mm zawierającej 1x roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS; bez wapnia i magnezu).
  8. Kontynuować usuwanie pozostałej tkanki tłuszczowej z aorty za pomocą małych nożyczek mikrochirurgicznych. Użyć małych nożyczek, aby otworzyć aortę wzdłużnie.
  9. Za pomocą małych nożyczek mikrochirurgicznych wyciąć niewielki fragment (~ 2 x 4 mm) aorty zstępującej i łuku aorty do analizy AFM (Rycina 1). Umieścić tkankę w plastikowej szalce 60-mm i utrzymać jej wilgotność w kropli PBS.

Schemat anatomiczny aorty; oznaczone łuk aorty, aorta zstępująca do celów edukacyjnych.
Rysunek 1: Obraz przedstawiający lokalizację poszczególnych odcinków aorty u myszy. Aortę wyizolowano na odcinku od serca do przepony, a do wyznaczenia modułów sprężystości wykorzystano niewielki fragment aorty zstępującej oraz łuk aorty. Pasek skali, 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

2. Przygotowanie próbek tkanek do pomiarów AFM

  1. Ostrożnie usuń PBS za pomocą chusteczki laboratoryjnej, nie dotykając aorty. Upewnij się, że strona światła tkanki jest skierowana do góry.
  2. Delikatnie przyklej oba końce otwartej aorty do płytki, nakładając 5 - 10 μl kleju cyjanoakrylowego za pomocą końcówki do nakładania żelu (Rysunek 2).
    UWAGA: Ilość kleju potrzebną do stabilnego przymocowania tkanki na każdym końcu należy określić empirycznie. Krytyczne jest, aby aorta nie została rozciągnięta podczas tego procesu.
  3. Sprawdź przyklejoną aortę, aby upewnić się, że nie jest ona złożona ani nie unosi się nad płytką. Po wysuszeniu kleju na powietrzu (30 - 60 sec), delikatnie dodaj PBS i zanurz próbkę.
    UWAGA: Przygotowanie AFM (kroki 3 - 5) można przeprowadzić podczas przygotowywania tkanki do analizy.

Układ do testu napięcia tkanki aorty w 60 mm szalce hodowlanej; końcówka do nakładania żelu, złącza klejowe. Schemat.
Rycina 2: Schemat segmentu aorty przyklejonego do 60-mm płytki hodowlanej za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Klej cyjanoakrylowy jest nakładany na krawędź próbki aorty w celu przygotowania jej do pomiarów AFM. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

3. Załadunek sondy

  1. Zamontuj uchwyt sondy do cieczy na statywie do ładowania sond.
  2. Za pomocą pęsety wsuń sondę AFM z azotku krzemu (belka o stałej sprężystości 0,06 N/m) z kulistą końcówką (użyto cząstki SiO2 o średnicy 1 µm, ale można zastosować również większe rozmiary) do uchwytu sondy. Upewnij się, że sonda AFM jest stabilnie zamocowana w uchwycie.
  3. Wsuń uchwyt sondy w mocowanie skanera Z głowicy AFM i upewnij się, że uchwyt sondy jest bezpiecznie przymocowany.

4. Ustawianie wiązki lasera na sondzie

  1. Uruchom oprogramowanie AFM. Wybierz w oprogramowaniu typ eksperymentu: Experiment Category na Contact Mode, Experiment Group na Contact Mode in fluid oraz Experiment na Contact Mode in fluid. Kliknij Load experiment w oprogramowaniu; spowoduje to włączenie lasera.
  2. Dodaj 3 ml wody destylowanej do szklanego naczynia z dnem o średnicy 50 mm i umieść naczynie na stole jednostki do wyrównywania lasera. Jednostka ta ułatwia proces ogniskowania wiązki lasera na tylnej części wspornika.
  3. Zamontuj głowicę AFM w pozycji pionowej w jednostce do wyrównywania lasera i włącz zasilanie urządzenia. Dodaj około 50 μl wody destylowanej, aby utworzyć kroplę na końcówce AFM.
  4. Za pomocą dżojstika obniż głowicę AFM tak, aby końcówka AFM miała kontakt z wodą w naczyniu. Jeśli kontakt między końcówką AFM a wodą w naczyniu nie zostanie nawiązany, delikatnie podnieś naczynie, aż do momentu uzyskania kontaktu. Dostosuj ostrość, jasność oraz pozycję XY tak, aby końcówka AFM była widoczna na ekranie LCD jednostki wyrównującej.
  5. Ustaw plamkę lasera na końcówce sondy AFM, regulując pokrętła pozycjonowania lasera w głowicy AFM. Używając pokręteł pozycjonowania detektora w głowicy AFM, dostosuj położenie fotodiody, aż wartości ugięcia pionowego wyniosą od 0 do -1 V, a ugięcie poziome wyniesie ok. 0 V.
  6. Sprawdź, czy sygnał sumaryczny lasera jest maksymalny. W razie potrzeby powtórz krok 4.5, aby ponownie dostosować pozycję wiązki lasera na końcówce AFM oraz położenie fotodiody w celu uzyskania maksymalnego sygnału sumarycznego.
    UWAGA: Nawet po powtórzeniu kroku 4.5 może być konieczne ponowne umieszczenie sondy AFM w uchwycie sondy, aby uzyskać maksymalny sygnał sumaryczny.

