Artykuł metodologiczny

Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych

DOI:

10.3791/54630

⸱

19 października 2016

 ,  ,  ,  , 
1Program in Translational Biomechanics, Institute of Translational Medicine and Therapeutics, University of Pennsylvania, 2Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 3Department of Physiology, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji aort od myszy i pomiaru ich modułu sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usztywnienie tętnic jest istotnym czynnikiem ryzyka i biomarkerem chorób sercowo-naczyniowych oraz cechą charakterystyczną starzenia się. Mikroskopia sił atomowych (AFM) jest wszechstronnym narzędziem analitycznym do charakteryzowania lepkosprężystych właściwości mechanicznych różnych materiałów, od twardych powierzchni (plastik, szkło, metal itp.) po komórki na dowolnym podłożu. Jest szeroko stosowany do pomiaru sztywności komórek, ale rzadziej używany do pomiaru sztywności aort. W tym artykule opiszemy procedury stosowania AFM w trybie kontaktowym do pomiaru modułu sprężystości ex vivo nieobciążonych tętnic myszy. Opisujemy naszą procedurę izolacji aort myszy, a następnie podajemy szczegółowe informacje do analizy AFM. Obejmuje to instrukcje krok po kroku dotyczące ustawiania wiązki laserowej, kalibracji stałej sprężystości i czułości ugięcia sondy AFM oraz pozyskiwania krzywych siły. Udostępniamy również szczegółowy protokół do analizy danych krzywych sił.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomechaniczne właściwości tętnic są krytycznym wyznacznikiem chorób sercowo-naczyniowych (CVD) i starzenia się. Sztywność tętnic, główny czynnik ryzyka niezależny od cholesterolu i wskaźnik progresji CVD, zwiększa się wraz z uszkodzeniem naczyń krwionośnych, miażdżycą, wiekiem i cukrzycą1-8. Usztywnienie ścian tętnic wiąże się ze zwiększonym odróżnicowaniem, migracją i proliferacją komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych9-12. Ponadto zwiększona sztywność tętnic została powiązana ze zwiększoną adhezją makrofagów1, przepuszczalnością śródbłonka i transmigracją leukocytów13 oraz przebudową ścian naczyń14,15. W związku z tym terapie, które mogą zapobiegać usztywnieniu tętnic w CVD lub starzeniu się, mogą uzupełniać obecnie dostępne interwencje farmakologiczne, które leczą CVD poprzez obniżenie wysokiego poziomu cholesterolu we krwi.

AFM to potężne narzędzie analityczne używane do różnych zastosowań fizycznych i biologicznych. AFM jest coraz częściej stosowany do uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości i charakteryzowania właściwości biomechanicznych miękkich próbek biologicznych, takich jak tkanki i komórki1,2,10,16,17 z dużą dokładnością na poziomie nanoskali. Dużą zaletą AFM jest fakt, że może być stosowany z żywymi komórkami.

Ten artykuł opisuje naszą metodę pomiaru modułu sprężystości tętnic myszy ex vivo za pomocą AFM. Opisana metoda pokazuje, w jaki sposób 1) prawidłowo izolujemy tętnice mysie (aorta zstępująca i łuk aorty) oraz 2) mierzymy moduł sprężystości tych tkanek za pomocą AFM. Pomiary nieobciążonych modułów sprężystości w tętnicach mogą pomóc w wyjaśnieniu zmian w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które zachodzą w odpowiedzi na uszkodzenie naczyń krwionośnych, CVD i starzenie się.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ze zwierzętami w tym badaniu została zatwierdzona przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Pensylwanii. Metody przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.

1. Przygotowanie myszy i izolacja aorty

  1. Znieczulij mysz ketaminą (80 - 100 mg / kg), ksylazyną (8 - 10 mg / kg) i acepromazyną (1 - 2 mg / kg) dootrzewnowo. Potwierdź znieczulenie testem szczypania ogona. Gdy mysz zostanie w pełni znieczulona, poddaj ją eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Umieść mysz na plecach i przypnij ją do deski sekcyjnej. Oczyść okolice brzucha chusteczkami z etanolu o stężeniu 70% (v/v).
  3. Uszczypnij skórę w linii środkowej i wykonaj małe początkowe nacięcie średniej wielkości nożyczkami mikrochirurgicznymi na brzuchu. Trzymając skórę kleszczami, użyj średniej wielkości nożyczek mikrochirurgicznych, aby przeciąć skórę i otrzewną od brzucha do mostka.
  4. Odetnij żebra po obu stronach średniej wielkości nożyczkami mikrochirurgicznymi. Ostrożnie usuń płuca i wątrobę małymi nożyczkami mikrochirurgicznymi i pozostaw serce i aortę. Przenieś mysz i deskę sekcyjną do mikroskopu preparacyjnego.
  5. Chwyć tłuszcz otaczający aortę małymi kleszczami i użyj małych nożyczek, aby ostrożnie odciąć tłuszcz wokół aorty.
  6. Delikatnie chwyć aortę kleszczami, wykonaj jedno cięcie małymi nożyczkami mikrochirurgicznymi na początku aorty wstępującej, a drugie nacięcie na końcu aorty zstępującej, tuż nad aortą brzuszną.
  7. Przenieś wypreparowaną aortę do 60-milimetrowego naczynia zawierającego 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; bez wapnia i magnezu).
  8. Kontynuuj wycinanie pozostałej tkanki tłuszczowej z aorty za pomocą małych nożyczek mikrochirurgicznych. Użyj małych nożyczek, aby otworzyć aortę wzdłużnie.
  9. Użyj małych nożyczek mikrochirurgicznych, aby wyciąć mały kawałek (~ 2 x 4 mm) aorty zstępującej i łuku aorty do analizy AFM (ryc. 1). Umieść chusteczkę w plastikowym naczyniu o średnicy 60 mm i utrzymuj ją wilgotną w kropli PBS .

figure-protocol-1
Rycina 1: Obraz przedstawiający położenie różnych segmentów aorty u myszy. Aortę wyizolowano od serca do przepony, a do określenia modułów sprężystości wykorzystano niewielką część aorty zstępującej i łuku aorty. Podziałka, 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie próbek tkanek do pomiarów AFM

  1. Ostrożnie usuń PBS za pomocą chusteczki laboratoryjnej, nie dotykając aorty. Upewnij się, że luminalna strona tkanki jest skierowana do góry.
  2. Delikatnie przyklej każdy koniec otwartej aorty do płytki, dodając 5 - 10 μl kleju cyjanoakrylowego z końcówką do nakładania żelu (Rysunek 2).
    nuta: Ilość kleju potrzebna do mocnego przymocowania tkanki na każdym końcu musi być określona empirycznie. Bardzo ważne jest, aby aorta nie była rozciągana podczas tego procesu.
  3. Sprawdź sklejoną aortę, aby upewnić się, że nie jest złożona lub pływająca. Po wysuszeniu kleju na powietrzu na aorcie (30 - 60 sek), delikatnie dodaj PBS i zanurz próbkę.
    nuta: Przygotowanie AFM (kroki 3 - 5) można przeprowadzić podczas przygotowywania tkanki do analizy.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Karytatura przedstawiająca odcinek aorty przyklejony do 60-milimetrowej płytki hodowlanej za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Klej cyjanoakrylowy nakłada się na krawędź próbki aorty w ramach przygotowań do pomiarów AFM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Ładowanie sondy

  1. Zamontuj uchwyt sondy płynu na stojaku obciążenia sondy.
  2. Za pomocą pęsety nasuń sondę AFM z azotku krzemu (wspornik 0,06 N/m) ze sferyczną końcówką (użyliśmy cząstki SiO2 o średnicy 1 μm, ale można również użyć większych rozmiarów) na uchwycie sondy. Upewnij się, że sonda AFM jest mocno przymocowana do uchwytu sondy.
  3. Wsuń uchwyt sondy na uchwyt skanera Z głowicy AFM i upewnij się, że uchwyt sondy jest dobrze zamocowany.