5. Kalibracja czułości ugięcia i stałej sprężystości sondy AFM

  1. Za pomocą pincety wykonaj zarysowanie na 60-mm szalce hodowlanej, a następnie wypełnij szalkę wodą destylowaną. Umieść szalkę na płytce uchwytu próbki. W tym przypadku zamocuj szalkę na zmotoryzowanym stoliku skanującym XY mikroskopu odwróconego.
  2. Umieść na górze płytki magnetyczny uchwyt, aby zapewnić jej stabilność podczas obrazowania.
  3. W menu Nawigacja w oprogramowaniu kliknij 'strzałkę w górę', aby przesunąć głowicę AFM niemal do najwyższej pozycji, co zapobiegnie dotknięciu sondy AFM szalki.
    UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny, ponieważ zapobiega uszkodzeniu końcówki AFM.
  4. Umieść głowicę AFM na stoliku mikroskopu.
  5. Użyj mikroskopu, aby ustawić ostrość na zarysowaniu na płytce. Za pomocą dżojstika lub klikając 'strzałkę w dół' w menu Nawigacja, powoli i ostrożnie opuść sondę AFM do PBS. Ustaw głowicę nieco powyżej zarysowania na płytce.
    UWAGA: Jeśli począ toenna pozycja głowicy AFM będzie bliżej próbki, czas kontaktu (engage time) zostanie znacznie skrócony.
  6. Przed nawiązaniem kontaktu, w razie potrzeby ponownie ustaw pozycję wiązki lasera na końcówce AFM oraz pozycję fotodiody, aby uzyskać maksymalny sygnał SUM.
  7. Wybierz typ końcówki, klikając Change Probe w menu Setup.
  8. Kliknij Check Parameters i ustaw parametry: Scan Size na 0, Scan Rate na 1 Hz, Sample/line na 256 oraz Deflection Setpoint na 20 nm. Kliknij Engage. Okno Engage Status pozostanie otwarte do momentu zetknięcia się sondy z powierzchnią płytki. Po nawiązaniu kontaktu sondy kliknij Ramp.
  9. Kliknij Expanded Mode w menu paska narzędzi Scan i ustaw parametry: Ramp Size w zakresie od 50 nm do 1 µm, Ramp Rate na 2 Hz, Number of Samples na 256, Tip Radius na 50 nm, Sample Poisson's Ratio na 0,5 (przy założeniu, że mierzony materiał jest całkowicie nieściśliwy), Tip Half Angle na 0, Trigger Mode na Relative oraz Trigger Threshold w zakresie od 20 do 10 nm.
  10. Kliknij Ramp Continuous w menu paska narzędzi Ramp, aby uzyskać krzywą siły na płytce (Rysunek 3A). W tej krzywej siły ustaw kanał 1 jako deflection error.
    UWAGA: Pozwoli to oprogramowaniu na przedstawienie wyników jako odchylenie pionowe w funkcji pozycji z.
    1. Kliknij lewy lub prawy koniec krzywej siły i przeciągnij kursor tak, aby objąć liniowy obszar krzywej siły (Rysunek 3A, czerwone przerywane linie). Użyj tych dwóch linii do wyznaczenia granic obszaru nachyłego, który ma zostać dopasowany do linii prostej.
  11. Wybierz Ramp na pasku narzędzi i kliknij Update Sensitivity. Zapisz wartość i powtórz ten krok jeszcze cztery razy. Wybierz Calibrate na pasku narzędzi, a następnie kliknij Detector. W polu Deflection Sensitivity wprowadź średnią wartość z pięciu pomiarów.
  12. Kliknij Withdraw 2-3 razy, aby podnieść głowicę AFM. Krok ten jest istotny, aby zapobiec interakcji między końcówką AFM a płytką podczas procesu strojenia termicznego (thermal tune). Kliknij Thermal Tune na pasku narzędzi.
  13. Ustaw Thermal Tune Range w zakresie 1 - 10 kHz (informację tę można znaleźć w katalogu producenta) oraz Deflection Sensitivity Correction na 1,14 dla belek w kształcie litery V oraz 1,106 dla belek prostokątnych.
  14. W menu Thermal Tune kliknij Acquire Data, aby uzyskać krzywą strojenia termicznego (Rysunek 3B). Używając oprogramowania AFM, przeciągnij myszą od krawędzi wykresu, aby nanieść czerwone przerywane linie po obu stronach krzywej (jak pokazano na Rysunku 3B), definiując granice dopasowania. Wybierz model Lorentzian (Air) lub Simple Harmonic oscillator (Fluid), w zależności od tego, który lepiej pasuje do danych.
  15. Kliknij Fit Data, a następnie Calculate Spring K i zapisz tę wartość. Powtórz kalibrację stałej sprężystości kilka razy i użyj wartości średniej. Kliknij Withdraw kilka razy.
  16. Zdejmij głowicę AFM ze stolika mikroskopu i umieść ją w jednostce wyrównawczej. Usuń szalkę ze stolika mikroskopu.