4. Ustawianie lasera na sondzie

  1. Otwórz oprogramowanie AFM. Wybierz typ eksperymentu w oprogramowaniu; Kategoria eksperymentu do trybu kontaktowego, grupa eksperymentalna do trybu kontaktowego w płynie i eksperyment do trybu kontaktowego w płynie. Kliknij Załaduj eksperyment w oprogramowaniu; Spowoduje to włączenie lasera.
  2. Dodaj 3 ml wody destylowanej do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 50 mm i umieść naczynie na stoliku laserowej jednostki wyrównującej naczynia. To urządzenie upraszcza proces skupiania wiązki laserowej z tyłu wspornika.
  3. Zamontuj głowicę AFM w pozycji pionowej na jednostce osiowania lasera i włącz jednostkę do osiowania lasera. Dodać około 50 μl wody destylowanej, aby utworzyć kropelkę na końcówce AFM.
  4. Za pomocą joysticka opuść głowicę AFM tak, aby końcówka AFM zetknęła się z wodą w naczyniu. Jeśli nie dojdzie do kontaktu między końcówką AFM a wodą w naczyniu, delikatnie podnieś naczynie, aż dojdzie do kontaktu. Dostosuj ostrość, jasność i pozycję XY tak, aby końcówka AFM była widoczna na ekranie LCD jednostki wyrównowania.
  5. Umieść plamkę lasera na końcówce sondy AFM, regulując pokrętła pozycjonowania lasera na głowicy AFM. Za pomocą pokręteł pozycjonujących detektor na głowicy AFM reguluj położenie fotodiody, aż do uzyskania wartości od 0 do -1 V dla odchylenia pionowego i ~ 0 V dla odchylenia poziomego.
  6. Sprawdź, czy sygnał sumy laserowej jest zmaksymalizowany. W razie potrzeby powtórz krok 4.5, aby ponownie wyregulować położenie wiązki laserowej na końcówce AFM i położenie fotodiody, aby uzyskać maksymalny sygnał sumy.
    nuta: Może być konieczna zmiana położenia sondy AFM na uchwycie sondy w celu uzyskania maksymalnego sygnału sumy, nawet jeśli krok 4.5 zostanie powtórzony.