Wykres spektroskopii nanomechanicznej; błąd ugięcia w funkcji Z; analiza piku rezonansowego wspornika.
Rysunek 3: Krzywe sił AFM wykorzystane do kalibracji sond AFM. (A) Reprezentatywna krzywa siły AFM (krzywa kalibracyjna). Odcinek rozciągania krzywej siły znajdujący się między czerwonymi przerywanymi liniami pionowymi posłużył do wyznaczenia czułości ugięcia wspornika. (B) Wykres dopasowania prostego oscylatora harmonicznego służący do obliczenia stałej sprężystości wspornika, zgodnie z wcześniejszym opisem20. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Pomiar modułu sprężystości tętnic myszy ex vivo

  1. Umieść szalkę hodowlaną o średnicy 60 mm zawierającą tkankę aorty na stoliku mikroskopu i zabezpiecz ją za pomocą magnetycznego uchwytu na szalki.
  2. Umieść głowicę AFM na stoliku mikroskopu. Upewnij się, że sonda AFM nie styka się z aortą, lecz delikatnie styka się z PBS, tworząc menisk. W razie potrzeby umieść głowicę AFM na jednostce wyrównawczej i kliknij Withdraw, aż powstanie wystarczający prześwit zapobiegający kontaktowi, a następnie umieść głowicę AFM na stoliku mikroskopu.
  3. Kliknij Navigate. Za pomocą joysticka lub klikając strzałkę 'Down', powoli opuść sondę AFM, aby zlokalizować wspornik nad aortą. W razie potrzeby dostosuj pozycję fotodiody, używając pokręteł pozycjonujących detektor na głowicy AFM.
  4. Kliknij Engage, aby pozwolić wspornikowi na kontakt z aortą.
  5. Po nawiązaniu kontaktu z aortą upewnij się, że centrum piezoelektryka jest stabilne i kliknij Ramp. Jeśli centrum piezoelektryka fluktuuje, może to być wynikiem fałszywego kontaktu. Cofnij sondę i zwiększ pionowy offset lasera na fotodiodzie w niewielkich przyrostach (~ 0.5 V), a następnie ponownie nawiąż kontakt.
    1. Ponadto, jeśli sonda znajduje się daleko nad powierzchnią próbki, ręcznie opuść ją bliżej powierzchni próbki przed ponownym nawiązaniem kontaktu. Jeśli powyższe kroki nie wyeliminują fluktuacji, spróbuj wymienić sondę.
  6. Ustaw Ramp Size na 3 µm, Trigger Mode na Relative oraz Trigger Threshold na 100 nm i kliknij Ramp Continuous. Zaobserwuj, czy punkt kontaktu między sondą a próbką występuje mniej więcej w centrum lub w dolnej ¾ cyklu rampy Z. Jeśli tak nie jest, przerwij kontakt z próbką, dostosuj rozmiar rampy (Ramp size) zgodnie z potrzebami i ponownie nawiąż kontakt z próbką.
  7. Kliknij Microscope w pasku menu, a następnie Engage Settings. Zmień SPM Withdraw na 30 µm. Kliknij Ramp Continuous w menu paska narzędzi Ramp.
  8. Po zaobserwowaniu krzywej siły kliknij Capture w pasku menu, a następnie Capture Filename. Wprowadź żądaną nazwę pliku z rozszerzeniem ".0" (pozwoli to na automatyczne zwiększanie numeracji kolejnych przechwyconych plików o 1). Wybierz wyznaczony folder i zapisz dane.
  9. Kliknij Capture w menu paska narzędzi Capture. Kliknij Withdraw, a następnie Navigate. Użyj joysticka lub sterowania programowego, aby ustawić wspornik nad innym obszarem aorty (obok punktu pomiarowego z początku; patrz Rysunek 4).
  10. Kliknij kolejno Engage, Ramp oraz Ramp Continuous. Po zaobserwowaniu krzywej siły kliknij Stop, a następnie Capture.
  11. Powtórz kroki 6.9 – 6.10. Wykonaj co najmniej 5 pomiarów na obszar, jak pokazano na Rysunku 4. UWAGA: Zazwyczaj zbieramy od 15 do 25 krzywych siły z 3 do 5 różnych lokalizacji w każdej tkance, odpowiednio zgodnie z Rysunkiem 4.

Schemat równowagi statycznej wspornika, pomiary w sekcjach klejonych, analiza eksperymentalna.