5. Kalibracja czułości ugięcia i stałej sprężystości sondy AFM

  1. Zrób zadrapanie na naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm za pomocą kleszcza i napełnij naczynie wodą destylowaną. Umieścić naczynie hodowlane na talerzu z uchwytem na próbkę. W takim przypadku zamontuj czaszę na zmotoryzowanym stoliku skanującym XY mikroskopu odwróconego.
  2. Umieść magnetyczny uchwyt płytki na górze płytki, aby zapewnić jej bezpieczeństwo podczas obrazowania.
  3. Kliknij strzałkę "W górę" w menu nawigacji w oprogramowaniu, aby przesunąć głowicę AFM do prawie najwyższej pozycji, aby upewnić się, że sonda AFM nie dotknie anteny.
    nuta: Ten krok jest bardzo ważny, ponieważ pozwala uniknąć złamania końcówki AFM.
  4. Umieść głowicę AFM na stoliku mikroskopu.
  5. Użyj mikroskopu, aby ustawić ostrość na rysie na płytce. Użyj joysticka lub kliknij strzałkę "W dół" w menu nawigacji, aby powoli i ostrożnie opuścić sondę AFM do PBS. Umieść głowę nieco powyżej rysy w płycie.
    nuta: Jeśli początkowa pozycja głowicy AFM znajduje się bliżej próbki, czas załączenia zostanie znacznie skrócony.
  6. Przed włączeniem należy ponownie wyregulować położenie wiązki laserowej na końcówce AFM oraz położenie fotodiody, aby w razie potrzeby uzyskać maksymalny sygnał SUM.
  7. Wybierz typ końcówki, klikając przycisk Change Probe (Zmień sondę) w menu Setup (Konfiguracja).
  8. Kliknij przycisk Check Parameters (Sprawdź parametry) i ustaw parametry: Scan Size (Rozmiar skanowania) na 0, Scan Rate (Częstotliwość skanowania) na 1 Hz, Sample/line (Próbka/linia) na 256 i Percentage Deflection (Nastawa odchylenia) na 20 nm. Kliknij przycisk Zaangażuj się. Okno Stan włączenia pozostanie otwarte, dopóki sonda nie zetknie się z powierzchnią płyty. Po włączeniu sondy kliknij przycisk Rampa.
  9. Kliknij Tryb rozszerzony w menu paska narzędzi skanowania i ustaw parametry: Rozmiar rampy od 500 nm do 1 μm, Szybkość narastania do 2 Hz, Liczba próbek do 256, Promień końcówki do 500 nm, Współczynnik Poissona próbki do 0,5 (przy założeniu, że mierzony materiał jest idealnie nieściśliwy), Kąt połówki końcówki na 0, Tryb wyzwalania do względnego i próg wyzwalania do zakresu od 20 do 100 nm.
  10. Kliknij opcję Rampa ciągła w menu paska narzędzi Ramza, aby uzyskać krzywą siły na płycie (Rysunek 3A). Na tej krzywej siły ustaw kanał 1 na błąd ugięcia.
    nuta: Umożliwi to oprogramowaniu przedstawienie wyników na wykresie jako odchylenia pionowego w funkcji pozycji z.
    1. Kliknij lewy lub prawy koniec krzywej siły i przeciągnij kursor, aby objąć obszar liniowy krzywej siły (Rysunek 3A, czerwone linie przerywane). Użyj tych dwóch linii, aby oznaczyć granice nachylonego obszaru, który ma być dopasowany do linii prostej.
  11. Wybierz opcję Rampa na pasku narzędzi i kliknij przycisk Aktualizuj czułość. Zapisz wartość i powtórz ten krok jeszcze cztery razy. Wybierz opcję Kalibruj na pasku narzędzi, a następnie kliknij przycisk Detektor. Wprowadź średnią wartość z pięciu pomiarów w polu Czułość ugięcia.
  12. Kliknij przycisk Wycofaj 2-3 razy, aby podnieść głowicę AFM. Ten krok jest ważny, aby zapobiec interakcji między końcówką AFM a płytką podczas procesu strojenia termicznego. Kliknij przycisk Thermal Tune (Dostrajanie termiczne) na pasku narzędzi.
  13. Ustaw zakres strojenia termicznego od 1 do 100 kHz (informacje te można uzyskać z katalogu producenta) i korekcję czułości ugięcia na 1,144 dla wsporników w kształcie litery V i 1,106 dla wsporników prostokątnych.
  14. W menu Thermal Tune (Dostrajanie termiczne) kliknij przycisk Acquire Data (Uzyskaj dane), aby uzyskać krzywą strojenia termicznego (Rysunek 3B). Korzystając z oprogramowania AFM, umieść czerwone linie przerywane po obu stronach krzywej (jak pokazano na rysunku 3B), przeciągając mysz od krawędzi wykresu, aby zdefiniować granice dopasowania. Wybierz model Lorentza (powietrze) lub prosty oscylator harmoniczny (płyn), w zależności od tego, który lepiej pasuje do danych.
  15. Kliknij Dopasuj dane, a następnie Oblicz sprężynę K i zapisz tę wartość. Powtórz kalibrację stałej sprężystości kilka razy i użyj wartości średniej. Kliknij przycisk Wypłać kilka razy.
  16. Zdejmij głowicę AFM z mikroskopu stage i umieść ją na jednostce wyrównującej. Wyjmij naczynie ze stolika mikroskopu.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Krzywe siły AFM używane do kalibracji sond AFM. (A) reprezentatywna krzywa siły AFM (krzywa kalibracyjna). Wydłużenie krzywej siły między pionowymi czerwonymi liniami przerywanymi wykorzystano do określenia wrażliwości na ugięcie wspornika. (B) Prosty wykres dopasowania oscylatora harmonicznego używany do obliczania stałej sprężystości wspornika, jak opisano wcześniej20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Pomiar modułu sprężystości na tętnicach myszy ex vivo

  1. Umieść 60-milimetrową naczynie hodowlane zawierające tkankę aorty na stoliku mikroskopu i zabezpiecz płytkę za pomocą magnetycznego uchwytu płytki.
  2. Umieść głowicę AFM na stoliku mikroskopu. Upewnij się, że sonda AFM nie styka się z aortą, ale delikatnie styka się z PBS i tworzy łąkotkę. W razie potrzeby umieść głowicę AFM na jednostce wyrównującej i klikaj przycisk Wycofaj, aż będzie wystarczający odstęp, aby zapobiec kontaktowi, a następnie umieść głowicę AFM na stoliku mikroskopu.
  3. Kliknij przycisk Nawiguj. Za pomocą joysticka lub klikając strzałkę "W dół" powoli opuść sondę AFM, aby zlokalizować wspornik nad aortą. W razie potrzeby wyreguluj pozycję fotodiody za pomocą pokręteł pozycjonowania detektora na głowicy AFM.
  4. Kliknij przycisk Włącz, aby umożliwić wspornikowi zetknięcie się z aortą.
  5. Gdy aorta zostanie zazębiona, upewnij się, że środek piezoelektryczny jest stabilny i kliknij Rampa. Jeśli centrum piezoelektryczne ulega wahaniom, może to być wynikiem fałszywego zaangażowania. Wyjmij sondę i zwiększ pionowe przesunięcie lasera na fotodiodzie o małe przyrosty (~ 0,5 V) i ponownie włącz.
    1. Ponadto, jeśli sonda znajduje się znacznie nad powierzchnią próbki, ręcznie opuść sondę bliżej powierzchni próbki przed ponownym włączeniem. Jeśli poprzednie kroki nie wyeliminują wahań, spróbuj wymienić sondę.
  6. Ustaw rozmiar rampy na 3 μm, tryb wyzwalania na względny, a próg wyzwalania na 100 nm, a następnie kliknij przycisk Ramp Continuous. Zwróć uwagę, że punkt styku między sondą a próbką występuje mniej więcej w środku do dolnych 3/4 cyklu rampy Z. Jeśli nie zostanie to zaobserwowane, odłącz się od sample, dostosuj rozmiar rampy zgodnie z potrzebami i ponownie włącz sample.
  7. Kliknij Mikroskop na pasku menu, a następnie Włącz ustawienia. Zmień wycofanie SPM na 30 μm. Kliknij opcję Rampa ciągła w menu paska narzędzi Ramza.
  8. Po zaobserwowaniu krzywej siły kliknij Przechwyć na pasku menu, a następnie Przechwyć nazwę pliku. Wprowadź żądaną nazwę pliku z końcówką ".000" (pozwoli to na zwiększenie liczby dodatkowych przechwyconych plików o 1). Wybierz wyznaczony folder i zapisz dane.
  9. Kliknij przycisk Przechwyć w menu paska narzędzi przechwytywania. Kliknij przycisk Wypłać, a następnie Nawiguj. Użyj joysticka lub elementów sterujących oprogramowania, aby ustawić wspornik nad innym obszarem aorty (obok początkowo zmierzonego punktu; patrz rysunek 4).
  10. Kliknij odpowiednio opcję Włącz, Rampa i Rampa ciągła. Po zaobserwowaniu krzywej siły kliknij Zatrzymaj, a następnie Przechwyć.
  11. Powtórz kroki 6.9 - 6.10. Wykonaj co najmniej 5 pomiarów na obszar, jak pokazano na rysunku 4. nuta: Zazwyczaj zbieramy 15 - 25 krzywych siły z 3 - 5 różnych miejsc w każdej tkance, jak pokazano odpowiednio na rysunku 4.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Karykatura wspornika zbliżającego się do tkanki i wciskającego się w nią (obszar 1). Ten pomiar AFM jest powtarzany do 15 - 25 razy z 3 - 5 różnych miejsc (obszary 1 - 5) w każdej tętnicy, aby uzyskać sztywność całej próbki tkanki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Analiza danych