Rysunek 4: Schemat zbliżania się wspornika do tkanki i wbijania się w nią (Obszar 1). Pomiary AFM są powtarzane od 15 do 25 razy w 3–5 różnych miejscach (obszary 1–5) w każdej tętnicy, aby określić sztywność całej próbki tkanki. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

7. Analiza danych

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy krzywych sił.
  2. Kliknij Find oraz Open na pasku menu, a następnie dwukrotnie kliknij plik przeznaczony do analizy.
  3. Kliknij Modify Force Parameters w menu paska narzędzi, aby sprawdzić czułość ugięcia, stałą sprężystości (Spring Constant), promień końcówki (Tip Radius), połowę kąta końcówki (Tip Half Angle) oraz współczynnik Poissona. Aby zmienić parametry, zaznacz pole obok nich i wprowadź poprawne wartości w kolumnie nowych wartości. Następnie kliknij Execute.
  4. Jeśli krzywe sił są zaszumione, kliknij Boxcar Filter i ustaw parametry: Direction na Extend, Average Points na 3 oraz Filter Order na 0th. Kliknij Execute, aby wygładzić dane.
  5. Kliknij Baseline Correction na pasku menu i ustaw parametry: Direction na Extend, Plot Units na Force, Type na Separation, Correction Order na 1st oraz Extend Baseline Source na Extend. Przesuń pionowe, niebieskie linie przerywane tak, aby objęły one płaski odcinek krzywej siły, a następnie kliknij Execute.
  6. Kliknij Indentation w menu paska narzędzi i ustaw parametry: Active Curve na Extended, Fit Method na Contact Point Based, Contact Point Algorithm na Treat as Fit Variable, Include Adhesion Force na No, Max Force Fit Boundary na 30%, Min Force Fit Boundary na 0% oraz Fit Model na Hertzian (Spherical).
    UWAGA: W naszych pomiarach rzadko obserwowano znaczną adhezję między końcówką a próbką (ujemne ugięcie wspornika na krzywej powrotnej). W przypadkach, gdy taka adhezja występuje, do analizy należy użyć odpowiedniego modelu (DMT lub JKR)18,19.
  7. Zapisz wartości modułu Younga. Przeanalizuj moduł Younga (sprężystości) dla każdego z 3–5 obszarów (5 krzywych sił na obszar) pobranych w niewielkiej odległości od siebie, jak pokazano na Rysunku 4.
    UWAGA: Aby usunąć artefakty, wyklucz z analizy wartości modułu Younga > 10 kPa (zwykle około 10% wszystkich pomiarów).
  8. Oblicz średnią wartość modułu Younga dla każdego z 3–5 (zmierzonych) obszarów i wykorzystaj te wartości do obliczenia średniego modułu sprężystości dla całej aorty.
    UWAGA: Aby uzyskać dokładną ocenę sztywności tętnic, wykorzystuje się co najmniej 3, a częściej 4–6 pojedynczych aort. Wyniki końcowe przedstawia się jako średnia + SEM z „n” niezależnych eksperymentów. Dokładna liczba potrzebnych aort będzie oczywiście zależeć od wymaganego poziomu dokładności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 5A przedstawia obraz w kontraście fazowym aorty zstępującej (piersiowej) od 6-miesięcznego, samca myszy C57BL/6. Ramie AFM znajduje się bezpośrednio nad tkanką i jest gotowe do przeprowadzenia indentacji. Rysunki 5B oraz 5C prezentują reprezentatywne krzywe siły uzyskane podczas indentacji AFM w trybie kontaktowym. Zielone linie przedstawione na Rysunku 5B i 5C reprezentują krzywe najlepiej dopasowane, uzyskane przy użyciu modelu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wgłębienie AFM można wykorzystać do scharakteryzowania sztywności (modułu sprężystości) komórek i tkanek. W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły krok po kroku, aby wyizolować zstępującą aortę i łuk aorty u myszy oraz określić moduły sprężystości tych obszarów tętniczych ex vivo. Podsumujemy teraz i omówimy problemy techniczne i ograniczenia metody opisanej w tym artykule.