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy krzywej siły.
  2. Kliknij przycisk Znajdź i otwórz na pasku menu, a następnie kliknij dwukrotnie plik, który chcesz przeanalizować.
  3. Kliknij przycisk Modyfikuj parametry siły w menu paska narzędzi, aby sprawdzić czułość ugięcia, stałą sprężystości, promień końcówki, kąt połówki końcówki i współczynnik Poissona. Aby zmienić parametry, zaznacz pole obok niego i wprowadź poprawne wartości w kolumnie nowej wartości. Następnie kliknij przycisk Execute (Wykonaj).
  4. Jeśli krzywe siły są hałaśliwe, kliknij opcję Filtr wagonu skrzyniowego i ustaw dane wejściowe dla opcji Kierunek do wydłużenia, Średnia liczba punktów na 3 i Kolejność filtrowania na 0th. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj), aby wygładzić dane.
  5. Kliknij opcję Korekta linii bazowej na pasku menu i ustaw dane wejściowe dla opcji Kierunek do wydłużenia, Jednostki wykresu do wymuszenia, Typ na separację, Kolejność korekcji na 1st i Wydłuż źródło linii bazowej na Wydłuż. Dostosuj pionowe kropkowane niebieskie linie, aby objąć płaską część krzywej siły, a następnie kliknij przycisk Wykonaj.
  6. Kliknij opcję Wcięcie w menu paska narzędzi i ustaw dane wejściowe dla opcji Aktywna krzywa na Wydłużona, Dopasuj metodę do Na podstawie punktu kontaktowego, Algorytm punktu kontaktowego traktuj jako zmienną dopasowania, Uwzględnij siłę przyczepności do Nie, Maksymalną granicę dopasowania siły na 30%, Minimalną granicę dopasowania siły na 0% i Dopasuj model do Hertza (sferycznego).
    nuta: W naszych pomiarach rzadko obserwowano znaczną adhezję między końcówką a próbką (ujemne ugięcie wspornika w krzywej retrakcji). W przypadkach, w których obserwuje się taką przyczepność, do analizy należy użyć odpowiedniego modelu (DMT lub JKR)18,19.
  7. Zapisz wartości modułu Younga. Przeanalizuj moduł Younga (sprężysty) każdego z 3-5 obszarów (5 krzywych siły na obszar) pobranych w niewielkiej odległości od siebie, jak pokazano na rysunku 4.
    nuta: Aby usunąć artefakty, należy wykluczyć z analizy moduły Younga > 100 kPa (zwykle ~10% całkowitych pomiarów).
  8. Oblicz średnią wartość modułu Younga dla każdego z 3 - 5 obszarów (które zostały zmierzone) i użyj tych wartości do obliczenia średniego modułu sprężystości dla aorty jako całości.
    nuta: Wykorzystuje się co najmniej 3, a częściej 4 - 6 pojedynczych aort w celu uzyskania dokładnej oceny sztywności tętnic. Wyniki końcowe są wykreślane jako średnia + SEM z "n" niezależnych eksperymentów. Dokładna liczba potrzebnych aort będzie oczywiście zależeć od wymaganego poziomu dokładności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 5A pokazuje kontrast fazowy zstępującej (piersiowej) aorty u 6-miesięcznego samca myszy C57BL/6. Wspornik AFM znajduje się bezpośrednio nad tkanką i jest gotowy do wcięcia. Rysunki 5B i 5C przedstawiają reprezentatywne krzywe siły uzyskane przez wgłębienie AFM w trybie kontaktowym. Zielone linie pokazane na rysunkach 5B i 5C reprezentują krzywe najlepszego dopasowania uzyskane przy użyciu modelu Hertza dla sfery. Na rycin...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wgłębienie AFM można wykorzystać do scharakteryzowania sztywności (modułu sprężystości) komórek i tkanek. W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły krok po kroku, aby wyizolować zstępującą aortę i łuk aorty u myszy oraz określić moduły sprężystości tych obszarów tętniczych ex vivo. Podsumujemy teraz i omówimy problemy techniczne i ograniczenia metody opisanej w tym artykule.

Podczas izolacji i analizy aort myszy może pojawić się kilka problemów technicznych, biorąc pod uwagę ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza AFM została przeprowadzona na instrumentach wspieranych przez Pennsylvania Muscle Institute oraz Institute for Translational Medicine and Therapeutics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania. Prace te były wspierane przez granty NIH HL62250 i AG047373. YHB był wspierany przez stypendium podoktorskie American Heart Association.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System BioScope Catalyst AFMMikroskop
Nikon Eclipse TE 200Nikon Instruments
Sonda AFM z azotku krzemuNovascan TechnologiesPT. SI02. SN.10.06 N/m wspornikowy; 1 &mikro; m Cząstki SiO2
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki precyzyjnej11251-10Patrz rozdział 1.4
Kleszcze do #5SF DumontNarzędzia do nauki precyzyjnej11252-00Patrz rozdział 1.8
Precyzyjne nożyczki-ToughCutNarzędzia do nauki14058-11Patrz sekcja 1.4 (średniej wielkości)
Vannas-Tü Nożyczki sprężynowe BingenFine Science Tools15008-08Patrz rozdział 1.6 (małe rozmiary)
60 mm naczynie do hodowli komórkowych poddanych TCCorning353004
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco, 1xCorning21-031-CMBez wapnia i magnezu
Krazy Glue płyn błyskawicznyKrazy GlueKG58548RPatrz punkt 2.2
Końcówki do ładowania żelem, 1 - 200 i mikro; lFisher02-707-139Patrz rozdział 2.2
Końcówka PęsetaMikroskopia elektronowa Nauki78092-CPPatrz rozdział 3.2
Naczynia z przezroczystym dnem o grubości 50 mmTED PELLA14027-20Patrz sekcja 4.4
odwrócony Bruker uniwersalny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kothapalli, D., et al. Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening. Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).
  2. Liu, S. -L., et al. Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening. Sci Rep. 5, 17189(2015).
  3. Lakatta, E. G. Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis. J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).
  4. Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease. Diabetologia. 51, 527-539 (2008).
  5. Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System. Cardiol Res Pract. 2011, 263585(2011).
  6. Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
  7. Mitchell, G. F., et al. Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  8. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  9. Klein, E. A., et al. Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening. Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).
  10. Bae, Y. H., et al. A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling. Sci signal. 7, ra57(2014).
  11. Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).
  12. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease. Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).
  13. Huynh, J., et al. Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration. Sci Transl Med. 3, 112ra122(2011).
  14. Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases. Circulation. 107, 2864-2869 (2003).
  15. Raffetto, J. D., Khalil, R. A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease. Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).
  16. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).
  17. Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2. PLoS ONE. 10, e0128974(2015).
  18. Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. Surface Energy and the Contact of Elastic Solids. Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).
  19. Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles. J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).
  21. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).
  22. Pogoda, K., et al. Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data. Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).
  23. Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress. Biophys J. 107, 314-323 (2014).
  24. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101(2010).
  25. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. J Biomech. 41, 454-464 (2008).
  26. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope. Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).
  27. Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
  28. Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. J Vis Exp. , e3733(2012).
  29. Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
  30. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nano. 7, 757-765 (2012).
  31. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat Nano. 6, 809-814 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja aorty mysiejmodu spr ysto ci ex vivoAFM w trybie kontaktowymanaliza krzywej si ykalibracja sta ej spr ysto ciczu o ugi ciapomiar sztywno ci tkankibiomechanika naczyniowawyr wnanie sondy AFM

Powiązane artykuły