Podczas izolacji i analizy aort myszy może pojawić się kilka problemów technicznych, biorąc pod uwagę ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Analiza AFM została przeprowadzona na instrumentach wspieranych przez Pennsylvania Muscle Institute oraz Institute for Translational Medicine and Therapeutics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania. Prace te były wspierane przez granty NIH HL62250 i AG047373. YHB był wspierany przez stypendium podoktorskie American Heart Association.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System BioScope Catalyst AFMMikroskop
Nikon Eclipse TE 200Nikon Instruments
Sonda AFM z azotku krzemuNovascan TechnologiesPT. SI02. SN.10.06 N/m wspornikowy; 1 &mikro; m Cząstki SiO2
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki precyzyjnej11251-10Patrz rozdział 1.4
Kleszcze do #5SF DumontNarzędzia do nauki precyzyjnej11252-00Patrz rozdział 1.8
Precyzyjne nożyczki-ToughCutNarzędzia do nauki14058-11Patrz sekcja 1.4 (średniej wielkości)
Vannas-Tü Nożyczki sprężynowe BingenFine Science Tools15008-08Patrz rozdział 1.6 (małe rozmiary)
60 mm naczynie do hodowli komórkowych poddanych TCCorning353004
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco, 1xCorning21-031-CMBez wapnia i magnezu
Krazy Glue płyn błyskawicznyKrazy GlueKG58548RPatrz punkt 2.2
Końcówki do ładowania żelem, 1 - 200 i mikro; lFisher02-707-139Patrz rozdział 2.2
Końcówka PęsetaMikroskopia elektronowa Nauki78092-CPPatrz rozdział 3.2
Naczynia z przezroczystym dnem o grubości 50 mmTED PELLA14027-20Patrz sekcja 4.4
odwrócony Bruker uniwersalny

Bibliografia

  1. Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
  2. Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189(2015).
  3. Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
  4. Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
  5. Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585(2011).
  6. Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
  7. Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  8. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  9. Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
  10. Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57(2014).
  11. Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
  12. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
  13. Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122(2011).
  14. Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
  15. Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
  16. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
  17. Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974(2015).
  18. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  19. Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).
  21. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).
  22. Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
  23. Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
  24. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101(2010).
  25. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
  26. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
  27. Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
  28. Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. , e3733(2012).
  29. Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
  30. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
  31. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja aorty mysiejmoduł sprężystości ex vivoAFM w trybie kontaktowymanaliza krzywej siłykalibracja stałej sprężystościczułość ugięciapomiar sztywności tkankibiomechanika naczyniowawyrównanie sondy AFM
Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.